Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

RNAi Trigger Levering inn Published: March 8, 2016 doi: 10.3791/53738
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1,3
1Biology Department, Boston College, 2Division of Biology, Kansas State University, 3Discovery Research, Biogen

Introduction

Malaria er en mygg-borne smittsom sykdom som rammer mange millioner av mennesker hvert år. Verdens helseorganisasjon (WHO) rapporterer at i 2013 var det ca 584 000 dødsfall på grunn av malaria, 78 prosent av dem skjedde i barn under fem år 1. Patogener som forårsaker menneskelig malaria er apicomplexan parasitter i slekten Plasmodium og overføres mellom sine menneskelige verter av kvinnelige Anopheles mygg. Smitteoverføring skjer når myggen tar et blodmåltid fra en person som er infisert, og deretter innskudd smitte parasitter inn i en frisk person i en påfølgende blodmåltid. Innenfor slekten Anopheles, er Anopheles gambiae artene med størst vektor kapasitet og er den mest fremtredende malaria vektor i Afrika sør for Sahara 1-3.

Foreløpig fortsetter mygg vektor kontroll ved distribusjon av insektmidler for å be de store metode som anvendes for å redusere byrden av menneskelig malaria. Selv om bruken av insektmidler siden 1960-tallet har vist seg å være svært vellykket, har økningen av insektmiddel motstand drevet et behov for utvikling av nye insektmidler og alternative vektorkontrollstrategier 4-7. I løpet av 2010, totalt 49 av 63 land som rapporterer til WHO indikerte forekomsten av insektmiddel resistens hos malaria vektorer 1. I tillegg IR Mapper verktøy, som benytter peer-reviewed litteratur for å vurdere resistensdata i Afrotropical regioner, rapporterer at mellom 2001 og 2012 var det 46% og 27% økning i motstand mot pyretroider og dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT), henholdsvis 7.

RNA interferens (RNAi) ble identifisert i begynnelsen av 1990 som en teknikk som kan brukes til å inaktivere gener i Petunia plante 8,9 og i soppen Neurospora crassa 9,10. Kort tid etteri 1998, ble RNAi først dokumentert i Caenorhabditis elegans som et middel for å redusere genuttrykk i en dyremodell ved innføring av antisense eller dobbel tråd RNA (dsRNA) via injeksjon eller fôring metoder 9,11. Siden den ble oppdaget, har RNAi revolusjonert jakten på funksjonell genomforskning ved å tillate forskere å utnytte revers genetikk å raskt undersøke de funksjonelle rollene gener av interesse via en svært selektiv post-transcriptional gene stillemekanisme. I visse organismer, slik som Drosophila melanogaster, har bruken av transgene organismer som uttrykker interfererende RNA-konstruksjoner vært vidt vellykket for genet knockdown (KD). Selv om bruken av transgener i An. gambiae for RNAi har blitt utnyttet og kan være nyttig for store skjermer, er den generasjonen av transgene mygg stammer både arbeids- og tidkrevende, vanligvis tar to til tre måneder å gå fra identifisering av et gen av interesse for generasjon avpå av en passende transgene lager 12. For tiden er den primære metoden for genet KD i An. gambiae er ved injeksjon i hemolymfe, i løpet av den voksne stadium, av dsRNA som er spesifikke for et gitt gen 12,13. Denne prosessen tar vanligvis omtrent en måned å gå fra identifisering av et gen av interesse for vurdering av genet KD, viser seg å være mye raskere enn transgene metoder 12. Metoder for larve-trinns RNAi er etablert nylig i An. gambiae og Aedes aegypti via nanopartikkel fôring 14-17 eller ved oral levering av mikroalger baserte dsRNA molekyler 18, med muligheter til å utføre funksjonell genomikk analyse i tidlige stadier av utviklingen. I direkte innsprøytning, fôring, og nanopartikkel leveringsmåte, er dsRNA tatt opp selvstendig av målcellen og spaltes av enzymet Dicer i 21-25 nucleotide lange "short inter RNA" (siRNAs) 19,20. Disse sirnas er så incorporrerte inn i RNA-induserte stanse kompleks (RISC), fra hvilken en tråd vil bli forkastet, slik at RNA-bundet RISC-komplekset for å binde seg til og spalte mål-mRNA og derved redusere dets nivå og hemme dens oversettelse 19,20.

Mange iboende trekk ved grunnleggende mygg biologi modulere vektor kapasitet, inkludert verts preferanse (f.eks luktesans, gustation), parring, reproduksjon og immunforsvar. Gitt betydningen av disse biologiske prosesser, er det sannsynlig at deres modulasjon på en genetisk eller farmakologisk nivået vil gi nye muligheter for vektorkontroll, inkludert omgåelse av insektmiddel motstand, og gi nye verktøy for mer bredt integrerte tilnærminger til vektor ledelse. Bruken av funksjonell genomforskning for å vurdere rollene til genene bak disse iboende biologiske funksjonene vil gjøre det mulig å identifisere nye mål og gi ny innsikt i hvordan vi effektivt kan skape nye, mer effektiv kontroll strategtallet. Vi beskriver utvikling og bruk av en rask injeksjon metode for å initiere RNAi under pupal fasen av An. gambiae. Vi observerer at pupal scenen injeksjon av en RNAi trigger muliggjør observasjon av resulterende fenotyper i tidlig stadium voksne, dvs. før etter fremveksten enn det som observeres hvis genet knockdown ble initiert av voksne etterveksten. Dette metoder gjør at genet knockdown begynner i løpet av pupal utviklings intervall og strekker seg inn adulte stadier, slik at genet knockdown startes under pupal utvikling kan vedvare og påvirke tidlig voksen hemolymph brukere celletyper, samt celletyper som er mer hemolymph brukere under metamorfose enn i den voksne, for eksempel sensoriske nevroner som finnes hos voksne vedheng etter fremveksten.

Protocol

1. Syntese og klargjøring dsRNA

  1. Identifisere en 200-800 bp knockdown region (for å frembringe det tilsvarende dsRNA) i genet av interesse som ventes å ha noen identifiserbare off-target effekter (for eksempel ingen sekvenshomologi ≥18 bp innenfor et annet gen) og en negativ kontroll (f.eks , en heterolog sekvens som ikke er til stede i målet insekt-genomet, slik som Escherichia coli-lacZ-genet (GenBank Gene ID: 945 006). Alternativt kan bruke en positiv kontroll (f.eks, noe som gir en lett observeres fenotype, for eksempel SRPN2 21,22 , GenBank Gene ID. 1270169) sekvensen av dsRNA målretting SRPN2 er definert i Michel et al (2005) 21..
    Merk: E-RNAi er en åpen kildekode bioinformatiske ressurs som er nyttig for identifisering av slike regioner og for prosessen med å utforme oligonukleotidprimere 23.
  2. Utfør standard PCR-amplifisering (dvs. utført med Taq DNA-polymerase ved bruk av 30-35 sykluser) ved anvendelse av en genomisk DNA eller cDNA som templat for å oppnå dsRNA syntese mal flankert av en T7-promoter-sekvens (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ') og fortsett med dsRNA preparat og rydde opp ved hjelp av en kommersiell in vitro transkripsjon kit i henhold til produsentens anvisninger. Bruk SRPN2 PCR amplifikasjonsbetingelser og primer informasjon som presenteres i An et al. (2011) 22.
  3. Kvantifisere rensede RNA fragment utbytter ved ultrafiolett spektroskopi absorbans ved bølgelengde på 260 nm og juster til den ønskede konsentrasjon (for eksempel 3 ug / ul) i RNase-fritt vann.
    1. For feilsøking lave RNA-konsentrasjoner, redusere væskevolum ved spinning prøvene ned i en vakuumsentrifuge ved romtemperatur eller ved frysetørking og rekonstituering av prøver i små mengder vann. Den nødvendige tid for prøven lyofilisering vil variere avhengigpå første prøvevolumer og dsrna konsentrasjoner.
  4. Kontrollere kvaliteten og lengden av dsRNA på en 2% agarose-gel fremstilles med 1 x TBE eller TAE-buffer og farget med etidiumbromid (EtBr), sammen med templat-DNA anvendes for transkripsjonsreaksjon. Den dsRNA vil migrere saktere enn templat-DNA. Kvalitet og lengde kan vurderes ved å sikre det ikke er noen ikke-spesifikke dsrna produkter, og ved å sammenligne produktene med en standard DNA-markør, respektivt.
    Merk: EtBr er en potent mutagen og må håndteres deretter.
    Merk: I en dsRNA konsentrasjon på 3 ug / ul, er mer enn tilstrekkelig for visualisering av EtBr-farget agarosegel 0,5 ul av prøven.
  5. Oppbevar dsRNA ved -20 ° C inntil nødvendig. Flere fryse / tine sykluser kan føre til nedbrytning, så porsjoner bør være forberedt på store volumer av dsRNA.

2. Forbered Fast Grønn FCF fargestoff (FGD) Tubes

  1. Fortynnet Fast Grønn FCF fargestofffra stamløsning (≥85% fargestoff-innhold) til 0,1% (v / v) (arbeidsløsning) i RNase-fritt vann.
  2. Pipetter 1 mL av fargestoff inn i bunnen av et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
  3. Plasser rør i en 65 ° C varme blokk i omtrent tre timer å fordampe væske, og deretter plassere rørene ved romtemperatur i minst 30 minutter, avkjøles før du bruker. Dette tørr solid fargestoff vil rekonstituere i dsRNA resuspensjon løsning.

3. Trekk kanyler

  1. Trekk borsilikatglass nåler ved hjelp av et oppvarmet nål avtrekker til en spiss diameter på 10-30 mikrometer. Dra innstillinger tilsvarer: Heater justering no. 1 = 100, Heater justering nei. 2 = 70.
  2. For å unngå skade på den fine tuppen av nålen, plassere alle trukket nåler horisontalt i en petriskål på en stripe av molding kitt.
    Merk: Ytterligere informasjon for kapillær nål trekke metoder kan finnes i ytterligere detalj i Malaria Research and Reference Reagens Resource Center MR4 manuell 24.

4. Forbered Injeksjon Station

  1. Samle nødvendige materialer: glass microcapillary nåler trukket til fine tips, microinjector, tynt filter papir og tykt filter papir, petriskåler, overføre pipetter, pensel og dissekere lysmikroskop.
  2. Klargjør microinjector som beskrevet i microinjector manuell, og sette injeksjonsvolumet til ønsket volum per puls (for eksempel maksimalt 69 nl per puls).
  3. På en plattform som er lett å manøvrere under et mikroskop (f.eks flate siden av en Styrofoam rør stativ), stable to filter papirark med den tynne filterpapir på toppen, og fest med tape rundt kantene.
  4. Suspender 10 mL av hver dsRNA løsning i separate fargestoff rør, og legg på is.

5. Samle puppe til injeksjon

  1. Fyll en liten 60 mm x 15 mm petriskål med 10 ml avionisert vann og samle ~ 50 blek puppe (During første 24 timer etter pupation) fra en insectary magasin med en engangs plast overføringspipetten.
  2. Fjern eventuelle puppe som har middels til mørk cuticle tanning.
    Merk: Når cuticle begynner å sole, blir det vanskeligere å trenge gjennom hårstråene, og injeksjon resulterer i mye høyere dødelighet.

6. dsRNA Injection

  1. Under dissekere mikroskop, brekke av den distale spissen av kanylen med et par fine tang.
  2. Forbered kanylen ved tilbakefylling nålen med mineralolje (ved hjelp av en sprøyte med en 3 tommers, 30 gauge nål), og utvise overflødig olje med microinjector.
  3. Front fylle kanyle med maksimalt med dsRNA, og ta ut en puls under mikroskop for å sikre utlevering av væske. I tilfelle at ingen væske blir tatt opp og / eller utvist, sjekk den distale tuppen av nålen for blokkeringer og sikre at nålen er godt sikret i microinjector.
  4. Plukk 1-3 puppe, og plassere dem på filterpapiret.
  5. Ved hjelp av pensel, plasser puppe på filterpapiret med rygg cuticle tilgjengelig, og bruke pensel til å presse på filterpapiret og absorbere av overflødig vann.
  6. Stabil puppe med tuppen av pensel, og stikk nålen inn i rygg hårstråene mellom brystkassen og magen i en vinkel på ca 30 ° i forhold til rygg overflaten av puppe. Injeksjon bør rettes mot den bakre enden av puppe og nålen skal flyttes i en anterior-til-posterior retning.
  7. Sprøyt to pulser (69 nl per puls) av 3 ug / ul dsRNA løsning i hemolymph, og sjekk for distribusjon av farge i hele kroppen. Dersom ingen farge er identifisert, skifte kanylen posisjon litt for å fjerne spissen fra hindringer og gjenta væske levering.
  8. Bruk fuktet pensel til å forsiktig flytte puppe fra nålen i vann for dyrking. Than puppe bør holde seg til pensel ved lett berøring.

7. Post-injeksjon betingelser

  1. Sett petriskål med injisert puppe i en mygg bur med egnet luftstrøm (f.eks mesh bur eller beholder med mesh lokk). Pupal oppdrettsforhold bør være konsekvent på 27 ± 3 ° C temperatur, 75 ± 5% fuktighet og være under et lys: mørke syklus på 16: 8 timer.
  2. Forbered en 10% (w / v) glukoseoppløsning, og plasser en løsning mettet bomullsdott på mygg buret mesh for voksen fôring.

8. Vurdere Knockdown

  1. Ved ønskede tidspunkt (er), vurdere fenotyper i eksperimentelle dsRNA-injiserte insekter, sammenlignet med kontroller.
    1. Vurdere dsSRPN2 og dsLacZ insekter daglig ved avkjøling ned voksne i ca. 2-3 min ved -20 ° C, å overføre dem til en kald plate ved 2 ° C og å identifisere enhver pseudo-tumordannelse ved anvendelse av et disseksjonsmikroskop ved 15Xforstørrelse med lysfelt belysning. Etter vurdering, returnere voksne til insectary forhold (27 ± 3 ° C, 75 ± 5% fuktighet).
      Merk: De eksperimentelle og kontroll dsRNAs ansatt i denne protokollen er dsSRPN2 og dsLacZ hhv. Det finnes mange alternativer som passer for kontroller; imidlertid er det foreslått at en positiv kontroll for hvilken fenotype og / eller ekspresjon enkelt visualisert (for eksempel ved å dissekere mikroskopi) og / eller kvantifiseres [f.eks kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR), Western blot] skal benyttes når man lærer denne teknikken. SRPN2 protein og transkripsjon kvantifisering via Western blot og QRT-PCR, henholdsvis, er beskrevet i Michel et al. (2005) 21.

Representative Results

Pupal injeksjon for genet KD gir optimale resultater når injeksjonen er utført i løpet av den tidlige pupal scenen, da skjel tanning nivået er lavt (figur 1A, venstre, og 1B). Økt soling og herding av skjellaget, vanligvis etter 24 timer, gir økt pupal død etter injeksjon (figur 1A, midtre og høyre). Satsen for pupal utvikling kan variere avhengig av insectary forhold og dyretetthet 24,25; Derfor er det best å vurdere pigmentering visuelt.

Under innsprøytningsprosessen blir kapillær nålen settes inn i dorsal neglebåndet i en vinkel på omtrent 30 ° i den fremre til bakre retning (figur 2A). Når nålen er satt inn, og dsRNA + 0,01% (w / v) FGD dispenseres, er fordelingen av fargestoffet tydelig gjennom den hemolymfe (Figure 2B).

Vurdering av voksen veksten for puppe injisert med 0,01% (w / v) FGD viste en gjennomsnittlig rente på 70% veksten, sammenlignet med 96,7% veksten av ikke-injiserte kontroller (figur 3A). Av notatet, ble delvis veksten fra pupal tilfelle observert for et stort antall ikke-overlevende mygg (Figur 3B). Støpt dyr utviser ingen forsinkelser i fremveksten tid (figur 4A) eller partisk innvirkning på begge kjønn (figur 4B). Ytterligere vurdering av voksenoverlevelse gjennomført opp til dag 10 etter fremveksten viser ingen tydelig effekt på etterveksten voksenoverlevelse (Figur 4C).

Validering av KD kvalitet ble vurdert av melanotisk pseudo-tumor (mørkt pigmentert vev cluster) fenotype forbundet med SRPN2 knockdown 21,22 som en positiv kontroll for knockdown og Fraværet av fenotypene assosiert med dsLacZ injeksjon som en negativ kontroll. Voksen mygg som fremkom ble scoret på dag 8 etter injeksjon (dag 6-7 etter fremveksten). Melanotiske pseudo-svulster (figur 5A og 5B) ble observert gjennom hårstråene av 93,5% av dsSRPN2 vs. 0% av dsLacZ voksen mygg (Figur 6A). Klynger av mørkt melanized vev ble identifisert ved disseksjon av pigmenterte flekker (figur 5C). Pseudo-svulster var synlig på den voksne skjellaget så tidlig som dag 3 post-veksten og var også til stede i en undergruppe av dsSRPN2 hemolymph og gut vev (data ikke vist). På 5 etter injeksjon (tidlig voksen scenen), betydelig redusert SRPN2 nivåer i dsSRPN2, men ikke dsLacZ eller ikke-injisert hemolymph protein isolater ble observert (Figur 6B).

ftp_upload / 53738 / 53738fig1.jpg "/>
Figur 1: Developmental staging for pupal dsRNA injeksjon Tidlig pupal injeksjon av dsrna resulterer i optimal overlevelse og progresjon til voksne stadiet.. Lave nivåer av skjellaget pigmentering (A, venstre, og B) kan observeres i løpet av første 0-24 timer etter pupation. Tanning av pupal skjellaget foregående injeksjon (A, senter og høyre) resulterer i moderat til dårlig overlevelse.

Figur 2
Fig. 2: Injeksjon stilling og fordeling av farvestoff-merket dsRNA (A) Capillary nål injeksjon av fargestoff-merket dsRNA inn i den dorsale neglebåndet i en vinkel på omtrent 30 °, i fremre til bakre retning. (B) Fargestoffet er synlig fordelt i pupal hemolymph. dsRNA injeksjonsvolum på 138 nl, merket med 0,01% FGD (w / v).

Figur 3
Fig. 3: Post-injeksjon voksen veksten (A) 70% av puppe injisert med 0,01% FGD (vekt / volum) med hell fremkom (n = 60), sammenlignet med 96,7% av ikke-injiserte kontroller (n = 60). Tre biologiske replikater ble utført. Ble observert (B) Delvis veksten fra pupal sak for et stort antall ikke-overlevende mygg. Feilfelt representerer standardfeil for gjennomsnittet (SEM).

Figur 4
Figur 4: Emergence rente, sex vurdering og voksenoverlevelse (A) Sammenlignveksten ganger ble observert etter pupal injeksjon med 0,01% FGD (24 hr = 80% og 48 timer = 20%), sammenlignet med ikke-injisert puppe (24. time = 83% og 48 t = 17%). (B (C) Survival analyse viser at injeksjon med 0,01% FGD ikke påvirker voksenoverlevelse, vurdert opp til dag 10 etter fremveksten. Resultatene representerer data fra tre uavhengige eksperimenter med 0,01% FGD injisert (n = 60) og ikke-injisert (n = 60) puppe (likt antall menn og kvinner). Feilfelt representerer standardfeil for gjennomsnittet (SEM).

Figur 5
Figur 5: Pseudo-tumor positiv kontroll fenotype reflekterer vellykket knockdown pseudo-svulster ble observert på (A) mage- og (B) thorax cuticle av dsSRPN2 -injected, men ikke dsLacZ -injected voksen mygg på dag 8 etter injeksjonen..(C) Høyere forstørrelse (400X) imaging (a) i skjellaget og disseksjon av pigmenterte flekker (b) viser klynger av mørk melanized celler.

Figur 6
Figur 6: Kvantifisering av pseudo-tumordannelse og redusert SRPN2 proteinnivåer (A) pupal scenen injeksjoner resultere i pseudo-tumordannelse i 93,5% av dsSRPN2 voksne (n = 21) sammenlignet med 0% av dsLacZ kontroller (n = 19). . Resultater oppnådd dag 8 etter injeksjonen. (B) Western blot (til venstre) viser redusert SRPN2 nivåer i dsSRPN2, men ikke dsLacZ eller ikke-injisert hemolymph protein isolater (dag 5 etter injeksjon). Resultater basert på tre uavhengige forsøk. Anti-SRPN2 21 og anti-SRPN3 26 antistoff fortynninger som ble brukt var 1: 1000 og 1: 2000, henholdsvis. Geit-anti-raBBIT IgG-HRP (Product sc-2004, Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX) ble brukt på 1: 5000. Alle proteinnivåer ble kvantifisert (til høyre) med bandet intensitet (ImageJ programvare, NIH, Bethesda, MD), normalisert til SRPN3, og statistisk sammenliknet med uparet t-test. P <0,05: *, P ≥0.05: ns (ikke signifikant). Feilfelt representerer standardfeil for gjennomsnittet (SEM).

Discussion

Aktuelle metoder for å fremkalle ikke-transgen RNAi i mygg involverer direkte injeksjon av dsRNA inn i voksen hemocoel 12,13 eller larve fôring av RNAi utløse belagt nanopartikler 14-17 eller mikroalger baserte dsRNA molekyler 18. Targeting den voksne mygg, mens svært verdifull, kan ekskludere et stort antall gener som fungerer under tidligere utviklingsperioder. Knockdown initiert av larvene kan gi inkonsistente fenotyper i løpet av voksenstadiet skyldes delvis, til potensialet av variabel protein persistens gjennom pupal trinnet. Derfor er innføring av en ytterligere metode som er rettet spesielt mot initiering av RNAi i løpet av pupal utvikling vil gi et middel for å vurdere mer fullstendig genfunksjoner i løpet av pre-voksen utviklingsstadier, så vel som forbedrede evner til å vurdere genfunksjon i løpet av adulte stadier. Som med genet knockdown tilnærming basert på dsRNA injeksjon eller uttrykk, utholdenhet av genet knockdownkan ikke forutsies. Derfor bør transkripsjons eller proteinnivå vurderes for genet av interesse under utviklings perioder av interesse. Selv om vi ser en fortsettelse av redusert proteinnivå på dag 5 etter injeksjon for SRPN2 i SRPN2 dsRNA-injiserte dyr, kan faktorer som protein omsetning og halveringstid variere for ulike mål. Det er viktig å sikre, så vel som den dsRNA som skal brukes for injeksjon er godt konsentrert og vises intakt på en agarosegel. Vi anbefaler forskere revurdere disse faktorene hvis knockdown resultatene ikke er tilstrekkelige, og respektive konsentrasjoner av dsRNA kan trenge å bli testet empirisk for spesifikke genet mål.

Vi beskriver en fremgangsmåte for initiering av RNA-interferens under pupal fasen av An. gambiae utvikling. Denne metoden er avhengig av innføring via mikroinjeksjon av dsRNA direkte inn i hemocoel av tidlig puppe og gjør det mulig for vurdering av kvaliteten av injeksjonsbruk av dye-merket dsRNA. Evnen til å visualisere injeksjons kvalitet utgjør en viktig forbedring for å sikre vellykket knockdown og utgjør et aspekt av sprøytebasert genet knockdown som ikke har blitt vurdert i de tidligere rapporterte dsRNA-baserte protokoller som fokuserer på det voksne stadium. Ved å målrette puppe ved utbruddet av denne utviklingsperioden, gener som kan spille en rolle i denne kritiske utviklings intervall, eller i den tidlige fasen av voksenlivet kan evalueres funksjonelt. I tillegg kan denne metoden gi dsRNA levering til cellene, og etablering av RNA interferens i celler som er tilgjengelig under metamorfosen, men mindre tilgjengelig i fullt dannet voksne mygg.

En fersk microarray analyse av Harker et al. (2012) identifiserte 560 An. gambiae transkripsjoner som ble oppregulert eller nedregulert med minst fire ganger i løpet av forskjellige utviklingsstadier, alt fra embryo til voksen. Av de 560 transkripsjoner identifisert, et sett av 309 ble oppregulert i løpet pupal utvikling 27. Disse funnene tyder på at det er mange krav til differensial genuttrykk gjennom mygg utvikling, inkludert de som oppstår under pupal scenen, et intervall der organismen gjennomgår metamorfose. I mange insektarter, inkludert An. gambiae, gener som er involvert i prosesser såsom utvikling (dvs. pupal cuticular og chitin-bindende proteiner) 27-31 og immunrespons (dvs., Toll-reseptor-lignende proteiner) 27,32-34 er sterkt uttrykt i løpet av pupal trinnet. Når en fullt dannet voksen har dukket opp, er det fremsatte genekspresjon i respons på miljø- og fysiologiske endringer 35. Spesielt, under tidlig voksen utvikling, er det en økning i ekspresjonen av utviklings gener (dvs. voksen cuticular og sarkoplasmatiske proteiner) 36, så vel som andre nøkkelgener (dvs. 27,36.

Den positive kontrollen som brukes i utviklingen av denne protokollen, SRPN2, er en An. gambiae serin protease inhibitor (Serpin). SRPN2 spiller en viktig rolle i den negative regulering av insekt melanization, et bredspektret medfødte immunrespons hos insekter 21,22. Knockdown av SRPN2 hos voksne mygg resulterer i pseudo-tumordannelsen 21,22, en fenotype som er lett observeres ved anvendelse av lysmikroskopi. Gitt at dette distinkt fenotype kan enkelt scoret i levende insekter, brukte vi SRPN2 for første pupal scenen RNAi injeksjoner. I tillegg er SRPN2 uttrykkes i alle utviklingsstadier 37, for derved å tilveiebringe et godt mål for pupal scenen RNAi injeksjon og vurdering av funksjon i tidlig voksen. Vi viser at metoden vi har utviklet er i stand til å fremkalle lignende voksen melanotisk pseud o-svulstdannelse som en følge av dsrna injeksjoner utføres i løpet av pupal utviklingstrinn. I utviklingen av denne protokollen, har vi observert at injeksjon under tidlig pupal utvikling (dvs. de første 24 timer etter larve-pupal molt) er kritisk for å oppnå optimal voksen veksten. I tilfelle dårlig veksten oppnås etter injeksjon, anbefaler vi avholder larver med større nøyaktighet, for å få puppe med mindre omfattende cuticle herding og sikre tidlig pupal scenen injeksjon oppnås. Videre minimere skader på skjel resulterer i optimal veksten priser og økende forstørrelse under injeksjon kan bidra til å sikre at bare den tiltenkte område av dyret er punktert. Hvis nålen skulle punktere gjennom til ventral skjellaget, vil kontinuitets dye-merket væske være tydelig på utsiden av puppe eller vil mette filterpapiret. Det er sterkt anbefalt å forkaste ethvert puppe som har mer enn en cuticle punktering.

jove_content "> Med de omfattende erfaringer fra mange laboratorier med utførelsen av voksne mygg injeksjoner, kan tidligere identifiserte mikroinjeksjon tilnærminger tilpasses med enkle protokoll modifikasjoner for bruk i pupal RNAi eksperimenter. Samlet er målet med denne metoden er å gi forskerne muligheten til å utvide tidsrammen der reversere genetiske analyser kan utføres, videre slik at forskning som vil støtte utviklingen av nye vektor kontroll strategier. Interessant, eksperimenter i andre arter, som for eksempel Rhodnius prolixus og Spodopterafrugiperda, avslører at genet Slå effekter pleier å være mye større når initiert under pre-adulte stadier 38,39. i alle stadier av utviklingen, er underlagt hensynet til hurtighet og utholdenhet av genet stanse, og stabiliteten av proteiner kodet av målrettede gener RNAi-mediert genet knockdown. det ideelle RNAi mål gener som har en tendens til å være de som koder for et Proteinkonn eller RNA som har en kort halveringstid og høy omløpshastighet 11,40.

Mens transgene RNAi strategier kan også anvendes for å ivareta hensynet vedrørende hurtighet og varighet av RNAi i løpet av pre-adulte stadier, transgene teknikker har mange ulemper (f.eks tid som er nødvendig for generering av transgene linjer, eksperimentelle tidsrammer for myggparringer for å generere insekter med regulert dsRNA uttrykk, og vedlikehold av transgene aksjer). Derimot, gir vår protokoll en enklere og raskere metode for å initiere genet knockdown under pupal utvikling og i celletyper som kommer og er tilgjengelig under metamorfosen, men er mindre tilgjengelig hos voksne. Bruken av fargemerkede dsrna suspensjoner gir enkel vurdering av injeksjon suksess og spredning av introduserte materialet innen puppe. Våre data om inntreden av tumordannelse i pupal-injisert voksne, sammenlignet med dyr injisert som voksne, er konsistent med initiation av RNAi-mediert knockdown under pupal scenen. Ved hjelp av vår G3 mygg linjen og under våre insectary forhold, vi observerer den voksne melanotisk pseudo-svulstdannelse så tidlig som 10 dager etter injeksjon av voksne injisert tre til fem dager etter fremveksten. Ved å utføre tidlig pupal-trinns, observerer vi synlig melanotisk pseudo-svulstdannelse så tidlig som fem dager etter injeksjon (dvs. tre til fire dager etter fremveksten). Disse data antyder at denne fremgangsmåte gjør det mulig for initiering av genet knockdown i løpet av en på forhånd under-studert utviklingsperioden (dvs. pupal utvikling). Vår fargestoff merking Fremgangsmåten kan også vise seg å være nyttige for utvikling av nye larve injeksjons protokoller, på grunn av den gjennomskinnelige karakter av hårstråene under alle larver instars. Mens kontrollgruppen brukt i denne studien krever progresjon inn i voksne stadiet for å vise en knockdown fenotype, for fremtidige eksperimenter vurdere pupal stadium-spesifikke fenotyper etter injeksjon av tidlig puppe vil giverdifull innsikt om utvidelse av denne metoden i flere utviklingsperioder som sen pupal utvikling. Oppsummert gir denne metoden en verdifull RNAi protokoll for pupal scenen initiering av RNAi-mediert genet knockdown og utvider funksjonell genomikk verktøyene som er tilgjengelige for bruk i vektor insekt forskningsmiljø.

Disclosures

Open Access for denne video-artikkelen er betalt av Biogen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MEGAscript RNAi kit Ambion AM1626
Nanoject II injector Drummond 3-000-204
Nanoject II foot switch Drummond 3-000-026
Borosilicate glass capillaries Drummond 3-000-203-G/X
Glass micropipette puller Narishigne PB-7
Fast Green FCF dye Sigma F7258 Can substitute with a non-toxic food dye.
Plastic transfer pipettes Thermo Scientific 1371150 ¼ inch cut from tip to create a wider opening.
Whatman “thin” filter paper  GE Healthcare 1001-090 This is 9 cm diameter Grade 1, but can be altered depending on size of injection pad.
Western blot “thick” filter paper BioRad 107-3931 This is the filter paper generally used for Western blots.
Petri dishes (60 mm x 15 mm) Fisher Scientific FB0875713A
Paint brush (size 0) Michael’s Art 10474940 Brush size and brand can vary based on availability and user preference.
Dissecting light microscope  ----  ----- This can vary based on availability and user preference.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. World Malaria Report. , Available from: http://www.who.int/topics/malaria/en (2014).
  2. Kelly-Hope, L. A., McKenzie, F. E. The multiplicity of malaria transmission: a review of entomological inoculation rate measurements and methods across sub-Saharan Africa. Malar. J. 8 (1), 1-16 (2009).
  3. The malERA Consultative Group on Vector Control. A Research Agenda for Malaria Eradication: Vector Control. PLoS Med. 8 (1), e1000401 (2011).
  4. Enyati, A., Hemmingway, J. Malaria Management: Past, Present, and Future. Annu. Rev. of Entomol. 55 (1), 569-591 (2010).
  5. Edi, C. V., et al. CYP6 P450 Enzymes and ACE-1 Duplication Produce Extreme and Multiple Insecticide Resistance in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae. PLoS Genet. 10 (3), 1004236 (2014).
  6. Mitchell, S. N., et al. Metabolic and Target-Site Mechanisms Combine to Confer Strong DDT Resistance in Anopheles gambiae. PLoS ONE. 9 (3), e92662 (2014).
  7. Knox, T. B., et al. An online tool for mapping insecticide resistance in major Anopheles vectors of human malaria parasites and review of resistance status for the Afrotropical region. Parasite Vector. 7 (76), 1-14 (2014).
  8. Napoli, C., Lemieux, C., Jorgensen, R. Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes. Plant Cell. 2, 279-289 (2002).
  9. Sen, G. L., Blau, H. M. A brief history of RNAi: the silence of the genes. FASEB J. 20 (9), 1293-1299 (2006).
  10. Romano, N., Macino, G. Quelling: transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences. Mol. Microbiol. 6 (22), 3343-3353 (1992).
  11. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  12. Catteruccia, F., Levashina, E. A. RNAi in the Malaria Vector, Anopheles gambiae: Therapeutic Applications of RNAi: Methods and Protocols. Methods Mol. Biol. 555, 63-75 (2009).
  13. Garver, L., Dimopoulos, G. Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A). gambiae). J. Vis. Exp. (5), e230 (2007).
  14. Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti. BMC Dev. Biol. 14 (9), 1-16 (2014).
  15. Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Disruption of Aedes aegypti Olfactory System Development through Chitosan/siRNA Nanoparticle Targeting of semaphorin-1a. PLoS Negl. Trop. Dis. 7 (5), (2013).
  16. Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect Mol. Biol. 19 (5), 683-693 (2010).
  17. Zhang, X., et al. Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae. J. Vis. Exp. (97), e52523 (2015).
  18. Kumar, A., Wang, S., Ou, R., Samrakandi, M., Beerntsen, B. T., Sayre, R. T. Development of an RNAi based microalgal larvicide to control mosquitoes. Malaria World J. 4 (6), 1-7 (2013).
  19. Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: A review. J. Insect Physiol. 56 (3), 227-235 (2010).
  20. Burand, J. P., Hunter, W. B. RNAi: Future in insect management. J. Invertebr. Pathol. 112, S68-S74 (2013).
  21. Michel, K., Budd, A., Pinto, S., Gibson, T. J., Kafatos, F. C. Anopheles gambiae SRPN2 facilitates midgut invasion by the malaria parasite Plasmodium berghei. EMBO Rep. 6 (9), 891-897 (2005).
  22. An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes. Cell Mol. Life Sci. 68 (11), 1929-1939 (2011).
  23. Horn, T., Boutros, M. E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update. Nucleic Acids Res. 38, W332-W339 (2010).
  24. Benedict, M. Q. Methods in Anopheles Research. , Malaria Research and Reference Reagent Resource Center. (2014).
  25. Lyimo, E. O., Takken, W., Koella, J. C. Effect of rearing temperature and larval density on larval survival, age at pupation and adult size of Anopheles gambiae. Entomol. Exp. Appl. 63, 265-271 (1992).
  26. Michel, K., et al. Increased melanizing activity in Anopheles gambiae does not affect development of Plasmodium falciparum. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (45), 16858-16863 (2006).
  27. Harker, B. W., et al. Transcription Profiling Associated With Life Cycle of Anopheles gambiae. J Med Entomol. 49 (2), 316-325 (2012).
  28. Dotson, E. M., Cornel, A. J., Willis, J. H., Collins, F. H. A family of pupal-specific cuticular protein genes in the mosquito Anopheles gambiae. Insect Biochem. Molec. Biol. 28, 459-472 (1998).
  29. Hopkins, T. L., Krchma, L. J., Ahmad, S. A., Kramer, K. J. Pupal cuticle proteins of Manduca sexta: characterization and profiles during sclerotization. Insect Biochem. Molec. Biol. 30, 19-27 (1999).
  30. Liang, J., Zhang, L., Xiang, Z., He, N. Expression profile of cuticular genes of silkworm, Bombyx mori. BMC Genomics. 11 (173), 1-13 (2010).
  31. Zhou, X., Riddiford, L. M. Broad specifies pupal development and mediates the "status quo" action of juvenile hormone on the pupal-adult transformation in Drosophila and Manduca. Development. 129, 2259-2269 (2002).
  32. Luna, C., Wang, X., Huang, Y., Zhang, J., Zheng, L. Characterization of four Toll related genes during development and immune responses in Anopheles gambiae. Insect Biochem. Molec. Biol. 32, 1171-1179 (2002).
  33. Tauszig, S., Jouanguy, E., Hoffmann, J. A., Imler, J. -L. Toll-related receptors and the control of antimicrobial peptide expression in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (19), 10520-10525 (2000).
  34. Tryselius, Y., Samakovlis, C., Kimbrell, D. A., Hultmark, D. CecC, a cecropin gene expressed during metamorphosis in Drosophila pupae. Eur. J. Biochem. 204, 1-5 (1992).
  35. Goodisman, M. A. D., Isoe, J., Wheeler, D. E., Wells, M. A. Evolution of Insect Metamorphosis: a Microarray-Based Study of Larval and Adult Gene Expression in the Ant Camponotus Festinatus. Evolution. 59 (4), 858-870 (2005).
  36. Cook, P. E., Sinkins, S. P. Transcriptional profiling of Anopheles gambiae mosquitoes for adult age estimation. Insect Mol. Bio. 19 (6), 745-751 (2010).
  37. Suwanchaichinda, C., Kanost, M. R. The serpin gene family in Anopheles gambiae. Gene. 442 (1-2), 47-54 (2009).
  38. Araujo, R. N., et al. RNA interference of the salivary gland nitrophorin 2 in the triatomine bug Rhodnius prolixus (Hemiptera: Reduviidae) by dsRNA ingestion or injection. Insect Biochem. Molec. Biol. 36 (9), 683-693 (2006).
  39. Griebler, M., Westerlund, S. A., Hoffmann, K. H., Meyering-Vos, M. RNA interference with the allatoregulating neuropeptide genes from the fall armyworm Spodoptera frugiperda and its effects on the JH titer in the hemolymph. J. Insect Physiol. 54 (6), 997-1007 (2008).
  40. Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J. Insect Physiol. 59 (12), 1212-1221 (2013).

Tags

Infeksjon Mosquito puppe malaria gambiae vektor injeksjon dsRNA RNA interferens RNAi revers genetikk funksjonell genomikk
RNAi Trigger Levering inn<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; puppe
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Regna, K., Harrison, R. M., Heyse,… More

Regna, K., Harrison, R. M., Heyse, S. A., Chiles, T. C., Michel, K., Muskavitch, M. A. T. RNAi Trigger Delivery into Anopheles gambiae Pupae. J. Vis. Exp. (109), e53738, doi:10.3791/53738 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter