RNA interference (RNAi) is an extremely valuable tool for uncovering gene function. However, the ability to target genes using RNAi during pre-adult stages is limited in the major human malaria vector Anopheles gambiae. We describe an RNAi protocol to reduce gene function via direct injection during pupal development.
RNA interference (RNAi), a naturally occurring phenomenon in eukaryotic organisms, is an extremely valuable tool that can be utilized in the laboratory for functional genomic studies. The ability to knockdown individual genes selectively via this reverse genetic technique has allowed many researchers to rapidly uncover the biological roles of numerous genes within many organisms, by evaluation of loss-of-function phenotypes. In the major human malaria vector Anopheles gambiae, the predominant method used to reduce the function of targeted genes involves injection of double-stranded (dsRNA) into the hemocoel of the adult mosquito. While this method has been successful, gene knockdown in adults excludes the functional assessment of genes that are expressed and potentially play roles during pre-adult stages, as well as genes that are expressed in limited numbers of cells in adult mosquitoes. We describe a method for the injection of Serine Protease Inhibitor 2 (SRPN2) dsRNA during the early pupal stage and validate SRPN2 protein knockdown by observing decreased target protein levels and the formation of melanotic pseudo-tumors in SRPN2 knockdown adult mosquitoes. This evident phenotype has been described previously for adult stage knockdown of SRPN2 function, and we have recapitulated this adult phenotype by SRPN2 knockdown initiated during pupal development. When used in conjunction with a dye-labeled dsRNA solution, this technique enables easy visualization by simple light microscopy of injection quality and distribution of dsRNA in the hemocoel.
La malaria es una enfermedad infecciosa transmitida por mosquitos que afecta a muchos millones de personas cada año. La Organización Mundial de la Salud (OMS) informa que en 2013 había aproximadamente 584.000 muertes debidas a la malaria, el 78 por ciento de los cuales ocurrieron en niños menores de cinco años 1. Los patógenos que causan la malaria humana son parásitos apicomplejos dentro del género Plasmodium y se transmiten entre sus huéspedes humanos por los mosquitos Anopheles hembra. La transmisión se produce cuando el mosquito ingiere sangre de un individuo que está infectado, y luego los depósitos parásitos infecciosos en un individuo no infectado en una comida de sangre posterior. Dentro del género Anopheles, Anopheles gambiae es la especie de mayor capacidad vectorial y es el vector de la malaria más prominente en el África subsahariana 1-3.
Actualmente, mosquito vector de control por el despliegue de insecticidas continúa a be el principal método empleado para reducir la carga de la malaria humana. Aunque el uso de insecticidas desde 1960 ha demostrado ser un gran éxito, el aumento de la resistencia a los insecticidas ha conducido una necesidad para el desarrollo de nuevos insecticidas y estrategias de control de vectores alternativa 4-7. Durante el año 2010, un total de 49 de los 63 países que comunicaron a la OMS indica la aparición de resistencia a los insecticidas en los vectores de la malaria 1. Además, la herramienta IR Mapper, que utiliza la literatura revisada por expertos para evaluar los datos de resistencia en las regiones de África tropical, informa que entre 2001 y 2012 hubo 46% y el 27% aumento de la resistencia a los piretroides y diclorodifeniltricloroetano (DDT), respectivamente 7.
La interferencia de ARN (RNAi) fue identificado en la década de 1990 como una técnica que se podrían emplear para inactivar genes en la planta Petunia 8,9 y en el hongo Neurospora crassa 9,10. Poco después,en 1998, el ARNi se documentó por primera vez en Caenorhabditis elegans como un medio de reducir la expresión génica en un modelo animal mediante la introducción de antisentido o ARN de doble cadena (dsRNA) a través de inyección o métodos de alimentación 9,11. Desde su descubrimiento, el ARNi ha revolucionado la búsqueda de la genómica funcional, permitiendo a los investigadores utilizan la genética inversa para investigar rápidamente el papel funcional de los genes de interés a través de un mecanismo de silenciamiento génico post-transcripcional altamente selectiva. En algunos organismos, tales como Drosophila melanogaster, el uso de los organismos transgénicos que expresan constructos de ARN de interferencia ha sido ampliamente exitosa para gen desmontables (KD). Aunque el uso de transgenes en An. gambiae de ARNi se ha utilizado y puede resultar útil para pantallas de gran escala, la generación de cepas de mosquitos transgénicos es tanto trabajo y tiempo intensivo, generalmente toman de dos a tres meses para pasar de la identificación de un gen de interés para los Generatien planta de un almacén transgénica apropiada 12. Actualmente, el método primario de KD gen en An. gambiae es por inyección en la hemolinfa, durante la etapa de adulto, de dsRNA específico para un gen dado 12,13. Este proceso generalmente tarda aproximadamente un mes para ir desde la identificación de un gen de interés a la evaluación de KD gen, demostrando ser mucho más rápida que los métodos transgénicos 12. Los métodos para larvas en etapa de ARNi se han establecido recientemente en una. ARN de doble cadena a base de microalgas gambiae y Aedes aegypti a través de la alimentación de nanopartículas 14-17 o mediante la administración oral de moléculas 18, ofreciendo oportunidades para llevar a cabo el análisis genómico funcional durante las primeras etapas de desarrollo. En la inyección directa, la alimentación, y los métodos de liberación de nanopartículas, dsRNA se recoge de forma autónoma por la célula diana y se escinde por la enzima Dicer en 21-25 nucleótidos de longitud "corto de interferencia ARN" (siRNAs) 19,20. Estos siRNAs son entonces incorado en el ARN inducida por silenciar complejo (RISC), de la que se descartará una hebra, permitiendo que el complejo RISC ARN unido para unirse y escindir el ARNm objetivo y por lo tanto reducir su nivel e inhiben su traducción 19,20.
Muchas de las características intrínsecas de la biología básica de mosquitos modulan la capacidad vectorial, incluyendo la preferencia de acogida (por ejemplo, el olfato, gustation), el apareamiento, la reproducción y la inmunidad. Dada la importancia de estos procesos biológicos, es probable que su modulación a nivel genético o farmacológico ofrecerá nuevas oportunidades para el control de vectores, incluyendo la elusión de resistencia a los insecticidas, y proporcionar nuevas herramientas para enfoques más ampliamente integrados para el manejo de vectores. El uso de la genómica funcional para evaluar las funciones de los genes que subyacen a estas características biológicas intrínsecas permitirá la identificación de nuevas dianas y proporcionar nuevos conocimientos sobre cómo podemos crear efectivamente nuevos, strateg control más efectivoIES. Se describe el desarrollo y el uso de un método de inyección rápida para iniciar RNAi durante la fase de pupa de An. gambiae. Observamos que la inyección estado de pupa de un disparador de ARNi permite la observación de los fenotipos resultantes en adultos en fase inicial, es decir, cuanto antes después de la emergencia de lo que se observaría si gen desmontables se iniciaron en adultos después del brote. Este método permite gen desmontables que comienza durante el intervalo del desarrollo de pupa y que se extiende en etapas adultas, tales principios adultos tipos de células de la hemolinfa de ruedas que desmontables gen iniciado durante el desarrollo pupal puede persistir y afectar, así como los tipos de células que son más hemolinfa de ruedas durante la metamorfosis que en el adulto, como las neuronas sensoriales que se encuentran en apéndices adultos siguientes emergencia.
Los métodos actuales para inducir el ARNi no transgénico en los mosquitos implican la inyección directa de ARN de doble cadena en el hemocoel adulto 12,13 o alimentación de las larvas de RNAi nanopartículas recubiertas de activación 14-17 o ARN de doble cadena a base de microalgas moléculas 18. Apuntando al mosquito adulto, aunque es extremadamente valiosa, puede excluir a un gran número de genes que funcionan durante los períodos anteriores del desarrollo. Caída iniciada por alimentación de las larvas puede producir fenotipos inconsistentes durante la etapa adulta, debido, en parte, a la posibilidad de la persistencia de proteínas a través de la variable de estado de pupa. Por lo tanto, se introduce un método adicional que se dirige específicamente a iniciar RNAi durante el desarrollo de pupa proporcionará un medio para evaluar más a fondo las funciones de genes durante las etapas de desarrollo pre-adultos, así como capacidades mejoradas para evaluar la función génica durante la etapa adulta. Como con enfoque de genes desmontables basado en la inyección de dsRNA o expresión, la persistencia del gen desmontablesno se puede predecir. Por lo tanto, los niveles de transcripción o proteínas deben ser evaluados para el gen de interés durante períodos de desarrollo de interés. Aunque se observa una continuación de la disminución de los niveles de proteína en el día 5 después de la inyección para SRPN2 en los animales inyectados con ARN de doble cadena SRPN2, factores como el recambio de proteínas y la vida media pueden ser diferentes para diferentes objetivos. Es fundamental para garantizar, además, que el ARN de doble cadena que se utilizará para la inyección es bien concentrado y parece intacto en un gel de agarosa. Recomendamos experimentadores reevaluar estos factores si los resultados no son suficientes desmontables, y pueden necesitar ser probado empíricamente para objetivos de genes específicos respectivas concentraciones de ARN de doble cadena.
Se describe un método para la iniciación de la interferencia de ARN durante la fase de pupa de An. desarrollo gambiae. Este método se basa en la introducción a través de microinyección de dsRNA directamente en el hemocoel de pupas temprano y permite la evaluación de la calidad de la inyección por elutilizar de dsRNA marcado con colorante. La capacidad de visualizar la calidad de inyección constituye una mejora fundamental para garantizar knockdown éxito y constituye un aspecto de la caída génica basada en la inyección que no se ha considerado en los protocolos basados en dsRNA más informes anteriores se centran en la etapa adulta. Al dirigirse a la pupa en el inicio de este periodo de desarrollo, los genes que podrían desempeñar un papel durante este intervalo crítico del desarrollo, o durante las primeras etapas de la edad adulta se puede evaluar funcionalmente. Además, este método puede permitir la entrega dsRNA a las células, y el establecimiento de la interferencia de ARN en las células que son accesibles durante la metamorfosis, pero menos accesibles en mosquitos adultos completamente formados.
Un análisis de microarrays reciente de Harker et al. (2012) identificó 560 An. gambiae transcripciones que fueron hasta reguladas o hacia abajo-regulados por al menos 4 veces durante las etapas de desarrollo distintas, que van desde el embrión a adulto. De los 560 transcripciones identificado, un conjunto de 309 fue hasta reguladas durante el desarrollo de pupa 27. Estos hallazgos sugieren que hay muchos requisitos para la expresión diferencial de genes en todo el desarrollo de mosquitos, incluyendo aquellos que se producen durante la fase de pupa, un intervalo durante el cual el organismo sufre metamorfosis. En muchas especies de insectos, incluyendo An. gambiae, genes implicados en procesos tales como el desarrollo (es decir, cuticular de pupa y proteínas de unión a quitina) 27-31 y la respuesta inmune (es decir, las proteínas similares al receptor de tipo Toll) 27,32-34 son altamente expresado durante la fase de pupa. Una vez que ha surgido un adulto completamente formado, no se continúa la expresión génica en respuesta a ambiental y fisiológica cambia 35. Cabe destacar que, durante el desarrollo adulta temprana, hay un aumento en la expresión de genes del desarrollo (es decir, cuticular de adultos y proteínas sarcoplásmicas) 36, así como otros genes clave (es decir, </em>, La proteína específica del esperma y del citocromo P450 enzimas del metabolismo) 27,36.
El control positivo utilizado en el desarrollo de este protocolo, SRPN2, es un An. gambiae inhibidor de serina proteasa (serpina). SRPN2 juega un papel importante en la regulación negativa de la melanización de insecto, una respuesta inmune innata amplio espectro en insectos 21,22. Desmontables de SRPN2 en mosquitos adultos en los resultados de la formación de pseudo-tumor 21,22, un fenotipo que se observa fácilmente mediante el uso de microscopía de luz. Dado que este fenotipo distinto puede ser fácilmente anotó en insectos vivos, se utilizó para las inyecciones SRPN2 fase de pupa RNAi iniciales. Además, SRPN2 se expresa durante todas las etapas de desarrollo 37, proporcionando de este modo un buen objetivo para la fase de pupa inyección RNAi y evaluación de la función a principios del adulto. Se demuestra que el método que hemos desarrollado es capaz de inducir pseud melanótica adulta similares la formación de o-tumor como consecuencia de las inyecciones de dsRNA realizadas durante la fase de pupa de desarrollo. En el desarrollo de este protocolo, hemos observado que la inyección durante el desarrollo temprano de pupa (es decir, las primeras 24 horas después de la muda larval-pupal) es fundamental para la obtención de emergencia de los adultos óptima. En el caso de que los pobres emergencia se obtiene después de la inyección, se recomienda la estadificación larvas con mayor precisión, para obtener pupas con menos extensa endurecimiento cutícula y asegurar la inyección se consigue fase de pupa temprano. Además, minimiza el daño a los resultados de la cutícula en tasas de emergencia óptimos y aumentando la ampliación durante la inyección puede ayudar a asegurar que sólo la región que el animal está pinchada. Si la aguja debe perforar a través de la cutícula ventral, puesta en común de líquido marcado con colorante será evidente en el exterior de la pupa o saturará el papel de filtro. Es muy recomendable para descartar cualquier pupas que tienen más de una punción de la cutícula.
jove_content "> Con las amplias experiencias de muchos laboratorios con el desempeño de las inyecciones de mosquitos adultos, los enfoques de microinyección previamente identificados se puede adaptar con modificaciones de protocolo sencillas para su uso en experimentos de RNAi pupa. En general, el objetivo de este método es proporcionar a los investigadores la capacidad de ampliar el período de tiempo durante el cual los análisis genéticos pueden llevar a cabo, lo que permite una mayor investigación que apoyará el desarrollo de nuevas estrategias de control de vectores inversa. Curiosamente, los experimentos en otras especies, como el Rhodnius prolixus, Spodoptera frugiperda, revelan que el gen efectos de silenciamiento tienden a ser mucho mayor cuando se inicia durante la pre-adulto etapas 38,39. durante todas las etapas de desarrollo, gen mediada por RNAi desmontables está sujeta a consideraciones relativas a la rapidez y la persistencia del silenciamiento de genes, y la estabilidad de las proteínas codificadas por los genes objetivo. el objetivo ideal RNAi los genes tienden a ser las que codifican una protein o ARN que tiene una vida media corta y elevada tasa de rotación 11,40.Aunque las estrategias de RNAi transgénicos también pueden ser empleados para tratar las consideraciones con respecto a la rapidez y la persistencia de la RNAi durante las etapas de pre-adultos, técnicas transgénicas tienen muchos inconvenientes (por ejemplo, tiempo requerido para la generación de líneas transgénicas, experimentales calendarios de apareamientos de mosquitos para generar insectos con la expresión de ARN de doble cadena regulada, y el mantenimiento de las poblaciones de transgénicos). Por el contrario, nuestro protocolo proporciona un método más fácil y más rápido para iniciar la precipitación génica durante el desarrollo de pupa y en tipos de células que se originan y que son accesibles durante la metamorfosis, pero son menos accesibles en los adultos. El uso de suspensiones de dsRNA marcados con colorante permite una fácil evaluación del éxito de la inyección y la dispersión del material introducido dentro de las pupas. Nuestros datos sobre la aparición de la formación de tumores en adultos de pupa inyectado, en comparación con los animales inyectados como adultos, es coherente con initiation de RNAi mediada desmontables durante la fase de pupa. El uso de nuestra línea G3 mosquitos y bajo nuestras condiciones de insectario, se observa la formación de pseudo-tumor melánico adulta a los 10 días después de la inyección de adultos inyectó tres a cinco días después del brote. Mediante la realización de la inyección temprana de pupa-etapa, se observa la formación de melanotic pseudo-tumor visible ya en cinco días después de la inyección (es decir, de tres a cuatro días después del brote). Estos datos implican que este método permite la iniciación de knockdown de genes durante un período de desarrollo anteriormente con-estudiado (es decir, el desarrollo de pupa). Nuestro método de etiquetado de tinte también puede resultar útil para el desarrollo de nuevos protocolos de inyección de larvas, debido a la naturaleza translúcida de la cutícula durante todos los estadios larvales. Mientras que el control utilizado en este estudio requiere progresión en la etapa adulta para mostrar un fenotipo desmontables, futuros experimentos para evaluar fenotipos pupa etapa específica después de la inyección de pupas temprano proporcionaráinformación valiosa con respecto a la expansión de este método en unos periodos de desarrollo adicionales, tales como el desarrollo de pupa tarde. En resumen, este método proporciona un protocolo de ARNi valiosa para la iniciación de la fase de pupa gen desmontables mediante RNAi y amplía las herramientas de genómica funcional para su uso dentro de la comunidad de investigación insecto vector.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Dr. Flaminia Catteruccia and her research group (Harvard School of Public Health, Boston, MA) for providing our laboratory with the G3 colony used in this research and for the LacZ template DNA. We thank Adam Jenkins (Boston College, Chestnut Hill, MA) for his assistance in maintaining the insectary. The Biology Department of Boston College generously funded the research associated with the development of this technique.
MEGAscript RNAi kit | Ambion | AM1626 | |
Nanoject II injector | Drummond | 3-000-204 | |
Nanoject II foot switch | Drummond | 3-000-026 | |
Borosilicate glass capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
Glass micropipette puller | Narishigne | PB-7 | |
Fast Green FCF dye | Sigma | F7258 | Can substitute with a non-toxic food dye. |
Plastic transfer pipettes | Thermo Scientific | 1371150 | ¼ inch cut from tip to create a wider opening. |
Whatman “thin” filter paper | GE Healthcare | 1001-090 | This is 9 cm diameter Grade 1, but can be altered depending on size of injection pad. |
Western blot “thick” filter paper | BioRad | 107-3931 | This is the filter paper generally used for Western blots. |
Petri dishes (60 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
Paint brush (size 0) | Michael’s Art | 10474940 | Brush size and brand can vary based on availability and user preference. |
Dissecting light microscope | —- | —– | This can vary based on availability and user preference. |