Summary
Hier voorgesteld is een eenvoudige methode voor het isoleren en flowcytometrische analyse van glioma infiltrerende perifere mononucleaire cellen die tijdsafhankelijk kwantitatieve gegevens over het aantal en activeringsstatus van immuuncellen die het begin hersentumor micro oplevert.
Abstract
Ons laboratorium heeft onlangs aangetoond dat natuurlijke killer (NK) cellen in staat zijn het uitroeien orthotopically geïmplanteerde muizen GL26 en rat CNS-1 maligne glioom kort na intracraniale enting als de kankercellen deficiënt zijn weergegeven in hun expressie van de β-galactoside-bindende lectine galectine -1 (gal-1). Meer recent werk toont nu dat een bevolking van Gr-1 + / CD11b + myeloïde cellen is cruciaal voor dit effect. Om een beter inzicht in de mechanismen waarmee NK- en myeloïde cellen samen om gal-1-deficiënte tumor afstoting verlenen we hebben een uitgebreid protocol voor de isolatie en analyse van glioma-infiltrerende perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC) ontwikkeld. De werkwijze wordt hier aangetoond door PBMC infiltratie in de tumor micro-omgeving van gal-1-expressie GL26 gliomen met die rendered gal-1-deficiënte via shRNA knockdown. Het protocol begint met een beschrijving van hoe de cultuur en voor te bereiden GL26 ceLLS voor enting in de syngene C57BL / 6J muis hersenen. Het verklaart vervolgens de stappen die betrokken zijn bij de isolatie en flowcytometrische analyse van glioom infiltreren PBMC's uit het begin van de hersenen tumor micro. De werkwijze is aanpasbaar aan een aantal in vivo experimentele modellen waarin temporele gegevens immune infiltratie in de hersenen vereist. De werkwijze is gevoelig en zeer reproduceerbare, zoals glioom-infiltrerende PBMCs worden geïsoleerd uit intracraniale tumoren 24 uur na tumor implantatie met gelijke waargenomen vanaf tijdstip afgestemd tumoren gedurende onafhankelijke experimenten celtellingen hoogte. Eén experimentalist kan de werkwijze van hersenen oogst tot cytometrische analyse van glioma infiltrerende PBMCs stromen ongeveer 4-6 uur afhankelijk van het aantal te analyseren monsters. Alternatieve glioma modellen en / of cel-specifieke detectie antilichamen kunnen eveneens worden gebruikt ter beoordeling van experimentalisten om de infiltratie van een aantal andere immun beoordelene celtypen van belang, zonder de noodzaak voor wijziging van de algemene procedure.
Introduction
Gliomen zijn een klasse van neuro hersenkanker voortvloeien uit getransformeerde glia binnen het centrale zenuwstelsel (CZS). Van alle gliomen, World Health Organization (WHO) graad IV glioma of glioblastoom (GBM) is de meest voorkomende en dodelijke 1. GBM is zeer ongevoelig is voor de huidige standaard-of-care bestaat uit tumorresectie zoveel mogelijk gevolgd door bestraling plus gelijktijdige en adjuvante chemotherapie met temozolomide 2. Deze dodelijke vormen van kanker dragen een sombere prognose slechts 15-18 maanden van overleving vanaf het moment van de initiële diagnose slechts 5% van de patiënten overleven van de ziekte na 5 jaar 3.
De aanwezigheid van de bloed-hersenbarrière (BBB), gebrek aan professionele antigenpresenterende cellen (APCs), en de eerder geïdentificeerde bestaan van bonafide lymfatische structuren binnen de hersenen 4 hebben geleid tot het begrip GBM immuun bevoorrecht. Echter, vele studies nu show dat deze hersenen kanker inderdaad wekken de werving van perifere immuuncellen die zijn overwegend myeloïde in oorsprong die monocyten, macrofagen, en myeloide suppressor cellen (MDSCs) 5 bevatten. GBM heeft ook invloed op de activiteit van de hersenen-resident microglia om pro-tumorigene 6,7 geworden. Lymfoïde cellen, zoals CD8 + T-cellen 8 en CD56 + natuurlijke killercellen 9 zijn ook aanwezig in de tumor micro-omgeving, maar in veel kleinere aantallen, een feit toe te schrijven aan immunosuppressieve werking aangezet door-glioom afgeleide factoren op tumor-geassocieerde macrofagen ( TAM) 10. CD4 + T-cellen zijn ook aanwezig in GBM, maar veel van deze populatie uit tevens CD25 en Foxp3, makers van immunosuppressieve regulerende T (T reg) cellen 11. De totale immunosuppressieve staat GBM culmineert in het bevorderen van immunologische ontsnappen en tumorprogressie 12.
13-19 ontwikkelen overwinnen. Het hoogtepunt van dit werk heeft nu geleid tot een klinische proef ontworpen om een gecombineerde cytotoxische en immuun-stimulerende therapeutische voor patiënten met nieuw gediagnosticeerde GBM (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT01811992) te evalueren.
Onze meest recente werk toont aan dat muis en rat CNS GL26-1 GBM cellen blokkeren anti-tumor NK cell immune surveillance door het produceren van grote hoeveelheden van de β-galactoside-bindende lectine galectine-1 (gal-1) 20. Dit werd aangetoond door het onderdrukken van de expressie van gal-1 in glioomcellen via shRNA gemedieerde gen knockdown. In vitro Experiments bleek dat gal-1-deficiënte glioomcellen gewoonlijk vermeerderd in cultuur, maar onderging een snelle afstoting kort na intracraniale enting in syngene C57BL / 6J of RAG1 - / - muizen, waardoor de onafhankelijkheid vaststelling van T- en B-cellen op deze vorm van tumor afstoting. NK cel immunodepletie met anti-asialo GM 1 anti- serum of monoklonale antilichamen NK1.1 geleid tot volledig herstel van intracraniale gal-1-deficiënte glioom groei, waardoor de rol van NK-cellen in gal-1-deficiënte glioom afstoting. We tonen nu dat immunodepletie van Gr-1 + / CD11b + myeloïde cellen voldoende om gal-1-deficiënte glioom afstoting ondanks de aanwezigheid van NK-cellen, dus een onmisbare ondersteunende rol van myeloïde cellen onthullend het verlenen van hulp NK-gemedieerde gal -1-deficiënte tumor lysis (ongepubliceerde gegevens). Deze onverwachte resultaat heeft geleid tot een algemeen protocol voor de isolatie en analyse van perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC's) ontstaan dieinfiltreren de hersenen tumor micro kort na intracraniële implantatie zodat we beter het immuunsysteem infiltratie gebeurtenissen die gal-1-deficiënte glioom afwijzing predikaat kunnen karakteriseren.
De methode wordt hier aangetoond met behulp van de muis GL26 glioom cellen die constitutief uitdrukkelijke mCitrine fluorescerend eiwit, genaamd GL26-Cit, dat directe tumorcel visualisatie mogelijk te maken door fluorescentiemicroscopie 21. Deze cellen worden geënt stereotactisch in de hersenen van syngene C57BL / 6J-muizen en kunnen groeien voor 24, 48 of 72 uur voorafgaand aan euthanasie muis. -Glioom infiltreren PBMC's worden vervolgens geïsoleerd en immunolabeled met behulp van anti -CD45, -GR-1, -CD11b en -NK1.1 celoppervlak antilichamen samen met intracellulaire immunolabeling voor granzyme B (GzmB). Deze specifieke combinatie van antilichamen maakt de identificatie van tumor infiltrerende Gr-1 + / CD11b + myeloïde cellen en NK1.1 + NK-cellen, celtypen we bEen betrokken bij gal-1-deficiënte tumor afstoting. De immune infiltratie profiel van gal-1-deficiënte GL26-Cit glioom, aangeduid hier als GL26-Cit-gal1i, wordt vervolgens vergeleken met die van gliomen expressie normale niveaus van gal-1 genoemd GL26-Cit-NT dat een niet bevatten targeting controle shRNA hairpin. Het protocol begint met een beschrijving over hoe de cultuur GL26-Cit glioom cellen in vitro, die wordt gevolgd door een uitleg over hoe orthotopically engraft deze cellen in het striatum van syngene C57BL / 6J muizen. Het gaat dan verder naar de stappen die betrokken zijn bij de isolatie en immunokleuring van glioma-infiltrerende PBMCs voor flowcytometrische analyse sommen. Het protocol wordt afgesloten met een toelichting van de standaard data-analyse en grafische weergave.
De demonstratie laat zien dat zowel Gr-1 + / CD11b + myeloïde cellen en NK1.1 + NK-cellen preferentieel ophopen in de gal-1-deficiënte hersenen tumor micro-omgeving binnen 48hr van de tumor implantatie, een resultaat dat helpt verklaren waarom deze tumoren sneller ondergaan volledige tumorlysis ongeveer 1 week na de tumor implantatie 20. De werkwijze is gemakkelijk aan een aantal verschillende in vivo experimentele modellen waarin temporele gegevens immune infiltratie in de hersenen vereist. Een enkele experimentalist kan het protocol uitvoeren van hersenen oogst tot cytometrische analyse van glioom infiltreren PBMCs stromen in ongeveer 4-6 uur, afhankelijk van het aantal monsters worden geanalyseerd. De werkwijze kan ook worden gecombineerd met experimenten gericht op het profiel van circulerende PBMCs in tumor dragende muizen ter vergelijking met die die de hersenen infiltreren zo te immunosuppressie fenotypes specifiek geïnduceerd door de tumor micro identificeren karakteriseren. De toepassing van deze en soortgelijke methoden moeten een beter begrip van de betrokken zijn bij de smokkel van perifere immuuncellen in de hersenen tumor micro factoren te vergemakkelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Let op: Lees de gehele protocol voor het uitvoeren van experimenten. Goedkeuring voor het gebruik van gewervelde dieren van de juiste institutionele commissie over het gebruik en het welzijn van dieren moeten voorafgaand aan de procedure worden verkregen.
1. Bereiding van tumorcellen voor Intracranial Engraftment
- Werken in een klasse II biologische veiligheid kabinet, beginnen met de voorbereiding van GL26-Cit-NT / gal1i celcultuurmedia door aanvulling van een fles van 500 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 10% steriel gefiltreerd hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS ), 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, 600 ug / ml G418 sulfaat (voor selectie van de mCitrine expressievector) en 3 ug / ml puromycine dihydrochloride (voor selectie van de niet- targeting of gal-1-specifieke shRNAs).
- Cultuur GL26-Cit-NT en / of GL26-Cit-gal1i cellen (Figuur 1A en 1B CO2 gedurende 1-2 dagen voorafgaand aan de tumor implantatie procedure of totdat de kolven bereikt 50-80% confluentie.
- Op de dag van de operatie, verwijder de celkweek media uit de glioom cellen met behulp van een 10 ml serologische pipet en een pipet pistool en gooi de media in een verspilling beker.
- Keer de kolf top-side-down en voeg 10 ml van DPBS aan de bovenzijde van de fles met behulp van een 10 ml serologische pipet. Langzaam keren de kolf met de cellen in DPBS te dekken, dan tip de kolf verticaal en te verwijderen en gooi de DPBS in een verspilling beker.
- Voeg 3-4 ml van niet-zoogdieren trypsine alternatief in DPBS met EDTA (zie lijst materialen voor meer informatie) voor elke T75 weefselkweek kolf en plaats terug in de weefselkweek kast voor 2-5 min. Met behulp van een helder-veld microscoop, controleren of alle van de cellen zijn losgeraakt van de bodem oppervlak voorafgaand aan de procedure.
- Remmen further enzymatische activiteit door verdunning van de trypsine alternatief met 6 ml van DPBS. Pipet op en neer met een 10 ml serologische pipet tot de bodem van de kolf te spoelen en mechanisch dissociëren elke celaggregaten. Zuig de cellen en plaats in de labels 15 ml centrifugebuizen. Draai de cellen neer op 550 xg (max RCF) gedurende 5 min bij 4 ° C (figuur 1C).
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen voorzichtig met 1 ml-un aangevuld DMEM. Zorg ervoor dat de cellen grondig en neer pipetteren met een P-1000 micropipet om een enkele celsuspensie te verkrijgen.
- Voeg een 1:10 verdunning van de verkregen celsuspensie gegenereerd in 1,6 door het plaatsen van 18 ui un aangevuld DMEM in een 0,6 ml kegelvormige polypropyleen microbuisjes gevolgd door de toevoeging van 2 pi van de tumorcel suspensie. Pipet op en neer met een P-10 micropipet om de cellen grondig homogeniseren.
- Voeg 10 ul &# 160, van de tumorcel 1:10 verdunning gemaakt in 1,7 een afzonderlijke 0,6 ml kegelvormige polypropyleen microbuisjes, voeg 10 ul van trypan blauwe vlek op de buis. Meng met een P-10 micropipet en voeg 10 ul van de resulterende tumorcel / trypan blauwe oplossing onder een dekglaasje bovenop een hemocytometer voorzichtig luchtbellen (figuur 1D) in te voeren.
- Tel de cellen met een lichte-veld microscoop met een 10X objectief volgens het protocol dat in verband met de gegeven hemocytometer. Zorg rekening houden met de 20-voudige verdunning van de oorspronkelijke tumor celsuspensie tijdens de bereiding van de cellen voor accurate schatting cel in de oorspronkelijke 1 ml aliquot. Gebruik de volgende formule om het totaal aantal cellen te berekenen: totale cellen / ml = [((Σcells gerekend per vierkante) / # vierkantjes geteld) x 20 (dwz verdunningsfactor) x 10.000 cellen / ml].
- Na determining het totale aantal cellen van elke cellijn gebruikt in het experiment gegeven, draaien ze neer op 550 xg (max RCF) gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant (s) en resuspendeer de cellen met een geschikt volume-un aangevuld DMEM om een doelconcentratie van 3 x 10 4 cellen per 1 pl bereiken voor elke cellijn volgens de volgende formule: (totaal # van cellen / 30.000).
- Plaats een equivalent volume van elke cellijn in respectievelijk gelabeld 0,6 ml conische polypropyleen buizen en plaats op ijs (figuur 1E). Zorg ervoor dat sommige cellen te redden door te gaan propageren elke cellijn als aparte T75s niet eerder werden gezaaid.
2. Procedure voor de stereotactische Engraftment van gliomacellen in het striatum van C57BL / 6J muizen
- Bereid als volgt werken oplossingen van chirurgische anesthesie, analgesie en anesthesie omkering voorafgaand aan de operatie:
- Voor ketamine / dexmedetomidine surgical anesthesie verwijderen 1,4 ml van een 10 ml flacon steriel 0,9% NaCl injectie en vervangen door 600 pl van een 100 mg / ml voorraadoplossing van ketamine-hydrochloride en 800 pl van een 0,5 mg / ml voorraadoplossing van dexmedetomidine hydrochloride met een opbrengst gemengde werkoplossing van ketamine hydrochloride (6 mg / ml) en dexmedetomidine hydrochloride (0,04 mg / ml).
- Voor buprenorfine analgesie: verwijder 1 ml van een 10 ml flacon steriel 0,9% NaCl-injectie vervangen door het gehele volume 1 ml van een 0,3 mg / ml stock buprenorfine hydrochloride ampul een 0,03 mg / ml werkoplossing verkregen.
- Voor atipamezol chirurgische anesthesie omkering: verwijder 1 ml van een 10 ml flacon steriel 0,9% NaCl injectie en vervangen door 1 ml van een 5 mg / ml voorraadoplossing van atipamezolhydrochloride een 0,5 mg / ml werkoplossing verkregen.
- Werken in een goedgekeurde locatie voor muis overleven surgery, eerst instellen geautoclaveerd of bead gesteriliseerd chirurgische instrumenten en andere reagentia zoals in (figuur 2A), bereken genoeg 8-10 weken oude vrouwelijke C57BL / 6J-muizen (syngene met GL26 glioom) vereist voor de studie; zorgen voor hun continue toegang tot voedsel en water.
- Verdoven de eerste muis met een intraperitoneale (ip) injectie van anesthesie werkende oplossing leveren van een dosis van 75 mg / kg ketamine en 0,5 mg / kg dexmedetomidine (ongeveer 250 ul van een 20 g muis). Vervolgens werd een 5 mg / kg subcutaan (sc) injectie van carprofen (ongeveer 100 ul van een 20 g muis). Zorg ervoor dat de muis is niet-ontvankelijk tot teen en de staart knijpt voorafgaand aan de procedure.
- Met behulp van chirurgische clippers, scheren de vacht van de schedel. Solliciteer povidonjood antiseptische oplossing voor het geschoren gebied, schrobben met een 70% isopropylalcohol prep pad, vervolgens opnieuw toe te passen povidonjood antiseptische oplossing. Breng vervolgens een kleine hoeveelheid sterile petrolatum oogzalf om elk oog om uitdroging te voorkomen.
- Zet de schedel in de stereotactische kader volgens het volgende protocol:
- Zorgvuldig de mond te openen door het bereiken met een paar gebogen ontleden tang om voorzichtig trek de tong en te verplaatsen naar één kant van de mond te voorkomen verstikking. Laat de tang te trekken, terwijl in de mond aan de kaak in het sleutelgat van de tand bar op de stereotactische kader verspreid open en begeleiden van de bovenste twee snijtanden. Zet de tandstang van scharnierende horizontaal of verticaal door het aanpassen van de respectievelijke schroeven. Zorg ervoor dat de schedel van de muis is niveau met de bank top.
- Plaats het oor staven stevig tegen postorbital botten van de schedel voorzichtig te veel binnenwaartse druk niet toe te passen op de schedel om te voorkomen breken.
- Plaats de neus balk over de snuit en vastschroeven tot knus. Controleer dat er geen verticale / zijwaartse beweging in het hoofd door het toepassen van lichte drukmet een duim en wijsvinger. Een muis goed geplaatst in een stereotactische frame is getoond in (figuur 2B).
- Met behulp van een scalpel, maak een 1 cm middellijn incisie in de schedel van de frontale bot om de occipitale bot. Trek de huid op de incisie met behulp van Colibri retractors.
- Laat de microliter spuit uitgerust met een 33 G naald bevestigd aan de verticale arm van de stereotactische kader direct boven de positie van bregma (figuur 2C). Van daar, stel de positie van de naald 0,5 mm AP, 2,5 mm ML naar het doel site voor tumorimplantatie bereiken. Gebruik een 1 ml tuberculine spuit uitgerust met een 26 G naald naar deze locatie markeren door voorzichtig excoriating het periost.
- Boor een gat in de schedel op de doelplaats tot aan de onderliggende dura mater met een draadloze nauwkeurig boormachine voorzien van 1/32 "(0,8 mm) bit. Tijdens het boren toepassing intermitterende druk gevolgd door verwijdering van de drill bit van het oppervlak van de schedel aan overmatige warmte en kracht die anders tot de boorbeitel doorboren het onderliggende hersenweefsel voorkomen.
- Spoel de microliter injectiespuit met 0,9% NaCl in een 1,7 ml kegelvormige polypropyleen microbuisjes zodat de naald niet verstopt. Tik zachtjes tegen de 0,6 ml conische polypropyleen microbuisjes met de tumorcellen verschillende keren om de cellen te mengen.
- Trek 2 pl van cellen in het microliter spuit ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen worden geïntroduceerd in de spuit. Verdeel 1 ul van de cellen op een 70% isopropyl alcohol prep pad verlaat precies 1 pl tumorcellen nog in de injectiespuit.
- Breng de naald naar beneden totdat het raakt de dura mater, dan introduceren de naald in de hersenen -3,5 mm ventraal en intrekken van 0,5 mm. Langzaam en gelijkmatig leveren van de cellen door het indrukken van de zuiger de loop van 1-2 minuten.
- Laat de cellen settle op de injectieplaats gedurende 5 min voor langzaam trekken van de naald. Veeg gestold bloed of de hersenen materie van de punt van de naald met een schone 70% isopropylalcohol prep pad. Spoel de naald en spuit grondig met 0,9% NaCl van 2,6 stap zodat de naald niet verstopt is voor de volgende injectie.
- Verwijder de Colibri oprolmechanismen en hechtdraad de hoofdhuid met behulp van drie 3-0 nylon monofilament hechtingen. Verwijder de muis uit het stereotactische frame toedienen 0,1 mg / kg buprenorfine hydrochloride subcutaan (sc) (ongeveer 67 pl van de 0,03 mg / ml werkoplossing een 20 g muis), gevolgd door 2,5 mg / kg atipamezolhydrochloride intramusculair (im) (ongeveer 100 pl van het 0,5 mg / ml werkoplossing een 20 g muis) voor post-operatieve pijnverlichting en anesthesie omkering. Plaats postoperatieve muizen terug in hun kooi onder een warmtelamp om te herstellen.
3. Mouse transcardial Perfusion en oogsten van de hersenen
- Bereid gehepariniseerde Tyrode de oplossing volgens het volgende protocol:
- Doe een magnetisch roerstaafje in een 1 L glas schroefdop opslag fles en vul aan met ultrapuur gedeïoniseerd water. Plaats de fles op een roerplaat.
- Weeg en voeg de volgende chemicaliën om de glazen fles onder roeren: 8 g natriumchloride (NaCl), 0,264 g calciumchloride (CaCl 2 • 2 H 2 O), 0,05 g natriumfosfaat monobasisch (NaH 2 PO 4 • 2 H 2 O), 1,0 g D-glucose (C 6 H 12 O 6), 1,0 g natriumbicarbonaat (NaHCO3), 0,2 g kaliumchloride (KCl). Laat de zouten op te lossen, voeg dan 100 ul van een 1,000U / ml voorraadoplossing natriumheparine de Tyrode-oplossing.
- Verwijder de container uit het roeren plaat en haal de roerstaaf met een magnetische toverstaf. Bewaar gehepariniseerde Tyrode-oplossing bij 4° C.
- Bereid een werkende oplossing voor terminale anesthesie als volgt:
- Voor ketamine / xylazine terminal anesthesie: verwijder 1360 pi van een 10 ml flacon steriel 0,9% NaCl injectie en vervang 1200 ui van een 100 mg / ml voorraadoplossing van ketamine-hydrochloride en 160 ui van een 100 mg / ml voorraadoplossing van xylazine hydrochloride een gemengde werkoplossing van ketamine hydrochloride (12 mg / ml) en xylazine hydrochloride (1,6 mg / ml) werd verkregen.
- Bereid dichtheidscentrifugeren mediamix oplossing door het plaatsen van 90 ml van 10x PBS in 264 ml ultrapuur gedeïoniseerd water (3.93x) in een steriele plastic container. Titreer op pH 7,0-7,2 met HCl en filtreer steriliseer door een 0,22 urn filter. Bewaar bij 4 ° C.
- Bereid 70% dichtheidcentrifugatie media door het combineren van 18 ml dichtheidscentrifugatie mediamix oplossing 30 ml dichtheidscentrifugatie media (zie lijst materialenvoor meer informatie) in een 50 ml polypropyleen centrifugebuis. Bewaar bij 4 ° C, maar brengt tot kamertemperatuur vóór gebruik.
- Bereid 37% dichtheidcentrifugatie media door het combineren van 9,6 ml DPBS met 10,4 ml 70% dichtheidscentrifugatie media in een 50 ml centrifugebuis. Bewaar bij 4 ° C, maar brengt tot kamertemperatuur vóór gebruik.
- Bereid stroom buffer door het plaatsen van 500 pl FBS in 50 ml DPBS (~ 1% FBS) in een 50 ml centrifugebuis. Slaan op te slaan bij 4 ° C
- Vul een 4,5 L polyurethaan ijsemmer capaciteit met ijs chips.
- Voeg een gecombineerde oplossing van 1 mg / ml collagenase en 1 mg / ml DNase-I in voldoende hoeveelheid 1 ml per hersenmonster in de studie door verdunning van een 10 mg / ml DNase-I voorraadoplossing 1:10 en 50 mg / ml collagenase stockoplossing 01:50 met steriele DPBS in een enkele 15 ml polypropyleen centrifugebuis. Meng de oplossing en neer te pipetteren met een P-1000 micropipet. Slaan op ijs in de polyurethane emmer vanaf stap 3.7.
- Verkrijgen twee 7 ml glazen Dounce weefsel slijpmachines. Label een "NT" en de andere "gal1i". Plaats het weefsel molens in het ijs emmer en voeg 1 ml DPBS aan elke.
- Verkrijgen genoeg 15 ml centrifugebuizen hersenen materie te verzamelen van elke muis in de studie en de plaats in de ijsemmer.
- Plaats ~ 150 ml DPBS tussen drie 50 ml centrifuge buizen in de ijsemmer.
- Verkrijgen genoeg polystyreen hexagonale droogschalen (bovenste binnendiameter (ID) 115 mm, base ID 85 mm, 203 ml volume) voor elke muis in de studie. De complete set voor dissectie en aanwrijven van muizenhersenen wordt weergegeven in (figuur 3A)
- Op gekozen tijdstippen verdoven de eerste tumordragende muizen in het onderzoek met een enkele ip injectie van 150 mg / kg ketamine hydrochloride en 20 mg / kg xylazine hydrochloride (ongeveer 250 pl van de gecombineerde 12 mg / ml ketamine / 1,6 mg / ml xylazine werkoplossing een 20 g muis) diepe anesthesie. Zorg ervoor dat de muis is non-respons tot teen en de staart knijpt voorafgaand aan de procedure.
- Haal de eerder bereide Tyrode's oplossing en plaats in een laminaire stroming kap gewijd aan klem dier chirurgische procedures. Plaats gas impermeabele polymere buis bevestigd aan een carbogen reservoir in de Tyrode-oplossing. Open de tankklep tot 95% O2 / 5% CO 2 carbogen laat continu borrelen in de oplossing.
- Bevestig een 20 G aluminium naaf stompe naald om het eind van extra gas impermeabele polymere buis verbonden met een peristaltische pomp. Plaats de buis aan het andere uiteinde van de peristaltische pomp in de Tyrode's oplossing en zet de pomp om de buis te vullen met zuurstof en gehepariniseerde Tyrode's oplossing. De set-up voor de muis transcardial perfusie wordt weergegeven in (figuur 3B).
- Met behulp van vier 26 G naalden, vastpinnende verdoofde muis buikzijde door de voorste en achterste poten op een geëxtrudeerd polystyreen blok bedekt met een verwijdering absorberende handdoek in de laminaire stroming kap.
- Pak de huid boven de peritoneale holte met een paar stompe dissectie pincet, en met een paar grote dissectie scharen een "Y" snede door penetreren de peritoneale wand snijden cephalically het membraan doorboren en vervolgens bifurcating het borstbeen te eindigen bij de linker en rechter axillaire.
- Gebruik een hemostaat aan het borstbeen klem en weerspiegelen de ribbenkast over de muis linker schouder. Verwijder het pericardium met het paar stompe dissectie pincet.
- Schakel de peristaltische pomp om een constante infuus van zuurstof en gehepariniseerde Tyrode's oplossing (ongeveer 2,3-2,5 ml / min) starten.
- Steek de stompe naald in de linker ventrikel van het hart. Gebruik een paar kleine dissectie schaar om het rechteratrium knippen om voor verbloeding (fig3C).
- Laat de Tyrode-oplossing grondig perfuseren de muis bloedsomloop totdat de lever en de longen volledig zijn geblancheerd vanwege het gebrek aan bloed. Zorg ervoor dat geen grote hoeveelheden bloed blijven de rechterboezem voorafgaand aan het verwijderen van de 20 G aluminium hub stompe naald uit de linker hartkamer te verlaten.
- Losmaken van de muis van de geëxtrudeerd polystyreen schuim blok en draai de muis ventrale zijde naar beneden. Met een grote paar dissectie scharen, scheid de kop van de rest van het lichaam ter hoogte van de nek.
- Met een paar kleine dissectie scharen, knippen de hoofdhuid aan de middellijn vanaf het schedelbeen voren werken aan de snuit om de schedel bloot te leggen.
- Trek de huid aan beide zijden van de schedel met een duim en wijsvinger en houd de schedel stevig. Gebruik een paar bot Rongeurs te breken door de schedel te beginnen bij de occipitale bot en werk uit naar de dorsale en laterale volledig blootoppervlakken van de hersenen. Zorg om schade aan de hersenen te minimaliseren.
- Zodra de schedelbotten zijn verwijderd, draai het hoofd van de muis ventrale zijde naar boven en gebruik een kleine paar van dissectie schaar om de hersenzenuwen aan de basis van de hersenen te snijden om het te bevrijden van de schedel.
4. Isolatie van glioom infiltreren PBMCs
- Met een schone enkele edged razor blade, isoleer het gebied van de hersenen die de tumor door een sagittale snede in het midden van de hersenen naar de twee hersenhelften halveren. Draai de ipsilaterale hemisfeer mediale zijde omlaag en maak twee coronale snijdt op het niveau van het cerebellum en de bulbus olfactorius tot het doelweefsel waarin de tumor implantaat (figuur 4A) te isoleren. Een equivalente deel van de contralaterale hemisfeer kunnen eveneens worden geïsoleerd en gebruikt als negatieve controle.
- Plaats het doelweefsel in de respectievelijk gelabeld glazen Dounce weefsel molen met 1 ml, van DPBS, duw de zuiger helemaal naar beneden en draai 7 keer om in eerste instantie te verstoren het weefsel. Til de zuiger om de vloeistof terug naar de bodem van de weefselvermaler. Herhaal deze stap driemaal; echter alleen draai de plunjer 4 keer tijdens de komende twee herhalingen en 3 keer tijdens de laatste herhaling te voorkomen dat over tritureren het weefsel.
- Met behulp van een P-1000 micropipet, achtereenvolgens drie volumina van 1 ml ijskoude DPBS (bereid in 3,11) langs de zijden van de plunjer toepassing te spoelen in het weefsel molen.
- Resuspendeer de getritureerd hersenmaterie door en neer te pipetteren en plaats in een gelabelde 15 ml centrifugebuis op ijs. Spoel de wanden van de Dounce weefselmaler met nog 1 ml ijskoude DPBS en aan dezelfde 15 ml centrifugebuis. Houd alle buizen die getritureerd hersenmassa op ijs totdat alle monsters zijn verwerkt.
- Herhaal stap 3,13-3,25 en 4,1-4,4 voor elke muis in de studie.
- Zodra alle monsters have verwerkt, het afsluiten van de getritureerd hersenmateriaal in de 15 ml centrifuge buizen bij 740 xg (max RCF) gedurende 20 min bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant met een pipet 10 ml serologische pipet en pistool en resuspendeer de gepelleteerde hersenmateriaal in 1 ml van de vooraf bereide collagenase / DNase-I spijsverteringsenzymen met een P-1000. Plaats de 15 ml centrifuge buizen in een reageerbuis rek en plaats in een 37 ° C waterbad gedurende 15 minuten.
- Voorzichtig schudden de monsters twee keer gedurende de incubatieperiode van flicking de buizen om weefsel disaggregatie vergemakkelijken.
- Voeg 6 ml ijskoud DPBS met een 10 ml serologische pipet aan elke buis aan de spijsverteringsenzymen verdunnen. Pipet op en neer te resuspendeer en filteren de totale volumes door steriele 70 um nylon mesh filters in nieuwe label 15 ml centrifuge buizen op ijs.
- Draai de hersenen celsuspensie neer op 740 xg (max RCF) gedurende 20 min bij 4 ° C te komen tot eensingle cell pellet (Figuur 4B). Na het verwijderen van de 15 ml buizen uit de centrifuge plaats ze op ijs en verhoog de temperatuurinstelling van de centrifuge tot ongeveer 21 ° C ter voorbereiding op de volgende stap.
- Volledig verwijderen van de supernatant uit elke buis die hersencellen en aanvankelijk resuspendeer de pellets in 1 ml 70% dichtheidscentrifugatie media met behulp van een P-1000 micropipet. Voeg dan 4 aanvullende milliliter 70% dichtheidscentrifugatie media aan elke buis met een 10 ml serologische pipet. Schroef de doppen op veilig en homogeniseren van de celsuspensie door voorzichtig omkeren om meerdere malen buizen.
- Verwijder de 15 ml centrifuge buisjes met hersencellen gesuspendeerd in 70% dichtheidscentrifugeren media uit ijs, en plaats in een reageerbuis rek bij RT. Een voor een voorzichtig overlay 2 ml 37% dichtheidscentrifugatie mediaoplossing op de 5 ml 70% dichtheidscentrifugatie media met een P-1000 micropipet ac vormenlean-interface tussen de twee dichtheidscentrifugeren media lagen (Figuur 4C).
- Gebruik een fijne tip marker om de positie van het grensvlak geven zodat deze eenvoudig kan worden geïdentificeerd na centrifugeren, waarin het onderscheid minder duidelijk.
- Spin beneden de 15 ml centrifuge buizen bij 740 xg (max RCF) gedurende 20 min bij kamertemperatuur zonder onderbreking aan te verstoren de interface.
- Na centrifugeren, verzamel de PBMC's die door invoering van een P-200 micropipet in de buis langs de zijkant voorzichtig omzeilen van de lipide laag bij het grensvlak tussen de twee media dichtheidscentrifugatie lagen (figuur 4D) hebben verzameld.
- Eenmaal op het niveau van de PBMC band langzaam extract 200 gl van het oppervlak van de 70% dichtheidscentrifugatie media laag en plaats in een respectievelijk gemerkt polypropyleen FACS buis op ijs. Herhaal dit eenmaal voor een totaal volume van 400 ul per monster.
- Voeg 3 ml buffer stroom aan elke FACS buis met 400 ui van PBMC's tot de dichtheid centrifugatie media voldoende verdund, dan draaien de cellen neer op 660 xg (max RCF) gedurende 20 min bij 4 ° C.
5. immunolabeling van glioom infiltreren PBMCs
- Voorafgaand aan de analyse van elke experimentele PBMC monsters, het uitvoeren van een enkele, onafhankelijke, celoppervlak isotypecontrole experiment om de baseline poorten vast te worden geassocieerd met een set van vaste PMT spanningen binnen een flowcytometrische data-analyse template gewijd aan de beoordeling van glioom infiltreren PBMCs volgens het volgende protocol:
- Engraft een C57BL / 6J muizen met GL26-Cit-gal1i en andere met GL26-Cit-NT volgens de werkwijze beschreven in punt 2. Na 72 h tumorgroei, euthanaseren zowel muizen en isoleren van de tumor-infiltrerende PBMC volgens de procedures geschetst hele paragrafen 3 en 4.
- Combineer de twee PBMC-monsters (NT and gal1i) in een volume (dat wil zeggen, 100 ui), vervolgens verder het monster gelijkmatig verdelen over drie FACS buisjes (dwz 33,3 pi per buis) gemerkt "CD45 isotype", "Gr-1 / CD11b isotype" en "NK1. 1 isotype ". De volgende antilichamen (elk bij een 1: 100 verdunning en verdund tot een totaal volume van 200 ul in flow buffer) aan de respectievelijk gemerkte FACS buisjes: "CD45 isotype": Alexa Fluor 700-geconjugeerd rat IgG2b, κ (kloon: RTK4530 ); "Gr-1 / CD11b isotype": Alexa Fluor 700-geconjugeerd rat anti-muis CD45 (kloon: 30-F11), PE-geconjugeerd rat IgG2b, κ (kloon: eB149 / 10H5) en PerCP / Cy5.5 -geconjugeerd rat IgG2b, κ (kloon: RTK4530); "NK1.1 isotype": Alexa Fluor 700-geconjugeerd rat anti-muis CD45 (kloon: 30-F11), PE-geconjugeerd rat anti-muis Gr-1 (kloon: RB6-8C5), PerCP / Cy5.5-geconjugeerd rat anti-muis CD11b (kloon: M1 / 70) en APC-conjugated muis IgG2a, κ (kloon: eBM2a).
- Sta PBMCs te immunolabel op ijs in het donker gedurende 20 minuten. Flick de buizen eenmaal halverwege de incubatieperiode om voorzichtig te mengen. Was met 1 ml buffer stroom, het afsluiten bij 660 xg (max RCF) gedurende 10 min bij 4 ° C en resuspendeer elk FACS buis met PBMCs met 200 ui buffer stroming.
- Met een flow cytometer uitgerust met een 85 urn geïntegreerde nozzle, analyseren "CD45 isotype" tube eerste basislijn CD45 interval gate stellen. Vervolgens voert u de "Gr-1 / CD11b isotype" buis naar een uitgangswaarde Gr-1 / CD11b kwadrant gate te vestigen met behulp van enige ware CD45 + cellen als input. Tot slot voert u de "NK1.1 isotype" buis naar een uitgangswaarde NK1.1 interval poort tot stand met behulp van enige ware CD45 + / Gr-1 laag / CD11b +/- cellen als input.
- Gebruik de volgende procedure voor alle toekomstige experimentele eenalysis:
- Voeg een voldoende hoeveelheid van een 1: 100 verdunning van celoppervlak antilichamen in flow buffer een 200 ui volume per monster (plus 1 voor GzmB isotype) te bereiken: Alexa Fluor 700-geconjugeerd rat anti-muis CD45 (kloon: 30-F11 ), PE-geconjugeerd rat anti-muis Gr-1 (kloon: RB6-8C5), PerCP / Cy5.5-geconjugeerd rat anti-muis CD11b (kloon: M1 / 70), APC-geconjugeerd muizen anti-muis NK1.1 (kloon: PK136).
- Verwijder de supernatant van de afgedraaid PBMC van 4,15 tot meniscus net boven de bodem van elke FACS buis (~ 50 pi) naar cel verliezen te vermijden. Resuspendeer de PBMCs in elke FACS buis met behulp van de reststroom buffer met een P-200 micropipet en verwijderen (1 / # van monsters) waarde van het volume van elk FACS buis en combineren tot een nieuwe FACS buis met het label "samengevoegde isotype".
- Voeg 200 ul van het celoppervlak antilichaam cocktail bereid 5.2.1 PBMC aan elk monster. Sta PBMCs te immunolabel op ijs in het donker gedurende 20 minuten. Flick tHij buizen eens halverwege de incubatieperiode om voorzichtig te mengen.
- Was met 1 ml buffer stroming; spin down 660 xg (max RCF) x 10 min bij 4 ° C.
- Resuspendeer alle FACS buisjes met PBMC in 200 pi van een commercieel verkrijgbaar formaline gebaseerde fixatief (zie lijst materialen voor details) gedurende 15 min op ijs in het donker. Flick de buizen eenmaal halverwege de incubatieperiode om voorzichtig te mengen.
- Was met 1 ml van een in de handel verkrijgbaar 1x permeabilisatie / wasbuffer (zie lijst materialen voor details) en spin neer op 660 xg (max RCF) gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Terwijl PBMC's worden met draaien, stelt een voldoende hoeveelheid van een 1: 100 verdunning van Pacific Blue-geconjugeerd muizen anti-muizen GzmB (Clone: GB11) intracellulaire antilichamen in 1x permeabilisatie / wasbuffer een 200 ui volume per monster te bereiken.
- In een afzonderlijke buis, stelt een enkelvoudige 200 gl volume van een 1: 100 verdunning van Pacific Blue-conjugated muis IgG1, κ (kloon: MOPC-21) isotype controle antilichaam.
- Resuspendeer elk van de experimentele PBMC monsters met 200 ui van de 1: 100 verdunning van antimuis GzmB antilichamen en resuspendeer de interne FACS buis label "gepoold isotype" de 200 ui volume van de 1: 100 verdunning van isotype antilichamen.
- Laat alle PBMC monsters immunolabel op ijs in het donker gedurende 20 min. Flick de buizen eenmaal halverwege de incubatieperiode om voorzichtig te mengen.
- Was met 1 ml buffer stroming; spin down bij 660 xg (max RCF) gedurende 10 min bij 4 ° C en resuspendeer PBMCs met 200 pl stroom buffer voor analyse.
- Flow cytometrically-glioom infiltreren PBMCs met behulp van een 85 micrometer geïntegreerde nozzle en de poorten en PMT voltages eerder in paragraaf 5.1 22 opgericht analyseren. Zorg ervoor dat u het volledige volume van elk monster op de stroom lopen cytometer om een eerlijke vergelijking van het totale aantal van glioom-infilt zorgenclassificatie PBMCs in elk monster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De volgende gating strategie wordt gebruikt voor een typisch experiment: FSC-A vs. SSC-A → SSC-H vs. SSC-W → FSC-H vs FSC-W → CD45 vs. count → Gr-1 vs. CD11b → NK1.1 vs. tellen. Gates geplaatst Gr-1 + / CD11b + myeloïde cellen en NK1.1 + NK-cellen worden vervolgens gestratificeerd op basis GzmB expressie (Figuur 5A). Backgating die cellen geïdentificeerd als NK1.1 + NK-cellen en Gr-1 + / CD11b + myeloïde cellen in onze experimenten op FSC-A vs. SSC-A bevestigt de kleinere lymfoïde omvang van NK-cellen en de relatief grote omvang van myeloïde cellen ( Figuur 5B). Ruwe data bestanden (bijv., FCS bestanden) worden geanalyseerd door commercieel beschikbare stroom cytometrische data-analyse software zoals FlowJo.
Een totaal van 18 C57BL / 6J muizen werden gebruikt om deze werkwijze te demonstreren. Negen (9) werden geënt met GL26-Cit-NT en 9 werden geënt met GL26-Cit-gal1i op dezelfde day gebruik equivalent aantal cellen (3x10 4). Drie muizen uit elke groep werden gedood op 24, 48 en 72 uur na tumor implantatie. De gegevens tonen aan dat engraftment van GL26-Cit-gal1i glioma cellen in de hersenen van syngene C57BL / 6J-muizen induceert snel de werving van CD45 + PBMC (figuur 6A). Op basis van de specifieke antilichaam cocktail die in de demonstratie kan verder worden aangetoond dat Gr-1 + / CD11b + myeloïde cellen en NK1.1 + NK-cellen specifiek voert de gal-1-deficiënte tumor micro-omgeving binnen 48 uur van tumor implantatie (figuur 6B en 6C); maar het totale aantal infiltrerende-glioom myeloïde cellen veel groter dan die van NK-cellen.
Figuur 1: Bereiding van GL26-Cit Cellen voor Intracranial Engraftment (A.) Vertegenwoordiger 10X helder-veld en epifluorescentie microfoto van GL26-Cit-NT (linker beelden) en GL26-Cit-gal1i (rechts beelden) cellen gekweekt in de cultuur. (B) Western blot van GL26-Cit-NT (links voorsorteren) en GL26-Cit-gal1i (rechter rijbaan) gehele cellysaat. Gamma tubuline (γ-bad.) Weergegeven als ladingscontrole. (C) GL26-Cit celpellet van een ongeveer 50% confluente T75 weefselkweek kolf na centrifugatie bij 550 xg (max RCF) gedurende 5 min bij 4 ° C. (D) Bright-gezichtsveld van een hemocytometer met GL26-Cit cellen (witte stippen) 1: 1 verdund met Trypan Blauw naar het aantal cellen en de levensvatbaarheid beoordelen. De cellen moet> 90% levensvatbaar reproduceerbaar tumorgroei waarborgen. Het gemiddelde van de celtellingen van de vierkantjes gemerkte 1 tot 5 moeten worden genomen om de nauwkeurigheid van de celtelling schatting toenemen. (E) GL26-Cit cellen gesuspendeerd in 3 x 10 4 cellen / ul in-un aangevuld DMEM voor intracraniële IMPLAntation. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Stereotactische Engraftment van glioomcellen in het striatum van C57BL / 6J muizen (A) operatiekamer layout waarin de vereiste chirurgische instrumenten en reagentia.. (B) Close-up van een C57BL / 6J muis ingezet in een stereotactische frame met de juiste plaatsing van de naald bij 0,5 mm AP, 2,5 mm ML en -3,0 mm DV opzichte van bregma. (C) Dorsaal zicht van de muis schedel die de positie van bregma en de beoogde locatie voor tumorcel innesteling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Muis transcardial Perfusie (A) Benodigde reagentia voor dissectie, trituratie en enzymatische afbraak van de muis hersenweefsel. (B) etage instrumenten en reagentia nodig voor muizen transcardial perfusie met zuurstofrijk en gehepariniseerde Tyrodes oplossing wordt in een laminaire stroming kap gewijd aan klem muis chirurgische procedures. (C) Schematische weergave van het hart te tonen juiste instrumenten en stages vereist voor transcardial perfusie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Isolatie van glioom-infiltrerendePBMCs. (A) strategie voor de dissectie van de muis hersenweefsel met vroeg stadium orthotopic glioom implantaten. Het bovenste paneel toont de sagittale tweedeling van de ipsilaterale hemisfeer weg van de contralaterale halfrond. Het onderste paneel toont de coronale twee bijkomende verlagingen noodzakelijk het doelweefsel daarin de tumor implantaat (paars gemarkeerd) isoleren. (B) Enkele cel hersenweefsel pellet (witte pijl) na de enzymatische afbraak, filtratie door een 70 um nylon mesh en centrifugeren. (C) Goed gegoten dichtheid gradiënt centrifugatie media voorafgaand aan centrifugatie. De witte pijl geeft de schone interface gevormd tussen de twee dichtheidscentrifugatie media lagen. (D) dichtheid gradiënt centrifugatie media na centrifugeren waaruit de lipide laag die vormt boven de 37% dichtheidscentrifugatie media layer witte pijl) en de PBMC band (geschetst the gestippelde zwarte lijnen) op het grensvlak tussen de twee lagen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Flow cytometrische Gating strategie gebruikt voor het identificeren-glioom infiltrerende Gr-1 + / CD11b + myeloïde cellen en NK-cellen (A) Stap 1:. Totaal immunolabeled cellen geïsoleerd uit PBMC band een dichtheidscentrifugatie media gradient zijn gated aan sluiten cellulair afval (FSC-A minder dan ~ 50 K). Stap 2 en 3: Doublet discriminatie gating om te filteren op cellulaire aggregaten. Stap 4: CD45 gate-glioom infiltrerende immuuncellen herkennen. Isotype controle wordt getoond als grijze silhouet. Stap 5: CD45 + cellen gestratificeerd op basis Gr-1 en CD11b. Isotypecontrole voor zowel Gr-1 en CD 11b wordt gelegd op het perceel en omsloten door de gouden cirkel. De rode cirkel geeft Gr-1 + / CD11b + myeloïde cellen. Stap 5 ': Gr-1 + / CD11b + myeloïde cellen gestratificeerd op basis van GzmB expressie. Zoals beweerd, zijn deze cellen niet te labelen met anti-GzmB antilichamen dan isotypecontrole (grijs silhouet). Stap 6: Gr-1 laag cellen door de zwarte rechthoek in stap 5 beschreven gestratificeerd op basis van NK1.1 expressie. Isotype controle wordt getoond als grijze silhouet. Stap 6 ': NK1.1 hoge cellen gestratificeerd op basis van GzmB expressie. Deze cellen inderdaad label met anti-GzmB antilichamen boven isotypecontrole (grijs silhouet). (B) Backgating van Gr-1 + / CD11b + myeloïde cellen op FSC-A vs. SSC-A aantonen dat NK cellen een kleinere lymfoïde omvang in vergelijking met de grotere afmetingen Gr-1 + / CD11b + myeloïde cellen."_blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Vergelijking van PBMC Infiltratie in de GL26-Cit-NT vs. GL26-Cit-gal1i tumor micro over de eerste drie dagen van intracraniële tumorgroei (A) Totaal CD45 + immuuncellen.. (B) CD45 + / Gr-1 + / CD11b + myeloïde cellen. (C) CD45 + /NK1.1 + NK-cellen. Datapunten uit PBMCs geïsoleerd van GL26-Cit-gal1i gliomen zijn verbonden door vloeiende lijnen, whiles die geïsoleerd van GL26-Cit-NT gliomen zijn verbonden door gestippelde lijnen. Glioom-infiltrerende PBMC van drie muizen werden geanalyseerd per tumortype op elk tijdstip. Getallen die bij elke gegevens punt op de GL26-Cit-gal1i curves vertegenwoordigen de fold-inductie van dat specifieke PBMC soort dan GL26-Cit-NT op de aangegeven uur na tumor implantatie (HPI). De gegevens stellen het gemiddelde aantal immuuncellen geteld ± de standaardfout van het gemiddelde (SEM). Statistische analyse werd uitgevoerd door 2-weg-analyse van variantie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft een robuuste en reproduceerbare werkwijze voor het isoleren en flowcytometrische analyse van PBMC die de vroege muizenhersenen tumor micro geïnfiltreerd. Glioom celsuspensies worden gegenereerd in een concentratie die door de experimentator die stereotactisch worden geënt in het striatum van de hersenen van muizen. Muizen worden vervolgens gedood op vooraf bepaalde tijdstippen gespecificeerd door het experimentele ontwerp en hun hersenen worden geoogst en verwerkt tot glioma infiltreren PBMCs die immunologisch met combinaties van fluorochroom-geconjugeerde primaire antilichamen te isoleren; immunolabeled cellen worden vervolgens gekwantificeerd door flow cytometrie. Hoewel de demonstratie hier gepresenteerde richt zich op vroege tijdstippen, kan-glioom infiltreren PBMCs worden beoordeeld op elk tijdstip na de tumor-implantatie tot muis moribundity. De werkwijze is zeer modulair als elk antilichaam verschillende combinaties kunnen worden toegepast om immuuncellen van belang i onderzochtncluding T-cellen, B-cellen, NK cellen, monocyten en macrofagen. Merk op dat het protocol is geoptimaliseerd voor gebruik met vrouwelijke C57BL / 6J muizen, 8-10 weken oud. Muizen buiten deze leeftijdsgroep kan percentages circulerende PBMCs die op gelijke tijdstippen die niet representatief zijn voor de hier gepresenteerde data kunnen leiden tot celtellingen hebben veranderd. Karakteriseringsexperimenten kan ook nodig zijn als andere tumormodellen worden gebruikt of die niet op de achtergrond B6 muizen worden gebruikt vanwege het feit dat stammen kunnen verschillen in hun PBMC profiel (Jaxpheno6; Mouse Phenome Database; Jackson Laboratory). Gender en milieu-omstandigheden kan ook een bron van ongelijkheid tussen PBMC frequenties en percentages.
Deze methode werd aangetoond door een combinatie van vier celoppervlak antilichamen die de detectie mogelijk te maken van Gr-1 + / CD11b + myeloïde cellen en NK1.1 + NK-cellen, celtypen betrokken bij de afstoting van GAl-1-deficiënte glioom. De opname van intracellulaire antilichamen GzmB maakt verder het detecteren van cytotoxische potentieel in de NK-cel subreeks. Representatieve resultaten zijn bedoeld voor immuun cel infiltratie in de vroege GL26-Cit gliomen in syngene C57BL / 6J muizen die ofwel uiten normale niveaus van gal-1 of die niveaus als gevolg van shRNA gemedieerde gen knockdown verminderd. De demonstratie toont de gevoeligheid en reproduceerbaarheid van de techniek blijkt dat glioma-infiltrerende PBMC reproduceerbaar kan worden geïsoleerd en gekwantificeerd zodra 24 uur na tumor implantatie. Afgezien van het onthullen van een populatie van tumor-infiltrerende Gr-1 hoog / CD11b + myeloïde cellen, de demonstratie laat ook een populatie van Gr-1 int / CD11b + cellen van wie de identiteit is op dit moment niet gedefinieerd.; Aanvullende experimenten zijn noodzakelijk om verder ontrafelen het karakter van deze celpopulatie. We merken ook op dat we niet een gemakkelijk te onderscheiden populatie van CD45 te observeren
Anti-Gr-1-antilichamen herkennen zowel de Ly6G en Ly6C cel oppervlakte-eiwitten die specifiek zijn voor polymorfonucleaire en mononucleaire myeloïde cellen, respectievelijk 25 zijn. Het gebruik van anti-Gr-1 Antibodies in de weg staat dus onderscheid tussen deze twee celpopulaties. Voorlopige resultaten in ons lab beginnen nu om licht te werpen op een meer accurate beschrijving van het begin van de Gr-1 + / CD11b + cellen die de gal-1-deficiënte glioom micro infiltreren. Experimenten waarin anti-Ly6G (kloon: 1A8) en anti-Ly6C (kloon: AL-21) antilichamen met anti-CCR2-antilichamen geven nu aan dat de Gr-1 hoog / CD11b + cellen infiltreren begin gal-1-deficiënte tumor micro- stroken met Ly6C hoog / CCR2 hoge inflammatoire monocyten, hoewel verdere experimenten nodig zijn om dit resultaat te bevestigen (data niet getoond).
Door cel verliest die kunnen optreden tijdens de herhaalde centrifugatie en resuspensie stappen van het isoleren van glioma-infiltrerende PBMC, is het waarschijnlijk dat de waargenomen celtellingen blijven beneden die welke daadwerkelijk in de intacte hersenen. Verschillen tussen eXperimental groepen moeten houden als gelijkwaardige delen van de 37/70 dichtheidscentrifugatie media-interface worden gehaald en als de gehele volume van elk monster wordt geanalyseerd door de flowcytometer. Het niet naleven van deze stappen zal leiden tot oneerlijke vergelijkingen tussen monsters en onpartijdige analyse uitsluit. Het onvermogen om het exacte aantal PBMCs invoeren van de hersenen tumor micro kwantificeren is niet beperkt tot een specifiek voor dit protocol. Alternatieve methoden zoals immunohistologische cel tellen strategieën zijn ook onderworpen aan fouten te wijten aan extrapolaties van het totale aantal cellen op basis van stereologische telt en de eis van gelijkwaardige afbeelding drempeling op weefselcoupe micrografen, die kunnen verschillen in het niveau van hun achtergrond kleuring, wat kan leiden tot vals -negatieve of vals-positieve signalen. Toch moet een vergelijking van tijdsverloop analyse tussen verschillende analysemethoden tijdsafhankelijke immuun-instroom bochten met soortgelijke algemene vorm te onthullen. Eenextra nadeel van immunohistochemische werkwijzen is het onvermogen van bepaalde antilichamen gevalideerd voor flowcytometrie te binden aan het equivalente antigene epitoop in de context van formaline gefixeerd hersenweefsel secties.
Er zijn een paar belangrijke stappen in dit protocol dat als beperkingen voor degenen die niet bekend met de methodologie kan dienen. Een dergelijke stap is het oogsten van de hersenen uit de schedel zonder deze te beschadigen. We raden de techniek een paar keer oefenen voorafgaand aan het uitvoeren van de juiste experimenten. Omdat de hersenen uiteindelijk zal worden aangewreven, geringe schade aan de oppervlakkige lagen van de hersenen waarschijnlijk onbelangrijk voor de kwantificatie van glioma-infiltrerende PBMCs. Een tweede stap die onervaren onderzoekers aanvankelijk moeilijk kan vinden is het gieten van de dichtheid centrifugeren media verloop. De experimentelen 'vermogen om een schone interface te vormen, terwijl bovenop de 2 ml van 37% dichtheidscentrifugatie media bovenopde 70% laag is cruciaal voor reproduceerbare isolatie van PBMC's. Hoewel deze stap aanvankelijk moeilijkheden opleveren, dat sterk verrijkt voor PBMC en vermindert drastisch de tijdsduur anders vereist voor monsteranalyse als geheel hersenweefsel waarbij cytometrically te analyseren flow. PBMC verrijking vermindert ook het totale aantal gebeurtenissen opgevangen door de flowcytometer, waardoor .fcs bestandsgrootte verminderen en helpt zeldzame hersenen infiltreren immuuncelpopulaties lossen. Voor het beste resultaat in de oprichting van een schone dichtheidscentrifugeren-interface raden wij aan het gieten van de 37% dichtheid centrifugeren media met behulp van een P-1000 micropipet met gladde zuiger actie. De hoek van de 15 ml centrifugebuis ongeveer 20-30 ° boven het werkblad. Laat de tip van de micropipet aan de zijde van de merktekens ml boven het oppervlak van de 70% dichtheidscentrifugatie medialaag tube 3-5. Pour gestaag en langzaam, zodat openlijke uiterlijke dynamiek van de 37% dichtheidscentrifugeren media als het extruder; koper te minimaliserendes van de micropipet tip om te voorkomen dat de onderliggende 70% dichtheidscentrifugatie media verstoren. Ten slotte is het feit dat het hersenweefsel architectuur noodzakelijk in het proces van isoleren vernietigd-glioom infiltrerende PBMC betekent dat aanvullende muizen zal moeten tijdstip aangepaste histologische gegevens.
Nieuwere modellen glioma gegenereerd door injectie van oncogene plasmide DNA in de normale knaagdieren hersenen zijn de laatste jaren 26-32. Deze "endogene" tumor modellen te omzeilen potentiële artefacten veroorzaakt door stereotactisch enten ex vivo kankercellen en nauwer bootsen de histologische kenmerken van klinische glioma. De hierin beschreven werkwijze is goed geschikt voor de studie van immune infiltratie evenementen deze meer klinisch relevante modelsystemen karakteriseren. Studies over immune instroom bij neonatale muizen kunnen ook worden uitgevoerd met behulp van deze methode, hoewel de dichtheid van neonatale mouse hersenen is dan die van volwassenen, waarbij een optimalisatie van de enzymatische digestie stap om te voorkomen dat over digestie van het hersenweefsel nodig. Bijkomende toepassingen van de techniek omvatten onderzoeken naar alternatieve klassen van inflammatoire hersenziekte afgezien van kwaadaardige tumoren zoals experimentele allergische encefalomyelitis (EAE) en immuunresponsen tegen virale infectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health / Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke (NIH / NINDS) verleent R01-NS074387, R01-NS057711 en R21-NS091555 naar MGC; NIH / NINDS verleent R01-NS061107, R01-NS076991, R01-NS082311 en R21-NS084275 om PRL; subsidies van Leah's Happy Hearts, Universiteit van Michigan Comprehensive Cancer Center uitgereikt aan MGC en PRL; de afdeling Neurochirurgie, Universiteit van Michigan School of Medicine; Michigan Institute for Clinical and Health Research, ondersteund door NIH-subsidie 2UL1-TR000433; de Universiteit van Michigan Cancer Biology Training Grant ondersteund door NIH / NCI (National Cancer Institute) subsidie T32-CA009676; de Universiteit van Michigan Training in Klinische en Basic Neurowetenschappen ondersteund door NIH / NINDS verlenen T32-NS007222; en de Universiteit van Michigan Medical Scientist Training Program ondersteund door NIH / NIGMS (Nationaal Instituut voor Algemene Geneeskunde Wetenschappen) verlenen T32-GM007863. De auteurs van eenopnieuw dankbaar voor de wetenschappelijke leiding en ondersteuning ontvangen van Dr. Karin Muraszko en de afdeling Neurochirurgie; M. Dahlgren, D. TOMFORD en S. Napolitaanse voor een uitstekende administratieve ondersteuning; M. Dzaman voor uitstekende technische bijstand; en Phil F. Jenkins voor genereuze steun voor de aankoop van een Zeiss 3D Scanning Electron Microscope. We erkennen ook Kuchroo laboratorium Harvard Medical School, waaruit een gemodificeerde versie van de dichtheidscentrifugatie media-gemedieerde strategie voor het isoleren van mononucleaire cellen hersenen werd getrokken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modification of Eagles Medium | Gibco | 12430-054 | with 4.5g/L D-glucose, L-glutamine, 25 mM HEPES and phenol red |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Gibco | 14190-144 | without calcium chloride or Magnesium chloride |
| Fetal bovine serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10,000 U/ml Penicillin; 10,000 μg/ml Streptomycin |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200 mM |
| G418 sulfate | Omega Scientific Inc. | GN-04 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P8833 | from Streptomyces alboniger |
| HyClone HyQTase non-mammalian trypsin alternative | Thermo Scientific | SV30030.01 | in DPBS with EDTA |
| Phase contrast hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | 0.1 mm deep |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250-061 | |
| Sterile 0.9% NaCl injection, USP | Hospira | NDC: 0409-4888 | 10 ml vials |
| 0.6 ml conical polypropylenemi microtubes | Genesee Scientific | 22-272 | |
| Atipamezole hydrochloride injection | Orion Pharma | NDC: 52483-6298 | 5 mg/ml solution |
| Ketamine hydrochloride injection | Fort Dodge | NDC: 0409-2051 | 100 mg/ml solution |
| Dexmedetomidine hydrochloride injection | Zoetis | NDC: 54771-2805 | 0.5 mg/ml solution |
| Xylazine hydrochloride injection | Lloyd | NDC: 61311-481 | 100 mg/ml solution |
| Carprofen injection | Pfizer | NDC: 61106-8501 | 50 mg/ml solution |
| Buprenorphine hydrochloride injection | Reckitt Benckiser | NDC: 12496-0757 | 0.3 mg/ml ampuls |
| 1 ml tuberculin syringes | Covidien | 8881501400 | |
| 26G x ½ (0.45 mm x 13 mm) syringe needles | BD | 305111 | |
| Surgical clippers | 3M | 9661 | |
| Providone-iodine solution | Aplicare | 82-217 | NDC: 52380-1905 |
| Sterile petrolatum ophthalmic ointment | Dechra | NDC: 17033-211 | |
| 70% isopropyl alcohol prep pads | Kendall | 6818 | |
| Sterile gauze | Covidien | 8044 | non-woven, 4" x 4", 4-ply |
| 1.7 ml conical polypropylene microtubes | Genesee Scientific | 22-281 | |
| Mouse stereotactic frame | Stoelting | 51730 | |
| Surgical lamp | Philips Burton | CS316W | Coolspot II Variable Spotlight |
| Curved dissecting forceps | Ted Pella Inc. | 5431 | |
| Colibri retractors | FST | 17000-03 | |
| Cordless precision power drill | Dremel | 1100-01 | Stylus model; 7.2-Volt Lithium-Ion with Docking Station |
| Engraving Cutter | Dremel | 105 | 1/32" or 0.8 mm bit diameter |
| Microliter syringe | Hamilton | 75 | Hamilton Microliter Syringes 700 series; 5 μl volume |
| Microliter syringe needles | Hamilton | 7762-06 | 33 G, small hub RN NDL, 1.5 in, point style 3, 6/PK |
| Ethilon 3-0 black monofilament nylon sutures | Ethicon | 1663 | |
| Magnetic stir bar | VWR | 74950-296 | 7.9 mm diameter x 50 mm length (5/16" diameter x 2" length) |
| 1 L glass screw-cap storage bottle | Corning | 1395 | Type 1, Class A borosilicate glass |
| Heparin sodium | Sagent | NDC: 25021-400 | 1,000 U/ml solution |
| Peristaltic pump | Cole Parmer Instruments Group | 77200-60 | Master Flex Easy Load II console drive |
| compressed carbogen (95% O2 / 5% CO2) | available from local vendor | N/A | A-type, large cylinder |
| 20 G x 1 ½" aluminum hub blunt needles | Kendall | 8881202363 | 0.9 mm x 38.1 mm |
| Polyurethane ice bucket | Fisherbrand | 02-591-45 | Capacity: 0.152 oz. (4.5L) |
| Collagenase (Type I-S) | Sigma Aldrich | C1639 | from Clostridium histolyticum |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical Corp. | LS002007 | >2,000 Kunitz units per mg dry weight |
| Antistatic polystyrene hexagonal weighing dishes | Ted Pella Inc. | 20157-3 | top I.D. 115 mm, base I.D. 85 mm, 203 ml volume |
| Stainless steel single edged razor blades | Garvey | 40475 | |
| Bone rongeurs | FST | 16001-15 | |
| Hemostat | FST | 13014-14 | |
| Large dissection scissors | Ted Pella Inc. | 1316 | |
| Small dissection scissors | FST | 14094-11 | |
| Blunt end forceps | Ted Pella Inc. | 13250 | |
| 7 ml glass Dounce tissue grinder | Kontes | KT885300-0007 | |
| Percoll Density Centrifugation Media | GE Healthcare | GE17-0891-01 | |
| 10 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | single use; sterile |
| 70 μm sterile nylon mesh cell strainers | Fisherbrand | 22363548 | |
| Alexa Fluor 700-conjugated rat anti-mouse CD45 (clone: 30-F11) | Biolegend | 103128 | |
| APC-conjugated mouse anti-mouse NK1.1 (clone: PK136) | eBiosciences | 17-5941-82 | |
| PE-conjugated rat anti-mouse Gr-1 (clone:RB6-8C5) | BD Pharmigen | 553128 | |
| PerCP/Cy5.5-conjugated rat anti-mouse CD11b (clone: M1/70) | Biolegend | 101228 | |
| Alexa Fluor 700-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control | Biolegend | 400628 | |
| APC-conjugated mouse IgG2a, κ (clone: eBM2a) isotype control | eBioscience | 17-4724 | |
| PE-conjugated rat IgG2b, κ (clone: eB149/10H5) isotype control | eBioscience | 12-4031-82 | |
| PerCP/Cy5.5-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control | Biolegend | 400632 | |
| Pacific Blue-conjugated mouse anti-mouse granzyme B (Clone: GB11) | Biolegend | 515403 | |
| Pacific Blue-conjugated mouse IgG1, κ (Clone: MOPC-21) isotype control | Biolegend | 400151 | |
| Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | |
| 15 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-103 | conical bottom |
| 50 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-108 | conical bottom |
| 12 mm x 75 mm round-bottom polypropylene FACS tubes | Fisherbrand | 14-956-1B | |
| FACSAria Special Order Research Product flow cytometer/cell sorter | BD | 650033 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | The Baker Company | SG603 | model: SterilGARD III Advance |
References
- Bleeker, F. E., Molenaar, R. J., Leenstra, S. Recent advances in the molecular understanding of glioblastoma. J Neurooncol. 108, 11-27 (2012).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352, 987-996 (2005).
- Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2007-2011. Neuro Oncol. 16, Suppl 4. iv1-63 (2014).
- Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523, 337-341 (2015).
- Kennedy, B. C., et al. Tumor-associated macrophages in glioma: friend or foe? J Oncol.. 2013, 486912 (2013).
- Markovic, D. S., Glass, R., Synowitz, M., Rooijen, N., Kettenmann, H. Microglia stimulate the invasiveness of glioma cells by increasing the activity of metalloprotease-2. J Neuropathol Exp Neurol. 64, 754-762 (2005).
- Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E.
- Kmiecik, J., et al. Elevated CD3+ and CD8+ tumor-infiltrating immune cells correlate with prolonged survival in glioblastoma patients despite integrated immunosuppressive mechanisms in the tumor microenvironment and at the systemic level. J Neuroimmunol. 264, 71-83 (2013).
- Yang, I., Han, S. J., Sughrue, M. E., Tihan, T., Parsa, A. T. Immune cell infiltrate differences in pilocytic astrocytoma and glioblastoma: evidence of distinct immunological microenvironments that reflect tumor biology. J Neurosurg. 115, 505-511 (2011).
- Wagner, S., et al. Microglial/macrophage expression of interleukin 10 in human glioblastomas. Int J Cancer. 82, 12-16 (1999).
- El Andaloussi, A., Lesniak, M. S. An increase in CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells in tumor-infiltrating lymphocytes of human glioblastoma multiforme. Neuro Oncol. 8, 234-243 (2006).
- Kostianovsky, A. M., Maier, L. M., Anderson, R. C., Bruce, J. N., Anderson, D. E. Astrocytic regulation of human monocytic/microglial activation. J Immunol. 181, 5425-5432 (2008).
- Curtin, J. F., et al. HMGB1 mediates endogenous TLR2 activation and brain tumor regression. PLoS Med. 6, e10 (2009).
- Curtin, J. F., et al. Fms-like tyrosine kinase 3 ligand recruits plasmacytoid dendritic cells to the brain. J Immunol. 176, 3566-3577 (2006).
- Mineharu, Y., et al. Engineering the brain tumor microenvironment enhances the efficacy of dendritic cell vaccination: implications for clinical trial design. Clin Cancer Res. 17, 4705-4718 (2011).
- Larocque, D., et al. Exogenous fms-like tyrosine kinase 3 ligand overrides brain immune privilege and facilitates recognition of a neo-antigen without causing autoimmune neuropathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 14443-14448 (2010).
- Curtin, J. F., et al. Treg depletion inhibits efficacy of cancer immunotherapy: implications for clinical trials. PLoS One. 3, e1983 (2008).
- Ali, S., et al. Combined immunostimulation and conditional cytotoxic gene therapy provide long-term survival in a large glioma model. Cancer Res. 65, 7194-7204 (2005).
- Dewey, R. A., et al. Chronic brain inflammation and persistent herpes simplex virus 1 thymidine kinase expression in survivors of syngeneic glioma treated by adenovirus-mediated gene therapy: implications for clinical trials. Nat Med. 5, 1256-1263 (1999).
- Baker, G. J., et al. Natural killer cells eradicate galectin-1-deficient glioma in the absence of adaptive immunity. Cancer Res. 74, 5079-5090 (2014).
- Baker, G. J., et al. Mechanisms of glioma formation: iterative perivascular glioma growth and invasion leads to tumor progression, VEGF-independent vascularization, and resistance to antiangiogenic therapy. Neoplasia. 16, 543-561 (2014).
- Ormerod, M. G., Novo, D. Flow cytometry : a basic introduction. , (2008).
- Stirling, D. P., Yong, V. W. Dynamics of the inflammatory response after murine spinal cord injury revealed by flow cytometry. J Neurosci Res. 86, 1944-1958 (2008).
- Hirai, T., et al. The prevalence and phenotype of activated microglia/macrophages within the spinal cord of the hyperostotic mouse (twy/twy) changes in response to chronic progressive spinal cord compression: implications for human cervical compressive myelopathy. PLoS One. 8, e64528 (2013).
- Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. J Immunol. 151, 2399-2408 (1993).
- Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. Cancer Res. 69, 431-439 (2009).
- Holland, E. C., et al. Combined activation of Ras and Akt in neural progenitors induces glioblastoma formation in mice. Nat Genet. 25, 55-57 (2000).
- Lynes, J., et al. Lentiviral-induced high-grade gliomas in rats: the effects of PDGFB, HRAS-G12V, AKT, and IDH1-R132H. Neurotherapeutics. 11, 623-635 (2014).
- de Vries, N. A., et al. Rapid and robust transgenic high-grade glioma mouse models for therapy intervention studies. Clin Cancer Res. 16, 3431-3441 (2010).
- Uhrbom, L., et al. Ink4a-Arf loss cooperates with KRas activation in astrocytes and neural progenitors to generate glioblastomas of various morphologies depending on activated Akt. Cancer Res. 62, 5551-5558 (2002).
- Marumoto, T., et al. Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors. Nat Med. 15, 110-116 (2009).
- Assanah, M., et al. Glial progenitors in adult white matter are driven to form malignant gliomas by platelet-derived growth factor-expressing retroviruses. J Neurosci. 26, 6781-6790 (2006).
