Summary
Présenté ici est une méthode simple pour l'isolement et le flux analyse cytométrique de cellules mononucléaires du sang périphérique gliome infiltrant qui donne des données quantitatives en fonction du temps sur le nombre et le statut activation des cellules immunitaires qui entrent dans le microenvironnement de tumeur cérébrale tôt.
Abstract
Notre laboratoire a démontré récemment que les cellules tueuses naturelles (NK) sont capables d'éradiquer GL26 de souris orthotopique implanté et rat CNS-1 gliomes malins peu de temps après la prise de greffe intracrânienne si les cellules cancéreuses sont rendues déficientes dans l'expression de la lectine galectine β-galactoside liaison -1 (gal-1). Des travaux plus récents montre maintenant que une population de GR-1 des cellules myéloïdes + / CD11b + est essentiel à cet effet. Pour mieux comprendre les mécanismes par lesquels les NK et les cellules myéloïdes coopèrent pour conférer rejet de tumeur gal-1-deficient nous avons mis au point un protocole détaillé pour l'isolement et l'analyse des cellules mononucléaires du sang périphérique gliome infiltrant (PBMC). La méthode est mise en évidence en comparant les PBMC ici infiltration dans le microenvironnement tumoral de Gal-1 exprimant GL26 gliomes avec ceux-gal rendu déficient par une shRNA-knockdown. Le protocole commence par une description de la façon dont la culture et de préparer GL26 CElls pour l'inoculation dans le cerveau de souris C57BL / 6J syngénique. On explique ensuite les étapes impliquées dans l'isolement et l'analyse par cytométrie flux de PBMC de gliome infiltrant du micro-environnement de la tumeur cérébrale précoce. Le procédé est adaptable à un certain nombre de modèles expérimentaux in vivo dans lequel des données temporelles sur infiltration immunitaire dans le cerveau est nécessaire. La méthode est sensible et hautement reproductibles, comme des PBMC de gliome infiltrant peuvent être isolées à partir de tumeurs intracrâniennes dès que la prise de greffe de post-tumeur 24 h avec le nombre de cellules observées similaires de points appariés de temps tout au long de tumeurs expériences indépendantes. Un seul expérimentateur peut réaliser le procédé à partir de cerveau de récolte de circuler analyse cytométrique des PBMC de gliome infiltrant dans environ 4-6 heures selon le nombre d'échantillons à analyser. Modèles de gliome alternatifs et / ou de détection des anticorps spécifiques de cellules peuvent également être utilisés à la discrétion des expérimentateurs pour évaluer l'infiltration de plusieurs autres immune types cellulaires d'intérêt sans la nécessité de modification de la procédure globale.
Introduction
Les gliomes sont une classe de cancers du cerveau résultant de la glie neuro-épithéliales transformées dans le système nerveux central (SNC). De tous les gliomes, Organisation mondiale de la Santé (OMS) de grade IV gliome, ou le glioblastome (GBM), est la plus fréquente et mortelle 1. GBM est hautement réfractaire au traitement standard-de-courant qui se compose de résection de la tumeur dans la mesure du possible, plus suivie d'une radiothérapie chimiothérapie concomitante et adjuvante avec 2 témozolomide. Ces cancers mortels portent un pronostic sombre de seulement 15-18 mois de survie à partir du moment du diagnostic initial avec seulement 5% des patients survivent à la maladie après 5 ans 3.
La présence de la barrière hémato-encéphalique (BHE), le manque de cellules présentatrices d'antigène professionnelles (APC), et l'existence non identifiés auparavant des structures lymphatiques de bonne foi dans le cerveau 4 ont conduit à la notion de GBM comme immunitaire privilégié. Cependant, de nombreuses études sho maintenantw que ces cancers du cerveau engendrent en effet le recrutement de cellules immunitaires périphériques qui sont principalement à l'origine myéloïde incluant les monocytes, les macrophages et les cellules myéloïdes suppressives (MDSC dérivés 5). GBM influe également sur l'activité de cerveau-résident microglie à devenir pro-tumorigènes 6,7. Les cellules lymphoïdes telles que les cellules T CD8 + 8 et cellules CD56 + tueuses naturelles 9 sont également présents dans le microenvironnement de la tumeur, mais en beaucoup moins grand nombre, un fait semble être due à la fonction immunosuppressive incité par des facteurs de gliome dérivés sur les macrophages associés aux tumeurs ( TAM) 10. Lymphocytes T CD4 + sont également présents dans GBM, mais une grande partie de cette population exprime également CD25 et FoxP3, les responsables de immunosuppresseur T régulatrices (T reg) cellules 11. L'état immunosuppresseur globale de GBM culmine dans la promotion de l'évasion immunologique et la progression de la tumeur 12.
13-19. Le point culminant de ce travail a conduit à un essai clinique visant à évaluer un cytotoxique combinée et thérapeutique immuno-stimulation pour les patients nouvellement diagnostiqués (identificateur ClinicalTrials.gov: NCT01811992) GBM.
Notre travail le plus récent montre que GL26 de la souris et de rat SNC-1 des cellules de glioblastome bloquent anti-tumorale des cellules NK surveillance immunitaire en produisant de grandes quantités de la β-galactoside lectine liant la galectine-1 (gal-1) 20. Cela a été démontré par la suppression de l'expression de gal-1 dans les cellules de gliome utilisant knockdown de gènes shRNA médiation. In vitro expérits ont montré que les cellules de gliome Gal-1 déficient prolifèrent normalement dans la culture, mais ont subi un rejet rapide, peu après la prise de greffe intracrânienne dans des souris C57BL / 6J ou RAG1 souris - / -, établissant ainsi l'indépendance de T ou cellules B sur cette forme de rejet de la tumeur. NK immunodéplétion de la cellule avec un anticorps anti-asialo GM1 anti-sérum ou des anticorps NK1.1 monoclonaux dirigés à la restauration complète de l'évolution de gliome gal-1-deficient intracrânienne, en établissant le rôle des cellules NK en gal-1-deficient rejet de gliome. Nous montrons maintenant que immunodéplétion des cellules myéloïdes Gr-1 + / CD11b + est suffisante pour prévenir le rejet d'un gliome gal-1 déficiente en dépit de la présence de cellules NK, révélant ainsi un rôle d'auxiliaire indispensable pour les cellules myéloïdes dans l'aide apportée à l'gal NK médiée lyse tumorale -1 déficiente (données non publiées). Ce résultat inattendu nous a conduit à développer un protocole détaillé pour l'isolement et l'analyse des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) quiinfiltrer le microenvironnement d'une tumeur cérébrale, peu après la prise de greffe intracrânienne afin que nous puissions mieux caractériser les événements d'infiltration immunitaires qui prédicat rejet de gliome gal-1 déficient.
La méthode est démontré ici en utilisant des cellules de gliome de GL26 de souris qui expriment constitutivement mCitrine protéine fluorescente, appelée GL26-Cit, qui autorisent la visualisation de la cellule tumorale directe par microscopie à fluorescence 21. Ces cellules sont greffées stéréotactique dans le cerveau de souris C57BL / 6J et syngéniques sont laissées se développer pendant 24, 48 ou 72 heures avant l'euthanasie des souris. PBMC de gliome infiltrant sont ensuite isolés et immunomarquées utilisant des anticorps anti -CD45, -GR-1, et -CD11b -NK1.1 anticorps de surface cellulaire conjointement avec immunomarquage intracellulaire de granzyme B (GZMB). Cette combinaison permet d'anticorps spécifique pour l'identification des Gr-1 + / + CD11b cellules myéloïdes infiltrant les tumeurs et NK1.1 +, les cellules NK, les types de cellules, nous avons been impliqué dans le rejet de la tumeur gal-1 déficient. Le profil d'infiltration immunitaire de Gal-1-deficient GL26-Cit gliome, appelé ici GL26-Cit-gal1i, est ensuite comparée à celle des gliomes exprimant des taux normaux de Gal-1 appelé GL26-Cit-NT qui contiennent une non- ciblant le contrôle shRNA épingle à cheveux. Le protocole commence par une description sur la façon de la culture des cellules GL26-Cit gliome in vitro, qui est suivie d'une explication sur la façon de greffer orthotopiquement ces cellules dans le striatum de souris C57BL / 6J syngéniques. Il procède ensuite à énumérer les étapes impliquées dans l'isolement et l'immunomarquage des PBMC de gliome infiltrant pour l'analyse par cytométrie en flux. Le protocole se termine par une explication de l'analyse de données standard et de représentation graphique.
La démonstration révèle que les deux Gr-1 + / + CD11b cellules myéloïdes et les cellules NK NK1.1 + accumuler de préférence dans le microenvironnement tumeur cérébrale gal-1 déficient dans les 48h d'implantation de la tumeur, un résultat qui contribue à expliquer pourquoi ces tumeurs subissent rapidement lyse tumorale complète d'environ 1 semaine de prise de greffe tumorale post-20. Le procédé est facilement adaptable à un certain nombre de différents modèles expérimentaux in vivo dans lequel des données temporelles sur infiltration immunitaire dans le cerveau est nécessaire. Un seul expérimentateur peut effectuer le protocole de récolte cerveau analyse cytométrique de flux de PBMC de gliome infiltrant en environ 4-6 heures en fonction du nombre d'échantillons à analyser. Le procédé peut également être combiné avec des expériences visant à caractériser le profil de circulation des PBMC chez les souris porteuses de tumeur pour la comparaison avec ceux qui infiltrent le cerveau afin d'identifier les phénotypes d'immunosuppression spécifiquement induites par le micro-environnement de la tumeur. Application de la présente et des méthodes similaires devrait faciliter une meilleure compréhension des facteurs impliqués dans le trafic de cellules immunitaires périphériques dans le microenvironnement de la tumeur du cerveau.
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Protocol
Note: S'il vous plaît examiner l'ensemble du protocole avant d'effectuer des expériences. Approbation de l'utilisation des animaux vertébrés du comité institutionnel approprié sur l'utilisation et le bien-être des animaux doit être obtenu avant de procéder.
1. Préparation des cellules tumorales pour intracrânienne prise de greffe
- Travailler dans une enceinte de sécurité biologique de classe II, commencez par préparer GL26-Cit-NT / gal1i milieux de culture cellulaire en complétant une bouteille de milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) de 500 ml avec du sérum fœtal bovin 10% filtration stérile inactivé par la chaleur (FBS ), 2 mM de L-glutamine, 100 U / ml de pénicilline, 100 ug / ml de streptomycine, 600 ug / ml de sulfate de G418 (pour la sélection du vecteur d'expression mCitrine) et 3 ug / ml de puromycine dichlorhydrate (pour la sélection de la non- ciblage ou shRNAs-1-spécifiques gal).
- Culture GL26-Cit-NT et / ou des cellules GL26-Cit-gal1i (Figure 1A et 1B 2 pendant 1-2 jours avant la procédure de la prise de greffe de la tumeur ou jusqu'à ce que les flacons atteignent 50-80% de confluence.
- Le jour de la chirurgie, retirer le support de culture cellulaire à partir des cellules de gliome utilisant une pipette sérologique de 10 ml et un pistolet à pipette et jeter le support dans un bêcher de déchets.
- Inversez le flacon top-side-down et ajouter 10 ml de DPBS à la partie supérieure du flacon en utilisant une pipette de 10 ml sérologique. Lentement inverser le flacon pour couvrir les cellules dans DPBS, puis versez le flacon verticalement et retirez et jetez les DPBS dans un bécher de déchets.
- Ajouter 3-4 ml de non-mammifères alternative trypsine dans DPBS avec de l'EDTA (voir la liste des matériaux pour plus de détails) à chaque T75 culture de tissus ballon et placer de nouveau dans la culture de tissus armoire pendant 2-5 min. En utilisant un microscope à champ clair, vérifier que toutes les cellules se sont détachées de la surface inférieure avant de procéder.
- Inhiber further activité enzymatique par dilution de la solution de trypsine avec 6 ml de DPBS. Introduire à la pipette de haut en bas en utilisant une pipette sérologique de 10 ml pour rincer la surface de fond de la fiole et de dissocier mécaniquement des agrégats cellulaires. Aspirer les cellules et la placer dans respectivement étiquetés tubes de 15 ml de centrifugeuses. Faites tourner les cellules vers le bas à 550 xg (max RCF) pendant 5 min à 4 ° C (figure 1C).
- Retirez le surnageant et remettre doucement les cellules avec 1 ml de non complétée DMEM. Assurez-vous de la pipette les cellules de haut en bas soigneusement avec une micropipette P-1000 pour obtenir une suspension de cellule unique.
- Ajouter une dilution à 1:10 de la suspension de cellules résultante générée en plaçant 18 1,6 par ul de DMEM supplémenté non dans un microtube de 0,6 ml en polypropylene conique suivi par l'addition de 2 ul de la suspension de cellules tumorales. Pipeter de haut en bas à l'aide d'une micropipette P-10 à homogénéiser les cellules à fond.
- Ajouter 10 pi &# 160; de la dilution de la cellule tumorale 01h10 généré en 1.7 à un séparées 0,6 ml polypropylène conique microtube, puis ajouter 10 pi de Trypan bleuissement au tube. Bien mélanger avec une micropipette P-10 et ajouter 10 ul de la / solution de bleu trypan cellule tumorale résultante sous une lamelle de verre placée sur le dessus d'un hémocytomètre en faisant attention de ne pas introduire de bulles d'air (figure 1D).
- Compter les cellules avec un microscope à champ clair utilisant un objectif 10X selon le protocole spécifique associé à la donnée hémocytomètre. Assurez-vous de prendre en compte la dilution de 20 fois de la suspension de cellules tumorales d'origine faite lors de la préparation des cellules pour l'estimation de la cellule précise dans l'aliquote initiale de 1 ml. Utilisez la formule suivante pour calculer le nombre total de cellules: les cellules totales / ml = [((Σcells comptées par carré) / Nombre de places comptés) x 20 (à savoir, le facteur de dilution) x 10.000 cellules / ml].
- Après déterminer le nombre total de cellules pour chaque lignée cellulaire utilisée dans l'expérience donnée, tourner les descendre à 550 xg (max RCF) pendant 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant (s) et remettre les cellules avec un volume approprié de non complétée DMEM afin de parvenir à une concentration cible de 3 x 10 4 cellules par 1 pl pour chaque lignée cellulaire selon la formule suivante: (# total de cellules / 30000).
- Placez un volume équivalent de chaque lignée cellulaire dans, respectivement étiquetés 0,6 ml coniques tubes de polypropylène et de placer sur la glace (figure 1E). Veillez à sauvegarder certaines cellules de continuer à propager chaque lignée cellulaire si T75s distincts ont pas été ensemencés précédemment.
2. Procédure de stéréotaxique prise de greffe de cellules de gliome dans le striatum de souris C57BL / 6J
- Préparer des solutions de l'anesthésie chirurgicale, l'analgésie, et l'inversion de l'anesthésie de travail avant la chirurgie comme suit:
- Pour kétamine / s dexmédétomidineanesthésie urgical: retirer 1,4 ml à partir d'un flacon de 10 ml d'injection stérile NaCl à 0,9% et le remplacer par 600 pi d'un ml de solution 100 mg / stock de chlorhydrate de kétamine et 800 pi d'un ml de solution 0,5 mg / ml de chlorhydrate de dexmédétomidine pour donner un solution mixte de travail de chlorhydrate de kétamine (6 mg / ml) et du chlorhydrate de dexmédétomidine (0,04 mg / ml).
- Pour buprénorphine analgésie: retirer 1 ml d'un flacon de 10 ml d'injection stérile à 0,9% de NaCl et le remplacer par l'ensemble du volume de 1 ml d'un seul 0,3 mg / ml de chlorhydrate stock buprénorphine ampoule pour donner un / ml solution de travail de 0,03 mg.
- Pour atipamezole inversion de l'anesthésie chirurgicale: retirer 1 ml d'un flacon de 10 ml d'injection stérile NaCl à 0,9% et le remplacer par 1 ml d'une solution à 5 ml mg / stock de chlorhydrate d'atipamézole pour donner un / ml solution de travail de 0,5 mg.
- Travailler dans un endroit approuvé pour la survie de la souris snterventionschirurgic ales, commencer par la mise en place des instruments chirurgicaux stérilisés autoclaves ou perles et autres réactifs comme le montre la (figure 2A), puis obtenir assez de 8-10 semaines d'âge femelles C57BL / 6J (syngénique avec GL26 gliome) requis pour l'étude; leur assurer l'accès continu à des aliments et de l'eau.
- Anesthésier la première souris avec une seule voie intraperitoneale (ip) injection de la solution de travail d'anesthésie en délivrant une dose de 75 mg / kg de kétamine et 0,5 mg / kg de dexmédétomidine (environ 250 ul pour une souris de 20 g). Ensuite, donner une 5 mg / kg sous-cutanée (sc) injection de carprofène (environ 100 ul pour une souris de 20 g). Assurez-vous que la souris est non recevable aux pieds et la queue pincées avant de procéder.
- L'aide de tondeuses chirurgicales, de se raser la fourrure du crâne. Appliquer une solution antiseptique de povidone-iode pour la zone rasée, frottez avec un tampon isopropylique de préparation d'alcool à 70%, puis ré-appliquer une solution antiseptique de povidone-iode. Ensuite, appliquez une petite quantité de SteriLe vaseline pommade ophtalmique à chaque œil pour éviter le dessèchement.
- Fixez le crâne dans le cadre stéréotaxique selon le protocole suivant:
- Ouvrez soigneusement la bouche en atteignant avec une paire de pinces de dissection courbes pour tirer doucement sur la langue et de passer à un côté de la bouche pour éviter l'étouffement. Permettre aux forceps pour se rétractent alors dans la bouche de répandre la mâchoire ouverte et guider les deux incisives supérieures dans la serrure de la barre de dent sur le cadre stéréotaxique. Fixer la barre de la dent de pivoter horizontalement ou verticalement en ajustant les vis respectives. Assurez-vous que le crâne de la souris est au niveau de la paillasse.
- Placez les barres d'oreilles en toute sécurité contre les os du crâne postorbital en faisant attention de ne pas appliquer trop de pression vers l'intérieur sur le crâne afin d'éviter l'écrasement.
- Placez la barre de nez sur le museau et visser jusqu'au blocage. Vérifiez qu'il n'y a pas de mouvement vertical / latéral dans la tête en appliquant une légère pressionavec un pouce et l'index. Une souris correctement placés dans un cadre stéréotaxique est montré dans (figure 2B).
- En utilisant une lame de scalpel, faire une incision médiane 1 cm sur le crâne de l'os frontal de l'os occipital. Rétracter la peau à l'aide de valves incision Colibri.
- Abaisser la seringue microlitre équipé d'une aiguille 33 G fixée au bras vertical du cadre stéréotaxique directement au-dessus de la position du bregma (figure 2C). De là, ajuster la position de l'aiguille 0,5 mm AP, 2,5 mm ML pour atteindre le site cible pour l'implantation de la tumeur. Utilisez une tuberculine seringue de 1 ml munie d'une aiguille 26 G pour marquer cette position par cinglantes doucement le périoste.
- Percez un trou dans le crâne sur le site cible jusqu'à atteindre la dure-mère sous-jacente à l'aide d'une perceuse de précision sans fil équipé d'un "(0,8 mm) 1/32 bits. Pendant le forage, appliquer une pression intermittente suivie de l'élimination de la DRIll peu de la surface du crâne pour éviter la chaleur excessive et de la force qui pourraient autrement conduire à la foret perforer le tissu cérébral sous-jacent.
- Rincer la seringue microlitre avec NaCl à 0,9% dans 1,7 ml d'un micro-tube en polypropylène de forme conique afin d'assurer que l'aiguille ne soit pas obstrué. Feuilleter doucement le microtube de 0,6 ml conique polypropylène contenant les cellules tumorales plusieurs fois pour remettre en suspension les cellules.
- Etablir 2 pi de cellules dans la seringue microlitre de veiller à ce que les bulles d'air sont introduits dans la seringue. Distribuer 1 pi de cellules sur un alcool isopropylique tampon de préparation de 70% laissant exactement 1 ul de cellules tumorales restant dans la seringue.
- Apportez de l'aiguille jusqu'à ce qu'elle touche la dure-mère, puis d'introduire l'aiguille dans le cerveau -3.5 mm ventral et se rétracter par 0,5 mm. Lentement et en douceur les cellules délivrer en appuyant sur le piston de la seringue au cours de 1-2 min.
- Permettre aux cellules de Settle au niveau du site d'injection pendant 5 minutes avant de retirer lentement l'aiguille. Essuyer tout sang coagulé ou la matière cérébrale de la pointe de l'aiguille avec un 70% d'alcool isopropylique tampon de préparation propre. Rincer l'aiguille et la seringue complètement avec le NaCl à 0,9% à partir de l'étape 2.6 pour assurer que l'aiguille ne soit pas obstrué pour l'injection suivante.
- Retirez les rétracteurs Colibri et suturer le cuir chevelu à l'aide de trois 3-0 sutures monofilament en nylon. Retirer la souris du cadre stéréotaxique et administrer 0,1 mg / kg de buprénorphine chlorhydrate voie sous-cutanée (sc) (environ 67 pi de la / ml solution de travail de 0,03 mg pour une souris de 20 g), suivie par 2,5 mg / kg chlorhydrate d'atipamézole par voie intramusculaire (IM) (environ 100 pi de la / solution à 0,5 mg de travail ml pour une souris de 20 g) pour le soulagement de la douleur post-opératoire et l'inversion de l'anesthésie. Placez la souris post-chirurgicales dans leurs cages sous une lampe chauffante pour récupérer.
3. Souris Transcardial Perfusions et récolte du cerveau
- Préparer la solution de Tyrode héparine selon le protocole suivant:
- Mettre une barre d'agitation magnétique dans un bouchon à vis bouteille de stockage 1 L verre et compléter au volume avec de l'eau ultra pure déminéralisée. Placez la bouteille sur une plaque d'agitation.
- Peser et ajouter les produits chimiques suivants de la bouteille en verre, sous agitation: 8 g de chlorure de sodium (NaCl), 0,264 g de chlorure de calcium (CaCl 2 • 2H 2 O), 0,05 g de phosphate de sodium monobasique (NaH 2 PO 4 • 2H 2 O), D-glucose (C 6 H 12 O 6), du bicarbonate 1,0 g 1,0 g de sodium (NaHCO 3), 0,2 g de chlorure de potassium (KCl). Autoriser les sels pour dissoudre, puis ajouter 100 pi d'une solution stock 1,000U / ml d'héparine de sodium à la solution de Tyrode.
- Retirer le récipient de la plaque d'agitation et extraire le barreau d'agitation en utilisant une baguette magnétique. Stockez solution héparine Tyrode à 4° C.
- Préparer une solution de travail pour l'anesthésie terminaux comme suit:
- Pour la kétamine / xylazine borne anesthésie: supprimer 1.360 pi à partir d'un flacon de 10 ml d'injection stérile NaCl à 0,9% et le remplacer par 1200 pi d'un ml de solution 100 mg / stock de chlorhydrate de kétamine et 160 pi d'un ml de solution 100 mg / stock de xylazine chlorhydrate pour donner une solution mixte de travail de chlorhydrate de kétamine (12 mg / ml) et du chlorhydrate de xylazine (1,6 mg / ml).
- Préparer la solution de mélange des médias de centrifugation de densité en plaçant 90 ml de 10x PBS dans 264 ml d'eau désionisée ultrapure (de 3.93x) dans un récipient en plastique stérile. Titrer à pH 7,0-7,2 avec HCl et stériliser par filtration à travers un filtre de 0,22 um. Conserver à 4 ° C.
- Préparer 70% des médias de centrifugation de densité en combinant 18 ml de solution de mix média de centrifugation de densité avec 30 ml de milieu de centrifugation de densité (voir la liste des matériauxpour plus de détails) dans un tube de centrifugation de polypropylene de 50 ml. Conserver à 4 ° C, mais apporter à RT avant utilisation.
- Préparer 37% milieu de centrifugation de densité en combinant 9,6 ml de DPBS avec 10,4 ml de 70% de médias centrifugation par densité dans un tube de centrifugeuse de 50 ml. Conserver à 4 ° C, mais apporter à RT avant utilisation.
- Préparer du tampon de flux en plaçant 500 pl de FBS dans 50 ml de DPBS (~ 1% de FBS) dans un tube de centrifugeuse de 50 ml. Entreposer à conserver à 4 ° C
- Remplissez un 4,5 L de la glace de polyuréthane seau à pleine capacité avec des morceaux de glace.
- Faire une solution combinée de 1 mg / ml de collagénase et 1 mg / ml DNase-I en quantité suffisante pour 1 ml par échantillon du cerveau à l'étude par dilution à 10 mg / ml de DNase I solution stock 1:10 et 50 mg / ml solution collagénase boursier 1h50 avec du DPBS stériles dans un seul tube de 15 ml polypropylène de centrifugeuse. Mélanger la solution par pipetage de haut en bas avec une micropipette P-1000 en douceur. Stocker sur la glace dans le polyurethane seau de l'étape 3.7.
- Obtenir deux broyeurs de tissus Dounce 7 ml en verre. Label One "NT" et l'autre "gal1i". Placez les broyeurs de tissus dans le seau de glace et ajouter 1 ml de DPBS à chacun.
- Obtenir des tubes de 15 ml à centrifuger pour collecter suffisamment de matière cérébrale de chaque souris dans l'étude et le placer dans le seau à glace.
- La place ~ 150 ml de DPBS entre trois tubes de 50 ml de centrifugeuses dans le seau à glace.
- Obtenir des plats assez polystyrène hexagonales pesage (top diamètre interne (ID) 115 mm, la base ID 85 mm, 203 ml de volume) pour chaque souris dans l'étude. L'ensemble complet pour la dissection et la trituration des cerveaux de souris est affiché dans (figure 3A)
- A des moments choisis, anesthésier la première souris portant la tumeur dans l'étude utilisant une injection ip unique de 150 mg / kg de chlorhydrate de kétamine et 20 mg / chlorhydrate de xylazine kg (environ 250 pi de la 12 mg / kétamine ml combiné / 1,6 mg / ml xylazine solution de travail pour une souris de 20 g) pour induire une anesthésie profonde. Assurez-vous que la souris est la non-réponse aux pieds et la queue pincées avant de procéder.
- Récupérer la solution de Tyrode préalablement préparée et la placer dans une hotte à flux laminaire dédié aux procédures chirurgicales animales terminal. Placer polymère imperméable aux gaz fixé un tube à un réservoir de carbogène dans la solution de Tyrode. Ouvrez la vanne du réservoir pour permettre à 95% O 2/5% de CO 2 carbogène à faire des bulles en continu dans la solution.
- Attacher une aiguille émoussée 20 G de moyeu en aluminium à l'extrémité de tubulure polymère imperméable aux gaz supplémentaire attaché à une pompe péristaltique. Placer le tube à l'autre extrémité de la pompe péristaltique dans la solution de Tyrode et tourner sur la pompe pour permettre au tube à remplir avec une solution de Tyrode oxygénée et héparinisé. La mise en place de la souris pour transcardial perfusion est représenté (figure 3B).
- En utilisant quatre 26 g d'aiguilles, cernerla face ventrale de souris anesthésiée par l'avant et l'arrière sur une patte bloc extrudé en mousse de polystyrène recouverte d'une serviette absorbante d'évacuation dans la hotte à flux laminaire.
- Saisir la peau au-dessus de la cavité péritonéale en utilisant une paire de pinces à dissection, et en utilisant une grande paire de ciseaux de dissection faire une incision en "Y" en pénétrant la paroi péritonéale, coupe cephalically pour perforer la membrane, puis bifurquer au niveau du sternum pour se terminer à les aisselles gauche et à droite.
- Utilisez une pince hémostatique pour serrer le sternum et refléter la cage thoracique sur l'épaule gauche de la souris. Retirer le péricarde avec la paire de pinces à dissection.
- Tournez sur la pompe péristaltique pour commencer une perfusion constante de la solution de Tyrode oxygénée et héparine (environ 2.3-2.5 ml / min).
- Insérez l'aiguille émoussée dans le ventricule gauche du cœur. Utilisez une petite paire de ciseaux de dissection pour couper l'oreillette droite pour permettre exsanguination (Figure3C).
- Laisser la solution de Tyrode à perfuser à fond le système circulatoire de la souris jusqu'à ce que le foie et les poumons ont complètement blanchies raison de l'absence de sang. Assurez-vous qu'aucun des montants bruts de sang continuent à quitter l'oreillette droite avant de retirer l'aiguille émoussée 20 G de moyeu en aluminium du ventricule gauche.
- Détacher la souris de l'extrudé bloc de mousse de polystyrène et de tourner la face ventrale de la souris enfoncé. En utilisant une grande paire de ciseaux de dissection, séparer la tête du reste du corps au niveau du cou.
- En utilisant une petite paire de ciseaux de dissection, couper le cuir chevelu à la ligne médiane à partir de l'os occipital de travail en avant vers le museau afin d'exposer le crâne.
- Rétracter la peau sur les deux côtés du crâne à l'aide d'un pouce et l'index et maintenez le crâne en toute sécurité. Utilisez une paire de rongeurs d'os à percer le crâne à partir de l'os occipital et de travailler avant d'exposer complètement la dorsale et latéralesurfaces du cerveau. Soyez prudent pour minimiser les dommages au cerveau.
- Une fois que les os crâniens ont été enlevés, tourner la tête de la souris face ventrale et d'utiliser une petite paire de ciseaux de dissection de couper les nerfs crâniens à la base du cerveau, afin de libérer de la boîte crânienne.
4. Isolement de PBMC de gliome infiltrant
- L'utilisation d'une seule lame de rasoir tranchant propre, isoler la zone du cerveau contenant la tumeur en faisant une coupe sagittale le long du centre du cerveau pour couper en deux les deux hémisphères. Tourner le côté ipsilatéral hémisphère médial vers le bas et deux coupes coronales faire au niveau du cervelet et le bulbe olfactif d'isoler le tissu cible contenant l'implantation de la tumeur (Figure 4A). Une portion équivalente de l'hémisphère contralateral peut également être isolé et utilisé comme témoin négatif.
- Placez le tissu cible dans le verre Dounce broyeur de tissus respectivement marqué contenant 1 ml; de DPBS, pousser le piston tout en bas et tourner 7 fois de perturber d'abord le tissu. Soulevez le piston pour permettre au liquide de régler vers le fond de la broyeur de tissus. Répétez cette étape trois fois; toutefois seulement tordre le plongeur 4 fois au cours des deux prochaines répétitions et 3 fois au cours de la dernière répétition pour éviter de trop triturer le tissu.
- En utilisant une micropipette P-1000, appliquer séquentiellement trois volumes de 1 ml de DPBS glacé (préparé dans 3,11) le long des côtés du piston de rinçage dans le broyeur de tissus.
- Reprendre la question du cerveau trituré par pipetage de haut en bas et le placer dans un tube de 15 ml de centrifugeuse étiqueté sur la glace. Rincer les parois du broyeur de tissus Dounce avec 1 ml de DPBS supplémentaires glacées et ajouter à 15 ml de la même tube de centrifugation. Conservez tous les tubes contenant trituré matière cérébrale sur la glace jusqu'à ce que tous les échantillons ont été traités.
- Répéter les étapes 03.13 à 03.25 et 04.01 à 04.04 pour chaque souris dans l'étude.
- Une fois que tous les échantillons have été traitées, centrifuger la matière cérébrale trituré dans les tubes de 15 ml à centrifuger à 740 xg (max RCF) pendant 20 min à 4 ° C.
- Retirer le surnageant avec une pipette et pipette pistolet 10 ml sérologique et remettre la question du cerveau pastille dans 1 ml de la collagénase / préalablement préparé DNase-je enzymes digestives aide d'un P-1000. Placer les tubes de 15 ml de centrifugeuses dans un rack de tube à essai et placer dans un bain d'eau à 37 ° pendant 15 min.
- Agiter doucement les échantillons deux fois tout au long de la période d'incubation en feuilletant les tubes pour faciliter la désagrégation des tissus.
- Ajouter 6 ml de DPBS glacés utilisant une pipette sérologique de 10 ml dans chaque tube pour diluer les enzymes digestives. Pipette haut et bas pour remettre en suspension, et filtrer les volumes totaux à travers des filtres en filet de nylon 70 um stériles dans de nouveaux tubes étiquetés 15 ml de centrifugeuses sur la glace.
- Faites tourner la suspension de cellules du cerveau vers le bas à 740 xg (max RCF) pendant 20 min à 4 ° C pour atteindre unculot cellulaire unique (figure 4B). Après avoir enlevé les tubes de 15 ml de la centrifugeuse placer sur la glace et augmenter la température de réglage de la centrifugeuse à environ 21 ° C en préparation pour l'étape suivante.
- Enlever entièrement le surnageant de chaque tube contenant les cellules du cerveau et initialement remettre en suspension les culots dans 1 ml de milieu de 70% centrifugation par densité à l'aide d'une micropipette P-1000. Ensuite, ajouter 4 millilitres supplémentaires de 70% des médias de centrifugation de densité à chaque tube en utilisant une pipette de 10 ml sérologique. Visser les capuchons en toute sécurité et d'homogénéiser la suspension de cellules en retournant doucement aux tubes à plusieurs reprises.
- Retirer les tubes de 15 ml à centrifuger contenant des cellules du cerveau remises en suspension dans 70% des médias de centrifugation de densité de la glace, et le placer dans un rack de tube à essai à la température ambiante. Un à la fois, soigneusement Recouvrir avec 2 ml de solution à 37% de médias de centrifugation de densité sur les 5 ml de 70% des médias de centrifugation de densité avec une micropipette P-1000 pour former acl'interface de soudure entre les deux couches de médias de centrifugation de densité (figure 4C).
- Utilisez un marqueur à pointe fine pour indiquer la position de l'interface de sorte qu'il peut être facilement identifié après centrifugation, lorsque la distinction devient moins apparente.
- Isoler les tubes de 15 ml à centrifuger à 740 xg (max RCF) pendant 20 min à température ambiante avec aucune pause pour éviter de perturber l'interface.
- Après centrifugation, les cellules PBMC recueillir qui se sont accumulées à l'interface entre les deux couches de milieux de centrifugation par densité (figure 4D) en introduisant une micropipette P-200 dans le tube le long de son côté, en contournant soigneusement la couche lipidique.
- Une fois au niveau de la bande de PBMC, extraire lentement 200 pi de la surface de la couche de 70% de centrifugation de densité de supports et placez dans un tube en polypropylène de FACS, respectivement étiquetés sur la glace. Répéter une fois pour un volume total de 400 ul par échantillon.
- Ajouter 3 ml de tampon de flux dans chaque tube FACS contenant 400 pi de CMSP pour diluer suffisamment les médias de centrifugation de densité, puis tourner les cellules vers le bas à 660 xg (max RCF) pendant 20 min à 4 ° C.
5. immunomarquage des PBMC de gliome infiltrant
- Avant d'analyser les échantillons de PBMC expérimentales, effectuer une seule, l'expérience de contrôle isotypique, indépendante surface de la cellule pour établir portes de base d'être associé à un ensemble de tensions PMT fixes dans un modèle d'analyse de données de cytométrie de flux dédié à l'évaluation des CMSP de gliome infiltrant selon le protocole suivant:
- Greffer une souris C57BL / 6J souris avec GL26-Cit-gal1i et une autre avec GL26-Cit-NT selon la procédure décrite dans la section 2. Après 72 heures de croissance de la tumeur, l'euthanasie les souris et isoler les PBMC infiltrant les tumeurs, selon les procédures décrit à travers les sections 3 et 4.
- Combiner les deux échantillons CMSP (NT unee gal1i) dans un volume (par exemple, 100 ul), puis divise en outre l'échantillon de façon égale entre les trois FACS tubes (par exemple, 33,3 ul par tube) étiqueté "isotype CD45», «Gr-1 / CD11b isotype» et «NK1. une isotype ». Ajouter les anticorps suivants (chacun à une dilution 1: 100 et on dilue jusqu'à un volume total de 200 ul dans du tampon de flux) dans les tubes FACS respectivement marquées: "CD45 isotype»: Alexa Fluor rat 700 conjugué à IgG2b, κ (clone: RTK4530 ); "Gr-1 / CD11b isotype»: Alexa Fluor 700-rat conjugué anti-souris CD45 (clone 30-F11), conjugué PE-IgG2b de rat, κ (clone: eB149 / 10H5), et PerCP / Cy5.5 IgG2b de rat conjugué à, κ (clone: RTK4530); "isotype NK1.1": Alexa Fluor 700-rat conjugué anti-souris CD45 (clone 30-F11), PE-conjugué rat anti-souris Gr-1 (clone: RB6-8C5), PerCP / Cy5.5-rat anti-souris conjuguée CD11b (clone: M1 / 70), et APC-conjugated souris IgG2a, κ (clone: eBM2a).
- Laisser CMSP à immunolabel sur de la glace dans l'obscurité pendant 20 min. Feuilletez les tubes une fois à mi la période d'incubation pour mélanger doucement. Laver avec 1 ml de tampon d'écoulement, centrifuger à 660 x g (max RCF) pendant 10 min à 4 ° C et remettre en suspension dans chaque tube FACS contenant des PBMC avec 200 pi de tampon de flux.
- L'utilisation d'un cytomètre de flux équipé d'une buse intégrée 85 um, analyser le tube "CD45 isotype" premier à établir une base CD45 porte intervalle. Ensuite, exécutez le tube "Gr-1 / CD11b isotype" pour établir une base Gr-1 / CD11b porte quadrant utilisant seuls vrais CD45 + cellules en entrée. Enfin, lancez le tube "NK1.1 isotype" d'établir un NK1.1 porte intervalle de référence en utilisant seulement vrai CD45 + / Gr-1 cellules faibles / CD11b +/- comme entrée.
- Utilisez la procédure suivante pour toutes les futures un expérimentalealy:
- Ajouter une quantité suffisante d'une dilution 1: 100 d'anticorps de surface de cellule dans un tampon de flux pour obtenir un volume de 200 ul par échantillon (plus 1 pour l'isotype GZMB): Alexa Fluor rat 700 conjugué anti-souris CD45 (clone 30-F11 ), PE-conjugué rat anti-souris Gr-1 (clone: RB6-8C5), rat PerCP / Cy5.5 conjugué anti-souris CD11b (clone: M1 / 70), APC-souris conjugué anti-souris NK1.1 (clone: PK136).
- Enlever soigneusement le surnageant des cellules PBMC à partir de filés vers le bas jusqu'à ce que le ménisque 4,15 est juste au-dessus du fond de chaque tube FACS (~ 50 ul) pour éviter les pertes de cellules. Reprendre les CMSP dans chaque tube FACS en utilisant le tampon de flux résiduel avec une micropipette P-200 et retirer (1 / # d'échantillons) d'une valeur du volume de chaque tube FACS et les combiner dans un nouveau tube FACS étiqueté «isotype commun».
- Ajouter 200 ul d'un cocktail d'anticorps de surface cellulaire préparé en 5.2.1 pour chaque échantillon de PBMC. Laisser CMSP à immunolabel sur de la glace dans l'obscurité pendant 20 min. Flick til Tubes fois à la mi période d'incubation pour mélanger délicatement.
- Laver avec 1 ml de tampon de débit; centrifuger à 660 xg (max RCF) x 10 min à 4 ° C.
- Reprendre tous les tubes FACS contenant CMSP dans 200 pi d'un fixateur à base de formol disponible dans le commerce (voir la liste des matériaux pour plus de détails) pendant 15 min sur de la glace dans l'obscurité. Feuilletez les tubes une fois à mi la période d'incubation pour mélanger doucement.
- Laver avec 1 ml d'un tampon 1x perméabilisation / de lavage disponibles dans le commerce (voir la liste des matériaux pour plus de détails) et centrifuger à 660 xg (max RCF) pendant 10 min à 4 ° C.
- Alors que les CMSP tournent vers le bas, préparer une quantité suffisante d'une dilution 1: 100 de la souris Pacific Blue conjugué anti-souris GZMB (Clone: GB11) anticorps intracellulaires dans un tampon perméabilisation / lavage 1x pour atteindre un volume de 200 ul par échantillon.
- Dans un tube séparé, préparer un seul volume de 200 pi d'une dilution de 1: 100 de Pacific Blue-conjugated souris IgG1, κ (clone: MOPC-21) anticorps de contrôle d'isotype.
- Remettre en suspension chacun des échantillons de PBMC expérimentales avec 200 ul de la dilution 1: 100 d'anticorps anti-souris GZMB et remettre en suspension le tube FACS unique étiqueté «isotype groupé" avec le volume de 200 ul de la dilution 1: 100 d'anticorps d'isotype.
- Permettre à tous les échantillons de PBMC à immunolabel sur de la glace dans l'obscurité pendant 20 min. Feuilletez les tubes une fois à mi la période d'incubation pour mélanger doucement.
- Laver avec 1 ml de tampon de débit; centrifuger à 660 xg (max RCF) pendant 10 min à 4 ° C et remettre en suspension les CMSP avec 200 pi de tampon de débit pour l'analyse.
- Débit cytométrie analyser CMSP de gliome infiltrant utilisant une buse intégrée de 85 um et les portes et les tensions PMT précédemment établies dans la section 5.1 22. Veillez à exécuter la totalité du volume de chaque échantillon sur le cytomètre en flux pour assurer une comparaison équitable du nombre total de gliome-infiltNote PBMC dans chaque échantillon.
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Representative Results
La stratégie de déclenchement suivant est utilisé pour une expérience typique: FSC-A vs SSC-A → SSC-H vs SSC-W → FSC-H vs FSC-W → CD45 vs. comptage → Gr-1 contre CD11b → NK1.1 contre comptage. Gates a mis sur Gr-1 + / + CD11b cellules myéloïdes et les cellules NK NK1.1 + sont ensuite stratifié basé sur l'expression GZMB (figure 5A). Backgating ces cellules identifiées comme des cellules NK et NK1.1 + Gr-1 + / + CD11b cellules myéloïdes dans nos expériences SUR DES FSC-A vs SSC-A confirme la taille de la plus petite lymphoïde des cellules NK et la taille relativement importante des cellules myéloïdes ( Figure 5B). Fichiers de données brutes (ie., Fichiers FCS) sont analysés par un logiciel commercial d'analyse de données de cytométrie de flux tels que FlowJo.
Un total de 18 souris C57BL / 6J ont été utilisés pour démontrer ce procédé. Neuf (9) ont été greffés avec le GL26-Cit-NT et 9 ont été greffés avec le GL26-Cit-gal1i sur le même day utilisant nombre équivalent de cellules (3x10 4). Trois souris de chaque groupe ont été euthanasiés à 24, 48, et la greffe à 72 h post-tumorale. Les données montrent que la prise de greffe de cellules de gliome GL26-Cit-gal1i dans le cerveau de souris C57BL / 6J syngéniques induit rapidement le recrutement de cellules PBMC CD45 + (figure 6A). Sur la base du cocktail d'anticorps spécifique utilisé dans la démonstration il peut en outre être démontré que Gr-1 + / CD11b + cellules myéloïdes et les cellules NK1.1 + NK entrer spécifiquement le microenvironnement tumoral gal-1 déficient dans les 48 heures de la prise de greffe de la tumeur (Figure 6B et 6C); toutefois, le nombre total de cellules myéloïdes gliome infiltrant dépasse de loin celle des cellules NK.
Figure 1: Préparation des cellules GL26-CIT pour intracrânienne prise de greffe (A.) Champ lumineux représentant 10X et micrographies épifluorescence de GL26-Cit-NT (images de gauche) et les cellules en culture GL26-Cit-gal1i (des images de droite). (B) de Western blot de GL26-Cit-NT (voie de gauche) et GL26-Cit-gal1i (voie de droite) de lysat de cellules entières. Tubuline gamma (γ-baignoire.) Est montré comme un contrôle du chargement. (C) GL26-Cit culot cellulaire confluente d'une culture de tissu T75 ballon environ 50% après centrifugation à 550 x g (max RCF) pendant 5 min à 4 ° C. (D) de vue à champ lumineux d'un hémocytomètre contenant des cellules GL26-Cit (points blancs) dilué 1: 1 avec du bleu Trypan pour évaluer le nombre de cellules et la viabilité. Les cellules doivent être> 90% viables pour assurer la croissance de la tumeur reproductible. La moyenne des numérations cellulaires des carrés numérotés de 1 à 5 doivent être prises pour accroître la précision de l'estimation du nombre de cellules. Cellules (E) GL26-Cit remises en suspension à 3 x 10 4 cellules / ul dans non complétée DMEM pour impla intracrâniennentation. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: stéréotaxique greffe de cellules gliome dans le striatum de souris C57BL / 6J (A) Surgical Agencement de bain montrant les instruments et réactifs chirurgicaux requis.. (B) Vue rapprochée d'une souris C57BL / 6J exploité dans un cadre stéréotaxique avec le placement de l'aiguille appropriée à 0,5 mm AP, 2,5 mm ML, et -3,0 mm DV par rapport au bregma. Vue (C) dorsale du crâne de souris montrant la position du bregma et le site cible pour la prise de greffe de cellules tumorales. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. Souris Transcardial Perfusion (A) Les réactifs nécessaires à la dissection, la trituration, et la digestion enzymatique des tissus du cerveau de la souris. (B) Disposition des instruments et des réactifs nécessaires à la souris transcardial perfusion avec la solution de oxygénée et héparine Tyrodes présentées dans une hotte à flux laminaire dédié aux procédures chirurgicales de souris terminal. (C) Représentation schématique du cœur démontrant instruments et les placements nécessaires à perfusion transcardial appropriées. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Isolement de gliome infiltrantCMSP. (A) Stratégie pour la dissection des tissus du cerveau de la souris contenant un stade précoce des implants de gliome orthotopique. Le panneau supérieur démontre la dichotomie sagittale de l'hémisphère ipsilatéral loin de l'hémisphère controlatéral. Le panneau du bas montre les deux coupes coronales supplémentaires nécessaires pour isoler le tissu cible contenant l'implantation de la tumeur (surligné en violet). Pastille (B) du tissu cérébral à l'unité de cellule (flèche blanche) après digestion enzymatique, filtration à travers un tamis en nylon de 70 pm et centrifugation. (C) correctement versé de gradient des médias de centrifugation de densité avant la centrifugation. La flèche blanche indique l'interface propre formée entre les couches de milieux de deux centrifugation de densité. (D) à gradient de densité de médias de centrifugation après la centrifugation démontrer la couche lipidique qui se forme à la partie supérieure de la flèche blanche 37% de la couche de milieu de centrifugation de densité) et la bande de PBMC (décrit par ee pointillés noirs) à l'interface entre les deux couches. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: Flow Stratégie Gating Cytometric Utilisé pour identifier gliome infiltrant Gr-1 + / CD11b + cellules myéloïdes et les cellules NK (A) Étape 1:. Nombre de cellules immuno-isolées à partir de la bande de PBMC d'un gradient de médias de centrifugation de densité sont déclenchés à exclure les débris cellulaires (FSC-A moins de ~ 50 K). Les étapes 2 et 3: Doublet discrimination gating pour filtrer les agrégats cellulaires. Étape 4: porte CD45 pour identifier les cellules immunitaires infiltrant gliome. Isotype contrôle est présenté comme la silhouette grise. Étape 5: CD45 + cellules stratifiées basées sur Gr-1 et CD11b. Isotype contrôle pour les deux Gr-1 et CD 11b est superposée sur l'intrigue et entourée par le cercle d'or. Le cercle rouge indique cellules myéloïdes Gr-1 + / CD11b +. Étape 5 ': des cellules myéloïdes Gr-1 + / + CD11b stratifié basé sur l'expression de GZMB. Comme prévu, les ces cellules ne étiqueter avec des anticorps anti-GZMB plus de contrôle isotypique (silhouette grise). Étape 6: Gr-1 cellules faibles soulignés par le rectangle noir à l'étape 5 stratifié basé sur l'expression de NK1.1. Isotype contrôle est présenté comme la silhouette grise. Étape 6 ': cellules NK1.1 haute stratifié basé sur l'expression de GZMB. Ces cellules effet étiqueter avec des anticorps anti-GZMB dessus isotype contrôle (de silhouette grise). (B) de Backgating Gr-1 + cellules myéloïdes / CD11b + sur FSC vs. SSC-A-A démontrant que les cellules NK ont une taille plus petite lymphoïde par rapport aux Gr-1 + cellules myéloïdes de plus grande taille / CD11b +."_blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6: Comparaison des CMSP infiltration dans le GL26-Cit-NT vs GL26-Cit-gal1i microenvironnement de la tumeur au cours des trois premiers jours de croissance de la tumeur intracrânienne (A) + CD45 total cellules immunitaires.. (B) des cellules myéloïdes CD45 + / Gr-1 + / CD11b +. (C) + CD45 + /NK1.1 cellules NK. Les points de CMSP isolées de gliomes GL26-Cit-gal1i données sont reliés par des lignes douces, whiles ceux isolés de gliomes GL26-Cit-NT sont reliés par des lignes en pointillés. CMSP de gliome infiltrant de trois souris ont été analysés par type de tumeur à chaque point de temps. Numéros associés à chaque point sur les courbes GL26-Cit-gal1i données représentent la fois l'induction de ce type CMSP notamment sur GL26-CIt-NT à l'implantation post-tumorale heure spécifiée (HPI). Les données représentent le nombre moyen de cellules immunitaires comptés ± l'erreur standard de la moyenne (SEM). L'analyse statistique a été effectuée par analyse 2 de la variance. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Ce protocole décrit un procédé robuste et reproductible pour l'isolement et l'analyse cytométrique en flux de cellules PBMC qui ont infiltré le micro-environnement de la tumeur du cerveau de la souris au début. Des suspensions de cellules de gliome sont générées à une concentration spécifiée par l'expérimentateur qui sont greffées stéréotaxique dans le striatum du cerveau de la souris. Les souris sont ensuite euthanasiés à des points de temps prédéterminés spécifiés par le protocole expérimental et leurs cerveaux sont récoltée et traitée pour isoler les PBMC de gliome infiltrant qui sont immunomarquées avec des combinaisons d'anticorps primaires conjugués à un fluorochrome; immunomarquées cellules sont ensuite quantifiés par cytométrie de flux. Bien que la démonstration présentée ici se concentre sur des points de temps précoces, CMSP de gliome infiltrant peuvent être évaluées à un point quelconque de temps après la prise de greffe tumorale jusqu'à un état moribond de la souris. La méthode est très modulaire comme un certain nombre de différentes combinaisons d'anticorps peut être utilisé pour examiner les cellules immunitaires d'intérêt including cellules T, les cellules B, les cellules NK, les monocytes et les macrophages. Notez que le protocole a été optimisé pour une utilisation avec les femmes C57BL / 6J 8-10 semaines d'âge. Souris en dehors de cette tranche d'âge peut avoir modifié les pourcentages de CMSP circulation, qui peut conduire à la numération des cellules à des points de temps équivalents qui ne sont pas représentatifs des données présentées ici. Expériences de caractérisation peuvent également être nécessaires si les modèles de tumeurs alternatives sont utilisées ou si les souris autres que ceux sur le fond de B6 sont utilisés en raison du fait que les souches peuvent différer dans leurs profils CMSP (Jaxpheno6; Base de données de souris Phenome; Jackson Laboratory). Sexe et les conditions environnementales peuvent aussi être des sources de disparité entre les fréquences et les pourcentages de CMSP.
Cette méthode a été démontrée en utilisant une combinaison d'anticorps de surface de cellule quatre qui permettent la détection de Gr-1 + / + CD11b cellules myéloïdes et les cellules NK1.1 + NK, des types de cellules impliqués dans le rejet de gal-1-deficient gliome. L'inclusion d'anticorps GZMB intracellulaires permet en outre la détection du potentiel cytotoxique dans la cellule NK sous-ensemble. Les résultats représentatifs sont prévus pour une infiltration de cellules immunitaires dans les premiers gliomes GL26-CIT dans syngéniques C57BL / 6J que ce soit, expresse des niveaux normaux de gal-1 ou qui ont des niveaux réduits en raison de knockdown de gènes shRNA médiation. La démonstration présente la sensibilité et la reproductibilité de la technique en montrant que les PBMC de gliome infiltrant peuvent être isolés et quantifiés de manière reproductible dès que la prise de greffe de post-tumeur 24 h. Mis à part révélant une population de GR-1 + CD11b cellules myéloïdes élevés / infiltrant les tumeurs, la démonstration révèle également une population de Gr-1 int / CD11b + cellules dont l'identité est actuellement définie. Des expériences supplémentaires sont nécessaires pour déchiffrer en outre le caractère de cette population de cellules. Nous notons également que nous ne observons une population facilement distinguable CD45
Anti-Gr-1 anticorps reconnaissent à la fois les protéines de la surface cellulaire et Ly6G Ly6C qui sont spécifiques à polymorphonucléaires et mononucléaires, cellules myéloïdes 25 respectivement. L'utilisation de l'anti-Gr-1 Antibods exclut donc distinction entre ces deux populations cellulaires. Les résultats préliminaires de notre laboratoire commencent maintenant à faire la lumière sur une description plus précise des cellules début Gr-1 + / + CD11b qui infiltrent le gliome microenvironnement gal-1 déficient. Des expériences incorporant anti-Ly6G (clone: 1A8) et anti-Ly6C (clone: AL-21) anticorps avec des anticorps anti-CCR2 indiquent maintenant que le GR-1 CD11b cellules élevées / + infiltrant le microenvironnement tumoral gal-1-deficient tôt sont compatibles avec Ly6C haute / CCR2 monocytes inflammatoires élevés, bien que d'autres expériences sont nécessaires pour confirmer ce résultat (données non présentées).
En raison de cellule perd qui peuvent survenir au cours des étapes de répétition de centrifugation et remise en suspension impliqués dans l'isolement CMSP de gliome infiltrant, il est probable que le nombre de cellules observées sont en fait plus faible que ce qui est effectivement présent dans le cerveau intact. Toutefois, les différences entre egroupes Xperimental doivent tenir si des volumes équivalents de l'interface de support de centrifugation de densité 37/70 sont extraites et si la totalité du volume de chaque échantillon est analysé par le cytomètre en flux. Le non respect de ces mesures se traduira par des comparaisons injustes entre les échantillons et empêchera analyse impartiale. L'incapacité de quantifier le nombre exact de CMSP entrant dans le microenvironnement de la tumeur est le cerveau pas une limitation spécifique à ce protocole. Des méthodes alternatives telles que les stratégies de comptage cellulaire immunohistologiques sont également soumis à l'erreur due à des extrapolations de nombre total de cellules basés sur les comptages stéréologiques et l'exigence de l'image seuil équivalent sur les coupes de tissus micrographies, qui peuvent différer de leur niveau de coloration de fond, pouvant aboutir à une fausse signaux séronégatifs ou faux-positifs. Néanmoins, une comparaison de l'analyse au cours du temps entre les différentes méthodes d'analyse devrait révéler courbes en fonction du temps immunitaire afflux de forme globale similaire. Uninconvénient supplémentaire des procédés immunohistochimiques est l'incapacité de certains anticorps validés pour cytométrie en flux à se lier à l'épitope antigénique équivalent dans le cadre de coupes de tissus fixés au formol cerveau.
Il ya quelques étapes clés de ce protocole qui pourrait servir de limites pour ceux qui ne connaissent sa méthodologie. Une telle étape est la récolte du cerveau du crâne sans l'endommager. Nous conseillons Pratiquer la technique à plusieurs reprises avant d'exécuter des expériences appropriées. Cependant, puisque le cerveau finira par être trituré, des dommages mineurs aux couches superficielles du cerveau sont susceptibles sans conséquence pour la quantification précise de CMSP de gliome infiltrant. Une deuxième étape que les enquêteurs inexpérimentés peuvent trouver difficile est d'abord la coulée du gradient des médias de centrifugation de densité. La capacité des expérimentateurs pour former une interface propre tout en recouvrant les 2 ml de 37% des médias de centrifugation de densité au-dessus dela couche 70% est cruciale à l'isolement reproductible de CMSP. Bien que cette étape peut se révéler au départ difficile, il enrichit considérablement pour CMSP et diminue considérablement la période de temps autrement nécessaire pour l'analyse de l'échantillon si tout le tissu de cerveau où à analyser flux cytométrie. PBMC enrichissement réduit également le nombre total d'événements capturés par le cytomètre en flux, ce qui réduit la taille des fichiers de .fcs et aider à résoudre les populations rares de cellules immunitaires infiltrant cerveau. Pour de meilleurs résultats dans l'établissement d'une interface de centrifugation de densité propre, nous vous recommandons de verser la densité des médias de centrifugation 37% en utilisant une micropipette P-1000 avec l'action de piston lisse. Angle du tube de 15 ml de centrifugeuse environ 20-30 ° au-dessus de la paillasse. Reste la pointe de la micropipette sur le côté du tube 3-5 ml repères au-dessus de la surface de la couche de 70% de centrifugation de densité de médias. Verser lentement et progressivement de manière à réduire au minimum élan vers l'extérieur ouverte du milieu de centrifugation de densité de 37% comme il EXTRUdes de la pointe de micropipette afin d'éviter de perturber les 70% les médias de centrifugation de densité sous-jacente. Enfin, le fait que l'architecture du tissu cérébral est nécessairement détruit dans le processus d'isolement de gliome infiltrant CMSP signifie que les souris supplémentaires seront nécessaires pour obtenir des points de données en temps histologiques appariés.
Les nouveaux modèles de gliome générées par l'injection d'ADN plasmidique oncogène dans le cerveau de rongeurs normaux ont été développés ces dernières années 26-32. Ces modèles tumoraux endogènes "contourner" artefacts potentiels causés par stéréotaxique de greffe ex vivo des cellules cancéreuses et imiter plus étroitement les caractéristiques histologiques de gliome clinique. Le procédé décrit ici est bien adaptée à l'étude des événements d'infiltration immunitaires qui caractérisent ces systèmes de modèles plus cliniquement pertinente. Les études sur l'afflux immunitaire des souris néonatale peuvent également être effectuées en utilisant cette méthode, bien que la densité de protocoles d'entente néonatalee cerveau est inférieure à celle de l'adulte, ce qui peut nécessiter une optimisation de l'étape de digestion enzymatique, afin d'éviter au cours de la digestion du tissu cérébral. D'autres applications de la technique comprennent les enquêtes sur d'autres classes de la maladie inflammatoire du cerveau en dehors de tumeurs malignes tels que encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE) et les réponses immunitaires à l'infection virale.
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Disclosures
Les auteurs ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la Santé / Institut national des troubles neurologiques et des maladies (NIH / NINDS) accorde R01-NS074387, R01-R21 et NS057711-NS091555 à MGC; NIH / NINDS accorde R01-NS061107, R01-NS076991, R01-R21 et NS082311-NS084275 à PRL; subventions de Happy Hearts de Léa, Université du Michigan Comprehensive Cancer Center attribué à MGC et PRL; du département de neurochirurgie de l'Université du Michigan School of Medicine; l'Institut du Michigan pour clinique et de recherche en santé, soutenu par NIH subvention 2UL1-TR000433; la Subvention de formation de biologie Université du Michigan Cancer soutenu par NIH / NCI (National Cancer Institute) subvention T32-CA009676; l'Université du Michigan de formation en neurosciences cliniques et fondamentales soutenu par NIH / NINDS accorder T32-NS007222; et l'Université de Programme de formation scientifique médicale Michigan soutenu par NIH / NIGMS (Institut national de médecine générale Sciences) accorder T32-GM007863. Les auteurs d'unre reconnaissants pour le leadership universitaire et le soutien reçu du Dr Karin Muraszko et le Département de neurochirurgie; M. Dahlgren, D. Tomford, et S. napolitaine pour le soutien administratif superbe; M. Dzaman pour l'assistance technique exceptionnelle; et Phil F. Jenkins pour le soutien généreux envers l'achat d'un microscope électronique à balayage Zeiss 3D. Nous reconnaissons également le laboratoire Kuchroo à la Harvard Medical School à partir de laquelle une version modifiée de la stratégie de médiation de médias centrifugation de densité pour l'isolement de cellules mononucléaires du cerveau a été prélevé.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modification of Eagles Medium | Gibco | 12430-054 | with 4.5g/L D-glucose, L-glutamine, 25 mM HEPES and phenol red |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Gibco | 14190-144 | without calcium chloride or Magnesium chloride |
| Fetal bovine serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10,000 U/ml Penicillin; 10,000 μg/ml Streptomycin |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | 200 mM |
| G418 sulfate | Omega Scientific Inc. | GN-04 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P8833 | from Streptomyces alboniger |
| HyClone HyQTase non-mammalian trypsin alternative | Thermo Scientific | SV30030.01 | in DPBS with EDTA |
| Phase contrast hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | 0.1 mm deep |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250-061 | |
| Sterile 0.9% NaCl injection, USP | Hospira | NDC: 0409-4888 | 10 ml vials |
| 0.6 ml conical polypropylenemi microtubes | Genesee Scientific | 22-272 | |
| Atipamezole hydrochloride injection | Orion Pharma | NDC: 52483-6298 | 5 mg/ml solution |
| Ketamine hydrochloride injection | Fort Dodge | NDC: 0409-2051 | 100 mg/ml solution |
| Dexmedetomidine hydrochloride injection | Zoetis | NDC: 54771-2805 | 0.5 mg/ml solution |
| Xylazine hydrochloride injection | Lloyd | NDC: 61311-481 | 100 mg/ml solution |
| Carprofen injection | Pfizer | NDC: 61106-8501 | 50 mg/ml solution |
| Buprenorphine hydrochloride injection | Reckitt Benckiser | NDC: 12496-0757 | 0.3 mg/ml ampuls |
| 1 ml tuberculin syringes | Covidien | 8881501400 | |
| 26G x ½ (0.45 mm x 13 mm) syringe needles | BD | 305111 | |
| Surgical clippers | 3M | 9661 | |
| Providone-iodine solution | Aplicare | 82-217 | NDC: 52380-1905 |
| Sterile petrolatum ophthalmic ointment | Dechra | NDC: 17033-211 | |
| 70% isopropyl alcohol prep pads | Kendall | 6818 | |
| Sterile gauze | Covidien | 8044 | non-woven, 4" x 4", 4-ply |
| 1.7 ml conical polypropylene microtubes | Genesee Scientific | 22-281 | |
| Mouse stereotactic frame | Stoelting | 51730 | |
| Surgical lamp | Philips Burton | CS316W | Coolspot II Variable Spotlight |
| Curved dissecting forceps | Ted Pella Inc. | 5431 | |
| Colibri retractors | FST | 17000-03 | |
| Cordless precision power drill | Dremel | 1100-01 | Stylus model; 7.2-Volt Lithium-Ion with Docking Station |
| Engraving Cutter | Dremel | 105 | 1/32" or 0.8 mm bit diameter |
| Microliter syringe | Hamilton | 75 | Hamilton Microliter Syringes 700 series; 5 μl volume |
| Microliter syringe needles | Hamilton | 7762-06 | 33 G, small hub RN NDL, 1.5 in, point style 3, 6/PK |
| Ethilon 3-0 black monofilament nylon sutures | Ethicon | 1663 | |
| Magnetic stir bar | VWR | 74950-296 | 7.9 mm diameter x 50 mm length (5/16" diameter x 2" length) |
| 1 L glass screw-cap storage bottle | Corning | 1395 | Type 1, Class A borosilicate glass |
| Heparin sodium | Sagent | NDC: 25021-400 | 1,000 U/ml solution |
| Peristaltic pump | Cole Parmer Instruments Group | 77200-60 | Master Flex Easy Load II console drive |
| compressed carbogen (95% O2 / 5% CO2) | available from local vendor | N/A | A-type, large cylinder |
| 20 G x 1 ½" aluminum hub blunt needles | Kendall | 8881202363 | 0.9 mm x 38.1 mm |
| Polyurethane ice bucket | Fisherbrand | 02-591-45 | Capacity: 0.152 oz. (4.5L) |
| Collagenase (Type I-S) | Sigma Aldrich | C1639 | from Clostridium histolyticum |
| Deoxyribonuclease I | Worthington Biochemical Corp. | LS002007 | >2,000 Kunitz units per mg dry weight |
| Antistatic polystyrene hexagonal weighing dishes | Ted Pella Inc. | 20157-3 | top I.D. 115 mm, base I.D. 85 mm, 203 ml volume |
| Stainless steel single edged razor blades | Garvey | 40475 | |
| Bone rongeurs | FST | 16001-15 | |
| Hemostat | FST | 13014-14 | |
| Large dissection scissors | Ted Pella Inc. | 1316 | |
| Small dissection scissors | FST | 14094-11 | |
| Blunt end forceps | Ted Pella Inc. | 13250 | |
| 7 ml glass Dounce tissue grinder | Kontes | KT885300-0007 | |
| Percoll Density Centrifugation Media | GE Healthcare | GE17-0891-01 | |
| 10 ml serological pipettes | Genesee Scientific | 12-104 | single use; sterile |
| 70 μm sterile nylon mesh cell strainers | Fisherbrand | 22363548 | |
| Alexa Fluor 700-conjugated rat anti-mouse CD45 (clone: 30-F11) | Biolegend | 103128 | |
| APC-conjugated mouse anti-mouse NK1.1 (clone: PK136) | eBiosciences | 17-5941-82 | |
| PE-conjugated rat anti-mouse Gr-1 (clone:RB6-8C5) | BD Pharmigen | 553128 | |
| PerCP/Cy5.5-conjugated rat anti-mouse CD11b (clone: M1/70) | Biolegend | 101228 | |
| Alexa Fluor 700-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control | Biolegend | 400628 | |
| APC-conjugated mouse IgG2a, κ (clone: eBM2a) isotype control | eBioscience | 17-4724 | |
| PE-conjugated rat IgG2b, κ (clone: eB149/10H5) isotype control | eBioscience | 12-4031-82 | |
| PerCP/Cy5.5-conjugated rat IgG2b, κ (clone: RTK4530) isotype control | Biolegend | 400632 | |
| Pacific Blue-conjugated mouse anti-mouse granzyme B (Clone: GB11) | Biolegend | 515403 | |
| Pacific Blue-conjugated mouse IgG1, κ (Clone: MOPC-21) isotype control | Biolegend | 400151 | |
| Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | |
| 15 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-103 | conical bottom |
| 50 ml polypropylene centrifuge tubes | Genesee Scientific | 21-108 | conical bottom |
| 12 mm x 75 mm round-bottom polypropylene FACS tubes | Fisherbrand | 14-956-1B | |
| FACSAria Special Order Research Product flow cytometer/cell sorter | BD | 650033 | |
| Class II Biological Safety Cabinet | The Baker Company | SG603 | model: SterilGARD III Advance |
References
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