Introduction
Essentiella metaller spelar en viktig roll i normala biologiska funktioner, inklusive sekundära budbärare vägar, metabolism vägar och organell funktioner. 30% av alla proteiner tros vara metalloproteiner 1 och 50% av alla enzymer 2. Metalloenzymer använder dessa spårmetaller som kofaktorer att katalysera kemiska reaktioner, stabilisera proteinstruktur och för regulatoriska roller som sekundära budbärare. Några av de mest studerade spårelement i fråga om att neurodegeneration är koppar, järn och zink 3. De tros vara inblandade i många sjukdomsvägar där genom dyshomeostasis kan ha negativa effekter. Exempelvis metallstatus för superoxiddismutas (SOD) direkt påverkar livslängden och fenotyp av de transgena musmodeller av familjär typ av amyotrofisk lateralskleros (ALS) 4. Vid Alzheimers sjukdom, har metalloproteomics tekniker använts för att upptäcka en minskning av metallstatus för transferrin i pLasma 5. Dessa studier belysa den viktiga roll metalloproteiner kan spela i sjukdom.
Studien av metalloproteiner direkt från biologiska vävnader är ett växande. Även om vissa metalloenzymer har präglats, de flesta fortfarande karaktäriserad eller okänd 6. En av de stora utmaningarna att mäta metalloproteiner är kravet att upprätthålla det nativa tillståndet av proteinet 7. Klassisk bottom-up proteomik tekniker förlitar sig på nedbrytning av proteiner till peptider. Denna process stör icke-kovalent interaktion av metaller och deras proteiner. Således är ingen information om metall status av ett protein som gjorts.
Ett sätt att lösa detta problem är att använda gelkromatografi parat med induktivt kopplad plasma - masspektrometri 8,9 (SEC-ICP-MS). Detta genererar information om proteinets ungefärlig storlek samt eventuella metaller som associated med den 10. Vidare är storleksuteslutning en mild kromatografisk teknik som kan bevara den nativa tillstånd av ett enzym eller protein-proteinkomplex. En fördel med att använda induktivt kopplad plasma - masspektrometri (ICP-MS) är den kvantitativa naturen hos teknologin. Med användning av en uppsättning av metalloproteiner standarder är det möjligt att åstadkomma absolut kvantifiering av metalloproteiner från biologiska prover 9,11. Detta uppnås genom att generera en standardkurva genom att injicera kända metalloproteiner över ett område av metallkoncentrationer.
Detta protokoll visar ett exempel på hur detta kan åstadkommas för en mängd olika metalloprotein standarder. I denna uppsats vill vi skapa standardkurvor för metaller som till stor del undersöks i biologiska områden, inklusive järn (Fe), koppar (Cu), zink (Zn), jod (I), och kobolt (Co).
Protocol
1. Beredning av buffertar och prover
- Förbereda 500 ml buffert, 200 mM ammoniumnitrat pH 7,6-7,8 (pH justerades med ammoniumhydroxid (NH4OH)) med cesium (Cs) och antinomi (Sb) tillsattes till en slutkoncentration av 10 ppb. Använd cesium och antinomi som interna standarder för att övervaka varje förändring i svaret av ICP-MS. Filter buffert före användning genom ett 0,22 pm filter.
- Förbereda prov beroende på den typ av prov: vätska, vävnad eller cellkultur.
- För prover som kräver homogenisering (t.ex. vävnad eller celler), se till att de inte innehåller diskmedel. Använd Tris-buffertar för provberedning. Alternativt kan du använda fosfatbuffertar, men de kan försämra metalloproteome över tid eller med frysupptiningscykler 12.
- Homogenisera vävnads- eller cellodlings prover medelst manuell Dounce eller sonikering under 5 min med användning av Tris-buffrad saltlösning (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM natriumklorid(NaCl) + etylendiamintetraättiksyra (EDTA) fria proteashämmare).
- Klargöra homogenat genom centrifugering vid 16.000 xg under 5 min. Samla upp den resulterande supernatanten. Hålla proverna vid 4 ° C.
Obs: Alla prover måste centrifugeras före laddning i högupplösande vätskekromatografi (HPLC) flaskor för att förhindra partiklar från att blockera kolonnstorleken (SEC).
- Normalisera totala mängden protein laddades på kolonnen över proverna. Bestäm proteinkoncentrationer vid 280 nm med hjälp av en mikrovolym UV-spektrofotometer 13. Belastningen mellan 20 och 150 | j, g protein. Använd Typiska injektionsvolymer som sträcker sig från 2 till 80 l beroende på provkoncentrationen.
- Rengör prov arm mikrovolym UV-spektrofotometer med destillerat vatten före provladdning. Provet armen är där proteinet prover laddas.
- Blank instrumentet mot 2 pl the-provbuffert. Då, belastning 2 | il av varje prov på armen och mät absorbansen vid 280 nm.
- Bestämma koncentrationerna. För råprotein prover använda en extinktionskoefficient av en Abs = 1 mg / ml. För att bestämma koncentrationen av protein i proverna, använd Beer-Lamberts lag, A = ε xlxc, där A är absorbansen, ε är extinktionskoefficienten, är l våglängden i cm och c är koncentrationen.
2. Bulk Analys av Metalloprotein Standards Använda induktivt kopplad plasma - masspektrometri
- Warm-up och stämma instrumentet med hjälp av tillverkarens protokoll.
- När instrumentet värms upp och trimmad, utföra bulk ICP-MS.
Notera: Stamlösningar av renade metalloproteiner behöver i allmänhet spädas före mätning. Metall koncentrationen av standard kan inte beräknas från den kända protein: metall stochiometries och den beräknade protein Concentration. Denna information kan användas för att bestämma den utspädning som kommer att vara lämpligt att ligga inom området för standardkurvan genereras.- Späd metalloprotein standarder, tyroglobulin, ferritin, ceruloplasmin, Cu / Zn SOD och vitamin B 12, så att de faller inom intervallet 0-500 ug / L, med hjälp av ett% salpetersyra. För att uppnå standarder inom detta område, inte använda späd än en i 20. Utför seriespäd i vatten för att späda lagren före detta om det behövs.
- Ställa upp ordningen av injektioner. Först analyserar de sju kalibreringsnivåerna, koncentrationer som sträcker sig från 0 till 500 | ig / l, följt av de metalloprotein standarder. De sju kalibreringsnivåerna är 0, 1, 5, 10, 50, 100 och 500 | ig / l.
- Välja element av intresse. Här använder Fe, Cu, Zn, Co och I, eftersom de är de element som de proteinstandarder är bundna till. Välj elementen i förvärvsmetoden genom att öppna fliken väljar och tillsätta eleme nts och deras respektive isotopmassor som skall analyseras.
- Utföra provanalys med instrumentet och instrumentets programvara skapar automatiskt kalibreringskurvor för vart och ett av elementen som analyseras. Kalibreringskurvorna är skapade av programvaran genom att plotta pulser / sek av metallen detekterades mot mängden metall att standarden är tänkt att innehålla, i ^ g / L. Använd kalibreringskurvor för att bestämma koncentrationen av metall i de okända proverna.
Obs: Med hjälp av kalibreringskurvan, avgör programmet koncentrationen av metall i varje metalloprotein standarder. - Från bulkanalysresultat, generera metalloprotein standarder som inbegriper de tre mest förekommande spårämnen i däggdjursvävnader med användning av en blandning av Cu, Zn-superoxiddismutas (SOD) utspädd till 200 | ig / l av koppar och zink och ferritin (FTN) vid en slutlig koncentration av 2000 | ig / l av järn.
Obs: Detta avsnitt ska utföras parallellt med föregående, eftersom de båda krävs ungefär 1-1,5 timme att slutföra.
- Purge HPLC pumpar med buffert görs i steg 1,1 och rensa pumparna av 5 min vid en flödeshastighet av 5 ml / min.
- När systemet spolas, ställ in flödeshastighet vid 0,1 ml / minut och anslut storleksuteslutningskolonn (4,6 x 300 mm, 3 | im, 150 Å).
Notera: En våt anslutning mellan slangen och kolonnen undviker eventuella luftbubblor att fastna under anslutning av kolonnen. - Anslut den andra änden av kolonnen till UV-detektor inställd för att mäta absorbansen vid 280 nm med användning av PEEK-slang.
- Gradvis öka flödeshastigheten av kolonnen i steg om 0,05 till 0,1 ml / min tills en slutlig flödeshastighet av 0,4 ml / min har nåtts. Även om detta sker, kontrollera anslutningarna slangen till kolumnen för eventuella läckor. Övervaka trycketav systemet för att säkerställa att det inte överstiger kolumnkraven genom att observera tryck spår på kromatogrammet i programvaran.
- Låt kolonnen komma i jämvikt vid den önskade flödeshastigheten över 5 - 10 kolonnvolymer. Efter det jämvikt ansluta instrument för att möjliggöra provanalys att ske.
- Inrättat HPLC-metoden upp till pump buffert A över kolonnen vid 0,4 ml / min under 15 min.
4. Installera och Running Size Exclusion - induktivt kopplad plasma - masspektrometri
Obs: Drifts förfaranden kan variera mellan instrument och modeller. Kontakta instrumentet teknisk specialist för att lära sig mer om hur du konfigurerar ICP-MS används.
- Placera ICP - MS i standby-läge innan du ändrar inställningen hårdvaran.
- En gång i standby-läge, stänga av kommunikation för den automatiska provtagaren och ändra provinledningen till "andra".
Obs! Beroende på vilken programvara och hårdware konfiguration välja "HPLC" som ett prov introduktion källa kan användas. Kontakta instrumentet teknisk specialist för att lära sig om detta alternativ är tillgängligt.
- En gång i standby-läge, stänga av kommunikation för den automatiska provtagaren och ändra provinledningen till "andra".
- Använd PEEK slang (ID 0,13 mm) för att ansluta utflöde från UV-detektorn direkt till nebulisatorn på ICP-MS.
- Makt säkerhetskopiera ICP - MS och låt instrumentet värmas upp under 10 - 20 min.
- Efter plasma har antänts ansluter fjärrkabeln från ICP - MS till baksidan av HPLC autosampler. Gör detta en gång plasman har antänts; annars HPLC-systemet kommer att stängas av automatiskt, eftersom ICP - MS är inte på.
- Ändra ICP-MS metod för att samla in data för LC-ICP-MS.
- Förändra förvärvsmetoden från spektrum då lösa förvärv (TRA).
- Välj de element som skall analyseras, Fe, Cu, Zn, Co, jag liksom alla andra delar av intresse, och som integreringstider (typiskt mellan 0,05 till 0,3 sek). Efter elementen av intresse enre valt justera förvärvet tid att matcha körtiden för kromatografi (t.ex. 900 sek för en 15 min kromatografi run).
- Manuellt ställa ICP - MS för känslighet och kollisionscell helium (He) gasflödeshastigheter med kromatografi bufferten flödar med hjälp av Cs och Sb ingår i bufferten. He flödeshastigheter är typiskt ~ 1 ml / min mindre än de som används för bulkanalys. När metalljoner räknas har stabiliserats och relativa standardavvikelsen (RSD) värden är under 5%, är systemet redo att användas.
- Gör provkörnlistor i både HPLC och ICP-MS program. Listan provkörningen innehåller den ordning i vilken vart och ett av proven skall injiceras, liksom det namn som data ska sparas. Kontrollera att det totala antalet sampel i listan matchning mellan de två programmen.
- Starta provparti för ICP-MS innan HPLC, eftersom injektionen av provet genom HPLC kommer att utlösa ICP - MS för att börja samladata. Om detta inte görs i rätt ordning det kommer att resultera i saknade data.
- Generera kalibrerings kurvpunkter genom att injicera olika volymer av SOD och FTN blandad standard från 200 mikrogram / L till 6000 mikrogram / L injicerades på kolumnen för Cu och Zn och 2000 ug / L upp till 60.000 mikrogram / L för Fe. Injektionsvolymer varierar från 1 till 30 pl.
Obs! Dessa koncentrationsintervall omfattar koncentrationerna av Fe, Cu och Zn typiskt observeras i komplexa homogen. För prover som innehåller endast renade proteiner bör justeras i enlighet med den maximala räckvidden av kurvan. Som mängden metall associerad med proteinet kan kräva en mindre eller större sortiment sedan det finns mindre föroreningar i provet från andra faktorer. - Analysera varje av de okända proverna vävnad, plasma eller cellkultur.
5. Dataanalys, manipulation och visualisering
- Lagra data i kommaseparerade värden (CSV) format och ladda into bearbetningsprogram efter behov.
- För att kontrollera för instrumentdrift, dela räkningar per sekund för varje element av pulser per sekund för antingen Cs eller Sb.
- Generera kalibreringskurvor för vart och ett av elementen.
- Bestämma området under metall topp som motsvarar den metalloprotein att det är bundet till för var och en av injektionerna genom att utföra toppintegrering i den föredragna dataanalys programvara.
- Rita området under metalltoppen mot den totala mängden metall som injicerades på kolonnen i varje körning, 200 - 6000 ug / L för Cu och Zn och 2000 - 60.000 mikrogram / L för Fe. Utför linjär regressionsanalys enligt programvaruprotokoll.
- Använd Lutning resultaten från den linjära regressionsanalysen som en faktor för att omvandla räkningar per sekund till pg / sek. Dela upp var och en av de räkningar per sekund datapunkter över hela kromatogrammet genom gradienten hos linjevärdet.
- Plotta data ipg / sek mot kromatogrammet tiden. Bestämma området under topparna av intresse. Arean under toppen representerar den totala mängden av metall att proteinet är bundet till, i pg.
- Generera en kalibrering baserad på molekylvikten hos de kända metalloproteiner och den tidpunkt vid vilken de eluerar. Använda detta för att uppskatta storleken på de proteintoppar i komplexa prover.
Representative Results
Användningen av metalloprotein standarder möjliggör för kalibrering av den storleksuteslutningskolonn. Figur 1A visar elueringsprofilen för standarder tyroglobulin, ferritin, ceruloplasmin, Cu / Zn SOD och vitamin B 12 baserat på den metall som de är bundna till (Fe, Co, Cu, Zn och i). Figur 1B visar kalibreringskurvan för storleksuteslutningskolonn baserad på molekylvikten för proteinstandarder och deras elueringstid, som presenteras i form av elueringsvolymen (Ve) dividerat med tomrumsvolymen av kolonn (Vo). De proteiner som används för att generera denna standardkurva är konkanavalin A, konalbumin, ceruloplasmin, ferritin, SOD och tyreoglobulin.
Figur 2A visar elueringen av ferritin över ett omfång av 2000 - 60000 pg av Fe injicerades på kolonnen och Figur 2D är ett regressionsanalys utfördes med användning av peak område. Figurerna 2B och 2C är elueringsprofilerna för Cu / Zn SOD för Cu och Zn och 2E och 2F är regressionsanalyser genereras med användning av toppareor. Resultaten av regressionsanalysen används för att omvandla rådata i pulser / sek till pg / sek så mängden metall associerad med proteinet kan bestämmas kvantitativt. Omvandlingen görs genom att dividera impulser / sekund av lutningen för den linjära regressionen (t.ex., 334,6 (pulser / sekund) x (sek / pg) av koppar).
Såsom angivits kan denna teknik användas för att identifiera metalloproteiner i komplexa biologiska prov. Mänskliga hjärnan och plasman har utsatts för denna teknik och figurerna 3 och 4, respektive, visar de erhållna resultaten. Mänskliga hjärnan separerades genom SEC-ICP-MS visas i figurerna 3A-3C, vilka var och en representerar en annan metall ur intresse (Cu, Zn eller Fe). Figurerna 4A-4C visar spåren som erhålles när humanplasma utsätts för denna teknik. Komplexiteten och överflöd av provet kommer att påverka antalet toppar som syns. Som väntat plasma domineras av ett fåtal metalloproteiner inklusive ceruloplasmin och transferrin.
Figur 1. Kalibrering av gelkromatografi - induktivt kopplad plasma - masspektrometri med hjälp av kända metalloproteiner (A) Elueringsprofil för metalloprotein normer som bygger på deras respektive metaller.. (B) Molekylvikt kalibreringskurva för proteinstandarder tyroglobulin (i), ferritin (ii), ceruloplasmin (iii), konalbumin (iv), Cu / Zn SOD (v) och concanavalin A (vi)."Target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Användning av ferritin och Cu / Zn SOD som Metalloprotein standarder för att bestämma mängden Cu, Fe eller Zn associerad med metalloproteiner i en komplex biologiskt prov (A) Elueringsprofil för ferritin över injektionsintervall 2000 -. 60.000 mikrogram / L av järn. (B) och (C) Elueringsprofil för Cu / Zn SOD över injektions intervallet 200 - 6000 | ig / l av koppar och zink, respektive. (D), (E) och (F) visar regressionsanalysresultat för metallerna järn, koppar och zink, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Cu, Fe och Zn Metalloproteome of Human Brain. (A) Koppar trace (B) Iron trace (C) Zink spår. Eluering av proteinstandarder för varje metall framgår av den svarta spår med deras molekylvikt anges under grafen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Cu, Fe och Zn Metalloproteome för human plasma. (A) Koppar trace (B) Iron trace (C) Zink spår. Eluering av proteinstandarder för varje metall visas av den svarta spår med deras molekylvikt idicated under grafen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Säkerställa det nativa tillståndet av proteinet innebär särskild uppmärksamhet åt buffertar används och lagring av provet behövs. Inte kan användas alla kromatografiska tekniker eller provberedningstekniker. Det är viktigt att de buffertar som används i hela beredningen och kromatografi prov saknar metallkelatorer och använda buffertar som efterliknar fysiologiska pH och saltkoncentrationer. Andra villkor för att undvika inkluderar uppvärmning provet eller tillsats av proteindenatureringsmedel (t.ex. urea). Det är kritiskt att minimera antalet av fryst tiningscykler. Förmågan hos den valda bufferten för att binda tvåvärda metaller är också viktig och är en anledning till att Tris eller ammoniumnitrat buffertar väljs över fosfatbaserade buffertar.
Den låga kapaciteten för storleksuteslutningskromatografi i förhållande till andra former av kromatografi upplösning och topp är en viktig begränsning av denna teknik. Men den milda karaktär storleksuteslutande chromatograPHY är viktigt att upprätthålla det nativa tillståndet av proteinet och därmed bevara de relativt svaga metall-proteinbindningar. Kravet på att hålla det nativa tillståndet av proteinerna kräver särskild uppmärksamhet på behandlingen av proverna, inklusive begränsa antalet frysupptiningscykler, undvika metallkelatorer (t.ex. EDTA) eller kaotropiska salter och rengöringsmedel.
Denna låg upplösning av denna teknik påverkar förmågan att kvantifiera mängden metall associerad med ett specifikt protein, om det är i ett komplext sampel som topparna som ses kommer att innehålla mer än ett protein. Därför skulle mängden metall bestämdes med användning av toppintegrering vara en indikation på den totala mängden metall associerad med alla proteinerna eluerades vid denna tidpunkt och inte bara ett specifikt protein. För att övervinna denna begränsning proteinet av intresse skulle behöva renas ytterligare under nativa betingelser. Detta skulle göra det möjligt för kvantifiering avmetallen i samband med detta protein som ska rapporteras med en högre grad av certainity. En annan potentiell begränsning av denna teknik skulle vara förlust av protein på grund av icke reversibel bindning till kolonnen. I syfte att bestämma om detta sker en återhämtnings försök bör genomföras varigenom mängden av protein eluerades från kolonnen analyseras för att avgöra om detta motsvarar storleken på injiceras. Samma sak kan göras genom att mäta metallhalten av elueringen material och utgångsmaterialet genom bulk ICP-MS. Kolumn återhämtning kan variera beroende på de betingelser som används, men det har visat sig att fullständig återhämtning av proteiner från en storleksuteslutningskolonn är möjligt nio. Därför är det viktigt att kontrollera om det finns någon förlust under driftsförhållanden som används.
Ändringar i protokollet kan relateras till de metalloprotein standarder som används samt de delar analyseras. Den typ av metalloprotein standard ossEd kommer att variera beroende på faktorer som är av intresse. För element, såsom Cu, Fe och Zn proteiner, SOD och ferritin användes. Någon annan metalloprotein som har kända stoichometries kan också användas och några exempel har visats här.
En stor komplikation som kan uppstå från att använda denna teknik är att bygga upp saltkristaller i fackla ICP-MS. För att förhindra uppbyggnad av saltkristaller, är brännaren tvättades med destillerat vatten efter varje 500 - 1000 ml buffert som har passerat genom systemet eller när det bestäms genom visuell inspektion att brännaren bör rengöras. Ett annat problem som kan uppstå är en snabbare nedgång i städning av prov- och utvinning koner. Dessa måste rengöras regelbundet enligt tillverkarens protokoll.
Den initiala provberedningen är det mest kritiska steget i protokollet. Om det finns några ändringar i proteinet - metallkomplexet infFörnyelsen som genereras kommer inte att gälla. Detta är en av de viktigaste begränsningarna hos den teknik; förutom användningen av den låga upplösningen, ger storleksuteslutningskolonn en begränsad detaljerad vy av den sanna komplexitet metalloproteiner i biologi.
Den teknik som beskrivs här tillåter expansion av kunskap om den metalloproteome av en organism. Bulk analys ger endast en rå indikation på förändringar i mängden metall i ett prov. Förutom de allmänna överväganden som måste beaktas, ger denna teknik ett verktyg som kan användas för att kvantifiera mängden metall i samband med proteiner samt identifiera metalloproteiner som skiljer sig genom att jämföra spår erhållits. Användningen av denna teknik kan användas för att identifiera skillnader mellan sjukdomstillstånd. De identifierade metalloproteiner kan sedan undersökas vidare för att avgöra vilken roll de spelar i sjukdomsprocesser. Tillämpningen av bindestreck ICP-MS har en växandeframtiden för att fastställa rollen för droger som har en heteroatom såsom platina, jod eller koppar som ICP-MS kan användas för att identifiera de proteiner som läkemedlet binder.
Acknowledgments
Vi vill tacka för stödet från viktorianska regeringens operativa Infrastruktur Support Program, Australian Research Council länknings Projekt Scheme (med Agilent Technologies), Australian National Health och Medical Research Council, den viktorianska hjärnan bank, Cooperative Research Centre för psykisk hälsa och Neuroproteomics anläggning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent 1290 Infinity Binary Pump | Agilent | G4220A | |
| Agilent 1290 Infinity Autosampler | Agilent | G4226A | |
| Agilent 1200 Series Autosampler Thermostat | Agilent | G1330B | |
| Agilent 1290 Infinity Thermostatted Column Compartment | Agilent | G1316C | |
| Agilent 1290 Infinity Variable Wavelength Detector | Agilent | G1314E | |
| Agilent 7700 ICP-MS | Agilent | G3282A | |
| Ammonium hydroxide trace metal basis | Sigma | 338818 | |
| Ammonium nitrate | Sigma | 256064 | Make fresh 200mM solution on day of experiment |
| Antinomy | Choice analytical | 10002-3 | |
| Ceruloplasmin | Sigma | ||
| Cesium | Choice analytical | 100011-1 | |
| Complete, EDTA free protease inhibitors | Roche | 11873580001 | |
| Conalbumin | Sigma | C7786 | |
| Concanavalin A from Canavalia ensiformis (Jack bean) | Sigma | L7647 | |
| Cu, Zn Superoxide dismutase | Sigma | S9697 | |
| Ferritin | Sigma | F4503 | |
| ICP-MS multielemental calibration standards | AccuStandard | Made up to required concentrations in 1% nitric acid | |
| Microvolume UV spectrophotometer | Thermo Scientific | ||
| 65% Nitric acid | Millipore | 100441 | Diluted to 1% for use |
| Peek tubing | Agilent | 5042-6461 | |
| Size exclusion column BioSEC-3 PLC. column, 4.6 x 300 mm, 3 μm, 150 Å | Agilent | 5190-2508 | |
| Sodium Chloride | Chem Supply | SA046 | |
| Tris Hydrochloride | ICN Biomedicals inc. | 103130 | |
| Thyroglobulin | Sigma | T9145 | |
| Vitamin B12 | Sigma | V2876 |
References
- Holm, R. H., Kennepohl, P., Solomon, E. I. Structural and Functional Aspects of Metal Sites in Biology. Chem Rev. 96, 2239-2314 (1996).
- Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G., Thornton, J. Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles. J Biol Inorg Chem. 13, 1205-1218 (2008).
- Roberts, B. R., Ryan, T. M., Bush, A. I., Masters, C. L., Duce, J. A. The role of metallobiology and amyloid-beta peptides in Alzheimer's disease. J Neurosci. 120 (Suppl 1), 149-166 (2012).
- Roberts, B. R., et al. Oral Treatment with CuII (atsm) Increases Mutant SOD1 In Vivo but Protects Motor Neurons and Improves the Phenotype of a Transgenic Mouse Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. J Neurosci. 34, 8021-8031 (2014).
- Hare, D. J., et al. Decreased plasma iron in Alzheimer's disease is due to transferrin desaturation. ACS CHEM NEUROSCI. , (2015).
- Cvetkovic, A., et al. Microbial metalloproteomes are largely uncharacterized. Nature. 466, 779-782 (2010).
- Barnett, J., Scanlan, D., Blindauer, C. Protein fractionation and detection for metalloproteomics: challenges and approaches. Anal Bioanal Chem. 402, 3311-3322 (2012).
- Fernandez Sanchez, L., Szpunar, J. Speciation analysis for iodine in milk by size-exclusion chromatography with inductively coupled plasma mass spectrometric detection(SEC-ICP MS). J. Anal. At. Spectrom. 14, 1697-1702 (1999).
- Manley, S., Byrns, S., Lyon, A., Brown, P., Gailer, J. Simultaneous Cu-, Fe-, and Zn-specific detection of metalloproteins contained in rabbit plasma by size-exclusion chromatography-inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy. J Biol Inorg Chem. 14, 61-74 (2009).
- Richarz, A. N., Brätter, P. Speciation analysis of trace elements in the brains of individuals with Alzheimer's disease with special emphasis on metallothioneins. Anal Bioanal Chem. 372, 412-417 (2002).
- Hare, D. J., et al. Profiling the iron, copper and zinc content in primary neuron and astrocyte cultures by rapid online quantitative size exclusion chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Metallomics. 5, 1656-1662 (2013).
- Balkhi, S. E., et al. Human Plasma Copper Proteins Speciation by Size Exclusion Chromatography Coupled to Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Solutions for Columns Calibration by Sulfur Detection. Anal Chem. 82, 6904-6910 (2010).
- Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J Vis Exp. , e1610 (2009).
