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Neuroscience

Chimeric निर्माणों के एचएसवी की मध्यस्थता transgene अभिव्यक्ति चूहे में GPCR Heteromers के व्यवहार समारोह का अध्ययन करने

Published: July 9, 2016 doi: 10.3791/53717
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3,4
1Department of Psychiatry, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Department of Neurology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Friedman Brain Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Department of Physiology and Biophysics, Virginia Commonwealth University Medical School

Summary

यह आलेख बताता है कि कैसे माउस ललाट प्रांतस्था में वायरल वैक्टर इंजेक्षन करने के लिए व्यवहार assays कि GPCR heteromeric गठन की आवश्यकता का परीक्षण करने के लिए।

Introduction

ऐसे एलएसडी, psilocybin और mescaline के रूप में hallucinogens, मानव चेतना, अनुभूति और भावना 7-9 में महत्वपूर्ण परिवर्तन का कारण है। या तो आनुवंशिक या औषधीय दृष्टिकोण से सेरोटोनिन 5 हिंदुस्तान टाइम्स 2A रिसेप्टर संकेतन की निष्क्रियता स्पष्ट रूप से दोनों कृंतक मॉडल 3,10 में hallucinogens को व्यवहार प्रतिक्रियाओं तनु और 11 मनुष्य का कारण बनता है। हालांकि hallucinogens बाँध अन्य रिसेप्टर उपप्रकार 8, 5 हिंदुस्तान टाइम्स 2A रिसेप्टर इन रसायनों की अनूठी व्यवहार गतिविधि के लिए आवश्यक के रूप में माना जाता है।

समूह द्वितीय metabotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर्स (अर्थात्।, MGlu2 और mGlu3) hallucinogens की आणविक तंत्र और उनके अभिन्न भूमिका अंतर्निहित मनोविकृति 12 के बारे में काफी ध्यान का लक्ष्य दिया गया है। इससे पहले, यह दिखा दिया है कि mGlu2 प्रोटीन (mGlu2-KO चूहों) की कोई अभिव्यक्ति के साथ चूहों एचएएल के सेलुलर और व्यवहार प्रभाव के प्रति असंवेदनशील हैंlucinogens 5। यह भी सुझाव दिया गया है कि 5 हिंदुस्तान टाइम्स 2A और mGlu2 रिसेप्टर्स एक विशिष्ट heteromeric जटिल है जिसके माध्यम से सेरोटोनिन और ग्लूटामेट ligands जीवित कोशिकाओं 1,2 में जी प्रोटीन युग्मन के पैटर्न मिलाना के रूप में।

संरचनात्मक, transmembrane (टीएम) डोमेन 4 और mGlu2 के 5 5 हिंदुस्तान टाइम्स 2A रिसेप्टर 5 के साथ heteromeric गठन में एक मौलिक भूमिका निभाते हैं। इसके अतिरिक्त, आगे की जांच पड़ताल प्रदर्शन किया है कि तीन mGlu2 की TM4 के intracellular छोर पर स्थित अवशेषों 5 हिंदुस्तान टाइम्स कोशिकाओं 6 जीने में 2A -mGlu2 रिसेप्टर heterocomplex फार्म के लिए आवश्यक हैं।

इन निष्कर्षों heterologous अभिव्यक्ति प्रणालियों में मनाया के आधार पर, यहाँ हम क्या परीक्षण करने के लिए जंगली प्रकार mGlu2 और mGlu2-को चूहों के ललाट प्रांतस्था में mGlu2 / mGlu3 कैमेरिक निर्माणों की एचएसवी की मध्यस्थता अभिव्यक्ति के उपयोग का वर्णन 5 हिंदुस्तान टाइम्स 2A के बीच heteromeric गठन और mGlu2 के लिए आवश्यक हैसिर से चिकोटी व्यवहार hallucinogenic 5 हिंदुस्तान टाइम्स 2A रिसेप्टर एगोनिस्ट द्वारा प्रेरित किया।

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Protocol

नोट: पशु प्रजनन और परवाह के लिए सभी प्रक्रियाओं माउंट सिनाई मेडिसिन में Icahn स्कूल की संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) विनियमन के अनुसार आयोजित की गई। प्रक्रिया के दौरान बाँझ दस्ताने का उपयोग सुनिश्चित करें।

1. दवा और वायरस तैयारी

  1. ड्रग तैयारी
    1. 12.9 0.9 मिलीलीटर% नमकीन घोल में 100 मिलीग्राम / एमएल अक्स की 1.35 मिलीग्राम और 20 मिलीग्राम / मिलीलीटर xylazine की 0.75 मिलीग्राम भंग द्वारा 15.0 मिलीलीटर ketamine / xylazine संवेदनाहारी तैयार करें। अच्छी तरह से समाधान का मिश्रण।
  2. वायरस तैयारी
    1. MGlu2 क्लोन और mGlu2ΔTM4N निम्न मानक प्रोटोकॉल पहले 6 वर्णित एक bicistronic दाद सिंप्लेक्स वायरस (एचएसवी) वेक्टर में निर्माण करती है। वायरल कणों पैकेज के रूप में पहले से 6,13,14 का वर्णन किया। अवशेषों के प्रतिस्थापन अला 677 4.40, अला 681 4.44 और 4.48 Ala685 mGlu2 में Ser686 4.40, पीएचडी के लिएE690 4.44 और Gly-694 4.48 mGlu3 (हा-mGlu2ΔTM4N) में पहले 6 वर्णित किया गया है।
      नोट: यह पहले से प्रदर्शन किया गया है कि कैमेरिक निर्माण हा-mGlu2ΔTM4N बरकरार जी प्रोटीन निर्भर संकेत 6 के साथ प्लाज्मा झिल्ली में व्यक्त किया जाता है।
    2. में वायरल वैक्टर स्टोर -80 डिग्री सेल्सियस जब उपयोग में नहीं है। बर्फ पर पिघलना वायरल वेक्टर, और फिर 10 μl aliquots में विभाज्य। शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के लिए, बर्फ पर रहते हैं।

2. सर्जरी

  1. सर्जरी की तैयारी
    1. माउस वजन और ketamine / xylazine कॉकटेल की उचित खुराक के साथ माउस इंजेक्षन (विवरण के लिए, 1.1.1 देखें)।
    2. माउस की जाँच करें अगर ठीक anesthetized देखने के लिए, दर्द प्रतिक्रिया के लिए पैर और पूंछ निचोड़ है, अगर एक प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना करने में असमर्थ है, माउस ठीक से anesthetized है।
    3. नाक क़ैंची का उपयोग करने की टिप करने के लिए खोपड़ी के आधार से माउस सिर दाढ़ी। माउस वायुसेना को नेत्र जेल लागूमाउस का अंधापन को रोकने के लिए terward।
    4. stereotaxic फ्रेम पर प्रत्येक सिरिंज लोड। तब stereotaxic फ्रेम में से प्रत्येक के हाथ का सीधा भाग झुकाव इतना है कि वे सामान्य से 10 डिग्री की दूरी पर हैं। सुनिश्चित करें कि हथियार झुका कर रहे हैं, जैसे कि सुई एक दूसरे का सामना कर रहे हैं।
    5. 70% इथेनॉल के साथ सुई भरने के द्वारा प्रत्येक सिरिंज साफ करें। सुई में कम से कम तीन बार भरें सुनिश्चित करने के लिए कि सिरिंज साफ है।
    6. एक बार सुई साफ किया गया है, डबल आसुत एच 2 ओ के साथ सुई भरने से सुई फ्लश एक बार जब प्लावित, डबल आसुत एच 2 ओ के 1.3 μl के साथ प्रत्येक सुई भरने दोहरा आसुत एच 2 ओ के 0.3 μl जारी करने के लिए सिरिंज के सवार ट्विस्ट सुई की नोक पर पानी मोती, ध्यान से पानी पोंछ हैं। कुछ भी नहीं सिरिंज से बाहर आता है, तो पूरी तरह से नीचे सवार धक्का और फिर सिरिंज की सफाई को दोहराएँ।
    7. पानी से भरने के बाद, तो सिरिंज के साथ सिरिंज भरने तक खींचहवा के 0.5 μl।
    8. एक बार जब हवा और पानी सिरिंज में हैं, ध्यान से वायरस समाधान के 1.3 μl के साथ सिरिंज भरें। इस बिंदु पर यह सुनिश्चित करें कि सिरिंज में कुल मात्रा 2.8 μl है। फिर वायरस के 0.3 μl जारी करने के लिए सिरिंज की नोक मोड़। सुई की नोक पर तरल मोती, ध्यान से तरल पोंछ हैं। कुछ भी नहीं सिरिंज से बाहर आता है, तो पूरी तरह से नीचे सवार धक्का और फिर सिरिंज की सफाई को दोहराएँ।
  2. सर्जरी
    1. stereotaxic फ्रेम करने के लिए माउस देते हैं, तो यह है कि खोपड़ी के स्तर पर और फ्लैट है stereotaxic फ्रेम समायोजित करने के लिए सुनिश्चित कर रही है। उजागर खोपड़ी को povodine आयोडीन लागू करें। एक छुरी का प्रयोग, उजागर मुंडा क्षेत्र के भीतर खोपड़ी के midline के साथ एक बाण चीरा बनाते हैं। तो यकीन है कि खोपड़ी उजागर रहता है चीरा साइट पर त्वचा के लिए buret अकड़न देते हैं।
    2. Periosteum दूर भंग करने के लिए एच 2 ओ 2 प्रयोग के टांके बेनकाब करने के लिएखोपड़ी। अब जब कि शीर्षस्थान और टांके दिखाई दे रहे हैं, यकीन है कि खोपड़ी के स्तर का है बनाना stereotaxic फ्रेम समायोजित करने के लिए सुनिश्चित हो।
    3. शीर्षस्थान के साथ सीरिंज की सुई सुझावों संरेखित करें और शीर्षस्थान के निर्देशांक रिकॉर्ड है। के निर्देशांक जहां सुई डाला जा जा रहे हैं गणना।
      1. व्याख्यान चबूतरे वाला Cauldal (आर सी) विमान के लिए, दर्ज आर सी पर्वबिन्दु निर्देशांक (शीर्षस्थान से 1.6) के लिए 1.6 मिमी जोड़ें। पृष्ठीय उदर (डीवी) विमान के लिए, दर्ज डीवी पर्वबिन्दु निर्देशांक (-2.4 शीर्षस्थान से) से 2.4 मिमी घटाना।
      2. अंत में, औसत दर्जे का पार्श्व (माले) विमान के लिए, दर्ज एमएल पर्वबिन्दु निर्देशांक (शीर्षस्थान से 2.6) के लिए 2.6 मिमी जोड़ें। जैसा कि यह एक द्विपक्षीय इंजेक्शन है सभी निर्देशांक के लिए, दोनों को छोड़ दिया और सही निर्देशांक रिकॉर्ड करने के लिए सुनिश्चित हो।
    4. वांछित निर्देशांक के लिए सुइयों लाओ। जहां सुई डाला जाएगा और एक ड्रिल के साथ, ड्रिल चिह्नित क्षेत्रों जा रहे हैं के स्थानों को चिह्नित।
    5. एक कपास टिप applicator वाई के साथदूर पे किसी भी अतिरिक्त रक्त या अस्थि टुकड़ा।
    6. खोपड़ी के लिए सुइयों जहां सुई के सुझावों के मस्तिष्क की सतह को छू रहे हैं लाओ। फिर वांछित निर्देशांक के लिए सुइयों को कम धीरे धीरे उन्हें कम।
    7. एक बार सुई वांछित निर्देशांक पर कर रहे हैं, धीरे-धीरे 5 मिनट (कुल 0.5 μl में) के पाठ्यक्रम पर प्रति मिनट सुई 0.1 μl के सवार घुमा द्वारा सिरिंज की सामग्री को इंजेक्षन।
    8. एक और 5 मिनट के लिए कोर्टेक्स में सिरिंज छोड़ एक बार इंजेक्शन दिया गया है।
  3. बंद / केयर
    1. माउस प्रांतस्था से सुई तेजी से और धीरे धीरे निकालें। तब stereotaxic फ्रेम से माउस को हटा दें।
    2. चीरा से त्वचा के आधार फ्लैप को cyanoacrylate (चमड़े के चिपकने वाला) लागू करें और फिर संदंश के साथ त्वचा के फ्लैप हड़पने के लिए और उन्हें एक साथ जगह है।
    3. cyanoacrylate सूखे की अनुमति दें। एक हीटिंग पैड पर पिंजरे में माउस प्लेस (हीटिंग पैड सर्जन यदि वैकल्पिक हैराजनैतिक सूट का 37 डिग्री सेल्सियस आरटी के तहत रखा जाता है - अन्यथा आवश्यक नहीं है)। सुनिश्चित करें कि बिस्तर शल्य साइट का पालन नहीं करता है सुनिश्चित करने के लिए एक कागज तौलिया पर माउस जगह सुनिश्चित करें।
    4. शल्य प्रक्रिया की लंबाई पर निर्भर करता है, यह सुनिश्चित करें कि चूहों 30 के भीतर संज्ञाहरण से बाहर है - प्रक्रिया के बाद 60 मिनट। सर्जरी के बाद, जानवर अपने स्वयं के पिंजरे में रखा गया है और नजर रखी जब तक यह ठीक करने के लिए अपने कमरे में लौटने से पहले सचेत हो जाता है। कोई दर्दनाशक दवाओं, उपयोग किया जाता है के बाद operatively क्योंकि वे मस्तिष्क जैव रासायनिक रास्ते में से कुछ को संशोधित करके हमारे प्रयोगों के परिणामों को बदल सकता है। हालांकि, जानवरों निगरानी कर रहे हैं, जब तक वे सर्जरी के दिन पर संज्ञाहरण से उबरने, और संक्रमण और दर्द / संकट के मूल्यांकन के संकेत के लिए दैनिक के बाद आपरेशन।

3. प्रमुख चिकोटी प्रतिक्रिया प्रयोग

  1. सेट अप
    1. stereota 3 दिनों के बाद - 10:00 AM और 2:00, 2 के बीच सभी व्यवहार परीक्षण के लिए बाहर लेवायरल कणों की CTIC इंजेक्शन।
    2. भंग (±) -1 (2,5-dimethoxy-4-iodophenyl) -2-aminopropane हाइड्रोक्लोराइड (DOI) 2.0 मिलीग्राम / किग्रा के लिए एक 0.9% खारा समाधान में। इसके अलावा एक 0.9% नमकीन घोल तैयार करते हैं।
    3. किसी भी बिस्तर के बिना एक घर पिंजरे (28 x 18 x 15 सेमी) तैयार है और एक सप्ताह में तीन फली का उपयोग कर, एक कैमरा समायोजित इतना है कि वीडियो कैमरा के मद्देनजर सीधे घर पिंजरे से ऊपर है।
    4. कम से कम 4 घंटा प्रयोग की शुरुआत से पहले कमरे के लिए चूहों आदत डालना।
    5. सिर चिकोटी रिकॉर्ड करने के लिए एक कैमकॉर्डर सेट करें।
  2. प्रयोग
    1. कैमरे की स्थिति तो यह है कि यह एक घर पिंजरे पर सीधे है। कैमरा जांचना ताकि पूरे घर पिंजरे देखने के क्षेत्र में है।
    2. माउस वजन और या तो 0.9% खारा या DOI की उचित खुराक (0.01 मिलीग्राम / छ) के साथ intraperitoneally माउस इंजेक्षन। नोट: एक माउस 25 ग्राम वजन का होता है, तो 0.25 मिलीलीटर की कुल मात्रा को खुराक प्रशासन।
    3. प्रत्येक माउस वापस उनके घर पिंजरे fo में रखेंआर 10 मिनट। 10 मिनट, जगह माउस खाली घर पिंजरे के बीच में होने के बाद और मान्य कैमरा के मद्देनजर क्षेत्र में कोई अंधा धब्बे होते हैं। camcorder पर प्रेस रिकॉर्ड है। कमरे से बाहर चले जाओ।
      नोट: माउस आंदोलनों और विभिन्न व्यवहार प्रतिक्रियाओं उसमें (।।। सिर चिकोटी, कान खरोंच, आदि कृपया पूरक डेटा तालिका 1 के गोंजालेज Maeso एट अल 2007 DOI से प्रेरित व्यवहार प्रतिक्रियाओं की पूरी सूची के लिए देखें) 3, के लिए दर्ज हो जाएगा 30 मिनट। इसलिए, यह रिकॉर्ड देखने के क्षेत्र में कोई अंधा धब्बे देखते हैं महत्वपूर्ण है।
    4. बाद 30 मिनट के मूल घर पिंजरे में वापस Camcorder और जगह माउस पर रिकॉर्डिंग बंद करो। प्रत्येक माउस के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
  3. समीक्षा
    1. ) (अर्थात्।, सिर के दौरान इस्तेमाल किया दवाओं के प्रयोग या intracranial इंजेक्शन के दौरान इस्तेमाल वायरस चिकोटी) प्रत्येक रेफरी समीक्षा टेप माउस की प्रयोगात्मक शर्तों को अंधा। स्वयं हर सिर चिकोटी throug रिकॉर्डHout वीडियो।
      नोट: सिर चिकोटी एक तीव्र झटकों सिर एक माउस (पूरक वीडियो) द्वारा किए गए आंदोलन के रूप में परिभाषित किया गया है।
    2. प्रत्येक माउस के लिए, औसत अंधा रेफरी के तीन योग से अंतिम HTR प्रतिक्रिया। तब समूह प्रयोगात्मक हालत से इन मूल्यों और सांख्यिकीय विश्लेषण (यानी।, टी परीक्षण या एनोवा) बाहर ले।

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Representative Results

पिछले निष्कर्ष है कि सिर से चिकोटी murine व्यवहार प्रतिक्रिया मज़बूती से और मजबूती के साथ hallucinogens द्वारा हासिल है दिखाना है, और यह 5 हिंदुस्तान टाइम्स 2A -ko चूहों 3 में अनुपस्थित है। इसके अलावा, यह दिखाया गया है कि सिर से चिकोटी प्रतिक्रिया hallucinogenic 5 हिंदुस्तान टाइम्स 2A DOI और एलएसडी एगोनिस्ट द्वारा हासिल काफी mGlu2-KO चूहों 5 में कमी आई थी। हालांकि, हालांकि पिछले निष्कर्ष खांसने दिखाना है कि 5 हिंदुस्तान टाइम्स 2A और mGlu2, ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं 1,2,15 में इन विट्रो में एक heteromeric परिसर के रूप में इकट्ठा कर रहे हैं इस संरचनात्मक व्यवस्था बर्ताव करता है कि क्या रहने वाले चूहों में इस तरह के रूप अनसुलझी बनी रही। पूरी तरह से इस manip है कि क्या जांच करने के लिए hallucinogenic 5 हिंदुस्तान टाइम्स 2A रिसेप्टर एगोनिस्ट, mGlu2-को चूहों के ललाट प्रांतस्था में या तो mGlu2 या mGlu2ΔTM4N की अभिव्यक्ति से प्रेरित psychoactive की तरह प्रभाव में 5 हिंदुस्तान टाइम्स 2A -mGlu2 रिसेप्टर heterocomplex की भूमिका को समझने के लिएआबादी के व्यवहार को नियंत्रित करता है।

चूहे हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) और या तो mGlu2 या mGlu2ΔTM4N, या GFP अकेले व्यक्त bicistronic एचएसवी के इंट्रा-ललाट cortical इंजेक्शन प्राप्त किया। सबसे पहले, यह पुष्टि की गई है कि वायरस माउस ललाट प्रांतस्था में mGlu2 या mGlu2ΔTM4N (आंकड़े 1 ए और 1 बी) से अधिक व्यक्त करता है। पहले प्रदर्शन के रूप में 5, सिर चिकोटी व्यवहार दोई को प्रेरित खाली वेक्टर एचएसवी GFP के साथ इंजेक्शन mGlu2-KO चूहों में अनुपस्थित था। विशेष रूप से, सिर चिकोटी प्रतिक्रिया hallucinogenic 5 हिंदुस्तान टाइम्स 2A एगोनिस्ट दोई को प्रेरित खत्म व्यक्त mGlu2 mGlu2-KO चूहों में बचाया गया था, लेकिन नहीं mGlu2ΔTM4N, ललाट प्रांतस्था में GFP (चित्रा 1 सी) व्यक्त जानवरों में देखा है कि तुलना में। साथ में, इन निष्कर्ष बताते हैं कि 5 हिंदुस्तान टाइम्स ललाट प्रांतस्था में 2A -mGlu2 रिसेप्टर परिसर मनोविकृति-जैसे राज्यों को विनियमित करने के लिए महत्वपूर्ण है।


5 हिंदुस्तान टाइम्स 2A के साथ एक रिसेप्टर के रूप में mGlu2 की एक रिसेप्टर Heterocomplex। अभिव्यक्ति के रूप में चित्रा 1. mGlu2 की अभिव्यक्ति मानसिकता की तरह व्यवहार hallucinogenic दवाओं से प्रेरित करने के लिए आवश्यक है। (ए) ललाट प्रांतस्था में एचएसवी की मध्यस्थता transgene अभिव्यक्ति के प्रतिनिधि छवि। एचएसवी mGlu2 है, जो भी GFP व्यक्त करता है, ललाट प्रांतस्था में इंजेक्ट किया गया था, और GFP अभिव्यक्ति immunocytochemistry, पैमाने बार, 200 उम से पता चला था। (बी) mGlu2-KO चूहों के माउस ललाट प्रांतस्था में एचएसवी की मध्यस्थता transgene अभिव्यक्ति है, और विरोधी mGlu2 जेट पश्चिमी सोख्ता द्वारा मापा गया था। MGlu2 रिसेप्टर के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी की विशिष्टता पहले से पीटा चूहों 6 में पुष्टि की गई है। Metabotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर्स GPCRs कि फार्म covalently जुड़े homodimers हैं। हम एक मोनोमर (100 केडीए) के रूप में 6 mGlu2 की immunoreactivity मापा। (सी एट अल (2012) से संशोधित किया गया था 6। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक 1 वीडियो हेड चिकोटी प्रतिक्रिया। (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)। CD-1 WT चूहों 2.0 मिलीग्राम / किग्रा DOI के साथ इंजेक्शन और एक पिंजरे में रखा गया (दीवार दो पिंजरों के बीच बेहोश) सिर चिकोटी प्रतिक्रिया बटोर (व्यवहार के बाद हासिल *)।

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Discussion

साथ में mGlu2-KO चूहों 5 में पिछले निष्कर्षों के साथ, कि संवर्धित कोशिकाओं में 5 हिंदुस्तान टाइम्स 2A -mGlu2 रिसेप्टर जटिल फार्म नहीं है mGlu2 और mGlu2 / mGlu3 कैमेरिक निर्माणों के साथ परिणाम बताते हैं कि 5 हिंदुस्तान टाइम्स 2A -mGlu2 में heteromeric रिसेप्टर परिसर माउस ललाट प्रांतस्था एलएसडी की तरह hallucinogenic 5 हिंदुस्तान टाइम्स 2A रिसेप्टर एगोनिस्ट द्वारा सिर से चिकोटी व्यवहार के लिए प्रेरित करने की जरूरत है। इस पद्धति की एक सीमा है कि यह देशी ऊतकों में एक subcellular स्तर पर बंद आणविक निकटता उपाय नहीं करता है। इसके अलावा, वहाँ विभिन्न महत्वपूर्ण बिंदुओं का उल्लेख किया जा सकता है। 4 दिन इंजेक्शन के बाद - क्योंकि चूहों एक एचएसवी वायरल वेक्टर इंजेक्शन के साथ कर रहे हैं, समय सीमा है कि प्रयोगों का प्रदर्शन किया जा करने के लिए 2 हैं। स्थान और वायरल वैक्टर की अभिव्यक्ति के लिए कोई अधिक से अधिक 4 दिनों प्रारंभिक इंजेक्शन के बाद sectioned मस्तिष्क के immunofluorescence धुंधला के साथ सत्यापित किया जाना चाहिए। चूहे जिसमें निर्देशांक मेल नहीं खाते या व्यक्त नहीं करते वायरल वेक्टर चाहिएप्रयोगात्मक डेटा से बाहर रखा जाना रूप में वे mGlu2 या mGlu2ΔTM4N व्यक्त नहीं करते। देखभाल के बाद स्टीरियोटैक्टिक सर्जरी भी महत्वपूर्ण है, के रूप में सिर घाव के अनुचित समापन संक्रमण है जो दोनों में विवो प्रयोगों और immunofluorescence धुंधला में मुद्दों पैदा कर सकता है हो सकता है। वायरल कणों के इंजेक्शन 4 के बाद - अंत में, स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन किसी भी व्यवहार प्रतिमान (। खुले मैदान, बारी टी परीक्षण, आदि) के बाद के रूप में लंबे समय के रूप में यह 2 के भीतर इस्तेमाल किया जा सकता है। फिर, निर्देशांक और अभिव्यक्ति immunofluorescence द्वारा पुष्टि की जानी चाहिए।

अवधारणा है कि होमो और / या जीवित कोशिकाओं में heteromers के रूप में GPCRs समारोह अब अच्छी तरह से 16-18 की स्थापना की है। हालांकि, कुछ प्रगति के बावजूद, और अधिक अध्ययन पूरे पशु मॉडल 19 में GPCR heteromeric परिसरों की सटीक भूमिका (ओं) को परिभाषित करने की जरूरत है। ऐसे BRET और / या झल्लाहट इमेजिंग के रूप में दृष्टिकोण छोटे जानवर की गहरी ऊतकों के भीतर प्रोटीन, प्रोटीन शारीरिक निकटता जांच करने के लिएमॉडल विषयों 20 में रहने वाले GPCR heteromers के कार्यात्मक भूमिका की समझ बढ़ाने के लिए साधन उपलब्ध करा सकता है। या तो देशी या संशोधित transmembrane प्रोटीन के साथ GPCRs के एचएसवी की मध्यस्थता अभिव्यक्ति का उपयोग करना, एक विवो मॉडल समारोह और GPCRs की बातचीत का मूल्यांकन करने के लिए प्रदान करते हैं।

कृंतक मॉडल में आगे की पढ़ाई भी उनके घटकों 24, और रिसेप्टर internalization 25,26 के बाद संभावित जी प्रोटीन युग्मन के बीच 21-23, संरचनात्मक rearrangements GPCR heteromers की स्थिरता और जीवन समय (के गठन और हदबंदी) की जांच करने की जरूरत है। सेल संकेतन और समारोह में GPCRs की मौलिक भूमिका को देखते हुए यह है कि इस क्षेत्र दिलचस्प बुनियादी और translational अध्ययन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं होने की संभावना लगती है।

आगे की जांच के लिए मात्रात्मक पिछले अध्ययन के साथ, मानव और माउस सीएनएस में दोनों रिसेप्टर्स के Ultrastructural सह स्थानीयकरण को चिह्नित करने के लिए एक साथ की आवश्यकता है यद्यपिमर जाता है कि खांसने प्रदर्शित electrophysiological, सेलुलर, और माउस मॉडल में hallucinogens से प्रेरित व्यवहार प्रतिक्रियाओं 5 हिंदुस्तान टाइम्स 2A रिसेप्टर व्यक्त cortical पिरामिड न्यूरॉन्स 3,27,28 के लिए आंतरिक हैं, निष्कर्ष एचएसवी की मध्यस्थता अभिव्यक्ति दृष्टिकोण का उपयोग कर प्राप्त यहाँ वर्णित का सुझाव माउस ललाट प्रांतस्था में 5 हिंदुस्तान टाइम्स 2A और mGlu2 रिसेप्टर्स के बीच कि heteromeric गठन के सिर से चिकोटी मानसिकता की तरह व्यवहार hallucinogenic 5 हिंदुस्तान टाइम्स 2A रिसेप्टर agonist दोई को प्रेरित करने के लिए की जरूरत है।

एचएसवी की मध्यस्थता mGlu2 की अभिव्यक्ति है, लेकिन नहीं mGlu2ΔTM4N, mGlu2-को चूहों के ललाट cortical न्यूरॉन्स में सिर से चिकोटी व्यवहार hallucinogenic 5 हिंदुस्तान टाइम्स 2A रिसेप्टर agonist दोई को प्रेरित बचाता है। preclinical अध्ययनों GPCR heteromers के व्यवहार phenotypes का मूल्यांकन करने के लिए इस उपकरण translational लाभप्रद हो सकता है।

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Acknowledgments

एनआईएच R01MH084894 इस अध्ययन के अनुदान के रूप में भाग लिया। हम डीआरएस को धन्यवाद देना चाहेंगे। चूहों का दान और इस काम के फिल्मांकन के दौरान उनकी सर्जरी और व्यवहार सुविधाओं के उपयोग के लिए यास्मीन हर्ड और स्कॉट रूसो मेडिसिन के माउंट सिनाई स्कूल में।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
mGlu2 bicitronic herpes simplex virus (HSV) vector  MIT Core mGlu2 and mGlu2DTM4N were subcloned into the bicistronic HSV-GFP virus vector p1005+ HSV expressing GFP under the control of the CMV promoter. Viral particles were produced by the Viral Core Facility at the McGovern Institute (MIT). For more information, please contact the director, Dr. Rachael Neve (rneve@mit.edu)
mGlu2ΔTM4N bicitronic herpes simplex virus (HSV) vector  MIT Core mGlu2 and mGlu2DTM4N were subcloned into the bicistronic HSV-GFP virus vector p1005+ HSV expressing GFP under the control of the CMV promoter. Viral particles were produced by the Viral Core Facility at the McGovern Institute (MIT). For more information, please contact the director, Dr. Rachael Neve (rneve@mit.edu)
GFP bicitronic herpes simplex virus (HSV) vector  MIT Core mGlu2 and mGlu2DTM4N were subcloned into the bicistronic HSV-GFP virus vector p1005+ HSV expressing GFP under the control of the CMV promoter. Viral particles were produced by the Viral Core Facility at the McGovern Institute (MIT). For more information, please contact the director, Dr. Rachael Neve (rneve@mit.edu)
Xylazine  Lloyd List no. 4811-20ml, NADA #139-236, NDC Code(s): 61311-481-10 1.35 ml of ketamine (100 mg/ml) + 0.75 ml of xylazine (20 mg/ml) are diluted in 12.0 ml of 0.9% saline solution
Ketamine  Vedco KetaVed-10ml, NADA #200-029, NDC Code(s): 50989-161-06 1.35 ml of ketamine (100 mg/ml) + 0.75 ml of xylazine (20 mg/ml) are diluted in 12.0 ml of 0.9% saline solution
Ophthalmic gel Fisher Scientific NC0550805
Burret clips Fisher Scientific NC9268369
Feather surgical blade Fisher Scientific NC9032736
Hydrogen Peroxide Fisher Scientific 19-898-919 
Hamilton syringe Fisher Scientific 14815203
Hamilton™ Small Hub Removable Needles (33 Ga) Fisher Scientific 14816206
Cordless Micro Drill Fisher Scientific NC9089241
Dermabond Dermal Adhesive Fisher Scientific NC0690470
(±)-1-(2,5-Dimethoxy-4-iodophenyl)-2-aminopropane hydrochloride (DOI) Sigma-Aldrich 42203-78-1 Dissolved in 0.9% saline solution to the concentration of 2.0 mg/kg

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References

  1. Fribourg, M., et al. Decoding the Signaling of a GPCR Heteromeric Complex Reveals a Unifying Mechanism of Action of Antipsychotic Drugs. Cell. 147 (5), 1011-1023 (2011).
  2. Gonzalez-Maeso, J., et al. Identification of a serotonin/glutamate receptor complex implicated in psychosis. Nature. 452 (7183), 93-97 (2008).
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Chimeric निर्माणों के एचएसवी की मध्यस्थता transgene अभिव्यक्ति चूहे में GPCR Heteromers के व्यवहार समारोह का अध्ययन करने
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Holloway, T., Moreno, J. L., González-Maeso, J. HSV-Mediated Transgene Expression of Chimeric Constructs to Study Behavioral Function of GPCR Heteromers in Mice. J. Vis. Exp. (113), e53717, doi:10.3791/53717 (2016).

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