Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Chemistry

Standarder for Kvantitativ Metalloproteomic analyse ved hjelp Size Exclusion ICP-MS

doi: 10.3791/53737 Published: April 13, 2016

Introduction

Essensielle metaller spiller en viktig rolle i normale biologiske funksjoner, inkludert videregående messenger trasé, metabolisme stier og organelle funksjoner. 30% av alle proteiner som er antatt å være metalloproteiner 1 og 50% av alle enzymer 2. Metallo-enzymene bruker disse spormetaller som kofaktorer for å katalysere kjemiske reaksjoner, stabilisere proteinstruktur, og for regulatoriske roller som sekundære budbringere. Noen av de mest studerte sporelementer i forhold til nevrodegenerasjon er kobber, jern og sink tre. De antas å være involvert i mange sykdoms trasé der etter dyshomeostasis kan ha negativ innvirkning. For eksempel metall status av superoksid dismutase (SOD) direkte påvirker levetiden og fenotype av transgene mus modeller av familiær type amyotrofisk lateral sklerose (ALS) 4. Ved Alzheimers sykdom, har metalloproteomics teknikker blitt benyttet for å oppdage en reduksjon i metall status av transferrin i plasma 5. Disse studiene markere den viktige rollen metalloproteiner kan spille i sykdom.

Studiet av metalloproteiner direkte fra biologisk vev er en utvikling felt. Selv om noen metallo-enzymene har blitt karakterisert, de fleste fortsatt uncharacterized eller ukjent seks. En av de store utfordringene i måle metalloproteiner er kravet om å opprettholde den opprinnelige tilstand av proteinet 7. Klassisk bottom-up proteomic teknikker stole på fordøyelsen av proteiner til peptider. Denne prosessen forstyrrer ikke-kovalent interaksjon av metaller og proteiner. Således blir ingen informasjon om metallet status av et protein oppnådd.

En måte å løse dette problemet på er ved hjelp av størrelse-utelukkelses-kromatografi sammenkoblet med induktivt koblet plasma - massespektrometri 8,9 (SEC-ICP-MS). Dette genererer informasjon om protein omtrentlige størrelse samt eventuelle metaller som er tilkniated med den 10. Videre er størrelseseksklusjon en svak kromatografisk teknikk som kan bevare den opprinnelige tilstand av et enzym eller protein-proteinkompleks. En fordel ved bruk av induktivt koblet plasma - massespektrometri (ICP-MS) er den kvantitative innholdet av teknologien. Ved hjelp av et sett av standarder metalloproteiner er det mulig å tilveiebringe absolutt mengdebestemmelse av metalloproteiner fra biologiske prøver 9,11. Dette oppnås ved å generere en standardkurve ved å injisere kjente metalloproteiner over et område av metallkonsentrasjoner.

Denne protokollen viser et eksempel på hvordan dette kan oppnås for en rekke metalloprotein standarder. I denne artikkelen ønsker vi å lage standardkurver for metaller som i stor grad undersøkt i biologiske områder, inkludert jern (Fe), kobber (Cu), sink (Zn), jod (I), og kobolt (Co).

Protocol

1. Utarbeidelse av buffere og Samples

  1. Fremstille 500 ml buffer, 200 mM ammoniumnitrat pH 7.6 til 7.8 (pH justert med ammoniumhydroksid (NH4OH)) med cesium (Cs) og antinomy (Sb) tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 10 ppb. Bruk cesium og antinomy som interne standarder for å overvåke for noen drift i responsen av ICP-MS. Filter-buffer før bruk gjennom et 0,22 um filter.
  2. Forberede prøven avhengig av typen av prøve: væske, vev eller cellekultur.
    1. For prøver som krever homogenisering (f.eks vev eller celler), sørge for at de ikke inneholder vaskemiddel. Bruk Tris buffere for prøveopparbeidelse. Alternativt kan du bruke fosfatbuffere, men de kan ha en negativ innvirkning på metalloproteome over tid eller med fryse-tinesykluser 12.
    2. Homogenisere vev eller cellekulturprøver ved manuell dounce eller ultralydbehandling i 5 minutter ved bruk av Tris-bufret saltvann (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM natriumklorid(NaCl) + etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) frie proteaseinhibitorer).
    3. Avklare homogenater ved sentrifugering ved 16 000 x g i 5 min. Samle den resulterende supernatant. Hold prøvene ved 4 ° C.
      Merk: Alle prøver må sentrifugeres før det brukes i den høytrykks-væskekromatografi (HPLC) ampuller for å hindre partikler fra å blokkere størrelseseksklusjonskromatografi (SEC) kolonne.
  3. Normaliser den totale mengden av protein applisert på kolonnen over prøvene. Bestem proteinkonsentrasjon ved 280 nm ved anvendelse av en mikro volum UV-spektrofotometer 13. Belastningen mellom 20 og 150 ug protein. Bruk typiske injeksjonsvolumer som strekker 2-80 ul avhengig av prøvekonsentrasjon.
    1. Rens prøven arm av mikro volum UV-spektrofotometer med destillert vann før prøven lasting. Prøven arm er der proteinprøvene er lastet.
    2. Blank instrumentet mot 2 mL av the sample buffer. Deretter belastning 2 ul av hver prøve inn på armen og mål absorbansen ved 280 nm.
    3. Bestem konsentrasjonen. For råolje proteinprøver, bruk en utryddelse koeffisient på 1 Abs = 1 mg / ml. For å bestemme konsentrasjonen av protein i prøvene, bruker Beer-Lambert loven, A = ε xlxc, hvor A er absorbans, ε er ekstinksjonskoeffisienten, l er banelengden i cm og c er konsentrasjonen.

2. Bulk Analyse av Metalloprotein Standards Bruke induktivt koblet plasma - massespektrometri

  1. Warm-up og tune instrumentet med produsentens protokoller.
  2. Når instrumentet er varmet opp og innstilt, utfører bulk ICP-MS.
    Merk: Stamløsninger av rensede metalloproteiner generelt må fortynnes før måling. Metallet konsentrasjon av standard kan anslås ut fra kjente protein: metall stochiometries og antatt protein konsensjon. Denne informasjonen kan brukes til å bestemme fortynningen som vil være hensiktsmessig å falle innenfor området av standardkurven.
    1. Fortynn metalloprotein standarder, thyroglobulin, ferritin, ceruloplasmin, Cu / Zn-SOD og vitamin B-12, for å sikre at de faller innenfor området 0 - 500 pg / l, ved å anvende 1% salpetersyre. For å oppnå standarder innenfor dette området, må du ikke bruke fortynninger på over 1 i 20. Utfør serielle fortynninger i vann for å fortynne aksjer før dette om nødvendig.
    2. Sett opp rekkefølgen av injeksjoner. Først analyserer de syv kalibreringsnivåer konsentrasjoner i området 0-500 ug / l, etterfulgt av metalloprotein standarder. De syv kalibreringsnivåer er 0, 1, 5, 10, 50, 100 og 500 ug / l.
    3. Velg elementer av interesse. Her bruker Fe, Cu, Zn, Co og jeg, som de er de elementer som proteinstandarder er bundet til. Velg elementene i oppkjøpsmetoden ved å åpne fanen element velgeren og legge eleme nts og deres respektive isotop massene som skal analyseres.
    4. Utføre analysen med instrumentet og instrumentet programvare skaper automatisk kalibreringskurver for hvert av elementene blir analysert. Kalibreringskurvene er skapt av programvaren ved å plotte tellinger / sek av metallet detektert mot mengden av metall som standarden er ment å inneholde, i ug / l. Bruk kalibreringskurver for å bestemme konsentrasjonen av metallet i de ukjente prøvene.
      Merk: Ved hjelp av kalibreringskurven, bestemmer programvaren at konsentrasjonen av metall i hver av de metalloprotein standarder.
    5. Fra masseanalyseresultatene, skape metalloprotein standarder som omfatter de tre mest vanlige sporelementer i pattedyrsvev ved hjelp av en blanding av Cu, Zn superoxide dismutase (SOD) fortynnet til 200 ug / L av kobber og sink og ferritin (FTN) ved en endelig konsentrasjon på 2000 ug / l av jern.
jove_title "> 3. HPLC System Setup og Size Exclusion Chromatography Column Ekvilibrering

Merk: Denne delen bør utføres i parallell med den foregående, siden de begge kreves omtrent 1 til 1,5 time å fullføre.

  1. Purge HPLC pumper med buffer laget i trinn 1.1 og rense pumpene i 5 min ved en strømningshastighet på 5 ml / min.
  2. Når systemet er spylt, angir strømningshastigheten til 0,1 ml / min, og koble størrelseseksklusjonskolonne (4,6 x 300 mm, 3 um, 150 Å).
    Merk: En våt forbindelse mellom røret og søylen unngår luftlommer blir fanget under sammenkopling av kolonnen.
  3. Koble den motsatte ende av kolonnen til den UV-detektor satt til å måle absorbansen ved 280 nm ved hjelp av PEEK-rør.
  4. Gradvis øke strømningshastigheten av kolonnen i trinn på 0,05 til 0,1 ml / min, inntil en endelig strømningshastighet på 0,4 ml / min nås. Mens dette skjer, sjekk slangekoblinger til kolonnen for eventuelle lekkasjer. Overvåke trykketav systemet for å sikre at den ikke overstiger kolonnekravene ved å observere trykket spor på kromatogrammet i programvaren.
  5. Forlater kolonnen til likevekt ved den ønskede strømningshastigheten i løpet av 5 - 10 kolonnevolumer. Etter at den er i likevekt, koble instrumentene for å tillate å skje analyse av prøver.
  6. Sett opp HPLC-metoden opp for å pumpe buffer A over kolonnen ved 0,4 ml / min i 15 min.

4. Sette opp og kjører Size Exclusion - induktivt koblet plasma - massespektrometri

Merk: Drifts prosedyrer kan variere mellom instrumenter og modeller. Kontakt instrumentet teknisk spesialist for å lære mer om hvordan du konfigurerer ICP-MS som brukes.

  1. Plasser ICP - MS i standby-modus før du endrer maskinvare innstillingen.
    1. En gang i standby-modus, slå av kommunikasjon for auto sampler og endre prøven introduksjon til "andre".
      Merk: Avhengig av hvilken programvare og hardtware konfigurasjon velge "HPLC" som et eksempel innføring kilde kan brukes. Kontakt instrumentet teknisk spesialist for å finne ut om dette alternativet er tilgjengelig.
  2. Bruk PEEK slangen (ID 0,13 mm) for å koble ut strømmen fra UV-detektoren direkte til forstøver på ICP-MS.
  3. Strømsikkerhetskopiere ICP - MS og la instrumentet varmes opp i 10 - 20 min.
  4. Etter at plasma har antent, koble den eksterne kabelen fra ICP - MS til baksiden av HPLC autosampler. Gjør dette en gang plasma har antent; ellers HPLC systemet automatisk nedstengt siden ICP - MS er ikke på.
  5. Endre ICP-MS-metoden for å samle inn data for LC-ICP-MS.
    1. Alter oppkjøpsmetoden fra spektrum for å beslutte kjøp (TRA).
    2. Velg elementene som skal analyseres, Fe, Cu, Zn, Co, jeg så vel som alle andre elementer av interesse, og satt integrasjonstider (typisk mellom 0,05 til 0,3 sek). Etter at elementene av interesse enre valgt, justerer oppkjøpet tid til å matche gangtid for kromatografi (f.eks 900 sek for en 15 min kromatografi løp).
    3. Manuelt justere ICP - MS for følsomhet og kollisjonscelle helium (He) gass-strømningshastigheter med den kromatografibuffer strømmer ved hjelp av Cs og Sb er inkludert i bufferen. He strømningshastigheter er vanligvis ~ 1 ml / min, mindre enn de som brukes for masseanalyse. Når metall-ion-tellinger har stabilisert seg og relativt standard avvik (RSD) verdier er lavere enn 5%, er systemet klart til bruk.
  6. Gjør prøve kjøre listene i både HPLC og ICP-MS programmer. Prøven kjøreliste inneholder i hvilken rekkefølge hver av prøvene skal injiseres samt navnet som dataene blir lagret. Sjekk at det totale antall sampler i listen match mellom de to programmer.
  7. Start satsvis for ICP-MS før HPLC, som injeksjonen av prøven ved hjelp av HPLC vil utløse ICP - MS for å begynne å samledata. Dersom dette ikke blir gjort i riktig rekkefølge vil det resultere i manglende data.
  8. Generere kalibreringskurvepunkter ved å injisere ulike volumer av SOD og FTN blandet standard fra 200 ug / l til 6000 ug / l injisert på kolonnen for Cu og Zn og 2,000 ug / l opp til 60 000 ug / l Fe. Injeksjonsvolum varierer fra 1 til 30 ul.
    Merk: Disse konsentrasjonsområder omfatter konsentrasjonene av Fe, Cu og Zn vanligvis observert i komplekse homogenates. For prøver som bare inneholder rensede proteiner den maksimale rekkevidden av kurven bør justeres tilsvarende. Etter hvert som mengden av metall i forbindelse med proteinet kan kreve et mindre eller større område, siden det er mindre forurensning i prøven fra andre faktorer.
  9. Analysere hver av de ukjente prøvene vev, plasma eller cellekultur.

5. Data Analysis, Manipulasjon og visualisering

  1. Lagre data i kommaseparert (CSV) filformat og laste jegnto behandlings programmer etter behov.
  2. For å kontrollere for instrumentdrift, dele tellinger per sekund for hvert element av tellinger per sekund for enten Cs eller Sb.
  3. Generere kalibreringskurver for hvert av elementene.
    1. Bestemme arealet under metalltopp som svarer til den metalloprotein at det er bundet til for hver av injeksjonene ved å utføre toppintegrering i den foretrukne dataanalyse-programvare.
    2. Plott område under metalltopp mot den totale mengden av metallet som ble injisert på kolonnen i hvert forsøk 200 - 6000 ug / l Cu og Zn og 2000 - 60 000 ug / l Fe. Utføre lineær regresjonsanalyse ifølge programvareprotokoll.
    3. Bruk skråningen resultater fra lineær regresjonsanalyse som en faktor for å konvertere tellinger per sekund til pg / sek. Dele hver av de tellinger per sekund datapunkter på tvers av kromatogrammet med gradienten av linjen verdi.
  4. Grafen dataene ipg / sek mot kromatogrammet tid. Bestem arealet under toppene av interesse. Arealet under toppen representerer den totale mengde av metallet at proteinet er bundet til, i s.
  5. Generere en kalibrerings basert på molekylvekten av de kjente metalloproteiner og det tidspunkt ved hvilket de elueres. Bruker dette til å beregne størrelsen på proteintopper i komplekse prøver.

Representative Results

Bruken av metalloprotein standarder gir mulighet for kalibrering av størrelseseksklusjonskolonne. Figur 1A viser elueringsprofilen for standarder thyroglobulin, ferritin, ceruloplasmin, Cu / Zn-SOD og vitamin B-12 basert på det metall som de er bundet til (Fe, Co, Cu, Zn og i). Figur 1B viser kalibreringskurven for den størrelseseksklusjonskolonne basert på molekylvekten av proteinstandarder og deres elueringstid, presentert i form av elueringsvolum (Ve) dividert med hulromvolumet av kolonne (Vo). Proteinene som brukes til å generere denne standardkurve er Con A, konalbumin, ceruloplasmin, ferritin, SOD og tyreoglobulin.

Figur 2A viser elueringen av ferritin over et område av 2000 - 60 000 pg av Fe injisert på kolonnen og figur 2D er det regresjonsanalyse utført under anvendelse av pEAK-området. Figurene 2B og 2C er de elueringsprofiler for Cu / Zn-SOD for Cu og Zn og 2E og 2F er de regresjonsanalyser ble generert ved hjelp av topparealer. Resultatene av regresjonsanalyse blir anvendt for å omdanne de rådata i tellinger / sek for å pg / sek, slik at mengden av metall i forbindelse med proteinet kan bestemmes kvantitativt. Omdannelsen blir utført ved å dividere tellinger / sek ved helningen av den lineære regresjon (f.eks 334,6 (tellinger / sek) x (sek / s) av kobber).

Som det fremgår, kan denne teknikken bli anvendt for å identifisere metalloproteiner i komplekse biologiske prøver. Menneskelige hjerne og plasma har vært utsatt for denne teknikk og figurene 3 og 4, henholdsvis, viser de oppnådde resultater. Menneskelige hjerne separert ved SEC-ICP-MS er vist i figurene 3A-3C, som hver representerer et annet metall av interesse (Cu, Zn eller Fe). Figurene 4A-4C viser opptegninger som oppnås når humanplasma underkastes denne teknikken. Kompleksiteten og overflod av prøven vil påvirke antall topper som er sett. Som forventet plasma er dominert av noen få metalloproteiner inkludert ceruloplasmin og transferrin.

Figur 1
Figur 1. Kalibrering av Size Exclusion Chromatography - induktivt koblet plasma - massespektrometri Bruke kjent metalloproteiner (A) elueringsprofilen for metalloprotein standarder basert på deres respektive metaller.. (B) Molekylvekt kalibreringskurve for proteinstandarder tyroglobulin (i), ferritin (ii), ceruloplasmin (iii), konalbumin (iv), Cu / Zn-SOD (v) og Concanavalin A (vi)."Target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Bruk av Ferritin og Cu ​​/ Zn SOD som Metalloprotein standarder for å bestemme mengden av Cu, Fe eller Zn Associated med metalloproteiner i en kompleks biologisk prøve (A) elueringsprofilen for ferritin på injeksjonsområdet 2000 -. 60 000 ug / L av jern. (B) og (C) elueringsprofil for Cu / Zn-SOD på injeksjons området 200 - 6000 ug / L av kobber og sink, respektivt. (D), (E) og (F) viser regresjonsanalyse resultater for metallene jern, kobber og sink, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.


Figur 3. Cu, Fe og Zn Metalloproteome of Human Brain. (A) Copper trace (B) Iron trace (C) Sink spor. Eluering av protein standarder for hvert metall blir vist i den svarte spor med sin molekylvekt angitt under grafen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Cu, Fe og Zn Metalloproteome for Human Plasma. (A) Copper trace (B) Iron trace (C) Sink spor. Eluering av proteinstandarder for hvert metall er vist i den svarte spor med deres molekylvekt idicated under grafen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Som sikrer den opprinnelige tilstand av proteinet betyr spesiell oppmerksomhet til bufferne som brukes og lagring av prøven er nødvendig. Ikke alle kromatografiske teknikker eller prøveprepareringsteknikker kan anvendes. Det er viktig at bufferne som brukes i hele prøvepreparering og kromatografi er blottet for metall-chelatorer og bruk av buffere som etterligner fysiologiske pH og saltkonsentrasjoner. Andre forhold som må unngås inkluderer oppvarming prøven eller tillegg av protein-denatureringsmidler (f.eks urea). Det er viktig å minimere antallet av fryse-tinesykluser. Evnen av den valgte buffer for å binde toverdige metaller er også viktig, og er en årsak som Tris eller ammoniumnitrat buffere er valgt i løpet av fosfatbaserte buffere.

Den lave oppløsning og maksimal kapasitet for størrelseseksklusjonskromatografi i forhold til andre former for kromatografi er en vesentlig begrensning av denne teknikken. Men den milde arten av størrelseseksklusjons kromatogramgrafi er viktig å opprettholde den opprinnelige tilstand av proteinet og dermed bevare den relativt svake metall-protein obligasjoner. Kravet om å opprettholde den opprinnelige tilstand av proteiner krever spesiell oppmerksomhet til behandlingen av prøvene, inkludert å begrense antall fryse-tinesykluser, å unngå metall-chelatorer (for eksempel EDTA) eller kaotrope salter og vaskemidler.

Denne lave oppløsning av denne teknikk påvirker evnen til å kvantifisere mengden av metall i forbindelse med et spesifikt protein hvis det er i en kompleks prøve som toppene sett vil inneholde mer enn ett protein. Derfor vil mengden av metall bestemmes ved hjelp av toppintegrering være en indikasjon på den totale mengden av metall i forbindelse med alle av proteinene som eluerer ved dette tidspunkt, og ikke bare ett spesifikt protein. For å overvinne denne begrensningen for proteinet av interesse vil måtte renses ytterligere i henhold til opprinnelige betingelser. Dette ville muliggjøre kvantifisering avmetallet forbundet med dette proteinet som skal rapporteres med en høyere grad av certainity. En annen potensiell begrensning av denne teknikken ville være tap av protein på grunn av ikke reversibel binding til kolonnen. For å bestemme om dette skjer en bedring eksperiment bør gjennomføres slik at mengden av protein ved eluering av kolonnen blir analysert for å bestemme om dette samsvarer med den injiserte mengde. Det samme kan gjøres ved måling av metallinnholdet i eluering materiale og utgangsmaterialet ved masse ICP-MS. Kolonne utvinning kan variere avhengig av de anvendte betingelser, men det har vist seg at fullstendig gjenvinning av proteiner fra en størrelseseksklusjonskolonne er mulig ni. Derfor er det viktig å kontrollere hvorvidt eller ikke det er noe tap under de driftsbetingelser som brukes.

Modifikasjoner av protokollen kan være relatert til metalloprotein standarder som er brukt, så vel som elementene analysert. Den type metalloprotein standard ossed vil variere avhengig av de elementene som er av interesse. For elementer som Cu, Fe og Zn-proteiner, blir SOD og ferritin anvendes. Enhver annen metalloprotein som har kjente stoichometries kan også brukes, og noen eksempler er vist her.

En stor komplikasjon som kan oppstå ved å bruke denne teknikken er oppbygging av saltkrystaller i brenneren av ICP-MS. For å forhindre oppbygging av saltkrystaller, er brenneren vasket med destillert vann etter hver 500 - 1000 ml buffer som har blitt passert gjennom systemet, eller når det er bestemt ved visuell inspeksjon at brenneren skal vaskes. Et annet problem som kan oppstå er en raskere nedgang i renslighet av prøven og utvinning kjegler. Disse må rengjøres regelmessig følge produsentens protokoller.

Den innledende prøvepreparering er den mest kritiske trinn i protokollen. Hvis det er noen endringer i protein - metall komplekse informasjon som genereres vil ikke være gyldig. Dette er en av de største begrensninger i teknikken; i tillegg bruk av lav oppløsning, gir størrelseseksklusjonskolonne et begrenset detaljert riss av den sanne kompleksiteten av metalloproteiner i biologi.

Teknikken som er beskrevet her gjør det mulig å utvide kunnskapen om metalloproteome av en organisme. Masseanalyse gir bare et urent indikasjon på endringer i mengden av metall i en prøve. I tillegg til de generelle hensyn som må tas i betraktning, gir denne metoden et verktøy som kan brukes til å kvantifisere mengden av metall i forbindelse med proteiner, så vel som å identifisere metalloproteiner som skiller seg ved å sammenligne de opptegninger som oppnås. Bruken av denne teknikken kan bli anvendt for å identifisere forskjeller mellom sykdomstilstander. De identifiserte metalloproteiner kan deretter undersøkes nærmere for å finne ut hvilken rolle de spiller i sykdomsprosesser. Anvendelsen av bindestrek ICP-MS har en voksendefremtid for å bestemme rollen til stoffer som har et heteroatom slik som platina, jod eller kobber som ICP-MS kan anvendes for å identifisere proteiner som stoffet binder seg til.

Acknowledgments

Vi ønsker å takke støtte fra viktoriansk regjeringens Operational Infrastructure Support Program, den australske Forskningsrådet Heis Prosjekter Scheme (med Agilent Technologies), Australian National Health and Medical Research Council, den viktorianske hjernen bank, Cooperative Research Centre for Mental Helse og Neuroproteomics studio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agilent 1290 Infinity Binary Pump Agilent G4220A
Agilent 1290 Infinity Autosampler Agilent G4226A
Agilent 1200 Series Autosampler Thermostat Agilent G1330B
Agilent 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment Agilent G1316C
Agilent 1290 Infinity Variable Wavelength Detector Agilent G1314E
Agilent 7700 ICP-MS Agilent G3282A
 Ammonium hydroxide trace metal basis    Sigma 338818
 Ammonium nitrate  Sigma  256064 Make fresh 200mM solution on day of experiment
 Antinomy  Choice analytical  10002-3 
 Ceruloplasmin  Sigma
 Cesium  Choice analytical  100011-1 
 Complete, EDTA free protease inhibitors   Roche 11873580001
 Conalbumin  Sigma C7786
 Concanavalin A from Canavalia ensiformis (Jack bean)  Sigma L7647
 Cu, Zn Superoxide dismutase  Sigma S9697
 Ferritin  Sigma F4503
 ICP-MS multielemental calibration standards  AccuStandard Made up to required concentrations in 1% nitric acid
 Microvolume UV spectrophotometer  Thermo Scientific
 65% Nitric acid  Millipore 100441 Diluted to 1% for use
 Peek tubing   Agilent 5042-6461
 Size exclusion column BioSEC-3 PLC. column, 4.6 x 300 mm, 3 μm, 150 Å  Agilent 5190-2508
 Sodium Chloride  Chem Supply SA046
 Tris Hydrochloride  ICN Biomedicals inc.  103130
 Thyroglobulin  Sigma T9145
 Vitamin B12  Sigma V2876

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holm, R. H., Kennepohl, P., Solomon, E. I. Structural and Functional Aspects of Metal Sites in Biology. Chem Rev. 96, 2239-2314 (1996).
  2. Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G., Thornton, J. Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles. J Biol Inorg Chem. 13, 1205-1218 (2008).
  3. Roberts, B. R., Ryan, T. M., Bush, A. I., Masters, C. L., Duce, J. A. The role of metallobiology and amyloid-beta peptides in Alzheimer's disease. J Neurosci. 120, (Suppl 1), 149-166 (2012).
  4. Roberts, B. R., et al. Oral Treatment with CuII (atsm) Increases Mutant SOD1 In Vivo but Protects Motor Neurons and Improves the Phenotype of a Transgenic Mouse Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. J Neurosci. 34, 8021-8031 (2014).
  5. Hare, D. J., et al. Decreased plasma iron in Alzheimer's disease is due to transferrin desaturation. ACS CHEM NEUROSCI. (2015).
  6. Cvetkovic, A., et al. Microbial metalloproteomes are largely uncharacterized. Nature. 466, 779-782 (2010).
  7. Barnett, J., Scanlan, D., Blindauer, C. Protein fractionation and detection for metalloproteomics: challenges and approaches. Anal Bioanal Chem. 402, 3311-3322 (2012).
  8. Fernandez Sanchez, L., Szpunar, J. Speciation analysis for iodine in milk by size-exclusion chromatography with inductively coupled plasma mass spectrometric detection(SEC-ICP MS). J. Anal. At. Spectrom. 14, 1697-1702 (1999).
  9. Manley, S., Byrns, S., Lyon, A., Brown, P., Gailer, J. Simultaneous Cu-, Fe-, and Zn-specific detection of metalloproteins contained in rabbit plasma by size-exclusion chromatography-inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy. J Biol Inorg Chem. 14, 61-74 (2009).
  10. Richarz, A. N., Brätter, P. Speciation analysis of trace elements in the brains of individuals with Alzheimer's disease with special emphasis on metallothioneins. Anal Bioanal Chem. 372, 412-417 (2002).
  11. Hare, D. J., et al. Profiling the iron, copper and zinc content in primary neuron and astrocyte cultures by rapid online quantitative size exclusion chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Metallomics. 5, 1656-1662 (2013).
  12. Balkhi, S. E., et al. Human Plasma Copper Proteins Speciation by Size Exclusion Chromatography Coupled to Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Solutions for Columns Calibration by Sulfur Detection. Anal Chem. 82, 6904-6910 (2010).
  13. Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J Vis Exp. e1610 (2009).
Standarder for Kvantitativ Metalloproteomic analyse ved hjelp Size Exclusion ICP-MS
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lothian, A., Roberts, B. R. Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS. J. Vis. Exp. (110), e53737, doi:10.3791/53737 (2016).More

Lothian, A., Roberts, B. R. Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS. J. Vis. Exp. (110), e53737, doi:10.3791/53737 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter