Summary
Опишем относительно простой метод экс виво живых изображений опухолевых клеток стромы взаимодействий внутри метастазов в легких, используя флуоресцентные репортеров у мышей. Используя спиннинг-диска конфокальной микроскопии, эта методика позволяет визуализировать живых клеток в течение по крайней мере 4 ч и могут быть адаптированы для изучения других воспалительных состояний легких.
Abstract
Метастазы являются основной причиной для рака, связанных с заболеваемостью и смертностью. Метастазы многоэтапный процесс, и из-за его сложности, точные клеточные и молекулярные процессы, которые регулируют метастатического распространения и роста по-прежнему не удается. Живая изображений позволяет визуализировать динамические и пространственные взаимодействия клеток и их микроокружения. Солидные опухоли обычно метастазируют в легкие. Тем не менее, анатомического расположения легких бросает вызов прижизненной визуализации. Этот протокол обеспечивает относительно простой и быстрый способ экс естественных живых изображений динамических взаимодействий между опухолевыми клетками и окружающей их стромы в метастазов в легких. С помощью этого метода, подвижность раковых клеток, а также взаимодействия между раковыми клетками и клетками стромы в их микросреде могут быть визуализированы в реальном времени в течение нескольких часов. При использовании трансгенных флуоресцентных мышей репортер, флуоресцентный клеточная линия, инъекционный флуоресцентную меткуМолекулы и / или антитела, множественные компоненты микросреды легких могут быть визуализированы, например, кровеносных сосудов и иммунных клеток. Чтобы создать образ различных типов клеток, был использован вращающийся диск конфокальной микроскопии, который позволяет долгосрочное непрерывное изображений с быстрым, четыре цвета захвата изображений. С интервальной фильмы собраны из изображений, собранных в течение нескольких позициях и фокальных плоскостях показать взаимодействие между живой метастатическим и иммунных клеток в течение по крайней мере 4 часа. Эта методика может быть дополнительно использован для тестирования химиотерапию или целевой терапии. Кроме того, этот метод может быть адаптирован для изучения других патологий легких, связанных которые могут повлиять на микросреду легких.
Protocol
Все процедуры, описанные должны быть выполнены в соответствии с действующими нормами и правилами по использованию позвоночных животных, в том числе предварительного одобрения со стороны местного Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUC).
1. Генерация метастазов в легких для Ex Vivo Живая съемка (Трансгенные или хвостовую вену для инъекций)
Примечание: метастазов в легких могут быть сгенерированы путем использования генной инженерии мышиные модели или путем внутривенной (IV) инъекции раковых клеток.
- Генерация легочные метастазы для визуализации путем скрещивания генетически измененных мышах опухоли в трансгенных репортера мыши, например, пересечь рак молочной железы мышиной модели мыши вируса опухоли молочной железы длинный концевой повтор полиома среднего Т-антиген (MMTV-PyMT) 11 в ACTB-ECFP мышиная модель 12.
Примечание: Модель ACTB-ECFP выражает усиливается голубой флуоресцентный белок (ECFP) под бета-актав промотора, такого, что все клетки светиться в голубом, канал CFP. Тем не менее, раковые клетки являются на сегодняшний день наиболее известных и появляются как основная часть ECFP-позитивных клеток под микроскопом. Мышиная модель MMTV-PyMT развивает прогрессирующее заболевание, при котором рост опухоли молочной железы, связанный с распространением раковых клеток к периферии, особенно в легкие. У мышей MMTV-PyMT на FvB / н фоне, микрометастазов может наблюдаться вокруг 10-11-недельного возраста. Как правило, это прогресс macrometastases на отметке 14-недельного возраста 13.
ИЛИ - Создать экспериментальные метастазы, используя первичные клетки или сингенных клеточных линий. Использование в пробирке манипулировать первичной опухолевых клеток или клеточных линий (например., Трансдукции) с последующей инъекцией 14 IV.
- Вкратце, в этом протоколе, придать зеленый флуоресцентный белок (GFP) -expressing (+) клеточную линию ВОМЖМ-PyMT в люминесцентных мышей репортер (ACTB-ECFP) или мышей дикого типа. Затем,визуализировать эти клетки, называемые VO-PyMT клеток 15, используя зеленый, GFP канала.
Примечание: Оригинальный клеточная линия В.О.-PyMT была определена на Вандербильта ортопедии в Нэшвилле, штат Теннесси. ВО означает Vanderbilt ортопедии. - После инъекции 10 6 клеток (в 200 мкл), наблюдается раковых клеток экстравазации немедленно и до нескольких часов после инъекции; наблюдать микрометастазов между 1-3 недель после инъекции и обнаружения macrometastases 3 недели после инъекции 15.
Примечание: Менее клетки могут быть введены, чтобы продлить время от инъекции рост метастазов.
- Вкратце, в этом протоколе, придать зеленый флуоресцентный белок (GFP) -expressing (+) клеточную линию ВОМЖМ-PyMT в люминесцентных мышей репортер (ACTB-ECFP) или мышей дикого типа. Затем,визуализировать эти клетки, называемые VO-PyMT клеток 15, используя зеленый, GFP канала.
2. Маркировка интересующих компонентов в метастатической микроокружения (трансгенных и / или инъекций)
Примечание: Маркировка может быть достигнуто путем трансгенных мышей и / или различными инъекций. Удостоверьтесь, чтобы использовать различные флуоресцентные цвета для маркировки различных типов клеток.
- Компоненты метку метастатическим микросреды с использованием трансгенных мышей. Замечательная ранее упомянутый модель опухоли мыши (например., ВОМЖМ-PyMT х ACTB-ECFP) в трансгенных мышах, в которых клетки стромы интересных помечены с помощью флуоресцентного белка, который не является ECFP., Например, гр-FMS-EGFP 4,16.
Примечание: В дополнение к визуализации раковых клеток в канале CFP, это позволяет визуализировать миелоидных клеток в канале GFP 4.
И / ИЛИ - Добавьте различные компоненты метастатическим микросреды с использованием инъекционных в трансгенных мышах флуоресцентный репортер или (нефлуоресцирующих) мышей дикого типа.
Примечание: Некоторые соединения могут быть введены для обозначения различных компонентов метастатического микросреды, например, AF647-конъюгированные Gr-1 антитело, используемого здесь, чтобы маркировать нейтрофилы и моноциты некоторые 13 и различные декстраны рные используемогомаркировать капилляры легких. Для подготовки этих инъекций смотрите шаг 4.
3. Подготовка материалов Перед Вскрытие
- 2% агарозном
- Взвесить 0,2 г агарозы и добавить до 10 мл 1 х PBS. Нагреть, чтобы растворить агарозы. Агарозном будет затвердевать при комнатной температуре, так поддерживать его в C водяной бане 37 ° С до использования для инфляции.
- CO 2 и регулятор температуры
- Проверьте DDh 2 O в влажную камеру. Пополнение в случае необходимости. Вставьте конфигурации пластину в температурном держателя этап пластины (климатическая камера). Включите контроллер СО 2 и СО 2 установлен на уровне 5%. Убедитесь, что расход воздуха устанавливается на уровне 0,4 л / мин.
- Откройте воздух и CO 2 клапанами. Включите контроллер температуры. Убедитесь, что температура климатической камере, и крышка установлены при 37 ° C.
- Отпустите давление воздуха на СО 2 метра. Проверьте CO 2 увеличивается, электроннойquilibration может занять до 30 минут.
- Вращающийся диск конфокальной микроскопии
Примечание: Подробная информация о микроскопа настройке были описаны ранее 4,17.- Включите лазеров (аргонового лазера для 488 нм возбуждения и твердотельный 405 нм, 561 нм и 640 нм лазеров). Включите микроскоп, камеры, блока управления диска прядении AOTF, блок управления лазером и контроллером камеры.
- Откройте микроскопа затвор, включите компьютер работает микроскоп и откройте программное обеспечение.
- Подготовка инструментов и рассечение платформы.
- Включите горячую борта стерилизатора и пусть он достигнет 250 ° C. Чистые 2 пары хирургических ножниц и щипцов с помощью воды и мыла. Стерилизация инструментов в течение по крайней мере 30 сек. Пусть инструменты остыть. Используйте полистирола крышку как рассечение платформы. Накройте его куском лаборатории Soaker.
4. Подготовка инъекций
Примечание: В зависимости от периода полураспада и предпочтительного ответ, вводят флуоресцентно меченных антител и / или флуоресцентных молекул либо непосредственно перед жертвоприношении или пару часов до нескольких дней раньше.
- Чтобы изображение Gr1-положительных нейтрофилов и моноцитов, подготовить шприц с 7 мкл фондовом AF647-конъюгированные Gr-1 антитела (1 мг / мл) в 100 мкл стерильного PBS под капотом. Поместите 27 G ½ иглу на шприц.
- Для изображения легочных капиллярах, подготовить вторую и третью шприц с 100 мкл либо 70 кДа родамина-сопряженных декстрана (4 мг / мл) или 10 кДа AF647-сопряженного декстрана (4 мг / мл). Поместите 27 G ½ иглу на шприцах.
- Вводят AF647-сопряженных раствора антител IV 5 часов перед удалением легких.
- Вводят один или оба декстран решения IV непосредственно до удаления легких.
5. Получение легких для Ex Vivo Живая съемка
Примечание: Старайтесь работать как стерильные и осторожно, насколько это возможно, чтобы избежать ненужных проблем иммунных клеток в легких.
- Вводят внутрибрюшинно мыши (IP) с летальным передозировки анестетика, разрешенной протоколом животных утвержденным IACUC., Например, 1 мл 2,5% Avertin. Подождите мыши, чтобы остановить дыхание и быть полностью нечувствительной к вредных раздражителей (заднюю лапу пинч).
Примечание: смещения шейных позвонков и эвтаназии диоксидом углерода следует избегать, поскольку это может негативно влиять на жизнеспособность клеток легких. - Остановите курсор мыши над рассечение борту и стерилизовать мышь с 70% этанола.
- Используйте хирургические ножницы, чтобы сначала сделать поперечную эпигастрии разрез через кожу, а затем аналогичным разреза через брюшину. Удерживая рассечение доска в вертикальном положении и сократить нисходящей аорты, так что пулы крови вниз в живот и не в грудной полости.
- Sпресечь небольшое отверстие в диафрагме, чтобы освободить вакуум. Сокращение вдоль 10-й и 12-го ребра, чтобы вырезать диафрагму и получить визуальный доступ к легким.
- Используйте хирургические ножницы, чтобы вырезать кожу до трахеи над грудной клетки, но оставить грудную клетку нетронутыми. Отделить кожу от грудной клетки. Expose трахеи путем удаления окружающий соединительной ткани, соблюдая осторожность, чтобы не повредить саму (1А) трахеи.
- Надрез небольшое отверстие около 1 мм в диаметре в открытой трахеи параллельно хрящевых колец, как можно ближе к гортани, насколько возможно (рис 1б). Будьте осторожны, чтобы не полностью прорезать трахеи.
- Возьмите 20 G иглу и аккуратно вставьте иглу 4-5 мм в трахею без каких-либо противодействующей силы (рис 1D). Конец иглы должен быть виден через трахею (рисунок 1С). Используйте пинцет, чтобы стабилизировать иглу в трахею. Альтернативно, шовный могут быть привязаны Ароунд трахею провести иглу на месте.
Примечание: При введении слишком глубоко, то киль может быть травмированы или только одна сторона легких может быть завышены. - Заполните шприц с 400 мкл 37 ° C 2% агарозы легкоплавки температур (взятой непосредственно из ванны с постоянной температурой). Убедитесь, что рассечение доска встает и медленно привить теплую агарозы через иглу в легкие, использовать ~ 400 мкл раздуть легкие.
Примечание: Смотрите легкие надувать внутри грудной клетки. Не слишком раздувать легкие, как это приведет к разрыву. - После того, как легкие раздуваются, заполняя ~ ⅔ части грудной клетки, отсоединить шприц и держать иглу внутри трахеи, чтобы предотвратить любую утечку агарозы.
- Налейте примерно 50 мл 20 ° C PBS более надутых легких, чтобы позволить агарозы внутри легких для установки и затвердеть. Медленно извлеките иглу и закрыть трахеи пинцетом, чтобы предотвратить любой не затвердевает агарозы от утечки. </ LI>
- Expose легкие, выполняя стернотомию и впоследствии вырезать легкие. Для удаления легких, провести на трахею при резке через трахею полностью. Осторожно потяните трахеи вверх, отрезать соединительную ткань и пищевод, потянув легкие из грудной полости, пока легкие не отделяется от мыши (рис 1E).
- Погрузитесь в легкие в теплой RPMI-1640, чтобы смыть избыточную кровь и осторожно отделить лепестки с помощью ножниц и щипцов, чтобы сократить главном стебле бронхов лепестков "на воротах (рис 1F).
- Поместите лепестки, с плоской поверхностью вниз, чтобы максимизировать поверхность формирования изображения, в лунке изображений пластины 24-луночного (рис 1G). Добавьте 100 мкл 37 ° C RPMI-1640 на верхней части лопастей. Место несколько 15 мм круглой микроскоп крышки скользит по верхней части мочки, чтобы предотвратить его плавающим.
- Налейте теплую PBS в окружающие скважин для предотвращения RPMI-1640 с EVAPorating. Вставьте 24-луночного планшета в уравновешенную климатической камере и поддерживать долей легких при 37 ° С с воздушным и 5% CO 2. Вставьте климатической камере на стадии конфокальной микроскопии.
Примечание: Другие газовые смеси (например, 5% O 2, 5% СО 2 в N 2 для изучения поведение клеток в условиях гипоксии / нижней кислорода) также может быть рассмотрен.
Рисунок 1. Протокол для приготовления легких для живого изображения. (А) Воздействие на трахею после приготовления мыши. (Б) Малый надрез выполнен в открытой трахеи параллельно хрящевых колец. (C) 20 G иглы вставляются 4-5 мм в трахею. (D) Инстилляции 400 мкл 2% легкоплавких температуре агарозы в легкие. (Е) Влиянованные легкие отделены от мыши. (F) Лопасти отделяют после инфляции. (G) лепестков помещают в лунку пластины изображения 24-луночного. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
6. Приобретение и анализа изображений
Примечание: Изображения могут быть приобретены с различными вращающийся диск конфокальной микроскопы, поддерживаемые различными программами. В этом протоколе, либо μManager с заказного вращающийся диск конфокальной микроскопии или дзен с коммерчески доступного вращающийся диск конфокальной микроскопии используется для получения изображения, в то время как Imaris используется для редактирования и анализа фильма.
- Получение изображений с помощью μManager. Подробное пошаговое протокола для приобретения изображений с использованием программного обеспечения μManager предварительно описано 18.
ИЛИ - Получение изображенийиспользуя программное обеспечение для анализа изображений, например Zen (рис S1).
- Нажмите на вкладку "Расположить", и выбрать цель (10x или 20x) в 'световой путь' инструмента (рис S1A, красное поле). Впоследствии, нажмите на кнопку "глаза - DAPI ', чтобы посмотреть на канале CFP через окуляр (Рисунок S1A, синей коробке). Локализация образца вручную с помощью микроскопа. Нажмите "Все Off'after ткани является центром поля зрения.
- Нажмите на вкладку "Приобретение", чтобы установить все параметры для получения изображения.
- В инструменте 'Каналы', нажмите кнопку "+" (рис s1b, выделена красным). Всплывающее меню появляется и поиск красителя (ов), присутствующего в образце в 'Dye Database' (рис s1b). Выберите краситель и нажмите кнопку "Добавить".
Примечание: Программа будет установлена все фильтры должны быть оптимизированы. Краситель может быть удаленавыбрав его последующим нажатием кнопки корзины (рис s1b, квадрат желтого цвета). - В меню "Режим захвата 'установите' Биннинг ', чтобы 5x5. Двойной щелчок по ECFP в меню каналов, чтобы выбрать его. Опустите мощность лазера до 20%, так что выборка не будет беленой при настройке параметров для получения изображения.
- Установите флажок "плиток в разделе" Эксперимент менеджер 'и инструмент плитки появляется в группе инструментов "многомерные Acquisition" (рис S1C). Нажмите на кнопку 'Advanced Setup', чтобы посмотреть живое изображение с камеры. Нажмите на кнопку "Добавить" в разделе "позиции", чтобы добавить 4 до 6 позиции в эксперименте. Чтобы удалить позицию, выберите эту позицию и нажмите на кнопку мусорного ведра.
- В группе инструментов "Приобретение Параметр ', открыть инструмент" Плата стратегия », и выберите« Absolutе Исправлена Z-позицию "из выпадающего списка.
- Установите флажок Z-Stack в разделе "Эксперимент менеджер» и инструмента Z-Stack появляется в группе инструментов в 'многомерных приобретения' (рис S1D). Двойной щелчок по одному из положений в разделе "Позиции" и нажмите кнопку "Live". Вручную установить первый и установить последнюю позицию области изображения. Установить интервал в 4 мкм.
Примечание: Программа будет определить число срезов для выбранного диапазона и интервала. В идеале, 5-7 ломтика удобны, чтобы обеспечить достаточное визуализации и быстрого получения изображения. - Проверьте флажок "Временные ряды" в разделе "Эксперимент менеджер '. Установите желаемый 'Продолжительность' и 'Интервал' раз в инструментальной временные ряды ', которая появилась в группе инструментов "многомерные Acquisition" (рис s1e).
- В «Acquisiным образом Mode 'меню, установить "Биннинг', чтобы 2x2. Двойной щелчок на флуорофора в меню каналов, чтобы выбрать его и увеличить мощность лазера до 100%. Нажмите 'Живая' и отрегулировать 'Время экспозиции'. Повторите эту процедуру для каждого флуорофора.
- Установите флажок "Разрешить Автосохранение 'окно. Выберите папку и введите имя файла. Все полученные изображения будут автоматически сохранены в этой папке.
- Нажмите на кнопку 'Пуск' эксперимента в разделе «Эксперимент менеджер", чтобы начать сканирование изображения.
- После получения изображения, компилировать исходные данные в программном обеспечении Imaris. Преобразование изображения в .ims файлы и настройки могут быть сделаны. Подробное пошаговое протокола для преобразования файлов, внося коррективы и сохранения фильмов с помощью Imaris предварительно описано 18.
- При сохранении фильма, установить 'Frame Rate' 5 кадров в секунду (FPS).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя спиннинг-диска конфокальной микроскопии, различные модели мыши системы и уколы, метастатической микросреда могут быть визуализированы и проследить во времени. Использование MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; гр-FMS-EGFP тройной трансгенная мышиная модель, разные клеточные компоненты флуоресцентную метку (2А, Фильм 1). Типичная структура легочной паренхимы могут быть визуализированы в канале CFP поскольку все клетки экспрессируют ECFP под -актина промотора. Большие / многоклеточные метастазы в легких легко разрешаются, как они появляются в массе клеток внутри организованной структуры легких. Миелоидных клеток визуализируются в GFP канала через гр-FMS -EGFP выражения, которая является трансгенной по ЧСФР-1 12. Миелоидных клеток очень динамичны, поскольку они мигрируют по всему полю изображения. Гр-FMS -EGFP-позитивные клетки более многочисленны и миграционного в легочной паренхимы по сравнению с теми, в тесном контакте с легкихметастазы. Динамика миелоидных клеток и их взаимодействий с метастазами в легких может сопровождаться в реальном времени в течение нескольких часов.
Чтобы исследовать метастатического посев и рост, экспериментальная модель метастаз используется (2В, фильм 2). Опухолевые клетки GFP + VO-PyMT вводили дикого типа, без репортера мыши и позволил, чтобы отобрать и расти в течение 2 недель. Структура легких отчетливо видна в канале GFP-за аутофлюоресценции легких. Однако клетки, VO-PyMT еще легко отличимы от структуры легких, так как они имеют круглую форму и большей экспрессией EGFP таким ярче по сравнению с легочной паренхимы. ВО-PyMT сотовой моторики может наблюдаться в течение установленного метастатическим поражением.
Клеточных взаимодействий между метастатическим и иммунных клеток в микросреде легких также могут быть изучены с помощью экспериментальной модели метастазов. Через две недели послеинъекция клеток VO-PyMT, флуоресцентную метку Gr-1 647 сопряженные антитела IV вводят 5 ч до легкого удаления (рис 2С, фильм 3). На левой стороне поля изображения, два GR-1 + миелоидных клеток взаимодействуют с клеткой VO-PyMT. Метастатической поражение наблюдается на правой стороне поля изображения. Со временем, клетки Gr-1 + вербуются в метастатическим поражением. Ниже метастатическим поражением, одна из ячеек Gr-1 + тесно взаимодействует с клеткой-ВО PyMT. В конце концов, клетка VO-PyMT смещает, расцепления с Gr-1 + клетки.
Сочетание репортер трансгенных мышиных моделей с экспериментальной моделью метастазов и инъекций антител нумерующих иммунные клетки дает трехцветный фильм. Через неделю после инъекции клеток VO-PyMT в репортера мыши ACTB-ECFP, флуоресцентно меченных GR-1 647 сопряженные антитела IV вводят 5 ч до тканей иссечение (рис 2D, фильм4). GR-1 + клетки мигрируют энергично в поле зрения, в то время как один GFP + метастатическим клеток видна в центре области формирования изображения.
Инъекционных различные флуоресцентные декстраны в репортер мышей, которые ранее вводили метастатических клеток, может дать четыре цвета кино (рис 2E, Фильмы 5-6). Ранние события в высева метастазов могут быть изучены, когда клетки VO-PyMT визуализируются немедленно и 4 ч после инъекции мышам репортер ACTB-ECFP. Инъекция родамина-конъюгирован, 70 кДа декстрана и 10 кД декстрана, конъюгированного с 647 флуоресцентной метки позволяет визуализировать легочные капилляры. Использование более низких и более высоких декстраны рных потенциально может быть использован для обнаружения изменений в проницаемости капилляров в легких, так как молекулы низкомолекулярные узловую быстрее по сравнению с теми, 19 с высокой молекулярной массой. Хотя cellul соток события еще можно эффективно изучать, фильм 5 является примером дрейфа ткани. При необходимости и в случае ткань не может быть повторно в течение сессии изображений, это может быть исправлено в течение анализирует приобретение пост изображения.
Эта система позволяет быстро, с четырьмя цветами приобретение непрерывного изображения следовать отличается флуоресцентно меченных типы клеток в метастатической легких микросреды. Этот протокол также позволяет визуализировать метастазирования различных размеров, от событий, связанных с посевом одиночных раковых клеток в штатные метастазов. Кроме того, опухолевые клетки и клетки стромы движение могут быть визуализированы в микросреде легких наряду с кровеносными сосудами. Как правило, сотовая движение можно наблюдать, по крайней мере, 4 ч от начала сессии изображений. Наблюдение различных метастатических микросреды в пределах той же ткани легкого помогает избежать мышь к мыши изменчивость.
нт "FO: Keep-together.within-странице =" всегда ">
Рисунок 2. Типичные кадры из фильмов, приобретенных живого изображения. (А) Снимок объединенной Z стека из фильма 1, показывающий миелоидных клеток, связанные с метастазами в легких (желтый вставки) по сравнению с теми, связаны с легочной паренхимы (красный вставки). (Б) Снимок объединенного Z стека из фильма 2, показывающий GFP + метастатической клетки в экспериментальной модели метастазов. Arrowhead указывает на подвижных метастатических клетке. (С) Снимок из Z стека из фильма 3, показывающий совместной локализации флуоресцентных сигналов от GFP + метастазирования и Gr 1-+ клеток визуализировали с помощью Gr-1 антитела, конъюгированного с 647 тегов (красный наконечником). Зеленые Arrowhead указывает на GFP + метастатическим клетки, которые смещаются от метастатического навалом. Белые Arrowhead указывает на Gr-1 + клетки, которые взаимодействовали с подвижных клетки GFP + VO-PyMT. (D) Снимокобъединенная стек Z из фильма 4 показывая клетки GFP + VO-PyMT, в ACTB-ECFP мыши. Один VO-PyMT клеток видна в центре (зеленый стрелки). Животное вводили Gr-1 647 конъюгированного антитела. (Е) представитель Z-стек фильмов 5 и 6, показывающих кровеносные сосуды в легких мышей, умерщвленных немедленно после инъекции 70 кД родамина-декстрана (красный наконечником) вместе с клетками GFP + VO-PyMT (зеленый). Масштабные бары 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Дополнительные Рисунок 1. Скриншоты ZEN ПО камеры для приобретения изображений. (A) Во-первых, в инструменте 'Light Path' право цель должна быть выбраны (красная коробка) и йе ткани быть локализованы в микроскоп. (Б) Настройка каналов для получения изображения, в каналы инструмент "каналы" могут быть удалены (красное поле) или добавлены (желтый ящик). (С) В инструменте '' Плитки, разные позиции могут быть добавлены к эксперименту. (D) В инструменте 'Z-Stack', Z-стек может быть установлен и толщина ломтиков можно регулировать. (E) В инструментальной временные ряды, длительностью и интервал может быть установлен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Фильм 1. (правый щелчок, чтобы загрузить). Взаимодействия между метастазов в легких и сюр. округления иммунные клетки, используя трансгенных мышей репортер Этот фильм показывает метастаз в легких тройной трансгенными MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; гр-FMS-EGFP мыши, в котором все клетки, меченные ECFP и миелоидных клеток помечены EGFP. Метастазы могут наблюдаться как основная часть клеток в синий, в отличие от обычной архитектуры легкого. Гр-FMS + миелоидных клеток мигрировать по всему полю всей визуализации. Этот фильм находится в 2 ч приобретение 1 мин.
Фильм 2. (правый щелчок, чтобы загрузить). Раковой клетки моторику в экспериментальной модели метастазов. Этот фильм показывает метастазов в легких, порожденную внутривенной инъекции GFP + VO-PyMT (зеленый) клеток в дикого типа, не-репортера, мышь. Легкие собирали через две недели после инъекции VO-PyMT Клетки. GFP + клетки движутся в метастатической навалом. Этот фильм представляет собой 4 ч 40 мин долго приобретение.
Фильм 3. (правый щелчок, чтобы загрузить). Кадрового иммунных клеток, визуализированных с помощью флуоресцентно-сопряженных антител к Экспериментально установлено метастазирование. Этот фильм показывает метастазов в легких, порожденную внутривенной инъекции клеток GFP + VO-PyMT (зеленый) в дикого типа, не- репортер, мышь. Легкие собирали две недели после того, как клетки VO-PyMT вводили. Гр-1 + клетки помечены Gr-1 647 конъюгированного антитела и наблюдается в ближней инфракрасной канала (белый). Обратите внимание, что клетки Gr-1 вербуются в GFP + метастазирования. Этот фильм является примером долгосрочного приобретения, в общей сложности 11 часов 27 мин.
Фильм 4. (правый щелчок, чтобы загрузить). Моторику иммунных клеток, визуализированных с помощью флуоресцентно-сопряженных антител в трансгенных репортера мыши вводили метастатических клеток. Этот фильм показывает одну ячейку GFP + VO-PyMT в легких, порожденной внутривенной инъекции vo- клетки PyMT (зеленый) в мыши ACTB-ECFP. Легкие собирали через неделю после клетки VO-PyMT вводили. Гр-1 + клетки помечены Gr-1 647 конъюгированного антитела и наблюдается в ближней инфракрасной канала (белый). Этот фильм находится в 2 ч 40 мин долго приобретение.
Фильм 5. (справа ClicК качать). метастатических клеток и капилляров визуализируются люминесцентных декстраны сразу после внутривенной инъекции в трансгенной репортера мыши. Этот фильм показывает экспериментальную метастаз, генерируемый внутривенной инъекции клеток GFP + VO-PyMT (зеленый) в ACTB-ECFP мыши вместе с инъекция родамина-конъюгированный, 70 кДа декстрана (красный) и 10 кД декстрана, конъюгированного с 647 флуоресцентной метки (белый), чтобы отметить кровеносные сосуды. Этот фильм является примером дрейфа ткани и является 18 мин долго приобретение.
Фильм 6. (правый щелчок, чтобы загрузить). Метастатических клеток и капилляров визуализируются люминесцентных декстраны несколько часов после инъекции в трансгенной репортера мыши. Этот фильм показывает экспериментальное метастазирование генерироватьd от внутривенной инъекции клеток GFP + VO-PyMT (зеленый) в мыши ACTB-ECFP вместе с инъекцией родамина-сопряженного 70 кДа декстрана (красный) и 10 кД декстрана, конъюгированного с 647 флуоресцентной метки (белый), чтобы отметить кровеносный сосуд. Легкие были извлечены 4 ч после инъекции клеток VO-PyMT. Этот фильм является 19 мин долго приобретение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта рукопись описывает подробную способ экс естественных живых изображений метастазов в легких в мышиных моделях метастазов. Этот протокол изображений обеспечивает прямой визуализации динамических и пространственных взаимодействий опухолевых клеток стромы внутри микросреды легких. Это относительно легко и быстро метод, который позволяет надежную визуализацию метастазов в легких, по крайней мере 4 часа. Фильмы, приобретенные в результате этих экспериментов могут быть использованы для отслеживания динамических процессов, как подвижность клеток и клеточных взаимодействий.
были описаны два способа генерации метастазов в легких: генетически сконструированный модель мыши и использование управляющей линии клеток. Мышиная модель ВОМЖМ-PyMT повторяет прогрессирование рака молочной железы и спонтанное метастазов в легких. Другие методы, которые воспроизводят метастазирования также доступны, например., Ортотопическая трансплантация клеток в молочной железе 20. Внутривенно VO-PyMT грELL линия используется для имитации посев и разрастание метастазов рака молочной железы. Норма времени для сотового выроста VO-PyMT зависит от экспериментальной предпочтение стадии метастазов в легких. В зависимости от количества вводимых клеток, микрометастазов может наблюдаться в течение нескольких дней до 2 недель после инъекции VO-PyMT клеток.
Для оптимальной визуализации легких, большое внимание должно быть принято во время накачивания легких. Для правильной инфляции, игла должна быть вставлена только 4-5 мм в трахею. Глубже введения иглы может привести к частичному, односторонней инфляции легких. Кроме того, легкие должны наблюдаться в течение фактической инфляции, чтобы предотвратить чрезмерную инфляцию, что может привести к повреждению тканей. Кроме того, очень важно, чтобы держать легкие максимальную стерильность, так что иммунные клетки в легких не будут оспорены.
Для каждого эксперимента живого изображения, оптимальный баланс между количеством сбора данных и гое потенциал повреждения тканей, вызванного чрезмерным лазерного воздействия необходимо рассматривать. Важно оптимизировать параметры получения изображения, выполнив пилотные эксперименты. Кроме того, рекомендуется, чтобы сохранить мощность лазера вниз при поиске оптимальных полей зрения и / или удержания затвора выключен, когда изображения не приобрела.
Моторику рака и / или иммунных клеток, представляющих интерес является одним из показателей для жизнеспособность клеток. Подвижность чувствителен к температуре, уровень кислорода, и фототоксичности 7. Однако, ингибирование или его отсутствие подвижности не могут быть связаны с условиями обработки изображений или технических проблем, а скорее биологическое. Ингибирование подвижности может быть следствием определенного терапевтического эффекта или ареста метастатических клеток непосредственно перед их пролиферации в микрососудах легких и их экстравазации в легочной паренхимы 21,22. Поэтому может оказаться важным для подтверждения таких данных, используя дополнительноеметоды (как миграции анализов в 2D культуре) 23.
Кроме того, этот экс естественных легких метод визуализации является достаточным для краткосрочного обучения, которая не требует микроциркуляцию легких. С помощью этого метода, движение рака и / или иммунных клеток наблюдается в течение по крайней мере 4 ч. До получения изображения, она занимает около 30 минут, чтобы подготовить легкие и 30-60 мин, чтобы найти позиции для приобретения. Хотя подвижность клеток наблюдается за 4 ч (до 11 ч, Movie 3), продолжительные изображений зависит от конкретных типов клеток исследованных услови х, используемых (например., Снижается кислорода), и должны быть определены для конкретного экспериментальной установки. Кроме того, из-за отсутствия микроциркуляции и возможного влияния посмертных изменений или в случае, если есть основания для необходимости проверки результатов в присутствии интактного микроциркуляции, прижизненной легких томография с грудной окна всасывания могут быть использованы. Тем не менее, это STILL вызов для выполнения прижизненной визуализации легких через несколько дней, используя окно визуализации, а выполняется в мозге, молочной железы и органов брюшной полости 5 из-за трудностей в поддержании достаточного отрицательного давления. В качестве альтернативного способа для перфузии интактных естественных условиях легких бывших, изолированной перфузии-метод легкого ранее использовалось для изучения легочного метастазирования. Тем не менее, этот метод часто используется для более крупных животных. Так мышей имеют меньшие грудной полостей, они представляют собой реальную проблему для эффективного перфузии 24.
Благодаря рассеяния света, максимальная глубина визуализации центробежно-дискового конфокальной микроскопии ограничено. Как следствие, визуализация динамики клеток и клеточных взаимодействий ограничивается поверхностным метастазов в легких. Метастазы обогащены периферии легких, так как метастатические клетки удерживаются капилляров, которые уменьшаются в размерах по направлению к внешним границам легких 1. Кроме того, это еаSier для поддержания жизнеспособности клеток ближе к поверхности легкого, как они предпочтительного доступа к информации и кислорода. Чтобы разрешить глубокое визуализацию в легкие, Живая съемка срезах легких может быть выполнена. Тем не менее, следует ожидать значительное количество клеточной смерти. Альтернативно, многофотонная микроскопии может быть проведена, позволяя проникновение большей тканей. Кроме того, многофотонная изображений генерирует внутреннюю оптический сигнал, называемый генерация второй гармоники (ГВГ), которая позволяет визуализировать нецентросимметричных структур в внеклеточного матрикса, таких как коллаген 1 волокон.
Как показано в данном исследовании, опухоли и поведение иммунных клеток в легочных метастазов может следовать и анализировали с использованием флуоресцентных мышей репортер, манипулировать опухолевые клетки и флуоресцентно меченных радиофармпрепаратов или антитела. Эта методика может быть модифицирована для изучения других клеток и детерминант внутри метастатическим микросреды. С этой целью, существуют различные трansgenic мышей репортер, доступные для исследования стромальных клеток в том числе для фибробластов как FSP1-EGFP 4, альфа-SMA-RFP 25 и COL1A1-EGFP 25 или эндотелиальных клеток как Tie-2-GFP 26.
Сотовый окрашивание на живых срезах легких была выполнена для визуализации популяциях клеток иммунной системы 8. Эта стратегия окрашивание может быть принят в качестве альтернативы для захвата изображения многоцветной. Тем не менее, большинство маркеров часто маркировать несколько клеточных популяций вместо отдельной популяции клеток. Инъекционные которые захватываются специфическими клеточными популяциями 4 или флуоресцентно меченных антител против дополнительных клеточных маркеров могут быть использованы для дальнейшей дифференциации популяций. Использование различных флуоресцентных цветов, чтобы пометить различные клетки, представляющие интерес является предпочтительным для визуализации. В тех случаях, когда не могут быть выполнены использование различных флуоресцентных красителей (например., Из-за ограниченного Chann изображенийELS), можно изображений различных типов клеток с аналогичными люминесцентными репортерами тех пор, пока они легко различимы по форме и / или анатомической локализации.
В дополнение к изучению различных типов клеток, несколько классов химиотерапевтических слабо люминесцентные (например, доксорубицин). Эти химиотерапевтические может в принципе быть использован для визуализации доставки лекарств и распределения в метастазов в легких в той же манере, в первичной опухоли 19. Другие целевые терапевтические которые могут быть флуоресцентно меченных также могут быть использованы в экс естественных изображений легких. Примечательно, что данные, полученные с изображениями легких может быть более информативным, о которых клетки принимают меры эти препараты и их взаимодействие с другими клетками внутри метастатическим микросреды в дополнение к экстравазации этих терапевтических из активных кровеносных сосудов. Этот метод может быть дополнительно использован для изучения первичного рака легких 27 или адаптированы для изучения другой легкихо связанных патологий, которые могут повлиять на микросреду легких 28,29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MMTV-PyMT/FVB mice | Jackson Laboratory | 2374 | Female mice |
| ACTB-ECFP/FVB mice | UCSF Werb lab | Female mice | |
| c-fms-EGFP/FVB mice | UCSF Werb lab | Female mice | |
| FVB mice | Jackson Laboratory | 1800 | Female mice |
| GFP+ VO-PyMT cells | UCSF Werb lab | ||
| 70,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated | Invitrogen | D1818 | Dilute to 4mg/ml in 1 x PBS and store at -20 °C. Use 0.4 mg per animal. |
| 10,000 kDa Dextran, Alexa Fluor 647 conjugated | Invitrogen | D22914 | Dilute to 4mg/ml in 1 x PBS and store at -20 °C. Use 0.4 mg per animal. |
| Anti-mouse Gr-1 antibody Alexa Fluor 647 | UCSF Monoclonal antibody core | Stock 1mg/ml. Use 7 ug per animal. | |
| Anesthetic | Anesthesia approved by IACUC, used for anesthesia and/or euthanesia | ||
| 1X PBS | UCSF cell culture facility | ||
| PBS, USP sterile | Amresco INC | K813-500ML | Ultra pure grade for i.v. injection |
| Styrofoam platform | Will be used as dissection board | ||
| Fine scissors sharp | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Forceps | Roboz Surgical Store | RS-5135 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn ON 30min before use |
| Air | UCSF | ||
| Oxygen | UCSF | ||
| Carbon dioxide | UCSF | ||
| 1 mL syringe without needle | BD | 309659 | |
| 27 G x 1/2 needle | BD | 305109 | for i.v. injection |
| 20 G x 1 needle, short bevel | BD | 305178 | |
| Low-melting-temperature agarose | Lonza | 50111 | To make 10 ml of solution, weigh 0.2 g of agarose, add to 10 ml 1 x PBS, and heat to dissolve. Agarose will solidify at room temperature, so maintain in a 37 °C water bath until used for inflation. |
| RPMI-1640 medium without phenol red | Life Technologies | 11835-030 | |
| 24 well Imaging plate | E&K scientific | EK-42892 | |
| Glass cover slides, 15 mm | Fisher Scientific | 22-031-144 | |
| Digital CO2 and temperature controller | Okolab | DGTCO2BX | http://www.oko-lab.com |
| Climate chamber | Okolab | http://www.oko-lab.com | |
| Cell Observer spinning disk confocal microscope | Zeiss | ||
| Zen software | Zeiss | ||
| Inverted microscope | Carl Zeiss Inc | Zeiss Axiovert 200M | |
| ICCD camera | Stanford Photonics | XR-Mega-10EX S-30 | |
| Spinning disk confocal scan-head | Yokogawa Corporation | CSU-10b | |
| Imaris | Bitplane | ||
| mManager | Vale lab, UCSF | Open-source software |
References
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
- Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells. Cell stem cell. 16 (3), 225-238 (2015).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Egeblad, M., Ewald, A. J., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1 (2-3), 155-167 (2008).
- Ellenbroek, S. I. J., van Rheenen, J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nat Rev Cancer. 14 (6), 406-418 (2014).
- Looney, M. R., Thornton, E. E., Sen, D., Lamm, W. J., Glenny, R. W., Krummel, M. F. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
- Thornton, E. E., Krummel, M. F., Looney, M. R.
- Thornton, E. E., Looney, M. R., et al. Spatiotemporally separated antigen uptake by alveolar dendritic cells and airway presentation to T cells in the lung. J Exp Med. 209 (6), 1183-1199 (2012).
- Mendoza, A., Hong, S. -H., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
- Lelkes, E., Headley, M. B., Thornton, E. E., Looney, M. R., Krummel, M. F. The spatiotemporal cellular dynamics of lung immunity. Trends Immunol. 35 (8), 379-386 (2014).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Mol Cell Biol. 12 (3), 954-961 (1992).
- Hadjantonakis, A. -K., Macmaster, S., Nagy, A. Embryonic stem cells and mice expressing different GFP variants for multiple non-invasive reporter usage within a single animal. BMC Biotechnol. 2, (2002).
- Casbon, A. -J., Reynaud, D., et al. Invasive breast cancer reprograms early myeloid differentiation in the bone marrow to generate immunosuppressive neutrophils. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (6), 566-575 (2015).
- Donovan, J., Brown, P.
- Halpern, J., Lynch, C. C., et al. The application of a murine bone bioreactor as a model of tumor: bone interaction. Clin Exp Metastas. 23 (7-8), 345-356 (2006).
- Sasmono, R. T., Oceandy, D., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harb Protoc. (2), (2011).
- Bonnans, C., Lohela, M., Werb, Z. Real-time imaging of myeloid cells dynamics in ApcMin/+ intestinal tumors by spinning disk confocal microscopy. J Vis Exp. (92), (2014).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer cell. 21 (4), (2012).
- Cheng, N., Lambert, D. L. Mammary transplantation of stromal cells and carcinoma cells in C57BL/6J mice. J Vis Exp. (54), (2011).
- Al-Mehdi, A. B., Tozawa, K., Fisher, A. B., Shientag, L., Lee, A., Muschel, R. J. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat Med. 6 (1), 100-102 (2000).
- Wong, C. W., Song, C., et al. Intravascular location of breast cancer cells after spontaneous metastasis to the lung. Am J Pathol. 161 (3), 749-753 (2002).
- Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Nelson, K., Bobba, C., Ghadiali, S., Hayes, D. J., Black, S. M., Whitson, B. A. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World J Exp Med. 4 (2), (2014).
- Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40 (5), 1151-1159 (2004).
- Motoike, T., Loughna, S., et al. Universal GFP reporter for the study of vascular development. Genesis. 28 (2), (2000).
- Srivastava, M. K., Andersson, A., et al. Myeloid suppressor cells and immune modulation in lung cancer. Immunotherapy. 4 (3), (2012).
- Craig, A., Mai, J., Cai, S., Jeyaseelan, S. Neutrophil recruitment to the lungs during bacterial pneumonia. Infect Immun. 77 (2), 568-575 (2009).
- Kreisel, D., Nava, R. G., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).
