Summary
初期の脳の腫瘍微小環境を入力する免疫細胞の数および活性化状態に対する時間依存の定量的データをもたらす神経膠腫浸潤末梢血単核細胞の単離およびフローサイトメトリー分析のための簡単な方法は、ここに提示しました。
Abstract
私たちの研究室では最近、癌細胞はβガラクトシド結合レクチンガレクチンの発現が欠損しレンダリングされた場合に、ナチュラルキラー（NK）細胞はすぐに頭蓋内移植後に同所移植したマウスGL26およびラットCNS-1悪性神経膠腫を根絶することができることを実証しました-1（GAL-1）。より最近の研究は現在、GR-1 + / CD11bの+骨髄系細胞の集団がこの効果に重要であることを示しています。優れたNK細胞と骨髄細胞は、我々は、神経膠腫浸潤末梢血単核細胞（PBMC）の単離および分析のための総合的なプロトコルを開発したGAL-1欠損腫瘍拒絶を付与するために協力するメカニズムを理解するために。この方法は、shRNAのノックダウンを経由してGAL-1欠損レンダリングされたものとGAL-1を発現するGL26の神経膠腫の腫瘍微小環境へのPBMCの浸潤を比較することによって、ここに示されています。プロトコルはどのように文化の説明から始まり、GL26のCEを準備同系のC57BL / 6Jマウスの脳への接種のためにLLS。その後、初期の脳の腫瘍微小環境から神経膠腫浸潤PBMCの単離およびフローサイトメトリー解析に必要な手順について説明します。この方法は、脳への免疫浸潤に関する時間データが要求されるインビボでの実験計画の数に適応可能です。神経膠腫浸潤PBMCを、すぐに独立した実験を通して腫瘍一致した時点から観察同様の細胞数と24時間後に腫瘍生着などの頭蓋内腫瘍から単離することができるような方法は、高感度で再現性の高いです。単一の実験者は、分析されるサンプルの数に応じておよそ4-6時間で神経膠腫浸潤PBMCのフローサイトメトリー分析するために脳から採取方法を実行することができます。代替の神経膠腫モデルおよび/または細胞特異的な検出抗体は、他のいくつかのIMMUNの浸潤を評価するために実験者の裁量で使用することができます手順全体への変更を必要とせずに、目的の電子細胞タイプ。
Introduction
神経膠腫は、中枢神経系（CNS）内に形質転換されたグリアから生じる神経上皮脳腫瘍のクラスです。すべての神経膠腫の、世界保健機関（WHO）グレードIVの神経膠腫、またはグリア芽腫（GBM）は、1最も一般的で致命的です。 GBMは、現在の標準のケアテモゾロミド2と放射線プラス付随およびアジュバント化学療法に続いて可能な限り腫瘍切除で構成さに非常に難治性です。これらの致命的な癌は5年3後の疾患の生存患者のわずか5％の初期診断時からの生存の唯一の15〜18ヶ月の悲惨な予後を運びます。
血液脳関門（BBB）の存在は、脳内の4細胞（APC）のプロフェッショナル抗原提示の欠如、および真正なリンパ管構造の以前に同定されていない存在は、免疫特権としてGBMの概念をもたらしました。しかし、今、多くの研究笙これらの脳癌は確かに、単球、マクロファージ、および骨髄由来抑制細胞（のMDSC）5を含む 、原点に主に骨髄ある末梢の免疫細胞の動員を生み出すことワットGBMはまた、6,7-プロ腫瘍形成になるための脳常駐ミクログリアの活性に影響を与えます。そのようなCD8 + T細胞8とCD56 +ナチュラルキラー細胞9などのリンパ系細胞はまた、腫瘍微小環境内に存在しているが、はるかに少ない数で、思ったことは、（、腫瘍関連マクロファージに神経膠腫由来因子によって扇動免疫抑制機能のためであるとするTAM）10。 CD4 + T細胞は、GBMにも存在するが、この集団の多くはまた、CD25とのFoxP3、免疫調節性T（TのREG）細胞11のメーカーを表しています。 GBMの全体的な免疫抑制状態は、免疫学的脱出し、腫瘍の進行12のプロモーションで最高潮に達します。
13-19を開発するために、脳腫瘍immunosuppressonのメカニズムを克服するために取り組んできました。この作品の集大成が今新たに診断されたGBM（：NCT01811992 ClinicalTrials.gov識別子）を持つ患者のために組み合わせた細胞傷害性および免疫刺激治療を評価するために設計された臨床試験につながっています。
私たちの最新作は、マウスGL26およびラットCNS-1 GBM細胞は、βガラクトシド結合レクチンガレクチン-1（GAL-1）20を大量に生産することにより、抗腫瘍NK細胞免疫監視をブロックすることを示しています。これは、shRNAを媒介遺伝子ノックダウンを用いた神経膠腫細胞におけるGAL-1の発現を抑制することにより実証された。 インビトロ experimenTSは、GAL-1欠損神経膠腫細胞は、培養中に正常に増殖していることを示した、まだ同系C57BL / 6JまたはRAG1に頭蓋内移植後すぐに急速な拒絶を受けた- / -マウスでは、このように、このフォームで、TまたはB細胞の独立性を確立します腫瘍拒絶。抗アシアロGM 1抗血清またはモノクローナルNK1.1抗体とNK細胞の免疫枯渇は、GAL-1欠損神経膠腫の拒絶反応におけるNK細胞の役割を確立し、頭蓋内GAL-1欠損神経膠腫の成長の完全な回復につながりました。現在、GR-1 + / CD11bのの免疫枯渇+骨髄細胞は、このように、NK媒介ギャルの補助で骨髄細胞のための不可欠な補助的な役割を明らかにし、NK細胞の存在にもかかわらず、GAL-1欠損神経膠腫の拒絶反応を予防するのに十分であることを示しています-1欠損腫瘍溶解（未発表データ）。この予想外の結果は、末梢血単核細胞（PBMC）の単離と解析のための包括的なプロトコルを開発するために私たちをリードしてきました私たちはより良いGAL-1欠損神経膠腫の拒絶反応を述免疫浸潤イベントを特徴づけることができるようにすぐに頭蓋内移植後の脳の腫瘍の微小環境を浸透させます。
この方法は、GL26-Citを呼ばれる構成的に発現mCitrine蛍光タンパク質は、蛍光顕微鏡21による直接の腫瘍細胞の可視化を可能にするマウスGL26神経膠腫細胞を用いて、ここに示されています。これらの細胞は、定位的に同系のC57BL / 6Jマウスの脳に移植され、前のマウス安楽死に24、48、または72時間増殖させます。神経膠腫浸潤PBMCを、次に抗-CD45を用いて単離し、免疫標識され、-GR-1、-CD11bおよびグランザイムBの細胞内免疫標識と一緒-NK1.1細胞表面抗体（GZMB）。抗体のこの特定の組み合わせは、腫瘍浸潤のGr-1 + / +骨髄系細胞のCD11bおよびNK1.1 + NK細胞、細胞型、我々は、Bを持っているの同定を可能にしますEENは、GAL-1欠損腫瘍拒絶に関与します。 GAL-1欠損GL26-のCIT神経膠腫の免疫浸潤プロファイルは、GL26-CIT-gal1iとしてここでいう、その後非が含まれているGAL-1 GL26-CIT-NTと呼ばれるの正常なレベルで発現する神経膠腫のものと比較します対照shRNAのヘアピンをターゲットに。プロトコルは、同所同系のC57BL / 6Jマウスの線条体にこれらの細胞を生着する方法についての説明が続いて試験管内でどのように文化GL26-Citの神経膠腫細胞上の説明で始まり。その後、フローサイトメトリー分析のための神経膠腫浸潤PBMCの単離及び免疫標識に必要な手順を列挙するために進みます。プロトコルは、標準的なデータ分析とグラフ表示の説明を終わります。
デモでは、両方のGr-1 + / CD11bの+骨髄系細胞およびNK1.1 + NK細胞は優先的に48内GAL-1欠損脳の腫瘍微小環境内に蓄積することが明らかになりました腫瘍移植の時間、これらの腫瘍は急速に完全な腫瘍溶解約1週間後の腫瘍生着20を受ける理由を説明するのに役立ちます結果。この方法は、脳への免疫浸潤に関する時間データが要求されるインビボでの異なる実験計画の数に容易に適応可能です。単一の実験者は、分析すべき試料の数に応じて、約4-6時間で神経膠腫浸潤PBMCのフローサイトメトリー分析するために脳の収穫からプロトコルを実行することができます。この方法はまた、特に腫瘍微小環境によって誘導される免疫抑制表現型を識別するよう脳に浸潤するものと比較するために、腫瘍担持マウスでのPBMCの循環プロフィールを特徴づけることを目的とした実験と組み合わせることができます。これと同じような方法の適用は、脳の腫瘍微小環境への末梢免疫細胞の輸送に関与する因子の理解を容易にするはずです。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注意：実験を実行する前に全体のプロトコルを確認してください。動物の使用と福祉の適切な制度委員会から脊椎動物の使用の承認に進む前に取得する必要があります。
頭蓋内生着のための腫瘍細胞の調製
- クラスII生物学的安全キャビネットでの作業、10％滅菌濾過し、熱不活性化ウシ胎児血清（FBSをダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）の500ミリリットルボトルを補充することによってGL26-CIT-NT / gal1i細胞培養培地を調製することにより開始）、2mMのL-グルタミン、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、mCitrine発現ベクターの選択のための/ mlのG418硫酸塩（600μgの）および非選択のためのピューロマイシン二塩酸塩（3μgの/ mlの）を標的またはGAL-1特異的shRNA。
- 文化GL26-CIT-NTおよび/ またはGL26-CIT-gal1i細胞（ 図1Aおよび1B 2インチ
- 手術の日に、10ミリリットルの血清学的ピペットとピペット銃を使用して、神経膠腫細胞からの細胞培養培地を除去し、廃棄物のビーカーにメディアを捨てます。
- フラスコ上部側を下にして反転し、10ミリリットルの血清学的ピペットを用いてフラスコの上面にDPBSの10ミリリットルを追加します。ゆっくりDPBSで細胞をカバーするために、フラスコを反転し、フラスコを上下に傾けて取り外し、廃棄物のビーカーにDPBSを捨てます。
- 追加各T75組織培養フラスコにEDTAをDPBSで非哺乳動物トリプシンの代替（詳細については材料のリストを参照）3-4 mlの2-5分のために戻って、組織培養キャビネットに配置します。明視野顕微鏡を用いて、細胞の全てが進む前に底面から外れていることを確認してください。
- furthe禁止DPBSを6 mlのトリプシンの代替を希釈することにより、R酵素活性。アップピペットとフラスコの底表面を洗浄して、機械的に任意の細胞凝集体を解離させるために10ミリリットルの血清学的ピペットを使用してダウン。細胞を吸引し、それぞれラベルされた15mlの遠心チューブに配置します。 4℃（ 図1C）で5分間550×gで（最大RCF）で細胞をスピンダウン。
- 上清を除去し、優しく未添加したDMEM 1mlで細胞を懸濁します。単一細胞懸濁液を達成するために、P-1000マイクロピペットで十分に上下細胞をピペットすることを確認します。
- 腫瘍細胞懸濁液の2μlを加え、続いて0.6ミリリットルの円錐形のポリプロピレンマイクロチューブに未添加したDMEMの18μLを配置することによって、1.6で生成された得られた細胞懸濁液の10倍希釈してください。アップピペット、徹底的に細胞を均質化するために、P-10マイクロピペットを用いてダウン。
- 10μLを追加＆＃160;独立した0.6ミリリットルの円錐形のポリプロピレンマイクロチューブに1.7で生成された1時10分腫瘍細胞希釈の後、チューブにトリパンブルー染色の10μlを添加します。徹底的P-10マイクロピペットで混合し、気泡（ 図1D）を導入しないように注意して、血球計数器の上に置かれたガラスカバースリップの下で、得られた腫瘍細胞/トリパンブルー溶液10μlを加えます。
- 指定された血球計数器に関連する特定のプロトコルに従って、10倍の対物レンズを用いて明視野顕微鏡で細胞をカウントします。元の1ミリリットルのアリコート中の正確な細胞推定のための細胞の調製中に行われた元の腫瘍細胞懸濁液の20倍希釈を考慮にしてください。細胞の総数を計算するには、次の式を使用します。全細胞/ mlの= [（（Σcellsが正方形ごとにカウント）/カウント正方形の＃）が20（すなわち、希釈率）は10,000細胞/ mlのX X]を。
- Dの後所与の実験で使用される各細胞株のための細胞の総数をetermining、4℃で5分間、550×gで（最大RCF）でそれらをスピンダウン。上清（s）を除去し、以下の式に従って、各細胞株について1μLあたり3×10 4細胞の標的濃度を達成するために、未補充したDMEMの適切な量で細胞を再懸濁し（細胞の総数/3万）。
- 氷の上でそれぞれラベル0.6ミリリットルの円錐ポリプロピレンチューブと所定の位置に、各細胞株（ 図1E）の同等のボリュームを配置します。別々のT75Sが以前に播種されていない場合は、各細胞株の伝播が継続するために、いくつかの細胞を保存してください。
C57BL / 6Jマウスの線条体に神経膠腫細胞の定位生着2.手順
- 次のように手術前に手術用の麻酔、鎮痛、麻酔反転の作業溶液を調製します：
- ケタミン/デクスメデトミジンsのurgical麻酔：無菌の0.9％NaCl注射の10ミリリットルバイアルから1.4ミリリットルを除去し、生成する塩酸ケタミンの100 mg / mlのストック溶液とデクスメデトミジン塩酸塩の0.5 mg / mlのストック溶液を800μlの600μlのと交換してください塩酸ケタミン（6 mg / mlで）およびデクスメデトミジン塩酸塩（0.04 mg / mlで）の混合作業溶液。
- ブプレノルフィンの鎮痛の場合：無菌の0.9％NaCl注射の10ミリリットルバイアルから1ミリリットルを削除し、0.03 mg / mlのワーキング溶液を得、単一の0.3 mg / mlのストック・塩酸ブプレノルフィンアンプルの全体1ミリリットルのボリュームと交換してください。
- アチパメゾール手術用麻酔反転の場合：無菌の0.9％NaCl注射の10ミリリットルバイアルから1ミリリットルを削除し、0.5 mg / mlのワーキング溶液を得アチパメゾール塩酸塩の5 mg / mlのストック溶液1mlと交換してください。
- マウスの生存のために承認された場所での作業urgery、その後の研究のために必要な十分な8〜10週齢の雌のC57BL / 6Jマウス（GL26神経膠腫と同系）を得る（ 図2A）に示すように、オートクレーブ滅菌またはビーズ滅菌手術器具および他の試薬 を設定することから始めます。食料や水への継続的なアクセスを確保します。
- 75ミリグラム/ kgのケタミンおよび0.5 mgの/ kgのデクスメデトミジン（20gのマウスでは約250マイクロリットル）の用量を提供することで、作業麻酔液の単回腹腔内（IP）注射で最初のマウスを麻酔。次に、カルプロフェンのは5mg / kgを皮下（SC）注射（20gのマウスでは約100μl）を与えます。マウスが進む前につま先と尾ピンチに非応答性であることを確認してください。
- 手術用バリカンを使用して、頭蓋から毛皮を剃ります。剃った領域にポビドンヨード消毒液、70％イソプロピルアルコールの準備パッドとスクラブ、その後再適用ポビドンヨード消毒液を適用します。次に、steriの少量を適用ルは、乾燥を防ぐために、それぞれの眼に眼軟膏をワセリン。
- 以下のプロトコルに従って定位フレームに頭蓋骨を固定します。
- 慎重にゆっくりと舌を引き出し、窒息を防ぐために、口の一方の側に移動するように湾曲解剖ピンセットで到達することにより、口を開きます。鉗子は、オープンジョーを広げ、定位フレーム上の歯バーの鍵穴に上の2つの切歯を導くために、口の中でしばらくを撤回することを許可します。それぞれのネジを調整することにより、水平方向または垂直方向に旋回するから歯のバーを固定します。マウスの頭蓋は、ベンチトップでのレベルであることを確認してください。
- 頭蓋の眼窩後部の骨が粉砕を防止するために、頭蓋骨にあまりにも多くの内側の圧力を適用しないように注意しながらに対してしっかりと耳のバーを配置します。
- 鼻の上に鼻のバーを配置し、ぴったりになるまでダウンネジ。穏やかな圧力を適用することにより、ヘッドには縦/横方向の動きがないことを確認してください親指と人差し指で。正しく定位フレームに入れマウス（ 図2B）に示されています。
- 手術用メスの刃を使用して、後頭骨に前頭骨から頭蓋骨の上に1cmの正中切開を行います。コリブリのリトラクターを使用して切開部の皮膚を撤回。
- 直接ブレグマの位置（ 図2C）上記定位フレームの垂直アームに取り付けられた33 G針を装備したマイクロシリンジを下げます。そこから、腫瘍移植のための標的部位に到達するために針0.5ミリメートルのAP、2.5ミリメートルMLの位置を調整します。静かに骨膜をexcoriatingことで、この場所をマークするために26 G針を備えた1 mLのツベルクリン注射器を使用してください。
- 1/32 "（0.8ミリメートル）ビットを搭載したコードレス精密電動ドリルを使用して、基礎となる硬膜に達するまで、標的部位で頭蓋に穴を開けます。掘削しながら、DRIを除去し、断続的圧力をかけます頭蓋の表面からLLビットは、そうでなければ、基礎となる脳組織を穿刺ドリルビットにつながる可能性があり、過度の熱と力を避けるために。
- 針が詰まっていないことを確認するために、1.7ミリリットルの円錐形のポリプロピレンマイクロチューブに0.9％NaClをマイクロシリンジをフラッシュします。静かに細胞を再懸濁するために、腫瘍細胞を数回を含む0.6ミリリットルの円錐形のポリプロピレンマイクロチューブをフリック。
- 空気の泡が注射器の中に導入されていないことを確実にマイクロシリンジに細胞の2μLを描画します。注射器に残っている腫瘍細胞の正確に1μLを残して70％イソプロピルアルコールの準備パッド上に細胞の1μLを分注します。
- それは硬膜に接触するまで、その後、-3.5 mmの腹側脳に針を導入し、0.5ミリメートルによって撤回ダウン針を持参してください。ゆっくりとスムーズに1〜2分かけてシリンジプランジャを押し下げることにより、細胞を提供します。
- 細胞がsettlを許可します5分前に、ゆっくりと針を引き抜くするための注射部位におけるE。きれいな70％のイソプロピルアルコールの準備パッドと針の先端から任意の凝固血液や脳の問題を拭いてください。針をすすぎ、針が次の注射のために詰まっていないことを確認するために、ステップ2.6から0.9％のNaClで徹底的に注射器。
- コリブリのリトラクターを取り外し、3 3-0ナイロンモノフィラメント縫合糸を使用して頭皮を縫合。アチパメゾール塩酸筋肉内（IM）の2.5mg / kgの続く（20gのマウスのための0.03 mg / mlのワーキング溶液の約67μl）を定位フレームからマウスを削除し、0.1 mgの投与/ブプレノルフィンkgの塩酸塩皮下（SC）術後の疼痛緩和と麻酔逆転用（20gのマウス用の0.5 mg / mlのワーキング溶液約100μl）を。回復するために加熱ランプの下に戻って自分のケージに手術後のマウスを置きます。
3.マウスTranscardial Perfus脳のイオンと収穫
- 以下のプロトコルに従って、ヘパリン化タイロード液を準備します。
- 1リットルのガラススクリューキャップ保存瓶に磁気撹拌棒を入れ、超純脱イオン水で体積に記入してください。撹拌プレート上のボトルを置きます。
- 撹拌しながら、秤量しガラス瓶に以下の化学物質を追加：8グラムの塩化ナトリウム（NaCl）で、0.264グラムの塩化カルシウム（CaCl 2を•2H 2 O）、0.05グラム一塩基性リン酸ナトリウム（NaHを2 PO 4•2H 2 O）、 1.0グラムのD-グルコース（C 6 H 12 O 6）、1.0グラムの炭酸水素ナトリウム（NaHCO 3）、0.2グラムの塩化カリウム（KCl）。塩が溶解することを許可し、その後、タイロード液にヘパリンナトリウムの1,000U / mlストック溶液100μlを添加します。
- 撹拌プレートからコンテナを削除し、磁気ワンドを使用して撹拌棒を取り出します。 4でのヘパリン化タイロード液を保存°C。
- 次のように終末麻酔のための作業溶液を準備します。
- ケタミン/キシラジン端子麻酔の場合：無菌の0.9％NaCl注射の10ミリリットルバイアルから1360μLを削除し、塩酸ケタミンの100 mg / mlのストック溶液とキシラジンの100 mg / mlのストック溶液160μlと1200μlの置き換え塩酸塩は、塩酸ケタミン（12 mg / mlで）及びキシラジン塩酸塩（1.6 mg / mlで）の混合作業溶液を得ました。
- 滅菌プラスチック容器に超純脱イオン水（3.93x）の264ミリリットルに90ミリリットル10倍のPBSを配置することによって、密度遠心分離メディアミックス溶液を調製します。 HClでpHを7.0〜7.2に滴定し、0.22μmのフィルターを通して滅菌濾過します。 4℃で保存します。
- 70％の密度遠心分離媒体は、（材料のリストを表示する密度遠心分離培地の30 mlの密度遠心分離メディアミックス溶液を18 mlのを組み合わせることにより調製します詳細については）50 mlのポリプロピレン遠心管中。 4℃で保管したが、使用前に室温にもたらします。
- 50 ml遠心チューブに10.4 mlの70％の密度遠心分離媒体に9.6 mlのDPBSを組み合わせることにより、37％の密度遠心分離媒体を準備します。 4℃で保管したが、使用前に室温にもたらします。
- 50mlの遠心チューブにDPBS（〜1％FBS）50mlにFBSを500μlを配置することによって、フロー・バッファを準備します。 4℃の店で店
- 氷のチップを搭載した容量に4.5 Lポリウレタンアイスバケットを埋めます。
- / 10 mg / mlのDNアーゼIストック溶液を1：10および50mgを希釈することにより、研究では、脳のサンプルあたり1 mlのために十分な量で1 mg / mlのコラゲナーゼおよび1 mg / mlのDNアーゼIを組み合わせたソリューションを作ります単一の15mlのポリプロピレン遠心管中の滅菌DPBSでmlのコラゲナーゼ原液1時50分。静かにピペッティングすることによって、およびP-1000マイクロピペットでダウン溶液を混合。 polyureth氷上で保管してくださいステップ3.7からANEバケット。
- 2 7ミリリットルガラスダウンス組織グラインダーを取得します。 1「NT」と「gal1i「他にラベルを付けます。アイスバケットで組織グラインダーを配置し、それぞれにDPBSの1ミリリットルを追加します。
- アイスバケットでの研究と場所に各マウスからの脳物質を収集するために十分な15ミリリットルの遠心管を入手します。
- アイスバケットに3 50ミリリットルの遠心管の中のDPBS〜150ミリリットル場所。
- 研究では、各マウスのための十分なポリスチレン六角形の計量皿（トップ内径（ID）115ミリメートル、ベースID 85ミリメートル、203ミリリットルボリューム）を取得します。マウスの脳の解剖とトリチュレーションのための完全なセットアップが（図3A）に示されています
- 選択した時点で、塩酸ケタミンおよび20mg / kgのキシラジン塩酸塩（合成12 mg / mlのケタミン/ 1.6メートルの約250μLの150ミリグラム/ kgの単回腹腔内注射を用いた研究の最初の担癌マウスを麻酔20グラムのマウスのためのグラム/ mlのキシラジン作業溶液）深い麻酔を誘導しました。マウスが進む前につま先と尾ピンチに非応答であることを確認してください。
- 先に調製したタイロード液を取得し、端末動物の外科手術に特化し、層流フード内に配置します。タイロード液にカーボゲンタンクに取り付けられたガス不透過性のポリマーチューブを置きます。溶液に連続してバブルに95％O 2/5％CO 2カーボゲンを可能にするために、タンクのバルブを開きます。
- 蠕動ポンプに接続されている追加のガス不透過性のポリマーチューブの端部に20gのアルミハブブラント針を取り付けます。タイロード液中に蠕動ポンプのもう一方の端にチューブを置き、チューブは酸素化と、ヘパリン化タイロード液を充填することを可能にするためにポンプの電源を入れます。マウスtranscardial灌流用にセットアップが（図3B）に示されています。
- 4 26 G針を使用して、突き止めます層流フード内で処分吸収性タオルで覆われた押出法ポリスチレンフォームブロックの前面と後足で麻酔マウス腹側まで。
- その後で終了するように胸骨に分岐、ダイヤフラムを穿刺するcephalically切断、腹腔壁を貫通して「Y」の切開を行い鈍的切開鉗子のペアを使用して腹腔の上に皮膚をつかみ、解剖はさみの大きなペアを使用して左右の腋窩。
- 胸骨をクランプし、マウスの左の肩の上に胸郭を反映するために止血剤を使用してください。鈍的切開鉗子のペアで心膜を除去します。
- 酸素化およびヘパリン処理タイロード液（約2.3〜2.5ミリリットル/分）の着実なドリップを開始するために蠕動ポンプをオンにします。
- 心臓の左心室に鈍針を挿入します。放血を可能にするために右心房を切り取るために解剖はさみの小さなペアを使用します（ 図3C）。
- 肝臓と肺が完全に起因する血液の不足のために湯通しするまで、タイロード液を徹底的にマウス循環系を潅流することを許可します。血液のない総額は、左心室から20 Gアルミニウムハブ鈍針を削除する前に、右心房を終了し続けないことを確認してください。
- 押出法ポリスチレンフォームブロックからマウスの固定を解除し、マウス腹側を下に向けます。解剖はさみ大きなペアを使用して、首のレベルで体の他の部分からヘッドを分離します。
- 解剖はさみの小さなペアを使用して、頭蓋を露出させるために鼻に向けて前進作業後頭骨から始まる正中線で頭皮を切りました。
- 親指と人差し指を使用して、頭蓋の両側の皮膚を撤回し、しっかりと頭蓋骨を保持します。完全に背と側面を露出させるために後頭骨で始まる頭蓋を突破し、前方に動作するように骨鉗子のペアを使用します脳の表面。脳へのダメージを最小限にするように注意してください。
- 頭蓋骨が削除されたら、マウス腹側を上の頭部を回し、頭蓋骨からそれを解放するために、脳の基部に脳神経を切断するために解剖はさみの小さなペアを使用。
神経膠腫浸潤PBMCの4.絶縁
- きれいな片刃カミソリの刃を使用して、2つの半球を二等分する脳の中心ダウン矢状カットすることにより、腫瘍を含む脳の領域を分離します。ダウン同側半球内側を回して、腫瘍移植（図4A）を含む標的組織を分離するために小脳と嗅球のレベルにある2つの冠状カットを行います。対側半球の等価な部分はまた、単離され、陰性対照として使用されてもよいです。
- 1ミリリットルを含むそれぞれラベルされたガラスダウンス組織グラインダーに標的組織を配置; DPBSで、最初に組織を破壊するために7回のすべての方法ダウンプランジャーを押して、ねじれ。液体が組織グラインダーの底に戻って落ち着くことができるようにプランジャーを持ち上げます。三度、この手順を繰り返します。しかし、唯一の組織を粉砕オーバー回避するために、最後の繰り返しの間にプランジャ次の二つの繰り返しの間に4回と3回をねじります。
- P-1000マイクロピペットを用いて、順次組織グラインダーに洗浄するために、プランジャの側面に沿って（3.11に調製した）の氷冷DPBSの3 1mL容量を適用します。
- ピペッティングにより粉砕し、脳の問題を再懸濁し、ダウンし、氷上でラベルされた15mlの遠心管に入れます。氷冷DPBSのさらに1 mlのダウンス組織グラインダーの側面を洗浄し、同じ15ミリリットル遠心管に追加します。すべてのサンプルが処理されるまで氷上で粉砕し、脳の問題を含む全ての管を保管してください。
- 繰り返し試験では、各マウスのための3.13から3.25と4.1から4.4を繰り返します。
- 一旦すべてのサンプルヘクタール4℃で20分間、740×gで（最大RCF）で15 ml遠心チューブ中で粉砕し、脳の問題をスピンダウンし、処理されていまし。
- 10ミリリットルの血清学的ピペットとピペット銃で上清を除去し、P-1000を使用して、以前に準備されたコラゲナーゼ/ DNアーゼI消化酵素の1ミリリットル中でペレット脳物質を再懸濁します。 15分間37℃の水浴中で試験管ラック、所定の位置に15 ml遠心チューブを置きます。
- ゆっくり組織脱凝集を促進するために、チューブをフリックすることにより、インキュベーション期間を通じて二回のサンプルを攪拌。
- 消化酵素を希釈するために各チューブに10ミリリットルの血清学的ピペットを用いて氷冷DPBSの6ミリリットルを追加します。ピペット上下に再懸濁し、氷上で新しいラベル15ml遠心チューブに滅菌70μmのナイロンメッシュフィルターを通る全ボリュームをフィルタリングします。
- 達成するために、4℃で20分間740×gで（最大RCF）で脳細胞懸濁液をスピンダウン単一細胞ペレット（図4B）。遠心機から15ミリリットルチューブを除去した後、氷の上に置き、次のステップの準備のために約21℃に遠心分離器で設定温度を上昇させます。
- 完全に脳細胞を含む各チューブから上清を除去し、最初にP-1000マイクロピペットを用いて70％の密度遠心分離培地1ml中にペレットを再懸濁します。その後、10ミリリットルの血清学的ピペットを用いて各チューブに70％密度遠心分離培地の4つの追加ミリリットルを追加します。安全上のキャップをねじ込み、軽く数回チューブに反転させることにより、細胞懸濁液を均質化します。
- 脳の氷から70％密度遠心分離培地に再懸濁された細胞、および室温で試験管ラック内の場所を含む15ml遠心チューブを外します。一度に、慎重に交流を形成するためにP-1000マイクロピペット70％の密度遠心分離培地を5mlに37％の密度遠心分離媒体溶液2mlをオーバーレイ2密度遠心分離媒体層（図4C）との間にリーンインターフェイス。
- それは簡単に区別があまり明らかになったときに、遠心分離後に同定できるように、界面の位置を示すために、先の細いマーカーを使用してください。
- インターフェイスの中断を避けるために無休憩で室温で20分間、740×gで（最大RCF）で15 ml遠心チューブをスピンダウン。
- 遠心分離後、慎重に脂質層をバイパスし、その側面に沿ってチューブ内にP-200マイクロピペットを導入することにより、2つの密度遠心分離媒体層（ 図4D）との界面に蓄積されたPBMCを収集。
- 一度PBMCバンドのレベルで、ゆっくりと70％の密度遠心分離媒体層の表面から200μLを取り出し、氷上でそれぞれ標識されたポリプロピレンFACSチューブに入れます。サンプルあたり400μlの総体積に対して一度繰り返します。
- 十分に4℃で20分間660×gで（最大RCF）で細胞をスピンダウンした後、密度遠心分離媒体を希釈するためにPBMCの400μLを含む各FACSチューブにフローバッファーの3ミリリットルを追加します。
神経膠腫浸潤PBMCの5免疫標識
- 任意の実験PBMCサンプルを分析する前に、係る神経膠腫浸潤PBMCの評価に専念し、フローサイトメトリーデータ分析のテンプレート内に固定されたPMT電圧のセットに関連するベースラインのゲートを確立するために、単一の独立した、細胞表面アイソタイプ対照実験を行います以下のプロトコルへ：
- 腫瘍増殖の72時間後のセクション2で概説した手順に従ってGL26-CIT-NTにGL26-CIT-gal1i別で1 C57BL / 6Jマウスを生着、両方のマウスを安楽死させると手順に従って、腫瘍浸潤のPBMCを分離部3,4を通して概説。
- 2 PBMC試料（NT aがコンバインND gal1i）1ボリューム（ すなわち、100μL）に、その後さらに3 FACSチューブ（ すなわち、チューブあたり33.3μl）をラベルされた「CD45アイソタイプ」、「GR-1 / CD11bのアイソタイプ」、および「NK1間で均等にサンプルを分割します。 1アイソタイプ」。 （1で各：100希釈し、フローバッファーで200μlの総体積に希釈した）以下の抗体を追加し、それぞれラベルされたFACSチューブへ：「CD45アイソタイプ」：アレクサフルオロ700結合ラットのIgG2b、κ（クローン：RTK4530 ）;「GR-1 / CD11bのアイソタイプ」：アレクサフルオロ700結合ラット抗マウスCD45（クローン：30-F11）、PE結合ラットのIgG2b、κ（クローン：eB149 / 10H5）、およびPerCPを/ Cy5.5の共役ラットのIgG2b、κ（クローン：RTK4530）; "NK1.1アイソタイプ」：アレクサフルオロ700結合ラット抗マウスCD45（クローン：30-F11）、PE結合ラット抗マウスGR-1（クローン： RB6-8C5）、PerCPを/ Cy5.5の結合ラット抗マウスのCD11b（クローン：M1 / 70）、およびAPC-CONJugatedマウスのIgG2a、κ（クローン：eBM2a）。
- PBMCを20分間、暗所で氷上で免疫標識することを許可します。穏やかに混合する潜伏期間を経て、一度途中でチューブをフリック。 、フロー緩衝液1mlで洗浄し、4℃で10分間、660×gで（最大RCF）でスピンダウンし、フロー緩衝液200μlとしたPBMCを含む各FACSチューブを再懸濁します。
- 85μmの統合されたノズルを備えたフローサイトメーターを使用して、ベースラインCD45間隔ゲートを確立するために、 最初の「CD45アイソタイプ」チューブを分析。次に、入力として唯一の真のCD45 +細胞を用いて、ベースラインのGr-1 / CD11bの象限ゲートを確立するために、「GR-1 / CD11bのアイソタイプ」チューブを実行します。最後に、入力として唯一の真のCD45 + / GR-1 ロー /のCD11b +/-細胞を用いたベースラインNK1.1間隔ゲートを確立するために、「NK1.1アイソタイプ」チューブを実行します。
- 将来のすべての実験ANには、次の手順を実行しますalysis：
- （GZMBアイソタイプに対するプラス1）200μlのサンプルあたりの容量を達成するために、フローバッファーで細胞表面抗体の100倍希釈：1の十分な量を作るアレクサフルオロ700結合ラット抗マウスCD45（クローン：30-F11 ）、PE結合ラット抗マウスGR-1（クローン：RB6-8C5）、PerCPを/ Cy5.5の結合ラット抗マウスのCD11b（クローン：/ 70 M1）、APC結合マウス抗マウスNK1.1 （クローン：PK136）。
- メニスカスがちょうどセルの損失を回避するために、各FACSチューブ（〜50マイクロリットル）の底部を超えるまで慎重に4.15からスピンダウンしたPBMCの上清を除去します。 P-200マイクロピペットで残留フロー・バッファを使用して、各FACSチューブ中のPBMCを再懸濁し、各FACSチューブから（サンプルの1 /＃）ボリュームの価値を削除し、「プールされたアイソタイプ」と表示された新しいFACSチューブに結合します。
- 各PBMCサンプルに5.2.1で調製された細胞表面抗体カクテルの200μLを加えます。 PBMCを20分間、暗所で氷上で免疫標識することを許可します。フリックトン彼は穏やかに混合する潜伏期間を経て一度途中でチューブ。
- フロー緩衝液1mlで洗浄します。 660 XG（最大RCF）でスピンダウンし、4℃で10分間xは。
- 暗所で氷上で15分間（詳細については材料のリストを参照）、市販のホルマリンベースの固定液の200μl中のPBMCを含むすべてのFACSチューブを再懸濁します。穏やかに混合する潜伏期間を経て、一度途中でチューブをフリック。
- 市販1X透過処理/洗浄緩衝液1mlで洗浄する（詳細については材料リストを参照）、4℃で10分間660×gで（最大RCF）でスピンダウン。
- サンプルあたり200μlの容量を達成するために：（GB11クローン）1xの透過処理/洗浄バッファーで細胞内抗体パシフィックブルー結合マウス抗マウスGZMB：100希釈のPBMCをスピンダウンしている間、1の十分な量を準備します。
- パシフィックブルー-CON：100希釈の別のチューブでは、1の単一200μlのボリュームを準備アイソタイプコントロール抗体：マウスのIgG1、κ（MOPC-21クローン）をjugated。
- アイソタイプ抗体の1：100希釈の200μlの容量で「プールされたアイソタイプ」と表示された単一のFACSチューブを抗マウスGZMB抗体の100倍希釈し、再懸濁：1の200μlで実験的なPBMCサンプルのそれぞれを再懸濁します。
- すべてのPBMC試料を20分間、暗所で氷上で免疫標識することを許可します。穏やかに混合する潜伏期間を経て、一度途中でチューブをフリック。
- フロー緩衝液1mlで洗浄します。 4℃で10分間660×gで（最大RCF）でスピンダウンし、分析のためのフロー緩衝液200μlとしたPBMCを懸濁します。
- 以前5.1節22に設立された神経膠腫浸潤85ミクロン統合ノズルを用いてPBMCおよびゲートとPMT電圧を分析フローサイトメトリー。神経膠腫-infiltの総数の公正な比較を確保するために、フローサイトメーター上で、各サンプルのボリューム全体を実行してください各サンプルにおける評価のPBMC。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CD11bの対FSC-W→CD45対数→GR-1対SSC-W→FSC-H対SSC-A→SSC-H対FSC-A→：次のゲーティング戦略は、典型的な実験のために使用されています数対NK1.1。ゲイツ氏はその後GZMB式（図5A）に基づいて層別化されたGR-1 + / CD11bの+骨髄系細胞およびNK1.1 + NK細胞上に置きました。 NK1.1 + NK細胞およびGR-1 + / CD11bのSSC-Aは、NK細胞の小さいリンパサイズおよび骨髄細胞の比較的大きなサイズを確認する対FSC-Aへの我々の実験で+骨髄細胞（と同定された細胞をバックゲート図5B）。生データファイル（ すなわち 、FCSファイル）は、FlowJoソフトなどの市販のフローサイトメトリーデータ分析ソフトウェアにより分析されます。
18 C57BL / 6Jマウスの合計は、この方法を示すために使用されました。ナイン（9）GL26-CIT-NTに移植したと9は同じD上のGL26-CIT-gal1iを移植しましたAY細胞（3×10 4）の同等の番号を使用して。各グループからの3匹のマウスは、24、48で安楽死させ、そして72時間後に腫瘍の生着されました。データは、同系のC57BL / 6Jマウスの脳へGL26-CIT-gal1i神経膠腫細胞の生着が急速にCD45 + PBMCを（図6A）の動員を誘発することを示します。デモで使用される特定の抗体カクテルに基づいて、それは、さらに、GR-1 + /のCD11b +骨髄系細胞およびNK1.1 + NK細胞は、特に、腫瘍移植の48時間（図内GAL-1欠損腫瘍微小環境に入ることを示すことができます図6Bおよび6C）。これまでNK細胞のそれを上回る神経膠腫浸潤骨髄細胞のしかし総数。
図1：頭蓋内生着のためGL26-Citを細胞の調製（。）代表10Xの明視野およびGL26-CIT-NT（左画像）とGL26-CIT-gal1i（右画像）培養で増殖させた細胞のエピ蛍光顕微鏡写真。 （B）GL26-CIT-NT（左レーン）とGL26-CIT-gal1i（右レーン）の全細胞溶解物のウエスタンブロット。ガンマチューブリンは、（γ-浴槽。）ローディングコントロールとして示されています。 4℃で5分間、550×gで（最大RCF）で遠心分離した後、約50％コンフルエントT75組織培養フラスコから（C）GL26-Citを細胞ペレット。細胞数および生存率を評価するために、トリパンブルーで1：（D）GL26-Citを細胞（白丸）を含む血球計の明視野図1に希釈しました。細胞は、再現性の腫瘍の成長を確保するために> 90％生存可能である必要があります。 1〜5を標識正方形の細胞数の平均値は、細胞数の推定の精度を高めるために取られるべきです。頭蓋内implaため未補充したDMEM中で3×10 4細胞 /μLで再懸濁し、（E）GL26-Citの細胞ntation。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：C57BL / 6Jマウスの線条体に神経膠腫細胞の生着に必要な定位手術器具や試薬を示す（A）手術室のレイアウト。。 （B）0.5ミリメートル、AP、2.5ミリメートル、ML、および-3.0 mmのブレグマへのDV相対的で適切な針の配置と定位フレームに活かさC57BL / 6Jマウスのビューを閉じます。ブレグマの位置および腫瘍細胞移植のための標的部位を示すマウスの頭蓋骨の（C）背ビュー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：マウスTranscardial灌流（A）解剖、粉砕、およびマウスの脳組織の酵素消化に必要な試薬。 （B）端子マウスの外科的処置に捧げ層流フードに示す酸素化し、ヘパリン処理したタイロード液でtranscardial灌流マウスに必要な機器・試薬のレイアウト。 （C）適切な楽器とtranscardial灌流のために必要な配置を実証した心臓の模式図。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：神経膠腫浸潤の単離PBMCを早期同所性神経膠腫のインプラントを含むマウスの脳組織の解剖のための（A）戦略。トップパネルは、離れて反対側の半球から同側半球の矢状二分を示しています。下のパネルは、（紫で強調表示）腫瘍移植を含む標的組織を分離するために必要な二つの追加の冠状カットを示しています。酵素消化後（B）の単一細胞の脳組織ペレット（白矢印）、70μmのナイロンメッシュおよび遠心分離による濾過。 （C）は、適切に遠心分離前に密度遠心分離媒体勾配を注ぎました。白い矢印は、二つの密度遠心分離媒体層との間に形成されたクリーンなインターフェイスを示しています。 （D）37％密度遠心分離媒体層の白矢印の上部に形成する脂質層）とPBMCバンドを実証し、遠心分離後の密度遠心分離媒質勾配（第によって概説します2つの層の間の界面での電子破線の黒線）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：フローサイトメトリーゲーティング戦略は、神経膠腫浸潤GR-1 + / CD11bの+骨髄細胞およびNK細胞を識別するために使用される（A）ステップ1：合計密度遠心分離メディア勾配のPBMCのバンドから単離された細胞は、上にゲートされ、免疫標識細胞破片を除外する（FSCレスK 50〜より）。ステップ2と3：ダブレット識別ゲーティングは、細胞凝集物をフィルタリングします。ステップ4：神経膠腫浸潤免疫細胞を同定するためのCD45ゲート。アイソタイプ対照は灰色のシルエットとして示されています。ステップ5：GR-1とのCD11bに基づいて層別化したCD45 +細胞 。 GR-1とCDの両方のアイソタイプ対照 11bは、プロット上に重ね、金の円で囲まれています。赤い円は、GR-1 + / CD11bの+骨髄細胞を示します。ステップ5 '：GZMB式に基づいて層別化のGr-1 + / +骨髄系細胞のCD11b。前提として、これらの細胞はアイソタイプコントロール（灰色のシルエット）を介して抗GZMB抗体で標識しません。ステップ6：NK1.1の発現に基づいて層別化し、ステップ5で黒い長方形によって概説GR-1 low細胞 。アイソタイプ対照は灰色のシルエットとして示されています。ステップ6 '：NK1.1 高い細胞GZMB式に基づいて層別化。これらの細胞は、確かに、アイソタイプコントロール（灰色のシルエット）上記抗GZMB抗体で標識します。 NK細胞はリンパより小さいサイズを有することを、実証SSC対FSC-AへのGr-1 + / +骨髄系細胞のCD11bの（B）バックゲートより大きなサイズのGr-1 + / +骨髄のCD11b細胞と比較して。"_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6：頭蓋内腫瘍増殖の最初の3日間でGL26-CIT-gal1i腫瘍微小環境対GL26-CIT-NTへのPBMC浸潤の比較（A）総CD45 +免疫細胞。 （B）CD45 + / GR-1 + / +骨髄系細胞のCD11b。 （C）CD45 + /NK1.1 + NK細胞。 GL26-CIT-gal1i神経膠腫から単離されたPBMCからのデータ点を滑らかな線で接続され、時々GL26-CIT-NT神経膠腫から単離されたものは、点線で接続されています。 3匹のマウスの神経膠腫浸潤PBMCを、各時点での腫瘍タイプごとに分析しました。 GL26-CIT-gal1i曲線上の各データポイントに関連付けられている数字はGL26-CI上で、その特定のPBMC型の誘導倍率を表しますT-NT指定時間後に腫瘍移植で（HPI）。データは、平均±標準誤差（SEM）カウント免疫細胞の平均数を表します。統計分析は、分散の2ウェイ分析によって行った。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
このプロトコルは、初期のマウスの脳の腫瘍微小環境を浸透させてきたPBMCの単離およびフローサイトメトリー分析のための堅牢で再現性のある方法について説明します。神経膠腫細胞懸濁液を定位マウス脳の線条体に移植された実験者によって指定された濃度で生成されます。次いで、マウスを実験的設計によって指定された所定の時点で安楽死させ、それらの脳を採取し、蛍光標識一次抗体の組み合わせで免疫標識された神経膠腫浸潤性のPBMCを単離するために処理されます。免疫標識細胞は、フローサイトメトリーによって定量化されます。ここで紹介するデモは、初期の時点に焦点を当てているが、神経膠腫浸潤PBMCをマウスの瀕死までの任意の時点後の腫瘍生着までで評価することができます。異なる抗体の組み合わせの任意の数の関心iの免疫細胞を検査するために使用することができるような方法は、高度にモジュール化されT細胞、B細胞、NK細胞、単球、およびマクロファージncluding。プロトコルはメスC57BL / 6Jマウス生後8〜10週での使用に最適化されていることに注意してください。この年齢範囲外のマウスは、ここに提示されたデータの代表ではないと同等の時点で細胞数につながる可能性がある、循環PBMCの割合が変化していてもよいです。特徴付け実験は、代替の腫瘍モデルを使用する場合にも必要とされ得るか、B6バックグラウンド上以外のマウスを伴う株は、それらのPBMCプロフィール（Jaxpheno6;マウスPhenomeデータベース;ジャクソンラボラトリー）で異なり得ることに使用されている場合。ジェンダーと環境条件はまた、PBMCの頻度およびパーセントの間で格差のソースすることができます。
この方法は、GAの拒絶に関与する細胞型のGr-1 + / +のCD11bの検出骨髄細胞およびNK1.1 + NK細胞を有効にする4つの細胞表面抗体の組み合わせを用いて実証されていますL-1欠損神経膠腫。細胞内GZMB抗体を含めることは、さらに、NK細胞のサブセットにおける細胞毒性の可能性を検出することができます。代表的な結果をいずれかが原因のshRNA媒介遺伝子ノックダウンのレベルが低下しているGAL-1の正常なレベルで発現するか、同系のC57BL / 6Jマウスで早期GL26-Citを神経膠腫への免疫細胞の浸潤のために提供されます。デモでは、神経膠腫浸潤PBMCを再現性よく単離して、すぐに24時間後に腫瘍生着として定量化することができることを示すことによって技術の感度と再現性を示します。 。別に腫瘍浸潤GR-1 の高 /のCD11b +骨髄性細胞の集団を明らかにするから、デモも、同一現在定義されていないGR-1 INT /のCD11b +細胞の集団を明らかにする。追加の実験は、さらに、この細胞集団の文字を解読するために必要です。我々はまた、我々は、CD45の容易に識別人口を観察していないことに注意してください
抗GR-1抗体は25、それぞれ、多形及び単核骨髄細胞に特異的であるLy6GとLy6C細胞表面タンパク質の両方を認識する。抗GR-1不格好なやつの使用IESは、このように、これら2つの細胞集団間の区別を排除します。私たちの研究室での予備的な結果は今GAL-1欠損神経膠腫の微小環境を浸透させる初期のGR-1 + / +細胞のCD11bのより正確な記述に光を当てるし始めています。 （：1A8クローン）および抗Ly6C（クローン：AL-21）抗Ly6G組み込んだ実験抗CCR2抗体と一緒に抗体が今GR-1 の高 /のCD11b +細胞が初期のGAL-1欠損腫瘍微小環境を浸透させることを示していますさらなる実験は、この結果を確認するために必要とされるが、 高 Ly6C / CCR2 高い炎症性単球と一致している（データは示さず）。
セルにそれが神経膠腫浸潤のPBMCを単離することに関与して繰り返しの遠心分離および再懸濁工程中に発生する可能性があります失うために、それは、細胞数を観察している可能性があり、実際に何が無傷の脳内に実際に存在していることが低くなっています。しかしEとの間には、違いが70分の37密度遠心分離メディアインターフェイスの同等のボリュームが抽出された場合、各サンプルの全体積をフローサイトメーターによって分析されている場合xperimentalグループが保持する必要があります。これらの手順に従わないはサンプル間の不公平な比較になりますし、公平な分析を排除します。脳の腫瘍微小環境に入るPBMCの正確な数を定量化することができないことは、このプロトコルに制限固有のものではありません。このような免疫組織細胞計数戦略などの代替の方法は、潜在的に偽につながる、また立体数とバックグラウンド染色のレベルが異なっていてもよい組織切片の顕微鏡写真上の同等の画像閾値化の要件に基づいて、総細胞数の外挿による誤差する場合があります陰性または偽陽性シグナル。それにもかかわらず、別の分析方法間の時間経過分析の比較は、同様の全体的な形状の時間依存免疫流入曲線を明らかにする必要があります。アン免疫組織化学的方法への追加の欠点は、ホルマリン固定された脳組織切片の文脈における等価な抗原エピトープに結合するために、フローサイトメトリーのために検証され、特定の抗体のできないことです。
その方法に慣れていない人のための制限として機能することができるこのプロトコルにはいくつかの重要なステップがあります。そのようなステップは、それを損傷することなく、頭蓋から脳を採取あります。私たちは前に適切な実験を実行するための技術を数回練習することをお勧めします。脳が最終的に摩砕されますので、脳の表層に若干の損傷は神経膠腫浸潤PBMCの正確な定量に取るに足らないと思われます。経験の浅い研究者が最初に困難見つけることが第二段階は、密度遠心分離メディア勾配の注入です。の上に37％の密度遠心分離媒体を2mlを覆う一方でクリーンな界面を形成する実験者の能力70％の層は、PBMCの再現性の分離に不可欠です。この手順は、最初に挑戦的な証明することができるが、それは非常にPBMCを富化し、劇的にフローサイトメトリーで分析する全脳組織の場合にそうでない場合、サンプル分析に必要な時間を減少させます。 PBMCの濃縮はまた、このように.fcsファイルサイズを削減し、希少な脳浸潤免疫細胞集団を解決するために支援し、フローサイトメーターにより取得されたイベントの合計数を減らすことができます。きれいな密度遠心分離インタフェースを確立する上で最良の結果を得るために、私たちは、滑らかなプランジャー作用を有するP-1000マイクロピペットを用いて37％の密度遠心分離媒体を注ぐお勧めします。 15ミリリットルの遠心管は約20〜30°ベンチトップ上の角度。 mlのマーキング70％密度遠心分離媒体層の表面上の管3-5の側にマイクロピペットの先端を休ま。それとして37％の密度遠心分離媒体の明白な外向きの運動量を最小にするために着実にゆっくりと注ぐextruデ基礎となる70％の密度遠心分離媒体を乱さないようにするためにマイクロピペットチップから。最後に、脳の組織構造は、必ずしも神経膠腫浸潤のPBMCの単離の過程で破壊されるという事実は、追加のマウスは、組織学的データと一致した時点を得るために必要とされることを意味します。
通常のげっ歯類の脳への発癌性のプラスミドDNAの注入を介して生成された新しい神経膠腫モデルは26-32近年開発されてきました。これらの「内因性」の腫瘍モデルは、定位的にex vivoで癌細胞を移植するとより密接に臨床神経膠腫の組織学的特徴を模倣することによって引き起こされる潜在的なアーチファクトを回避します。本明細書に記載される方法は、これらの多くの臨床的に関連するモデル系を特徴付ける免疫浸潤事象の研究に適しています。新生仔マウスにおける免疫流入の研究はまた、新生児の覚書の密度が、この方法を用いて行うことができますE脳は、脳組織の消化にわたって防止するために、酵素消化工程の最適化を必要とすることが成人のそれよりも小さいです。技術のさらなる用途は、そのような実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）などの悪性腫瘍やウイルス感染に対する免疫応答とは別に、炎症性脳疾患の代替クラスの調査を含みます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作品は、神経疾患および脳卒中（NIH / NINDS）MGCにR01-NS074387、R01-NS057711とR21-NS091555を付与する/国立研究所国立衛生研究所によってサポートされていました。 NIH / NINDSはPRLにR01-NS061107、R01-NS076991、R01-NS082311とR21-NS084275を付与。リアのハッピーハート、ミシガン大学総合がんセンターからの助成金は、MGCとPRLに授与。脳神経外科、医学のミシガン学校の大学の学部; NIH助成2UL1-TR000433でサポートされている臨床的および保健研究、ミシガン研究所。 NIH / NCI（国立癌研究所）助成金T32-CA009676によってサポートされているミシガン大学のがん生物学のトレーニンググラント。臨床およびNIH / NINDSグラントT32-NS007222によってサポートされる基本的な神経科学におけるミシガントレーニングの大学。およびNIH / NIGMS（一般医科学研究所）でサポートされているミシガン医学者研修プログラムの大学は、T32-GM007863を付与します。作者博士はカリンMuraszkoと脳神経外科から受信した学術的リーダーシップと支援に感謝再び。 M.ダールグレン、D. Tomford、と優れた行政支援のためのS.ナポリへ。優れた技術支援のためのM. Dzamanへ。そして、ツァイス3D走査型電子顕微鏡の購入に向けての暖かい支援に感謝フィルF.ジェンキンスへ。また、脳単核細胞の単離のための密度遠心メディア媒介戦略の修正版が描かれたハーバード・メディカル・スクールのKuchrooの研究室を認めます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modification of Eagles Medium | Gibco | 12430-054 | with 4.5g/L D-glucose, L-glutamine, 25 mM HEPES and phenol red |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Gibco | 14190-144 | without calcium chloride or Magnesium chloride |
| Fetal bovine serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10,000 U/ml Penicillin; 10,000 μg/ml Streptomycin |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200 mM |
| G418 sulfate | Omega Scientific Inc. | GN-04 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P8833 | from Streptomyces alboniger |
| HyClone HyQTase non-mammalian trypsin alternative | Thermo Scientific | SV30030.01 | in DPBS with EDTA |
| Phase contrast hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | 0.1 mm deep |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250-061 | |
| Sterile 0.9% NaCl injection, USP | Hospira | NDC: 0409-4888 | 10 ml vials |
| 0.6 ml conical polypropylenemi microtubes | Genesee Scientific | 22-272 | |
| Atipamezole hydrochloride injection | Orion Pharma | NDC: 52483-6298 | 5 mg/ml solution |
| Ketamine hydrochloride injection | Fort Dodge | NDC: 0409-2051 | 100 mg/ml solution |
| Dexmedetomidine hydrochloride injection | Zoetis | NDC: 54771-2805 | 0.5 mg/ml solution |
| Xylazine hydrochloride injection | Lloyd | NDC: 61311-481 | 100 mg/ml solution |
| Carprofen injection | Pfizer | NDC: 61106-8501 | 50 mg/ml solution |
| Buprenorphine hydrochloride injection | Reckitt Benckiser | NDC: 12496-0757 | 0.3 mg/ml ampuls |
| 1 ml tuberculin syringes | Covidien | 8881501400 | |
| 26G x ½ (0.45 mm x 13 mm) syringe needles | BD | 305111 | |
| Surgical clippers | 3M | 9661 | |
| Providone-iodine solution | Aplicare | 82-217 | NDC: 52380-1905 |
| Sterile petrolatum ophthalmic ointment | Dechra | NDC: 17033-211 | |
| 70% isopropyl alcohol prep pads | Kendall | 6818 | |
| Sterile gauze | Covidien | 8044 | non-woven, 4" x 4", 4-ply |
| 1.7 ml conical polypropylene microtubes | Genesee Scientific | 22-281 | |
| Mouse stereotactic frame | Stoelting | 51730 | |
| Surgical lamp | Philips Burton | CS316W | Coolspot II Variable Spotlight |
| Curved dissecting forceps | Ted Pella Inc. | 5431 | |
| Colibri retractors | FST | 17000-03 | |
| Cordless precision power drill | Dremel | 1100-01 | Stylus model; 7.2-Volt Lithium-Ion with Docking Station |
| Engraving Cutter | Dremel | 105 | 1/32" or 0.8 mm bit diameter |
| Microliter syringe | Hamilton | 75 | Hamilton Microliter Syringes 700 series; 5 μl volume |
| Microliter syringe needles | Hamilton | 7762-06 | 33 G, small hub RN NDL, 1.5 in, point style 3, 6/PK |
| Ethilon 3-0 black monofilament nylon sutures | Ethicon | 1663 | |
| Magnetic stir bar | VWR | 74950-296 | 7.9 mm diameter x 50 mm length (5/16" diameter x 2" length) |
| 1 L glass screw-cap storage bottle | Corning | 1395 | Type 1, Class A borosilicate glass |
| Heparin sodium | Sagent | NDC: 25021-400 | 1,000 U/ml solution |
| Peristaltic pump | Cole Parmer Instruments Group | 77200-60 | Master Flex Easy Load II console drive |
| compressed carbogen (95% O2 / 5% CO2) | available from local vendor | N/A | A-type, large cylinder |
| 20 G x 1 ½" aluminum hub blunt needles | Kendall | 8881202363 | 0.9 mm x 38.1 mm |
| Polyurethane ice bucket | Fisherbrand | 02-591-45 | Capacity: 0.152 oz. (4.5L) |
| Collagenase (Type I-S) | Sigma Aldrich | C1639 | from Clostridium histolyticum |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical Corp. | LS002007 | >2,000 Kunitz units per mg dry weight |
| Antistatic polystyrene hexagonal weighing dishes | Ted Pella Inc. | 20157-3 | top I.D. 115 mm, base I.D. 85 mm, 203 ml volume |
| Stainless steel single edged razor blades | Garvey | 40475 | |
| Bone rongeurs | FST | 16001-15 | |
| Hemostat | FST | 13014-14 | |
| Large dissection scissors | Ted Pella Inc. | 1316 | |
| Small dissection scissors | FST | 14094-11 | |
| Blunt end forceps | Ted Pella Inc. | 13250 | |
| 7 ml glass Dounce tissue grinder | Kontes | KT885300-0007 | |
| Percoll Density Centrifugation Media | GE Healthcare | GE17-0891-01 | |
| 10 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | single use; sterile |
| 70 μm sterile nylon mesh cell strainers | Fisherbrand | 22363548 | |
| Alexa Fluor 700-conjugated rat anti-mouse CD45 (clone: 30-F11) | Biolegend | 103128 | |
| APC-conjugated mouse anti-mouse NK1.1 (clone: PK136) | eBiosciences | 17-5941-82 | |
| PE-conjugated rat anti-mouse Gr-1 (clone:RB6-8C5) | BD Pharmigen | 553128 | |
| PerCP/Cy5.5-conjugated rat anti-mouse CD11b (clone: M1/70) | Biolegend | 101228 | |
| Alexa Fluor 700-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control | Biolegend | 400628 | |
| APC-conjugated mouse IgG2a, κ (clone: eBM2a) isotype control | eBioscience | 17-4724 | |
| PE-conjugated rat IgG2b, κ (clone: eB149/10H5) isotype control | eBioscience | 12-4031-82 | |
| PerCP/Cy5.5-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control | Biolegend | 400632 | |
| Pacific Blue-conjugated mouse anti-mouse granzyme B (Clone: GB11) | Biolegend | 515403 | |
| Pacific Blue-conjugated mouse IgG1, κ (Clone: MOPC-21) isotype control | Biolegend | 400151 | |
| Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | |
| 15 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-103 | conical bottom |
| 50 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-108 | conical bottom |
| 12 mm x 75 mm round-bottom polypropylene FACS tubes | Fisherbrand | 14-956-1B | |
| FACSAria Special Order Research Product flow cytometer/cell sorter | BD | 650033 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | The Baker Company | SG603 | model: SterilGARD III Advance |
References
- Bleeker, F. E., Molenaar, R. J., Leenstra, S. Recent advances in the molecular understanding of glioblastoma. J Neurooncol. 108, 11-27 (2012).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352, 987-996 (2005).
- Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011. Neuro Oncol. 16, Suppl 4. iv1-63 (2014).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523, 337-341 (2015).
- Kennedy, B. C., et al. Tumor-associated macrophages in glioma: friend or foe? J Oncol.. 2013, 486912 (2013).
- Markovic, D. S., Glass, R., Synowitz, M., Rooijen, N., Kettenmann, H. Microglia stimulate the invasiveness of glioma cells by increasing the activity of metalloprotease-2. J Neuropathol Exp Neurol. 64, 754-762 (2005).
- Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E.
- Kmiecik, J., et al. Elevated CD3+ and CD8+ tumor-infiltrating immune cells correlate with prolonged survival in glioblastoma patients despite integrated immunosuppressive mechanisms in the tumor microenvironment and at the systemic level. J Neuroimmunol. 264, 71-83 (2013).
- Yang, I., Han, S. J., Sughrue, M. E., Tihan, T., Parsa, A. T. Immune cell infiltrate differences in pilocytic astrocytoma and glioblastoma: evidence of distinct immunological microenvironments that reflect tumor biology. J Neurosurg. 115, 505-511 (2011).
- Wagner, S., et al. Microglial/macrophage expression of interleukin 10 in human glioblastomas. Int J Cancer. 82, 12-16 (1999).
- El Andaloussi, A., Lesniak, M. S. An increase in CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells in tumor-infiltrating lymphocytes of human glioblastoma multiforme. Neuro Oncol. 8, 234-243 (2006).
- Kostianovsky, A. M., Maier, L. M., Anderson, R. C., Bruce, J. N., Anderson, D. E. Astrocytic regulation of human monocytic/microglial activation. J Immunol. 181, 5425-5432 (2008).
- Curtin, J. F., et al. HMGB1 mediates endogenous TLR2 activation and brain tumor regression. PLoS Med. 6, e10 (2009).
- Curtin, J. F., et al. Fms-like tyrosine kinase 3 ligand recruits plasmacytoid dendritic cells to the brain. J Immunol. 176, 3566-3577 (2006).
- Mineharu, Y., et al. Engineering the brain tumor microenvironment enhances the efficacy of dendritic cell vaccination: implications for clinical trial design. Clin Cancer Res. 17, 4705-4718 (2011).
- Larocque, D., et al. Exogenous fms-like tyrosine kinase 3 ligand overrides brain immune privilege and facilitates recognition of a neo-antigen without causing autoimmune neuropathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 14443-14448 (2010).
- Curtin, J. F., et al. Treg depletion inhibits efficacy of cancer immunotherapy: implications for clinical trials. PLoS One. 3, e1983 (2008).
- Ali, S., et al. Combined immunostimulation and conditional cytotoxic gene therapy provide long-term survival in a large glioma model. Cancer Res. 65, 7194-7204 (2005).
- Dewey, R. A., et al. Chronic brain inflammation and persistent herpes simplex virus 1 thymidine kinase expression in survivors of syngeneic glioma treated by adenovirus-mediated gene therapy: implications for clinical trials. Nat Med. 5, 1256-1263 (1999).
- Baker, G. J., et al. Natural killer cells eradicate galectin-1-deficient glioma in the absence of adaptive immunity. Cancer Res. 74, 5079-5090 (2014).
- Baker, G. J., et al. Mechanisms of glioma formation: iterative perivascular glioma growth and invasion leads to tumor progression, VEGF-independent vascularization, and resistance to antiangiogenic therapy. Neoplasia. 16, 543-561 (2014).
- Ormerod, M. G., Novo, D. Flow cytometry : a basic introduction. , (2008).
- Stirling, D. P., Yong, V. W. Dynamics of the inflammatory response after murine spinal cord injury revealed by flow cytometry. J Neurosci Res. 86, 1944-1958 (2008).
- Hirai, T., et al. The prevalence and phenotype of activated microglia/macrophages within the spinal cord of the hyperostotic mouse (twy/twy) changes in response to chronic progressive spinal cord compression: implications for human cervical compressive myelopathy. PLoS One. 8, e64528 (2013).
- Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. J Immunol. 151, 2399-2408 (1993).
- Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. Cancer Res. 69, 431-439 (2009).
- Holland, E. C., et al. Combined activation of Ras and Akt in neural progenitors induces glioblastoma formation in mice. Nat Genet. 25, 55-57 (2000).
- Lynes, J., et al. Lentiviral-induced high-grade gliomas in rats: the effects of PDGFB, HRAS-G12V, AKT, and IDH1-R132H. Neurotherapeutics. 11, 623-635 (2014).
- de Vries, N. A., et al. Rapid and robust transgenic high-grade glioma mouse models for therapy intervention studies. Clin Cancer Res. 16, 3431-3441 (2010).
- Uhrbom, L., et al. Ink4a-Arf loss cooperates with KRas activation in astrocytes and neural progenitors to generate glioblastomas of various morphologies depending on activated Akt. Cancer Res. 62, 5551-5558 (2002).
- Marumoto, T., et al. Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors. Nat Med. 15, 110-116 (2009).
- Assanah, M., et al. Glial progenitors in adult white matter are driven to form malignant gliomas by platelet-derived growth factor-expressing retroviruses. J Neurosci. 26, 6781-6790 (2006).
