Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Utvikling og validering av en kvantitativ PCR metode for Equid herpesvirus-2 Diagnostics i respirasjonsorganer Fluids

Published: March 17, 2016 doi: 10.3791/53672
Automatic Translation
1,2,3, 1,3, 1, 1, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1LABÉO Frank Duncombe, 2Unité de Risques Microbiens (U2RM, EA 4655), Normandy University, 3Hippolia Foundation

Introduction

Equid herpesvirus-2 (EHV-2) er involvert i en luftveissyndrom, med potensielle kliniske manifestasjoner som rennende nese, faryngitt og hovne lymfeknuter 1-3. Dette viruset er også mistenkt for å være assosiert med den dårlige ytelse av hester, noe som kan resultere i en betydelig og negative økonomiske konsekvenser for hesteindustrien 2.

Inntil nå, gullstandarden for gamma-EHV (γ-EHV) deteksjon var celledyrkningsmetode. Den første ulempe med denne fremgangsmåten var fraværet av diskriminering mellom EHV-2 og andre γ-EHV-tallet (f.eks EHV-5). Den andre ulempe var den langsomme utvikling av cytopatiske prosess, som tar fra 12 til 28 dager for å manifestere 4,5.

Utvikling av en validert og normalisert kvantitativ sanntids polymerasekjedereaksjon (QRT-PCR) metoden vil hjelpe til å raskt påvise virus, for å diskriminere mellom EHV-2 og EHV-5 og for å studere sammenhengen mellom det virale genomet belastning og sykdoms takket være kvantifisering aspekt.

Polymerase kjedereaksjon (PCR) ble beskrevet for første gang i 1986 av Mullis 6 og er i ferd med å bli den nye standarden i de fleste av de felt av biologisk diagnose (human, miljø og veterinær). Denne metoden, som er basert på amplifikasjon av en del av genomet av patogener, gir mange fordeler: spesifisitet, følsomhet og hurtighet. Videre risikoen for amplicon forurensning trukket seg tilbake siden advent av QRT-PCR og kvalitetssikring 7. Likevel anerkjennelse av PCR som en ny gullstandard metode nødvendig mer enn bare forbedret ytelse data, men også demonstrasjon av kontroll av utviklings- og validerings trinn av hele metoden uten degradering av ytelse over tid.

De første molekylære verktøy som brukes for deteksjon av EHV-2 var tid consuming og involvert uspesifikk amplifikasjon med nestet PCR etterfulgt av sekvense 8. De målrettede gener for herpesvirus ble deoksyribonukleinsyre (DNA)-polymerase og DNA-pakking 9. Imidlertid presenterer nestet PCR en høy risiko for forurensning av amplikonene. Siden da har konvensjonelle PCR tester er designet for å forsterke interleukin 10-lignende gen eller glykoprotein B-genet, anmeldt i 2009 2. Mer nylig, real-time PCR-egenskaper ble beskrevet for kvantifisering av EHV-2 10, men ingen data var tilgjengelige om validering av hele fremgangsmåten inkluderer ekstraksjonsprosessen.

I denne protokollen, utviklings- og valideringsprosedyrer beskrevet for en kvantitativ PCR-metode for påvisning og kvantifisering av EHV-2 DNA i equine luftveis væsker i henhold til Association Française de normalisering (AFNOR) normen NF U47-600 3,11,12, som er den franske representanten iden internasjonale normalisering komiteen. Denne normen detaljer "Krav og anbefalinger for gjennomføring, utvikling og validering av veterinær PCR i dyrehelse analysemetode" 11,12, i henhold til NF EN ISO / CEI 17025, 2005 13 og OIE (Verdens dyrehelseorganisasjon) . anbefalinger, 2010 14 EHV-2 QRT-PCR valideringsprotokoll omfatter en tredelt prosedyre: (a) utvikling av QRT-PCR-analyse, (b) karakterisering av QRT-PCR-analyse alene og (c) å karakterisere hele analytisk metode (fra ekstrahering av nukleinsyrer fra den biologiske prøven for å PCR-analyse).

Karakterisering av QRT-PCR-analyse og av hele analysemetoden omfatter definisjonen av to grenser: deteksjonsgrense (LOD) og kvantifiseringsgrensen (LOQ). LOD 95% PCR representerer det laveste antallet nukleinsyre eksemplarer per volumenhet som kan oppdages i 95% av alle cases. LOQ 95% PCR representerer den laveste mengden av nukleinsyre-kopier som kan bestemmes idet det tas hensyn til usikkerhet.

Dette QRT-PCR metoden gjør nøyaktig deteksjon og hurtig kvantifisering av EHV-2 i luftveis væsker. Videre kan fremgangsmåten anvendes i andre laboratorier for å sikre en standardisert fremgangsmåte, og som generelt templat for utvikling av andre nye QRT-PCR-analyser.

Protocol

Merk: Se alle de forskjellige trinnene som er illustrert i figur 1.

1. Utvinning av nukleinsyrer

Merk: Utfør ekstraksjon under en avtrekkshette for å begrense luftveis forurensning med nukleinsyrer. Omfatte en ekstraksjon negativ kontroll med DEPC-behandlet vann for å sikre at ingen av reagensene er forurenset med uønskede DNA.

  1. Utdrag nukleinsyrer fra den biologiske prøven i henhold til en tidligere beskrevet protokoll 15 og produsentens protokoll.
    1. Legg 140 mL av biologiske prøve til 560 ul lyseringsløsning (AVL buffer) og inkuberes i 10 min ved romtemperatur. Legg 560 ul etanol. Anvende de første 630 pl av denne oppløsning (prøve + lyseringsoppløsning + etanol) til en silikakolonne og sentrifuge.
    2. Anvende de resterende 630 ul av denne løsning på det samme silikakolonne og sentrifuge. Deretter vaskes kolonnen med 500 ulav 2 forskjellige vaske buffere (AW1 og AW2).
  2. Eluere nukleinsyre med 50 ul elueringsbuffer (AVE-buffer) og romtemperatur. Lukk lokket og inkuber ved værelsestemperatur i 1 min. Sentrifuger ved 6000 g i 1 min.

2. Amplification Prosedyre

  1. Forbered 22,5 mL av reaksjonsblandingen for hver reaksjon. Legge til 12,5 ul av PCR masterblanding, x ul 20 uM forover primer, x pl av 20 pM revers primer, y ul 10 uM probe og z ul ultrarent vann som er nødvendig for å nå 22,5 pl (x-, y- og z-volumer erholdes etter titrering, se avsnitt 3.2.3 og 3.2.6).
  2. Alikvoter 22,5 ul av den passende reaksjonsblandingen til hver reaksjon brønn i en 96-brønns plate.
    Merk: Ta med negative kontroller for utvinning og for PCR for å sikre at ingen av reagenser er forurenset med uønsket DNA.
  3. Legg 2,5 ul av prøven, 2,5 mL av ekstraksjon negative kontroll, 2,5 ul av PCR negativ kontroll og 2,5 ul av positiv prøve (referansestamme eller plasmid) til den tilsvarende reaksjon brønnen. Etter fordeling, dekke platen med et klebeplate tetning. Sentrifuger plate i 10 sekunder ved 6000 g.
  4. Sett platen i en Real-Time PCR system. Velg malen for analysen layout og starte kjøringen. Bruke PCR-innstillingen program: 10 min ved 95 ° C etterfulgt av 45 sykluser med 15 sek ved 95 ° C og 1 min ved 60 ° C (tabell 1).
  5. Overfør rådata fra Real-Time PCR system til et regneark. Sett terskel i forsterknings plott over grunnlinjen, og i løpet av den eksponentielle vekstregionen for å oppnå det terskelsyklusen for hver prøve. Plotte hvert punkt standard satt som en standardkurve for å oppnå linearitet. Beregn kopitallet for de forskjellige prøver basert på standardkurven.

3. Utvikling av Kvantitativ RT-PCR

Merk: Utviklingen av en QRT-PCR testen krever referansestammer, en bestemt titrert plasmid, og ulike kontroller og innebærer titrering av primere og probe.

  1. foreløpige Test
    1. Design primere og prober med spesifikk programvare i henhold til tidligere anbefalinger 16.
    2. Pakk referansestammer som beskrevet i kapittel 1.
    3. Forsterke som beskrevet i seksjon 2 med 900 nM for den endelige konsentrasjonen av primere og 250 nM for den endelige konsentrasjonen av proben. Analyser signalet som beskrevet i kapittel 2.5.
    4. På samme tid, utføre amplifikasjon av referansestammer DNA (som beskrevet i seksjon 3.1.3) uten prober. Sekvens amplikonene innhentet av Sanger-metoden 17,18. Analyser sekvensene ved å kjøre en nukleotid BLAST 19.
  2. Titrering av Grunning og Probe
    1. Forbered 3 forskjellige blandinger med 250 nM endelig konsentrasjon på sonde og med forskjellig endelige konsentrasjonersjoner av forover og bakover primere (50 nM / 50 nM, 300 nM / 300 nM, 900 nM / 900 nM) for de 3 replikater av den positive prøven, og en negativ kontroll. For hver blanding, tilsett den samme hensiktsmessige volum av 20 uM forover primer og 20 uM revers primer (0,25 pl for å oppnå 50 nM sluttkonsentrasjon, 1,5 pl for å oppnå 300 nM sluttkonsentrasjon eller 4,5 pl for å oppnå 900 nM sluttkonsentrasjon) , 50 ul av PCR masterblanding, 2,5 ul 10 uM probe og ultrarent vann som er nødvendig for å nå 90 pl.
    2. Utfør forsterkning prosedyre som beskrevet i kapittel 2.
    3. Velg den beste forutsetning for å oppnå den høyeste grad av forsterkning, tidligst syklus terskel (Ct) og beste repeterbarhet mellom de 3 forhold. Bestemme den beste konsentrasjonen og det tilsvarende volum x pl av forover og revers primere.
    4. Forbered 5 forskjellige blandinger for de 4 prøvene (3 replikater av den positive prøven og en negativ kontroll)med 5 forskjellige sluttkonsentrasjoner på sonden (50 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM). For hver blanding, tilsett x ul 20 mikrometer fremover primer og x ul 20 mikrometer revers primer (tidligere bestemt, i avsnitt 3.2.3), 50 ul av PCR Master Mix, passende volum av 10 mm probe (0,5 mL for å oppnå 50 nM konsentrasjon, 1 pl for å oppnå 100 nM konsentrasjon, 1,5 pl for å oppnå 150 nM konsentrasjon, 2 pl for å oppnå den 200 nM konsentrasjon eller 2,5 pl for å oppnå 250 nM konsentrasjon) og ultrarent vann som er nødvendig for å nå 90 pl.
    5. Utfør forsterkning prosedyre som beskrevet i kapittel 2.
    6. Velg den beste forutsetning for å oppnå den høyeste grad av forsterkning, tidligst syklus terskel (Ct) og beste repeterbarhet mellom 5 forhold. Bestemme den beste konsentrasjonen og det tilsvarende volum y ul i sonden.

4. Karakterisering av Quantitative Real-time PCR (QRT-PCR)

Merk: Etter utviklingen trinnet og fastsettelse av de beste forutsetninger til å bruke, karakterisering trinn i PCR inkluderer spesifisitet, deteksjonsgrense, linearitet rekkevidde og grensen for kvantifisering av QRT-PCR.

  1. Utarbeidelse og Titrering av Plasmid
    1. Bestille kommersielle plasmid inneholdende det relevante fragmentet av DNA-mål-gen valgt for PCR (i denne protokollen, nukleotidene 2081-2381 av EHV-2-glykoprotein-genet, se tabell 1).
      Merk: For å begrense risikoen for luftveis forurensning med syntetisk DNA, utføre serielle fortynninger av plasmider under en avtrekkshette i et eget rom og arbeide med fortynnet DNA under alle trinnene i utvikling og validering prosedyre.
    2. Re-suspen plasmidet med ultrarent vann for å fremstille en stamløsning på 50 ng / ml. Vortex og sentrifuger kort plasmidet stamløsning.
      Merk: Bestem den virkelige konsentrasjonen av plasmidet stock oppløsning etter re-suspensjon for å beregne kopiantallet av plasmidet.
    3. Tilsett 1 mL av plasmid til spektrofotometer. Les den optiske densitet (OD) ved 230 nm, 260 nm og 280 nm. Les av DNA konsentrasjon på spektrofotometer programvare (OD, 260 nm).
    4. Beregn kopiantallet av plasmidet ved å bruke Avogadros tall (N A) og formelen:
      Kopier nummer / mikroliter = (N A [plasmid i ng / ul]) / (plasmid lengde x 10 9 x gjennomsnittsvekt på et basepar) = (6022 x 10 23 x [plasmid]) / (plasmid lengde x 10 9 x 660)
  2. Teste spesifisitet (inclusivity og Eksklusivitet) av QRT-PCR
    1. Test inclusivity av PCR-system. Velg EHV-2 prøver positive DNA, som tidligere preget av sekvensering (etablert positiv status).
    2. Utfør forsterkning prosedyre som beskrevet i kapittel 2.
    3. AnalyserPCR data for hver prøve som beskrevet i kapittel 2.5. Sjekke nærværet av en eksponentiell kurve for alle prøver valgt i avsnitt 4.2.1 og bekrefte inclusivity av PCR.
    4. Test eksklusivitet av PCR-systemet ved hjelp av DNA-ekstrakter fra patogener med genetiske likheter til målet (i dette tilfellet, andre equid herpesvirus som EHV-1, EHV-4, EHV-3, EHV-5 og asinine herpesvirus-5 som beskrives i tabell 2) og andre patogener som er involvert i luftveissykdommer hos verten (i dette tilfellet, hestearteritt-virus, hesteinfluensa-virus, Coxiella burnetii, Rhodococcus equi, Streptococcus equi equi, Streptococcus equi zooepidemicus, Chlamydophila abortus og Klebsiella pneumoniae, se tabell 2).
    5. Utfør forsterkning prosedyre som beskrevet i kapittel 2.
    6. Analyser PCR data for hver prøve som beskrevet i kapittel 2.5. Sjekk for fraværet av en eksponentiell kurve for alle prøver valgt iavsnitt 4.2.4 for å bekrefte eksklusivitet av PCR.
  3. Deteksjonsgrense på QRT-PCR
    1. Tilsett 90 mL av ultrarent vann i 6 rør.
    2. Gjør 6 ti-gangers seriefortynninger av plasmidet for å målrette minking sonen (tap av Ct deteksjon). Overføre 10 ul fra plasmidet arbeider fortynning til røret med 90 ul av ultrarent vann. Vortex og sentrifuger kort røret. Gjenta trinn 4.3.2 inntil det siste røret i seriefortynning har fått plasmidet.
    3. Utføre forsterkningen av de 6 ti-gangers seriefortynninger av det plasmid som er beskrevet i avsnitt 2.
    4. Bestem minking sone: sonen mellom den siste fortynningen av plasmid presentere et positivt signal og den første fortynning uten deteksjon (se figur 2).
    5. For å starte 6 to-ganger seriefortynninger ved å velge den siste fortynningen av plasmid som gir et positivt signal (se avsnitt 4.3.4).
      Merk: Utfør tre uavhengige trials for å bestemme grensen for påvisning av QRT-PCR (LOD 95% PCR)
    6. Tilsett 25 mL av ultrarent vann i 6 rør.
    7. Gjør 6 to-gangers seriefortynninger av plasmidet. Overfør 25 mL fra plasmidet jobbe fortynning, som bestemmes i punkt 4.3.5, til røret med 25 ul av ultrarent vann. Vortex og sentrifuger kort røret. Gjenta trinn 4.3.7 inntil det siste røret i seriefortynning har fått plasmidet.
    8. Utfør forsterkning av de 6 to-fold serielle fortynninger av plasmid som beskrevet i kapittel 2. Gjenta trinn 4.3.7 til 4.3.8 to ganger, for å få 3 forsøk med 8 replikater (24 replikat) av hver av de seks ti-fold serielle fortynninger av plasmidet.
      Merk: deteksjonsgrense på QRT-PCR (LOD 95% PCR) er definert som den laveste antall DNA-kopier av volumenhet som er påvist i 95% av tilfellene.
    9. Beregn antall positive gjentak av 24 replikater for hvert nivå av plasmid konsensjon.
    10. Bestem LOD 95% PCR. LOD 95% PCR er det nivå som resulterer i påvisning av 23 positive replikater av 24 replikater.
  4. Linearitet Range og kvantifiseringsgrensen av QRT-PCR
    Merk: Utfør 4 uavhengige forsøk med 6 ti-gangers seriefortynninger av plasmidet for å sikre at den laveste konsentrasjonen som brukes i området svarer til LOD 95% PCR fastslått tidligere i 4.3.10.
    1. Tilsett 45 mL av ultrarent vann i 6 rør.
    2. Start 6 ti-gangers seriefortynninger med konsentrasjonen av plasmid arbeider fortynning svarende til 10 7 LOD 95% PCR.
    3. Gjør 6 ti-gangers seriefortynninger av plasmidet. Overføring 5 mL fra plasmidet arbeider fortynning (bestemt i pkt 4.4.2) til røret med 45 mL av ultrarent vann. Vortex og sentrifuger kort røret. Gjenta trinn 4.4.3 til siste røret i serie fortynning har fått plasmid.
    4. Forsterke de 6 ti-fold serielle fortynninger av plasmid som beskrevet i kapittel 2.
    5. Trace den lineære regresjonen y = ax + b med en for skråningen og b for skjæringspunktet (figur 3).
    6. Beregn utvidelseseffektiviteten (E) fra hellingen av en standardkurve (se 4.4.5) ved hjelp av ligningen:
      4.4.6 .
      Gjenta trinn 4.4.1 til 4.4.6 tre ganger.
      Merk: Amplification effektivitet representerer mengden av PCR-produkt økning etter hver syklus. En ideell reaksjon når effektivitet nær 100%. I praksis er E (%) var mellom 75% og 125%. Høyere E kan indikere amplifikasjon av uspesifikke produkter eller et pipetteringsfeil i seriefortynning. Nedre E kan også indikere en pipetteringsfeil i serie fortynning, dårlig grunning design eller ikke-optimale reaksjonsbetingelser.
    7. Beregn skjevhet (tabell3). Kontroller for hvert plasmid nivå at den absolutte forskyvningsverdi er mindre enn den kritiske forskyvningsverdi (0,25 log 10). Bestem middelverdien skjevhet og linearitet usikkerhet (U Lini) for hver plasmid nivå (tabell 3) for å evaluere resultatene av lineær regresjon for EHV-2 qPCR (figur 4). U Lini er linearitet usikkerhet bestemmes for hver jeg plasmid nivå beregnes fra standardavvik (SD'i) og mener bias. Bestemme den kombinerte linearitet usikkerheten (U LIN) av EHV-2 qPCR gitt ved formelen:
      4.4.7
      Merk: Aksept av skjevhet er spesifisert av laboratoriet (generelt absolutt skjevhet 0,25 log 10) og tilsvarer forskjellen mellom laveste og høyeste verdi på 0,5 log 10 (mengde målt i log 10 kopier nummer). U LIN
    8. Bestemme grensen for kvantifisering av QRT-PCR (LOQ PCR): LOQ PCR er den laveste konsentrasjon med en skjevhet 0,25 log 10 anvendes for linearitet område (tabell 3).

5. Karakterisering av hele Analytical Method (fra DNA Extraction til QRT-PCR resultater)

Merk: karakterisering av hele fremgangsmåten er validering av alle trinn som er nødvendige for å oppnå QRT-PCR-data (dvs, etter utvinning av DNA fra luft prøven (se avsnitt 1) til forsterkning og kvantifisering av målet (se avsnitt 2 )).

  1. Etablere samsvar mellom kopiene nummer i PCR-reaksjonen, og kopier nummer til stede i den biologiske prøven med formelen:
    5,1 til 1 .
    De 5,1 til 2 er volumet av prøven tilsatt til PCR-blanding for forsterkning, 5,1 til 4 er volumet av Buffer AVE benyttet for å eluere nukleinsyrer og 5,1 til 5 er volumet av den ekstraherte prøven.
  2. Test Sensitivitet og spesifisitet av hele Analytisk metode
    Merk: Bare kjente EHV-2 positive (eller negative) prøver brukes i denne delen.
    1. Test "følsomhet" av QRT-PCR-metoden ved å analysere positive prøver for målet (EHV-2).
      1. Velg EHV-2 prøver positive DNA, tidligere karakterisert (positiv status).
      2. Pakk den nukleinsyre som beskrevet i kapittel 1. Utfør en forsterkning prosedyre som beskrevet i kapittel 2.
      3. Bestem antall virkelige positive (positive prøversom er positive med dette RT-PCR) og antallet av falske negativer (kjent positive prøver som er negative med denne RT-PCR).
    2. Test "spesifisitet" av QRT-PCR-metoden ved å analysere negative prøver
      1. Velg EHV-2 prøver negative DNA (negativ status).
      2. Pakk den nukleinsyre som beskrevet i kapittel 1. Utfør en forsterkning prosedyre som beskrevet i kapittel 2.
      3. Bestem antall virkelige negativer (negative prøver som er kjent for å være negative med denne RT-PCR), og antallet av falske positiver (kjente negative prøver som er positive med dette RT-PCR).
    3. Beregn "diagnostisk sensitivitet» (Se) og "diagnostisk spesifisitet" (Sp) av hele metoden (tabell 4) som følger: Se = antall virkelige positive / (antall virkelige positive + falske negativer) og Sp = antall virkelige negativer / (antall virkelige negatives + falske positive) (se tabell 4).
    4. Beregn 95% konfidensintervall for sensitivitet og spesifisitet av hele metoden med formelen for Greiner og Gardner forhold 12,20:
      5.2.4
      der e er estimert feil, er θ Se (eller Sp) og n antall prøver analysert.
      Merk: For et lite antall prøver, bruker Schwartz tabellen etter AFNOR norm 12 til å beregne 95% konfidensintervall for sensitivitet og spesifisitet av hele metoden.
  3. Utarbeidelse av Negative ressurs materialet for karakterisering av hele Analytisk metode
    FORSIKTIG: For å bestemme grensene for påvisning og kvantifisering av hele metoden (LOD Metode og LOQ Method), legge til kjente konsentrasjoner av plasmid til de biologiske prøvene som er kjent for å være friav målet (EHV-2 i dette tilfelle). Disse prøvene, sammen med den kvantifiserte plasmid, utgjør positive standarder med å bestemme LOD-metoden og den LOQ metode.
    1. Bekrefte fraværet av målet (EHV-2) i de biologiske prøver som brukes for å konstruere positive standarder.
      1. Velg forskjellige kjente negative biologiske prøver.
      2. Pakk biologiske prøver som beskrevet i kapittel 1. Utfør forsterkning prosedyre som beskrevet i kapittel 2.
      3. Bekrefte fraværet av målet ved fraværet av PCR-signal i disse prøvene.
        Merk: Bruk samme negative ressursmateriell for alle trinn mellom 5,4 og 5,5.
    2. Pool de forskjellige negative prøvene for å oppnå 15 ml av negative grunnmateriale (et volum som er nødvendig for den fullstendige validering). Tilsett 135 ul av denne negative ressursmateriell i 100 rør. Holde rørene ved 4 ° C eller ved -80 ° C for lang lagring.
  4. Limit av Påvisning av Whole Analytisk metode
    1. Bestem reduksjon sone av hele fremgangsmåten.
      1. Tilsett 45 mL av ultrarent vann i 6 rør.
      2. Gjør 6 ti-gangers seriefortynninger av plasmidet. Overføring 5 mL fra plasmidet arbeider fortynning tilsvarende 10 7 LOD 95% PCR (som bestemt i § 4.3.10) til røret med 45 mL av ultrarent vann. Vortex og sentrifuger kort røret. Gjenta trinn 5.4.1.2 til siste røret i serie fortynning har mottatt plasmid.
      3. Transfer 5 ul av hver fortynning av plasmid til 2 rør med 135 ul av den negative materiale for å oppnå to replikater for de 6 positive standarder. Vortex og kort sentrifugering.
      4. Utfør ekstraksjon av 2 replikater for de 6 positive standarder som beskrevet i kapittel 1. Utfør forsterkning prosedyre som beskrevet i kapittel 2.
      5. Bestem minking sone: sone mellom siste konsentration av plasmid som gir et positivt signal og den første konsentrasjon som viser noe signal.
    2. Grense av Oppdagelsen av Method (LOD Method) Bestemmes av 2 uavhengige forsøk
      Merk: Utfør 2 uavhengige forsøk for å bestemme grensen for deteksjon av hele metoden (LOD Method).
      1. Start 6 to-ganger seriefortynninger med plasmidet arbeids fortynning som er 4 ganger så konsentrert som den siste konsentrasjonen av det plasmid som ga et positivt signal (se avsnitt 5.4.1.5).
      2. Tilsett 25 mL av ultrarent vann i 6 rør.
      3. 5 utføre to-gangers seriefortynninger av plasmidet. Overfør 25 mL fra plasmidet jobbe fortynning (som fastsatt i § 5.4.2.1) til røret med 25 ul av ultrarent vann. Vortex og sentrifuger kort røret. Gjenta trinn 5.4.2.3 til siste rør i seriefortynning har mottatt plasmid.
      4. Overføring 5 mL fra hver fortynning av plasmid til 4 rør med 135 ul av den negative materiale for å oppnå 4 replikater av de 5 positive standarder. Vortex og kort sentrifugere rørene.
      5. Utfør utvinning av de 4 replikater for de 5 positive standarder som beskrevet i kapittel 1. Utfør forsterkning prosedyre som beskrevet i kapittel 2.
      6. Gjenta trinn 5.4.2.1 til 5.4.2.5 gang for å få 8 replikater for hvert nivå av plasmid konsentrasjon.
      7. Tell antall positive gjentak av 8 replikater for hvert nivå av plasmid konsentrasjon.
      8. Bestem LOD Method. LOD metode er det siste nivået der åtte replikater av 8 replikater er positiv (som beskrevet i avsnitt 5.4.2.7).
  5. Linearitet Range og kvantifiseringsgrensen av hele Analytisk metode
    Merk: For å bestemme grensen for kvantifisering av hele metoden (LOQ Method), legge til kjente konsentrasjoner av plasmidet til biologiskprøver som er kjent for å være fri for målet (EHV-2 i dette tilfelle). Disse prøvene utgjør positive standarder for å bestemme LOQ Method.
    1. Tilsett 45 mL av ultrarent vann i 6 rør.
    2. Gjør 6 ti-gangers seriefortynninger av plasmidet. Overføring 5 mL fra plasmidet arbeider fortynning tilsvarende 10 7 LOD Method (som bestemt i § 5.4.2.8) til røret med 45 mL av ultrarent vann. Vortex og sentrifuger kort røret. Gjenta trinn 5.5.2 inntil det siste røret i seriefortynning har fått plasmidet.
    3. Transfer 5 ul av hver fortynning av plasmidet til 2 rør med 135 ul av negativ biologisk kilde materiale for å oppnå 2 replikater av de 6 positive standarder. Vortex og kort sentrifugering.
    4. Utfør ekstraksjon av 2 replikater for de 6 positive standarder som beskrevet i kapittel 1. Utfør forsterkning prosedyre som beskrevet i kapittel 2. Gjenta trinn 5.5.1til 5.5.4 tre ganger.
    5. Definer en Nøyaktighet profil for å evaluere og validere den kvantitative Utførelse av metode.
      1. Definer for akseptable grenser i hele fremgangsmåten for laboratoriet. I denne protokollen, aksept grensene definert som ± 0,75 Log 10 av LABéO Frank Duncombe.
      2. For en rettssak, spore en første lineær regresjon y = ax + b (a er stigningstallet og b er skjærings) med en gjengivelse av Ct-verdier som tilsvarer hver estimert verdi av standardkurven. Med denne første lineær regresjon, beregne den eksperimentelle verdi av kopitallet for replikater av Ct-verdier som benyttes for denne første standardkurve. Gjenta trinn 5.5.5.2 til den andre replikater av Ct-verdier for å oppnås en andre lineær regresjon og beregne den eksperimentelle verdi av kopiantallet for den andre replikater av Ct-verdier som benyttes for andre standardkurve.
      3. Beregn presisjon, riktighet og nøyaktighet grenser for hvert plasmid nivå i henhold til NF U47-600-2 12.
      4. Opprett et regneark for å samle inn informasjon for alle standardpunkter (5.5.5.4) og opprette en nøyaktighet profil med de tidligere definerte akseptable grenser i 5.5.5.1 og riktighet av dataene sammen med den nedre og øvre nøyaktighet grensene som beregnet i 5.5 .5.4 (figur 5).
    6. Bestem LOQ Metode: dette tilsvarer den laveste konsentrasjon av en standardkurve med riktighet 0,75 log 10 som benyttes for linearitet rekke beregnet på 5.5.5.5.
  6. Evaluering av repeterbarhet og reproduserbarhet
    Merk: Kontroller repeterbarhet og reproduserbarhet ved hjelp av forholdet mellom standardavviket og gjennomsnittet av gjentatte målinger (variasjonskoeffisient eller CV = standardavvik /mener).
    1. Vurdere Repeterbarhet av hele Metode ved en Analytiker:
      1. Velg 3 biologiske prøver med 3 forskjellige virusgenom laster (tidligere testet i PCR for eksempel).
      2. Pakk 8 replikater av de 3 prøvene som beskrevet i kapittel 1. Utfør forsterkning prosedyre som beskrevet i kapittel 2.
      3. Beregn middelverdien og standardavviket for Ct-verdien samlet for hver prøve.
      4. Beregn intra-assay CV ved hjelp av formelen CV = standardavvik / mener.
    2. Vurdere reproduserbarhet av hele Method av 3 Analytikere:
      1. Velg 3 biologiske prøver med 3 forskjellige viral genom laster (tidligere testet i PCR for eksempel)
      2. Pakk 2 replikater av de 3 prøvene valgt i 5.6.2.1 (som beskrevet i punkt 1). Utfør forsterkning prosedyre som beskrevet i kapittel 2. Gjenta trinn 5.6.2.2 av 2 uavhengige analytikere.
      3. Beregn gjennomsnitt og standardavvikav den Ct-verdien samlet for hver prøve.
      4. Beregn inter-assay CV ved hjelp av formelen CV = standardavvik / mener.

Representative Results

Den kvantitative RT-PCR-metoden, som beskrevet ovenfor, ble benyttet for å påvise og kvantifisere equid herpesvirus-2 i respiratoriske fluider. Figur 1 viser et skjematisk arbeidsdiagram for utvikling og validering av en kvantitativ RT-PCR-metoden i henhold til AFNOR standard NF U47-600. Spesifisiteten til primere og prober ble validert under den trinnvise utvikling av PCR. Bare EHV-2-stammer ble amplifisert i dette systemet. Deretter ytelsen til QRT-PCR måtte bli karakterisert.

For det første, å estimere LOD PCR, en seks ti-gangers seriell fortynning ble utført for å etablere minking sone (figur 2). I dette eksempel ble 6 ti-gangers seriefortynninger gjøres mellom 10 -5 ° C og 10 -10 (mellom 26.000 og 0,26 kopier / 2,5 pl prøve) for å estimere LOD PCR. Den minking sone ltallet mellom fortynninger av 10 -9 og 10 -10 (mellom 2,6 og 0,26 kopier / 2,5 mL prøve). For å bestemme LOD PCR-verdien i dette tilfellet, ble 6 to-gangers seriefortynninger av plasmidet gjort i denne minking sonen mellom 5,2 og 0,16 kopier / 2,5 ul prøve. LOD PCR-verdien var 2,6 kopier / 2,5 mL prøve.

For å bestemme lineariteten rekkevidde og LOQ PCR, ble LOD PCR-verdien som brukes til å starte utvalget av 6 ti-gangers seriefortynninger, mellom 2,6 (LOD PCR) og 260000 kopier / 2,5 ul prøve. Figur 3 illustrerer en lineær regresjon for EHV2 QRT-PCR fra en rettssak. Forestillinger av lineær regresjon (figur 4) er validert i fire eksemplarer ved hjelp av de beregningene som er beskrevet i tabell 3. Beregningene er utført for å definere linearitet området i henhold til kriteriene absolutt Bias jeg value ≤0.25 log 10, uansett nivå i av plasmid belastning. I dette tilfellet serien linearitet lå mellom 2,6 og 260.000 kopier / 2,5 mL prøve. LOQ PCR er den laveste konsentrasjonen i linearitet området (dvs. 2,6 kopier / 2,5 ul prøve i dette tilfelle). U LIN ble bestemt til å være 0,12 log 10 i området 2.6-260,000 kopier / 2,5 ul av DNA.

Etter utvikling (figur 1, blå) og karakterisering av QRT-PCR (figur 1, gul), AFNOR NF U47-600 norm anbefaler karakterisering av hele analysemetoden fra DNA-ekstraksjon til QRT-PCR (figur 1, appelsin). Den diagnostiske sensitivitet og spesifisitet ble beregnet som beskrevet i tabell 4. De kvantitative forestillinger av QRT-PCR hele analysemetode ble evaluert og validert med en nøyaktighet profil (

Denne protokollen, som bruker state-of-the-art molekylær teknologi, tillot oss å oppdage og kvantifisere EHV-2 virale genomet belastning i 172 nasale penselprøver hentet fra hester med luftveissykdommer og / eller klinisk mistanke om infeksjon. Forekomsten av EHV-2 fra felt (biologiske) prøver var 50% (86/172) i denne populasjonen. De kvantitative analyser viste at virusgenom masse EHV-2 var signifikant høyere hos unge hester og partisjonere av virale genomet belastninger redusert med alderen (figur 6). I denne studien ble det høyeste EHV-2 virale genomet belastning (1,9 x 10 11 kopier / ml) påvist hos føll (figur 6).

Figur 1
Figur 1: Arbeidsflyt diagram for utvikling (blå), karakteriseringen av den kvantitative RT-PCR(gul) og karakteriseringen av hele analysemetoden fra DNA-ekstraksjon til QRT-PCR (oransje) i henhold til AFNOR standard NF U47-600-2. Den arbeidsflyten diagrammet fortsetter de ulike trinnene for utvikling, karakteriseringen av den kvantitative RT -PCR og karakteriseringen av hele analysemetoden fra DNA-ekstraksjon til QRT-PCR. For hvert trinn, arbeidsflyten diagrammet viser antall nødvendige løyper, fortynninger som skal utføre og antallet nødvendige analytikere. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Fastsettelse av tiltakssonen med representative resultater fra Real-Time PCR kurver oppnådd med 6 ti-fold serielle fortynninger av plasmid. For å estimere minking sonen, 6 ti-fold seriefortynninger er gjort mellom 10 -5 (26.000 kopier / 2,5 mL prøve) og 10 -10 (0,26 kopier / 2,5 mL prøve). Den minking Sonen ligger mellom fortynninger av 10 -9 (2,6 kopier / 2,5 mL prøve) og 10 -10 (0,26 kopier / 2,5 mL prøve). I dette tilfellet ble 6 to-fold serielle fortynninger av plasmid laget i denne minking sonen for å bestemme LOD 95% PCR, mellom 5,2 og 0,16 kopier / 2,5 mL prøve. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Fig. 3: Lineær regresjon for EHV2 QRT-PCR Lineariteten kvantitativ testing er evnen til å generere resultater som er proporsjonal med konsentrasjonen av tilstedeværende target i et spesifikt område. Dette kan modelleres vedlineær regresjon (y = ax + b) mellom instrumentell respons (Cycle terskel eller Ct) og logaritmen av mengden av målet (antall mål kopier / 2,5 mL prøve). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet .

Figur 4
Figur 4:. Utførelse av lineær regresjon av EHV-2 qPCR Mean skjevhet representerer gjennomsnittlig forskjell mellom den målte plasmid mengde ( fig4-1 ) Og den teoretiske plasmid mengde (x 'i) for hvert plasmid nivå. Loddrette linjer representerer linearitet usikkerheten (U Lini) gitt ved formelen
fig4-2
hvor SD'i er standardavviket o f målt plasmid kvantitet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5:. Nøyaktighet profiler basert på validerings resultatene av EHV-2 QRT-PCR-metoden Den grønne linjen (sirkler) representerer sannferdighet av dataene (systematisk feil, eller bias). Aksepten grensene er definert på ± 0,75 log 10 av laboratoriet (stiplede linjer). De nedre og øvre nøyaktighet grensene ble bestemt for hvert plasmid belastningsnivå fra bety skjevhet ± to ganger standardavviket av pålitelighetsdata (røde linjer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

1 "> Figur 6
Figur 6:. Kvantifisering av virale genom masse EHV-2 i henhold til alder Det virale genomet lastfordeling av EHV-2 detekteres i nesepenselprøver er vist for de forskjellige aldersgrupper. De horisontale linjer representerer medianverdiene innenfor standardavviket (m = måneder). * Signifikant forskjellig fra ANOVA med Newman-Keuls post-hoc test (p <0,05). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Target genet Grunning, probe og plasmide-sekvenser (5'-3 ') nukleotid-posisjon Produkt størrelse (nukleotider) Referanser
EHV2 gB
(HQ247755.1) 		Forward: GTGGCCAGCGGGGTGTTC 2113-2130 78 95 ° C 5 min 11
Omvendt: CCCCCAAAGGGATTYTTGAA 2189-2170 95 ° C 15 sek 45 sykluser
Probe: FAM-CCCTCTTTGGGAGCATAGTCTCGGGG-MGB 2132-2157 60 ° C 1 min
plasmid:
ACCTGGGCACCATAGGCAAGGTGGTGGTCA
ATGTGGCCAGCGGGGTGTTCTCCCTCTTTG
GGAGCATAGTCTCGGGGGTGATAAGCTTTTT
CAAAAATCCCTTTGGGGGCATGCTGCTCATA
GTCCTCATCATAGCCGGGGTAGTGGTGGTG
TACCTGTTTATGACCAGGTCCAGGAGCATAT
ACTCTGCCCCCATTAGAATGCTCTACCCCGG
GGTGGAGAGGGCGGCCCAGGAGCCGGGCG
CGCACCCGGTGTCAGAAGACCAAATCAGGA
ACATCCTGATGGGAATGCACCAATTTCAG 		2081-2381

Tabell 1:. Sekvenser av primere, prober og positive syntetiske DNA-kontroller som brukes i denne protokollen Sekvensen av plasmid (positiv syntetisk DNA) tilsvarer nukleotid posisjonene 2081 til 2381 av sekvens EHV2gB (HQ247755.1). Utformingen av primere og prober som brukes i denne protokoll ble erholdt ved hjelp av spesiell programvare.

patogener Referanse (opprinnelse) Antall stammer RESULTATER
EHV-2
EHV-2 VR701 (ATCC) positiv
20 prøver (FDL samling)
EHV-5 KD05 (GERC) 20 Negativ
20 prøver (FDL samling)
EHV-3 VR352 (ATCC) 2 Negativ
T934 WSV (GERC)
EHV-1 Kentucky belastning Ky A (ATCC) 3 Negativ
2 prøver (FDL samling)
EHV-4 VR2230 (ATCC) 1 Negativ
Asinine herpesvirus AHV5 FDL Collection 1 Negativ
equineinfluensa Virus A / hest / Jouars / 4/2006 (H3N8) 1 Negativ
(Accession Number JX091752)
Equine arteritt Virus VR796 (ATCC) 2 Negativ
Rhodococcus equi FDL Collection 1 Negativ
Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus FDL Collection 1 Negativ
Streptococcus equi subsp. equi FDL Collection 1 Negativ
Coxiella burnetii ADI-142-100 (Adiagene) 1 Negativ
Chlamydophila abortus ADI-211-50 (Adiagene) 1 Negativ
Klebsiella pneumoniae FDL Collection 1 Negativ

Tabell 2: Analytisk spesifisitet QRT-PCR for EHV-2.

Tabell 3
Tabell 3: Beregning av skjevhet og linearitet usikkerhet (tilpasset fra NF U47-600-2 12). For hvert forsøk, forestillinger av lineær regresjon (y = ax + b) er godkjent for bruk av bordet hvor y er syklusen terskelen oppnådd; a er stigningstallet oppnås;. X er plasmidet nivå og b er skjærings i er plasmidet nivå (i varierer fra 1 til k nivåer), k er antallet av plasmid nivåer som brukes (for eksempel k = 6 i tsitt bord), j er prøve (j varierer fra 1 til I-studier), I er antall forsøk, som ligger mellom 3 og 6 forsøk (som I = 4 i denne tabellen) x i er den beregnede plasmidet kvantum for hver. jeg plasmid nivå. x 'jeg er den teoretiske plasmid størrelse oppnådd med likningen x' i = log 10 (x i) for hvert jeg plasmid nivå. Under hver j rettssaken, syklusen terskelen oppnådd for hver jeg plasmid nivå beregnes ved lineær regresjon y i, j = a j x i, j + b j. table3-1 er den målte plasmid kvantum under rettssaken j. Bias jeg sub> er forskjellen observert mellom den målte plasmid mengde og den teoretiske plasmid kvantum for hvert forsøk, og hvert plasmid nivå. table3-2 er middelverdien av table3-3 etter hvert i plasmid nivå; SD 'i er standardavviket til målt mengde table3-4 for hvert jeg plasmid nivå; Mean bias er gjennomsnittet av Bias i; U Lini er linearitet usikkerhet bestemmes for hver jeg plasmid nivå beregnet fra SD'i og mener bias. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

En "fo: keep-together.within-page =" 1 "fo: keep-med-next.within-side =" always "> Ekte status prøve positiv Negativ Resultater oppnådd med hele metoden positiv RP (virkelig positiv) FP (falsk positiv) Negativ FN (falsk negativ) RN (virkelige negative) Total RP + FN FP + RN SE = RP / (RP + FN) Sp = RN / (RN + FP)

Tabell 4:. Beregning av diagnostisk sensitivitet (Se) og spesifisitet (Sp) av hele metode A Schwartz tabell ble anvendt for å beregne confidence intervall på 95% av sensitivitet og spesifisitet av hele fremgangsmåten som er beskrevet i NF U47-600-2.

Discussion

Siden 2000-tallet, har real-time PCR vært å erstatte gullstandardteknikker (cellekultur og bakterier kultur metoder) i et økende antall laboratorier. Gjennomføring av den teknikk som er forholdsvis enkelt. Men validering av laboratoriemetoder er viktig for molekylær deteksjon og kvantifisering av patogener for å sikre nøyaktige, repeterbare og pålitelige data.

Etter ekstraksjonstrinnet er den primære kilde til tap av biologisk materiale, kan det betraktes som hovedkilden til feil for mengde mellom en protokoll og en annen. Som slike, etablering av en standardkurve av DNA-plasmid under QRT-PCR, hovedsakelig rapportert i litteraturen, viser det virale genomet belastning, men tar ikke hensyn til ekstraksjonstrinnet.

Beskrivelse av en de novo strategi for en hel fremgangsmåte valideringsprosessen i AFNOR norm NF U47-600-2 representerer et betydelig fremskritt på dette området. Som illustrert iDette papir for EHV-2 hos hester, eller ved andre i bier 21, nødvendiggjør dette klart skille mellom fremkallingstrinnet og valideringstrinnet med karakterisering av PCR og karakterisering av hele fremgangsmåten. En begrensning i dette interessant tilnærming er at enhver endring i protokollen vil resultere i plikten til å forlenge hele prosessen som kan være svært kostbart. Denne begrensningen er også understreket ved det faktum at rammen av kvantifisering avhengig av kilden som den virus ekstraheres (f.eks, respiratoriske væske, organer, blod eller urin). Faktisk, presenterer hver matrise forskjellige spesifisiteter i sine fysisk-kjemi egenskaper, og det er viktig å definere uavhengig ved hver forskjellig matrise brukes for viral deteksjon og kvantifisering av QRT-PCR. Således kan det virale genomet belastningen av hver biologisk prøve kvantifiseres mer presist fra ekstraksjonen. Karakterisering tar også hensyn til termo model og ved bruk av en tidligere godt karakterisert metode (f.eks EHV-2 qPCR metode som er beskrevet i denne artikkelen) nødvendiggjør en ny type maskin i moder laboratorium eller et annet laboratorium, må man bekrefte ytelsen til det instrument. Bekreftelsen av ytelsen til en qPCR-analyse er en forutsetning for alle tester bringe inn i et laboratorium. Dette oppnås normalt ved å analysere en referanseprøve med kjente egenskaper. En slik sjekk er en forutsetning og anses obligatorisk som anmodet av NF 47-600-1 AFNOR norm for å validere resultatene av qPCR (LOD, LOQ effektivitet) og robustheten i hele metoden (LOD, LOQ). Ikke bare under utvikling og karakterisering trinn, men også når det brukes i forskning eller for diagnostiske formål, kan risikofaktorer identifiseres og godt kontrollert for å sikre standardisering av protokollen. Av spesiell bekymring er tilstrekkelig opplæring av personalet, høyt kvalifisert personell, kvalitetskontroll av forbruksvarerbrukt og deres lagring, kontroll av de umiddelbare miljøforhold og bevissthet om metrologiske forhold som kan påvirke resultatene av vitenskapelige instrumenter som er involvert i analysen. Bruk av referanseprøver for inter-laboratorium sammenligninger kan også bidra til å kontrollere usikkerhet. På denne måte kan sammenligning av data mellom laboratorier lettes. Faktisk, inter-laboratorietegnethetsprøvinger er nødvendig for å evaluere og bekrefter reproduserbarheten av fremgangsmåten.

Viral genom last resultater som uttrykkes i internasjonale enheter (IE) analysert biologisk matrise (IE: kopier / ml for væsker eller kopier / g for vev) er lettere å bruke for å sammenligne resultater mellom ulike laboratorier. Alle resultatene ovenfor LOQ er uttrykt som kopier / ml og et resultat mellom LOD og LOQ er tatt som et ikke-kvantifiserbare positivt resultat. Presentere quantificational data fra genomet på denne måte i overensstemmelse mer presist å forarbeides analyser (amplifikasjon av genomet). Faktisk, i cellekultur eksperimenter, ekspresjon av virusmengde ved TCID 50 (median vevskultur infeksiøs dose) er avhengig av typen av celler og virusstammer. Hver stamme linjen besitter sine unike infeksjon kinetikk og noen virus som EHV-2 kan ta flere dager før den første cytopatogen effekten er åpenbar.

I konklusjonen, bør denne nye metoden for karakterisering av QRT-PCR lette harmonisering av data presentasjon og tolkning mellom laboratorier. Dette vil være svært nyttig for eventuelle nye anvendelser av QRT-PCR i fremtiden som etablering av en cut-off verdi for deklarasjon av sykdomsstatus i stedet for bare nærvær eller fravær av organismen.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AB-1900 natural color ABgene 96 well plate  Dutsher 16924
Adhesive film qPCR Absolute  Dutsher 16629 Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run
0.5 ml microtubes, skirted, caps Dutsher 039258
Ethanol 98% Sodipro SAF322941000
Primers Eurofins Custom order
Probe Life Technologies Custom order
Plasmid Eurofins Custom order
QIAamp  RNA viral Mini Kit
(containing: QIAamp Mini column, AVL  buffer,  AW1 buffer, AW2 buffer, AVE buffer, collection tubes) 		 Qiagen 52906 AVL buffer: pre-warm 5 min at 72 °C
Sequencing by Sanger method Eurofins Custom order
Taqman Universal PCR Master Mix Life Technologies 4364340
Tris-EDTA buffer solution Santa Cruz sc-296653A
NanoDrop 2000c Spectrophotometer Thermoscientific ND-2000C
StepOnePlus Real-Time PCR systems Life Technologies 4376600 pre-warm 15 min 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brault, S. A., et al. The immune response of foals to natural infection with equid herpesvirus-2 and its association with febrile illness. Vet.Immunol.Immunopathol. 137 (1-2), 136-141 (2010).
  2. Fortier, G., Van Erck, E., Pronost, S., Lekeux, P., Thiry, E. Equine gammaherpesviruses: pathogenesis, epidemiology and diagnosis. Vet.J. 186 (2), 148-156 (2010).
  3. Hue, E. S., et al. Detection and quantitation of equid gammaherpesviruses (EHV-2, EHV-5) in nasal swabs using an accredited standardised quantitative PCR method. J Virol.Methods. 198 (1), 18-25 (2014).
  4. Diallo, I. S., et al. Multiplex real-time PCR for the detection and differentiation of equid herpesvirus 1 (EHV-1) and equid herpesvirus 4 (EHV-4). Vet.Microbiol. 4 (1-3), 93-103 (2007).
  5. Williams, K. J., et al. Equine multinodular pulmonary fibrosis: a newly recognized herpesvirus-associated fibrotic lung disease. Vet.Pathol. 44 (6), 849-862 (2007).
  6. Mullis, K., et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol. 51 (1), 263-273 (1986).
  7. EPA Office of Water (4607). EPA-815-B-04-001. Quality Assurance/Quality Control Guidance for Laboratories Performing PCR Analyses on Environmental Samples. , (2004).
  8. Telford, E. A., et al. Equine herpesviruses 2 and 5 are gamma-herpesviruses. Virology. 195 (2), 492-499 (1993).
  9. Fortier, G., et al. Identification of equid herpesvirus-5 in respiratory liquids: A retrospective study of 785 samples taken in 2006-2007. Vet.J. 182 (2), 346-348 (2009).
  10. Brault, S. A., Bird, B. H., Balasuriya, U. B., MacLachlan, N. J. Genetic heterogeneity and variation in viral load during equid herpesvirus-2 infection of foals. Vet.Microbiol. 147 (3-4), 253-261 (2011).
  11. Association Francaise de Normalisation. NFU 47-600-1. Animal health analysis methods-PCR-Part 1: Requirements and recommandations for the implementation of veterinary PCR. , (2015).
  12. Association Francaise de Normalisation. NFU 47-600-2. Animal health analysis methods-PCR-Part 2: Requirements and recommendations for the development and the validation of veterinary PCR. , (2015).
  13. ISO. EN ISO-CEI 17025. General requirements for the competence of testing and calibration laboratories. , (2005).
  14. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2010. Chapter1.1.1.4/ 5. Principles and Methods of Validation of Diagnostic Assay for Infectious Diseases. , This thoroughly revised chapter replaces Chapter 1.1.4 Principles of validation of diagnostic assays for infectious diseases and Chapter 1.1.5 Validation and quality control of polymerase chain reaction methods used for the diagnosis of infectious diseases from the sixth edition of the OIE Terrestrial Manual (2009).
  15. Apaza, S., et al. Detection and genogrouping of noroviruses from children's stools by Taqman One-step RT-PCR. J Vis.Exp. (65), e3232 (2012).
  16. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis.Exp. (63), e3998 (2012).
  17. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol.Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  18. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  19. NCBI. BLAST Homepage and Selected Search Pages. Introducing the BLAST homepage and form elements/functions of selected search pages. , (2015).
  20. Greiner, M., Gardner, I. A. Application of diagnostic tests in veterinary epidemiologic studies. Prev.Vet Med. 45 (1-2), 43-59 (2000).
  21. Blanchard, P., Regnault, J., Schurr, F., Dubois, E., Ribiere, M. Intra-laboratory validation of chronic bee paralysis virus quantitation using an accredited standardised real-time quantitative RT-PCR method. J Virol.Methods. 180 (1-2), 26-31 (2012).

Tags

Immunologi Kvantitativ RT-PCR PCR norm titrering deteksjonsgrenser grenser for kvantifisering linearitet følsomhet spesifisitet validering equid herpesvirus-2 heste
Utvikling og validering av en kvantitativ PCR metode for Equid herpesvirus-2 Diagnostics i respirasjonsorganer Fluids
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hue, E. S., Fortier, C. I., Laurent, … More

Hue, E. S., Fortier, C. I., Laurent, A. M., Quesnelle, Y. F., Fortier, G. D., Legrand, L. J., Pronost, S. L. Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids. J. Vis. Exp. (109), e53672, doi:10.3791/53672 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter