Summary
Descriviamo un metodo relativamente semplice per ex vivo l'imaging dal vivo del tumore interazioni cellula-stroma all'interno di metastasi polmonari, utilizzando i reporter fluorescenti nei topi. Utilizzando la microscopia confocale spinning-disk, questa tecnica consente la visualizzazione di cellule vive per almeno 4 ore e potrebbe essere adattato per studiare altre malattie polmonari infiammatorie.
Abstract
Metastasi è una delle principali cause di morbilità e mortalità per cancro. Metastasi è un processo a più fasi e causa della sua complessità, le esatte processi cellulari e molecolari che regolano la diffusione e la crescita metastatica sono ancora sfuggente. Immagini dal vivo permette la visualizzazione delle interazioni dinamiche e spaziali delle cellule e il loro microambiente. I tumori solidi comunemente metastasi ai polmoni. Tuttavia, la posizione anatomica dei polmoni rappresenta una sfida per l'imaging intravitale. Questo protocollo fornisce un metodo relativamente semplice e veloce per ex vivo l'imaging dal vivo delle interazioni dinamiche tra le cellule tumorali e la loro stroma circostante all'interno di metastasi polmonari. Utilizzando questo metodo, la motilità delle cellule tumorali, nonché le interazioni tra cellule tumorali e cellule stromali nel loro microambiente possono essere visualizzati in tempo reale per diverse ore. Utilizzando topi transgenici reporter fluorescente, una linea cellulare a fluorescenza, iniettabili fluorescentemolecole e / o anticorpi, componenti multipli del microambiente polmonare possono essere visualizzati, come i vasi sanguigni e cellule immunitarie. Per immagine diversi tipi cellulari, è stato usato un disco rotante microscopio confocale che permette a lungo termine di imaging continuo con acquisizione delle immagini rapida, a quattro colori. filmati time-lapse compilati da immagini raccolte su più posizioni e piani focali mostrano le interazioni tra metastatico dal vivo e le cellule immunitarie per almeno 4 ore. Questa tecnica può essere ulteriormente utilizzato per testare chemioterapia o terapia mirata. Inoltre, questo metodo potrebbe essere adattato per lo studio di altre patologie polmonari correlati che possono influenzare il microambiente polmonare.
Protocol
Tutte le procedure descritte devono essere eseguite in conformità con le linee guida e regolamenti per l'uso di animali vertebrati, tra cui l'approvazione preventiva della Istituzionale Cura locali animali e del Comitato Usa (IACUC).
1. Generazione di polmone metastasi per ex vivo l'imaging dal vivo (transgenico o la coda Vein Injection)
NOTA: metastasi polmonari possono essere generati utilizzando modelli murini geneticamente o per via endovenosa (ev) delle cellule tumorali.
- Generare metastasi polmonari per l'imaging attraversando un modello murino di tumore geneticamente modificato in un topo giornalista transgenico, ad esempio, si attraversa il cancro al seno modello di topo, mouse virus tumore mammario lunga terminal repeat-polyoma mezzo T antigene (MMTV-PyMT) 11 in ACTB-ECFP modello di topo 12.
NOTA: Il modello ACTB-ECFP esprime migliorato proteina fluorescente ciano (ECFP) sotto il β-actnel promotore in modo tale che tutte le cellule fluorescenti nel blu, il canale PCP. Tuttavia, le cellule tumorali sono di gran lunga i più importanti e appaiono come una massa di cellule ECFP-positive al microscopio. Il modello di topo MMTV-PyMT sviluppa una malattia progressiva, in cui la crescita del tumore mammario è associata con la diffusione delle cellule tumorali alla periferia, soprattutto ai polmoni. Nei topi MMTV-PyMT sul FVB / n sfondo, micrometastasi possono osservare intorno 10-11 settimane di età. In generale, questi progressi macrometastasi a circa 14 settimane di 13 anni.
O - Generare metastasi sperimentali utilizzando cellule primarie o linee cellulari singenici. Utilizzare nelle cellule tumorali in vitro primaria manipolato o linee cellulari (ad es., Trasduzione) seguito da iniezione endovenosa 14.
- In breve, in questo protocollo, iniettare una proteina fluorescente verde (GFP) esprimente (+) linea cellulare MMTV-PyMT in topi fluorescenti Reporter (ACTB-ECFP) o di tipo selvatico mice. Poi,visualizzare queste cellule denominate cellule VO-PyMT 15 utilizzando il verde, il canale GFP.
NOTA: La linea cellulare originale VO-PyMT è stato derivato al Vanderbilt Ortopedia a Nashville, TN. VO acronimo di Vanderbilt Ortopedia. - Dopo l'iniezione di 10 6 cellule (in 200 microlitri), osservare stravaso cellula tumorale immediatamente e fino a poche ore dopo l'iniezione; osservare micrometastasi tra 1-3 settimane dopo l'iniezione e rilevare macrometastasi 3 settimane dopo l'iniezione 15.
NOTA: minor numero di cellule possono essere iniettati per prolungare il tempo di iniezione per la crescita metastatica.
- In breve, in questo protocollo, iniettare una proteina fluorescente verde (GFP) esprimente (+) linea cellulare MMTV-PyMT in topi fluorescenti Reporter (ACTB-ECFP) o di tipo selvatico mice. Poi,visualizzare queste cellule denominate cellule VO-PyMT 15 utilizzando il verde, il canale GFP.
2. L'etichettatura dei componenti di interesse per il metastatico Microenvironment (transgenici e / o iniettabili)
NOTA: etichettatura può essere ottenuto topi transgenici e / o vari iniettabili. Assicurarsi di utilizzare i colori fluorescenti diversi per l'etichettatura dei vari tipi di cellule.
- componenti Label del microambiente metastatico utilizzando topi transgenici. Attraversate il modello di tumore del mouse precedentemente menzionato (ad es., MMTV-PyMT x ACTB-ECFP) in un modello di topo transgenico in cui le cellule stromali di interesse sono etichettati da una proteina fluorescente che non è ECFP, ad es., C-fms-EGFP 4,16.
NOTA: Oltre alla visualizzazione delle cellule tumorali nel canale PCP, questo permette la visualizzazione di cellule mieloidi nel canale GFP 4.
E / O - Etichettare i vari componenti del microambiente metastatico utilizzando iniettabili in topi transgenici reporter fluorescente o topi di tipo selvatico (non fluorescenti).
NOTA: Diversi composti può essere iniettato per etichettare vari componenti del microambiente metastatico, ad esempio, un AF647-coniugato Gr-1 anticorpo viene qui utilizzato per etichettare neutrofili e sono utilizzati alcuni monociti 13 e diversi destrani peso molecolareper etichettare capillari polmonari. Per la preparazione di questi iniettabili vedere il punto 4.
3. Preparazione dei Materiali prima della dissezione
- 2% agarosio
- Pesare 0,2 g di agarosio ed aggiungere a 10 ml 1 x PBS. Riscaldare la soluzione per sciogliere l'agarosio. Agarose solidificherà a RT, quindi mantenerlo a bagnomaria C 37 ° fino utilizzato per il riempimento.
- CO 2 e regolatore di temperatura
- Controllare DDH 2 O nella camera di umidificazione. Riempire quando necessario. Inserire piastra di configurazione nel portatarga fase temperatura (camera climatica). Accendere il controller di CO 2 e impostare CO 2 al 5%. Assicurarsi che la portata d'aria è fissato a 0,4 Nl / min.
- Aprire l'aria e CO 2 valvole. Accendere il regolatore di temperatura. Assicurarsi che la temperatura della camera climatica e il coperchio sono fissati a 37 ° C.
- Scaricare la pressione dell'aria sul CO 2 metri. Controllare CO 2 in aumento, equilibration può richiedere fino a 30 min.
- Spinning disco microscopio confocale
NOTA: I dettagli del microscopio set-up sono stati precedentemente descritti 4,17.- Attivare i laser (laser argon 488 nm di eccitazione e lo stato solido 405 nm, 561 nm e 640 nm laser). Accendere il microscopio, la telecamera, l'unità di controllo disco rotante, la AOTF, l'unità di controllo laser e il controllore fotocamera.
- Aprire l'otturatore microscopio, accendere il computer che esegue il microscopio e aprire il software.
- Preparazione degli strumenti e la piattaforma dissezione.
- Accendere lo sterilizzatore a caldo tallone e lasciarlo raggiungere i 250 ° C. Pulire le 2 paia di forbici chirurgiche e pinze con acqua e sapone. Sterilizzare gli strumenti per almeno 30 sec. Lasciate che gli strumenti raffreddare. Utilizzare un coperchio di polistirolo come piattaforma di dissezione. Coprire con un pezzo di laboratorio soaker.
4. Preparazione di iniezioni
NOTA: A seconda del tempo di dimezzamento e la risposta preferita, iniettare fluorescente anticorpi e / o molecole fluorescenti o immediatamente prima del sacrificio animale o un paio di ore o giorni prima.
- Per neutrofili immagine Gr1-positive e monociti, prepara una siringa con 7 ml di brodo Gr-1 anticorpi AF647-coniugato (1 mg / ml) in 100 ml di PBS sterile sotto il cofano. Posizionare un 27 G ½ ago sulla siringa.
- Per capillari polmonari immagine, preparare una seconda e terza siringa con 100 ml di o 70 kD rodamina-destrano coniugato (4 mg / ml) o destrano 10 kD AF647-coniugato (4 mg / ml). Posizionare un 27 G ½ ago sulle siringhe.
- Iniettare l'AF647 coniugato soluzione di anticorpi iv 5 ore prima di escissione polmoni.
- Iniettare una o entrambe le soluzioni di destrano iv immediatamente precedenti l'escissione polmoni '.
5. Preparazione dei polmoni per ex vivo l'imaging dal vivo
NOTA: Prova a lavorare come sterile e accurato possibile per evitare inutili sfide delle cellule immunitarie nei polmoni.
- Iniettare il intraperitoneale mouse (ip) con un sovradosaggio letale di anestetico consentita dal protocollo animale approvato da IACUC, ad es., 1 ml di 2,5% Avertin. Attendere il mouse per smettere di respirare e di essere completamente non-responsivi agli stimoli nocivi (zampa posteriore pinch).
NOTA: dislocazione cervicale e biossido di carbonio l'eutanasia dovrebbe essere evitato in quanto può influenzare negativamente la vitalità delle cellule del polmone. - Immobilizzare il mouse su una tavola di dissezione e sterilizzare il mouse con il 70% di etanolo.
- Utilizzare forbici chirurgiche prima fare una incisione epigastrica trasversale attraverso la pelle, seguita da un'incisione simile attraverso il peritoneo. Tenere la tavola di dissezione in posizione verticale e tagliare l'aorta discendente, in modo che le piscine sangue giù nell'addome e non nella cavità toracica.
- Snip una piccola apertura nel diaframma per rilasciare il vuoto. Tagliare lungo la nervatura 10 e 12 di asportare il diaframma e ottenere accesso visivo ai polmoni.
- Usare le forbici chirurgiche per tagliare la pelle fino alla trachea sopra la gabbia toracica, ma lascia intatta la gabbia toracica. Separare la pelle dalla cassa toracica. Esporre la trachea rimuovendo il tessuto connettivo circostante, facendo attenzione a non danneggiare la trachea stessa (Figura 1A).
- Snip una piccola apertura di circa 1 mm di diametro nella trachea esposto parallelamente agli anelli cartilaginei, più vicino alla laringe possibile (Figura 1B). Fare attenzione a non tagliare completamente attraverso la trachea.
- Prendere un ago G 20 e inserire delicatamente l'ago mm 4-5 nella trachea, senza alcuna forza contatore (Figura 1D). L'estremità dell'ago deve essere visibile attraverso la trachea (Figura 1C). Utilizzare pinze per stabilizzare l'ago nella trachea. In alternativa, una sutura può essere legato aroUnd la trachea per tenere l'ago in posizione.
NOTA: Inserendo troppo profonda, la carena può essere traumatizzato o solo un lato dei polmoni potrebbe essere gonfiato. - Riempire una siringa con 400 ml di 37 ° C 2% agarosio a bassa temperatura di fusione (presa direttamente da un bagno a temperatura costante). Assicurarsi che la scheda di dissezione è in piedi e infondere lentamente l'agarosio caldo attraverso l'ago nei polmoni, usare ~ 400 microlitri per gonfiare i polmoni.
NOTA: Guarda i polmoni gonfiano all'interno della cassa toracica. Non gonfiare eccessivamente il polmone come sarà rottura. - Una volta che i polmoni sono gonfiati, riempiendo ~ ⅔ della gabbia toracica, staccare la siringa e l'ago mantenere all'interno della trachea per evitare la fuoriuscita di agarosio.
- Versare circa 50 ml di 20 ° C PBS oltre i polmoni gonfiati per consentire l'agarosio all'interno dei polmoni per impostare e solidificare. Lentamente rimuovere l'ago e chiudere la trachea con una pinza per evitare non solidificato agarosio da perdite. </ Li>
- Esporre i polmoni eseguendo una sternotomia e successivamente asportare i polmoni. Per escissione dei polmoni, trattenere la trachea durante il taglio attraverso la trachea completamente. Tirare delicatamente la trachea up, tagliare il tessuto connettivo e dell'esofago tirando i polmoni dalla cavità toracica fino polmoni è separato dal mouse (Figura 1E).
- Immergere i polmoni a caldo RPMI-1640 per lavare via il sangue eccessivo e separare delicatamente i lobi utilizzando forbici e pinze per tagliare fusto principale bronco lobi 'in ilo (Figura 1F).
- Posizionare i lobi, con la superficie piatta giù per massimizzare la superficie di imaging, in un pozzetto di una piastra di imaging 24 pozzetti (Figura 1G). Aggiungere 100 pl di 37 ° C RPMI-1640 in cima dei lobi. Posizionare diversi 15 mm vetrini di copertura microscopio circolare sulla parte superiore dei lobi per evitare che galleggianti.
- Versare caldo PBS nei pozzetti circostanti per evitare che i media RPMI-1640 da evaporante. Inserire la piastra 24 pozzetti nella camera climatica equilibrato e mantenere i lobi polmonari a 37 ° C con aria e 5% CO 2. Inserire la camera climatica sul palco del microscopio confocale.
NOTA: Altre miscele di gas (ad esempio, 5% O 2, 5% CO 2 in N 2 per esaminare il comportamento delle cellule in condizioni di ipossia / ossigeno inferiore) potrebbe anche essere considerato.
Figura 1. Protocollo per la preparazione dei polmoni per l'imaging in tempo reale. (A) esposizione della trachea dopo la preparazione del mouse. (B) Piccola snip fatto nella trachea esposto parallelamente agli anelli cartilaginei. (C) 20 ago G inserita 4-5 mm nella trachea. (D) instillazione di 400 microlitri 2% a bassa temperatura di fusione agarosio nei polmoni. (E) Inflpolmoni ATED separati dal mouse. (F) lobi separati dopo l'inflazione. (G) Lobi posto in un pozzo di una piastra di imaging 24-bene. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
6. Acquisizione e analisi di immagini
NOTA: Le immagini possono essere acquisite con una varietà di filatura del disco microscopio confocale supportati da vari programmi software. In questo protocollo, sia μManager con una filatura disco microscopio confocale misura o Zen con un disco di filatura microscopio confocale disponibile in commercio viene utilizzato per l'acquisizione dell'immagine, mentre Imaris viene utilizzato per l'editing di film e di analisi.
- Acquisire le immagini utilizzando μManager. Un passo dettagliata da protocollo passo per l'acquisizione di immagini utilizzando il software μManager è descritto in precedenza 18.
O - acquisire le immaginiutilizzando il software di analisi delle immagini, come Zen (vedi Figura S1).
- Fare clic sulla scheda 'Locate' e scegliere obiettivo (10x o 20x) nello strumento di 'Light Path' (Figura S1A, scatola rossa). Successivamente, clicca su 'Occhi - DAPI' a guardare il canale PCP attraverso l'oculare (Figura S1A, scatola blu). Localizzare il campione manualmente utilizzando il microscopio. Fare clic su 'All Off'after il tessuto è centro del campo visivo.
- Fare clic sulla scheda 'Acquisizione' per impostare tutti i parametri per l'acquisizione delle immagini.
- Nello strumento di 'canali', fare clic sul pulsante '+' (Figura S1B, scatola rossa). Appare un menu pop-up e cercare il colorante (s) presente nel campione nel 'Dye Database' (Figura S1B). Selezionare il colorante e fare clic su 'Aggiungi'.
NOTA: Il programma impostato tutti i filtri di ottimizzare. Un colorante può essere cancellatoselezionandolo seguito facendo clic sul pulsante del cestino (Figura S1B, scatola gialla). - Nel menu 'Acquisition Mode', impostare 'Binning' a 5x5. Fare doppio clic sul ECFP nel menu canali per selezionarla. Abbassare la potenza del laser al 20% in modo che il campione non verrà sbiancato durante l'impostazione dei parametri di acquisizione delle immagini.
- Selezionare la casella 'piastrelle' nella sezione 'Experiment Manager' e lo strumento piastrelle compare nel gruppo di strumenti 'multidimensionale Acquisition' (Figura S1C). Fare clic sul pulsante 'Impostazioni avanzate' per visualizzare l'immagine dal vivo dalla telecamera. Fare clic sul pulsante 'Aggiungi' nella sezione 'posizioni' aggiungere da 4 a 6 posizioni per l'esperimento. Per cancellare una posizione, selezionare quella posizione e fare clic sul pulsante del cestino.
- Nel gruppo strumento 'acquisizione dei parametri', aprire lo strumento 'Strategia Focus', e selezionare 'Absolute fissa Z-position 'dal menu a discesa.
- Selezionare la casella Z-Stack nella sezione 'Experiment Manager' e lo strumento Z-Stack appare nel gruppo di strumenti del 'multidimensionale Acquisition' (Figura S1D). Fare doppio clic su una delle posizioni nella sezione 'posizioni' e premere 'Live'. Impostare manualmente prima e impostare ultima posizione del campo dell'imaging. Impostare l'intervallo di 4 micron.
NOTA: Il programma determina il numero di fette per l'intervallo e l'intervallo selezionato. Idealmente, 5-7 fette sono convenienti per permettere la visualizzazione sufficiente e rapida acquisizione delle immagini. - Controllare la casella 'Time Series' nella sezione 'Experiment Manager'. Set desiderato 'Durata' e tempi 'intervallo' in funzione 'Time Series' che è apparso nel gruppo di strumenti 'multidimensionale Acquisition' (Figura S1E).
- Nel 'acquisiModalità ne 'di menu, impostare' Binning 'a 2x2. Doppio click su un fluoroforo nel menu canali per selezionare e aumentare la potenza del laser al 100%. Premere 'Live' e regolare il 'tempo di esposizione'. Ripetere questa operazione per ogni fluoroforo.
- Selezionare la casella 'Enable Auto Save'. Selezionare una cartella e digitare il nome del file. Tutte le immagini acquisite verranno salvate automaticamente in questa cartella.
- Fare clic su 'Start Experiment' nella sezione 'Experiment Manager' per avviare l'acquisizione delle immagini.
- Dopo l'acquisizione delle immagini, compilare i dati grezzi nel software Imaris. Convertire immagini in .ims i file e le regolazioni possono essere effettuate. Un passo dettagliata da protocollo passo per la conversione di file, le regolazioni e film risparmio utilizzando Imaris è descritto in precedenza 18.
- Quando si salva il film, impostare la 'Frame Rate' a 5 fotogrammi al secondo (fps).
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Representative Results
Utilizzando la microscopia confocale spinning-disk, i vari sistemi modello mouse e iniettabili, il microambiente metastatico possono essere visualizzati e monitorati nel tempo. L'utilizzo di un MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; c-fms-EGFP tripla modello di topo transgenico, diversi componenti cellulari sono fluorescente (Figura 2A, Film 1). La struttura tipica del parenchima polmonare può essere visualizzato nel canale PCP poiché tutte le cellule esprimono ECFP sotto il promotore β-actina. metastasi polmonari più grandi / pluricellulari sono facilmente risolti come questi appaiono come una massa di cellule all'interno della struttura del polmone organizzata. Cellule mieloidi sono visualizzati nel canale GFP attraverso c-fms -EGFP espressione, che è il transgene per RFCS-1 12. Cellule mieloidi sono molto dinamico come migrano in tutto il campo di imaging. C-fms cellule -EGFP-positive sono più abbondanti e migratoria nel parenchima polmonare rispetto a quelli a stretto contatto con il polmonemetastasi. La dinamica di cellule mieloidi e le loro interazioni con metastasi polmonari possono seguire in tempo reale per diverse ore.
Per esaminare la semina e la crescita metastatica, un modello sperimentale di metastasi è utilizzato (Figura 2B, Movie 2). Le cellule tumorali GFP + VO-PyMT sono state iniettate in un tipo selvatico, mouse non giornalista e lasciate seminare e crescere per 2 settimane. La struttura del polmone è chiaramente visibile nel canale GFP causa autofluorescenza dei polmoni. Tuttavia, le cellule VO-PyMT sono ancora facilmente distinguibili dalla struttura dei polmoni poiché hanno una forma rotonda ed espressione EGFP superiore così più luminose rispetto al parenchima polmonare. VO-PyMT motilità cellulare può essere osservato all'interno della lesione metastatica stabilita.
interazioni cellulari tra metastatico e cellule immunitarie nel microambiente polmonare possono anche essere esaminati utilizzando il modello di metastasi sperimentale. Due settimane dopoiniezione di cellule VO-PyMT, fluorescente Gr-1 647 anticorpi coniugati sono iv iniettato 5 ore prima di escissione del polmone (Figura 2C, Film 3). Sul lato sinistro del campo dell'imaging, due Gr-1 + cellule mieloidi interagiscono con una cellula VO-PyMT. Una lesione metastatica si osserva sul lato destro del campo dell'imaging. Nel corso del tempo, le cellule Gr-1 + sono reclutati per la lesione metastatica. Sotto la lesione metastatica, una delle celle Gr-1 + interagisce strettamente con una cella VO-PyMT. Alla fine, la cella VO-PyMT dislodges, disimpegno dal Gr-1 + cellule.
La combinazione di modelli di topi transgenici giornalista con il modello di metastasi sperimentale e anticorpi iniettabili etichettatura cellule del sistema immunitario produce un film a tre colori. Una settimana dopo l'iniezione di cellule VO-PyMT in un mouse giornalista ACTB-ECFP, fluorescente GR-1 647 anticorpi coniugati sono iv iniettato 5 ore prima di asportazione del tessuto (Figura 2D, Film4). cellule Gr-1 + migrano vigorosamente all'interno del campo di vista, mentre un singolo GFP + cellule metastatico è visibile al centro del campo di ripresa.
Iniezione destrani fluorescenti differenti in topi giornalista, che in precedenza erano iniettati con cellule metastatiche, può produrre un film a quattro colori (Figura 2E, filmati 5-6). Eventi presto nella semina di metastasi possono essere studiate quando le cellule VO-PyMT vengono visualizzati immediatamente e 4 ore dopo l'iniezione iv in topi giornalista ACTB-ECFP. L'iniezione di rodamina-coniugato, 70 kD destrano e 10 kD destrano coniugato a un tag fluorescente 647 permette la visualizzazione dei capillari polmonari. L'uso di destrani peso molecolare inferiore e superiore potrebbe potenzialmente essere utilizzato per rilevare cambiamenti nella permeabilità dei capillari nel polmone, poiché le molecole di peso molecolare inferiore stravaso veloce rispetto alle alte quelli peso molecolare 19. Anche se Cellul eventi ar possono ancora essere efficacemente studiati, film 5 è un esempio di una deriva tessuti. Se necessario, e nel caso del tessuto non può essere riposizionato durante la sessione di imaging, questo potrebbe essere corretta durante analizza l'acquisizione dell'immagine palo.
Questo sistema permette un rapido, a quattro colori acquisizione delle immagini continua a seguire diversi tipi di cellule fluorescente all'interno del microambiente metastatico del polmone. Questo protocollo permette anche la visualizzazione di metastasi di dimensioni diverse, da eventi legati alla semina delle cellule tumorali singole a metastasi stabiliti. Inoltre, le cellule tumorali e cellule stromali movimento possono essere visualizzati nel microambiente polmonare insieme con i vasi sanguigni. Tipicamente, il movimento cellulare può essere osservato per almeno 4 ore dall'inizio della sessione di imaging. L'osservazione di diversi microambienti metastatici all'interno dello stesso tessuto polmonare aiuta ad evitare la variabilità del mouse a mouse.
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Figura 2. Immagini rappresentative da filmati acquisiti da immagini dal vivo. (A) Snapshot di una pila Z unito dal film 1 che mostra le cellule mieloidi associate ad una metastasi polmonari (inserto giallo) rispetto a quelli associati al parenchima polmonare (inserto rosso). (B) Istantanea di un Z pila unito dal film 2 che mostra GFP + cellule metastatico in un modello di metastasi sperimentale. Arrowhead punta a una cellula metastatica mobili. (C) Istantanea di una pila Z da film 3 che mostra co-localizzazione dei segnali fluorescenti da un GFP + metastasi e 1 GR-cellule + visualizzato da un anticorpo Gr-1 coniugato a un tag 647 (punta di freccia rossa). Verde punti punta di freccia a una cella metastatico GFP + che sloggiato dalla massa metastatica. punti freccia bianca ad un Gr-1 + cella che ha interagito con la motilità delle cellule GFP + VO-PyMT. (D) Snapshot diuna pila Z unito dal film 4 che mostra le cellule GFP + VO-PyMT, in ACTB-ECFP mouse. Una singola cellula VO-PyMT è visibile al centro (freccia verde). L'animale è stato iniettato con Gr-1 647 anticorpo coniugato. (E) Rappresentante Z-stack di film 5 e 6 mostrano i vasi sanguigni nei polmoni dei topi sacrificati immediatamente dopo l'iniezione di 70 kD rodamina-destrano (punta di freccia rossa) insieme con le cellule GFP + VO-PyMT (verde). Barre di scala sono 100 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Supplementari Figura 1. Le schermate del software della fotocamera ZEN per l'acquisizione di immagini. (A) In primo luogo, nello strumento di 'Percorso Light' l'obiettivo destra dovrebbe essere scelto (scatola rossa) e the tessuti essere localizzato nel microscopio. (B) configurare i canali per l'acquisizione delle immagini, nei canali strumento 'canali' possono essere cancellati (scatola rossa) o aggiunto (scatola gialla). (C) Nello strumento 'piastrelle', posizioni diverse può essere aggiunto al esperimento. (D) Nello strumento 'Z-Stack', Z-stack può essere impostato e lo spessore delle fette è regolabile. (E) In strumento del 'Time Series', la durata e l'intervallo può essere impostato. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Film 1. (Tasto destro del mouse per scaricare). Le interazioni tra una metastasi polmonare e sur. arrotondamento cellule immunitarie utilizzando topi transgenici giornalista Questo film mostra una metastasi nel polmone di una tripla-transgenico MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; c-fms-EGFP topo in cui tutte le cellule sono etichettati con ECFP e cellule mieloidi sono etichettati con EGFP. La metastasi può essere osservata come una massa di cellule in blu in contrasto con l'architettura polmone normale. C-fms + cellule mieloidi migrano durante l'intero campo di imaging. Questo film è un 2 ore 1 min acquisizione.
Movie 2. (clic destro per il download). Motilità cellulare del cancro in un modello di metastasi sperimentale. Questo film mostra una metastasi polmonari generato mediante iniezione endovenosa di GFP + VO-PyMT (verde), le cellule in una di tipo selvatico, non giornalista, mouse. I polmoni sono stati raccolti due settimane dopo l'iniezione di VOcellule -PyMT. cellule GFP + si muovono all'interno della massa metastatica. Questo film è un 4 hr acquisizione lungo 40 min.
Movie 3. (clic destro per il download). Il reclutamento di cellule immunitarie visualizzati da anticorpi fluorescenti-coniugato stabilita sperimentalmente metastasi. Questo film mostra una metastasi polmonari generato mediante iniezione endovenosa di cellule GFP + VO-PyMT (verde) in una di tipo selvatico, non giornalista, mouse. I polmoni sono state raccolte due settimane dopo che le cellule VO-PyMT sono stati iniettati. Gr-1 + cellule sono etichettati con GR-1 647 anticorpo coniugato e osservato nel canale dell'infrarosso vicino (bianco). Si noti che GR-1 le cellule sono reclutati per la metastasi GFP +. Questo film è un esempio di acquisizione a lungo termine, per un totale di 11 h 27 min.
Movie 4. (clic destro per il download). Motilità delle cellule immunitarie visualizzati da anticorpi fluorescente-coniugati in un topo transgenico giornalista iniettato con cellule metastatiche. Questo film mostra una singola cellula GFP + VO-PyMT nel polmone generato mediante iniezione endovenosa di VO- cellule PyMT (verde) in un mouse ACTB-ECFP. I polmoni sono state raccolte una settimana dopo le cellule VO-PyMT sono stati iniettati. Gr-1 + cellule sono etichettati con GR-1 647 anticorpo coniugato e osservato nel canale dell'infrarosso vicino (bianco). Questo film è un 2 hr acquisizione lungo 40 min.
Movie 5. (clic destrok per il download). cellule metastatiche e capillari visualizzati da destrani fluorescenti immediatamente dopo l'iniezione endovenosa in un topo giornalista transgenico. Questo film mostra metastasi sperimentale generato mediante iniezione endovenosa di cellule GFP + VO-PyMT (verde) in un mouse ACTB-ECFP insieme al iniezione di rodamina-coniugato, 70 kD destrano (rosso) e 10 kD destrano coniugato ad un 647 tag fluorescente (bianco), per contrassegnare vasi sanguigni. Questo film è un esempio di una deriva tessuti ed è un'acquisizione lunga 18 min.
Film 6. (Tasto destro del mouse per scaricare). Cellule metastatiche e capillari visualizzati da destrani fluorescenti diverse ore dopo l'iniezione endovenosa in un topo transgenico giornalista. Questo film mostra metastasi sperimentale generared mediante iniezione endovenosa di cellule GFP + VO-PyMT (verde) in un mouse ACTB-ECFP con l'iniezione di rodamina-coniugato, 70 kD destrano (rosso) e 10 kD destrano coniugato a un tag 647 fluorescente (bianco), per contrassegnare vasi sanguigni. I polmoni sono stati recuperati 4 ore dopo l'iniezione delle cellule VO-PyMT. Questo film è una lunga acquisizione 19 min.
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Discussion
Questo manoscritto descrive un metodo dettagliato per ex vivo l'imaging dal vivo di metastasi polmonare in modelli murini di metastasi. Questo protocollo di imaging fornisce una visualizzazione diretta delle interazioni tumore a cellule-stroma dinamici e spaziali all'interno del microambiente polmonare. Si tratta di un metodo relativamente semplice e veloce che permette l'imaging affidabile di metastasi polmonari per almeno 4 ore. Film acquisiti da questi esperimenti possono essere utilizzati per monitorare i processi dinamici come la motilità cellulare e interazioni cellulari.
sono stati descritti due metodi per la generazione di metastasi polmonari: un modello di topo geneticamente e l'uso di una linea cellulare manipolato. Il modello di topo MMTV-PyMT ricapitola la progressione del cancro al seno e metastasi polmonari spontanea. Altre tecniche che ricapitolano diffusione metastatica sono inoltre disponibili, per esempio., Il trapianto ortotopico di cellule nella ghiandola mammaria 20. Un iniettata per via endovenosa VO-PyMT clinea ell viene utilizzato per mimare la semina e la conseguenza di metastasi del cancro al seno. L'indennità di tempo per escrescenza cellulare VO-PyMT dipende dalla preferenza sperimentale per la fase di metastasi polmonari. A seconda del numero di cellule iniettate, micrometastasi possono essere osservati entro alcuni giorni a 2 settimane dopo l'iniezione delle cellule VO-PyMT.
Per l'imaging polmonare ottimale, grande cura deve essere presa durante il gonfiaggio dei polmoni. Per l'inflazione corretto, l'ago deve essere inserito solo 4-5 mm nella trachea. Più profondo inserimento dell'ago può causare parziale inflazione unilaterale dei polmoni. Inoltre, i polmoni dovrebbero essere guardato durante l'inflazione reale per evitare un eccesso di gonfiaggio che può causare danni ai tessuti. Inoltre, è fondamentale per mantenere il polmone sterile come possibile, in modo che le cellule immunitarie nei polmoni non saranno in discussione.
Per ogni esperimento di imaging in tempo reale, l'equilibrio ottimale tra la quantità di acquisizione dati e the il potenziale di danno tissutale causato da esposizione a laser eccessiva deve essere considerato. È importante ottimizzare le impostazioni per l'acquisizione di immagini eseguendo esperimenti pilota. Inoltre, si raccomanda di mantenere la potenza del laser verso il basso durante la ricerca di campi ottimali di vista e / o per mantenere l'otturatore quando le immagini non vengono acquisite.
La motilità del cancro e / o cellule immunitarie di interesse è uno degli indicatori per la vitalità cellulare. La motilità è sensibile alla temperatura, livelli di ossigeno e fototossicità 7. Tuttavia, l'inibizione o la mancanza di motilità possono non essere correlati a condizioni di imaging o problemi tecnici, ma piuttosto biologico. Inibizione della motilità può derivare da un certo effetto terapeutico o dal arresto delle cellule metastatiche appena prima della loro proliferazione nella microcircolo del polmone e loro stravaso nel parenchima polmonare 21,22. Può quindi essere importante per corroborare tali dati utilizzando aggiuntivitecniche (come i test di migrazione in cultura 2D) 23.
Inoltre, questo metodo di imaging polmonare ex vivo è sufficiente per uno studio a breve termine che non richiede microcircolazione polmonare. Utilizzando questo metodo, il movimento del cancro e / o cellule immunitarie si osserva per almeno 4 ore. Prima di acquisizione delle immagini, ci vogliono circa 30 minuti per preparare i polmoni e 30-60 min per trovare posizioni per l'acquisizione. Anche se la motilità delle cellule si osserva al di là di 4 ore (fino a 11 ore, Film 3), l'imaging prolungata dipende dai particolari tipi di cellule studiate, le condizioni utilizzate (ad es., Ridotta di ossigeno), e deve essere determinato per un particolare apparato sperimentale. Inoltre, a causa della mancanza del microcircolo e il possibile impatto delle modifiche post mortem o nel caso ci sia un razionale per la necessità di verificare i risultati in presenza di un microcircolazione intatta, imaging intravitale polmone con una finestra di aspirazione toracica può essere utilizzato. Tuttavia, è still una sfida per eseguire l'imaging polmonare intravitale su più giorni utilizzando una finestra di imaging come eseguita in cervello, ghiandola mammaria e organi addominali 5 a causa delle difficoltà nel mantenere una sufficiente pressione negativa. Come metodo alternativo per la perfusione di ex vivo polmoni intatti, il metodo polmone isolato-perfuso è stato precedentemente usato per studiare metastasi polmonari. Tuttavia, questo metodo viene spesso utilizzato per animali più grandi. Dal momento che i topi hanno più piccole cavità toracica, essi rappresentano una vera sfida per la perfusione efficace 24.
Grazie alla dispersione della luce, la profondità imaging microscopia confocale spinning-disk è limitato. Come conseguenza, la visualizzazione delle dinamiche cellulari e interazioni cellulari è limitato a metastasi polmonari superficiali. Metastasi polmonari sono arricchiti in periferia polmonare poiché le cellule metastatiche sono limitate dai capillari che diminuiscono in dimensioni verso i margini esterni del polmone 1. Inoltre, è bissier per mantenere la vitalità delle cellule più vicino alla superficie del polmone come hanno preferito l'accesso ai mezzi di comunicazione e di ossigeno. Per permettere la visualizzazione più in profondità nei polmoni, l'imaging dal vivo delle sezioni polmonari può essere eseguita. Tuttavia, dovrebbe essere previsto notevole quantità di morte cellulare. In alternativa, la microscopia multiphoton può essere condotta, consentendo una maggiore penetrazione nei tessuti. Inoltre, l'imaging multiphoton genera un segnale ottico intrinseco, chiamato generazione di seconda armonica (SHG), che permette la visualizzazione di strutture non centrosimmetriche nella matrice extracellulare, come collagene 1 fibre.
Come mostrato in questo studio, tumore e il comportamento delle cellule immunitarie in metastasi polmonari possono essere seguiti e analizzati utilizzando topi reporter fluorescenti, le cellule tumorali manipolate e traccianti o anticorpi fluorescente. Questa metodologia potrebbe essere modificato per lo studio di altre cellule e determinanti nel microambiente metastatico. A tal fine, ci sono vari trtopi reporter ansgenic disponibili per lo studio delle cellule stromali compresi quelli per i fibroblasti come FSP1-EGFP 4, alfa-SMA-RFP 25 e COL1A1-EGFP 25 o cellule endoteliali come Tie2-GFP 26.
Cellulare colorazione su sezioni di polmone dal vivo è stata eseguita a visualizzare popolazioni di cellule immunitarie 8. Questa strategia colorazione può essere adottato come alternativa per l'acquisizione di immagini multi-color. Tuttavia, la maggioranza dei marcatori spesso etichettare più popolazioni cellulari invece di una popolazione di cellule distinte. Iniettabili che vengono ripresi da specifiche popolazioni cellulari 4 o fluorescente anticorpi contro marcatori di cellule aggiuntive possono essere utilizzate per differenziare ulteriormente tra le popolazioni. L'uso di colori fluorescenti differenti per etichettare le varie cellule di interesse è preferito per l'imaging. Nei casi in cui l'uso di coloranti fluorescenti diverse non può essere eseguita (ad es., A causa della limitata chann immaginiels), è possibile immagine diversi tipi cellulari con reporter fluorescente stessi finché sono facilmente distinguibili per forma e / o localizzazione anatomica.
Oltre a studiare vari tipi cellulari, varie classi di chemioterapici sono debolmente fluorescenti (ad esempio doxorubicina). Questi chemioterapici possono in linea di principio essere utilizzati per visualizzare drug delivery e distribuzione in metastasi polmonari in modo simile come nel tumore primario 19. Altre terapie mirate che potrebbero essere fluorescente possono essere utilizzati anche in ex dell'imaging polmonare vivo. In particolare, i dati acquisiti con imaging polmonare potrebbe essere più informato sulla quale le cellule prendono-up questi farmaci e la loro interazione con altre cellule nel microambiente metastatico oltre alla stravaso di queste terapie da vasi sanguigni attivi. Questa tecnica può essere ulteriormente utilizzato per lo studio del cancro polmonare primario 27 o adattato per lo studio di altro polmonepatologie -related che possono influenzare il microambiente polmone 28,29.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MMTV-PyMT/FVB mice | Jackson Laboratory | 2374 | Female mice |
| ACTB-ECFP/FVB mice | UCSF Werb lab | Female mice | |
| c-fms-EGFP/FVB mice | UCSF Werb lab | Female mice | |
| FVB mice | Jackson Laboratory | 1800 | Female mice |
| GFP+ VO-PyMT cells | UCSF Werb lab | ||
| 70,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated | Invitrogen | D1818 | Dilute to 4mg/ml in 1 x PBS and store at -20 °C. Use 0.4 mg per animal. |
| 10,000 kDa Dextran, Alexa Fluor 647 conjugated | Invitrogen | D22914 | Dilute to 4mg/ml in 1 x PBS and store at -20 °C. Use 0.4 mg per animal. |
| Anti-mouse Gr-1 antibody Alexa Fluor 647 | UCSF Monoclonal antibody core | Stock 1mg/ml. Use 7 ug per animal. | |
| Anesthetic | Anesthesia approved by IACUC, used for anesthesia and/or euthanesia | ||
| 1X PBS | UCSF cell culture facility | ||
| PBS, USP sterile | Amresco INC | K813-500ML | Ultra pure grade for i.v. injection |
| Styrofoam platform | Will be used as dissection board | ||
| Fine scissors sharp | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Forceps | Roboz Surgical Store | RS-5135 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn ON 30min before use |
| Air | UCSF | ||
| Oxygen | UCSF | ||
| Carbon dioxide | UCSF | ||
| 1 mL syringe without needle | BD | 309659 | |
| 27 G x 1/2 needle | BD | 305109 | for i.v. injection |
| 20 G x 1 needle, short bevel | BD | 305178 | |
| Low-melting-temperature agarose | Lonza | 50111 | To make 10 ml of solution, weigh 0.2 g of agarose, add to 10 ml 1 x PBS, and heat to dissolve. Agarose will solidify at room temperature, so maintain in a 37 °C water bath until used for inflation. |
| RPMI-1640 medium without phenol red | Life Technologies | 11835-030 | |
| 24 well Imaging plate | E&K scientific | EK-42892 | |
| Glass cover slides, 15 mm | Fisher Scientific | 22-031-144 | |
| Digital CO2 and temperature controller | Okolab | DGTCO2BX | http://www.oko-lab.com |
| Climate chamber | Okolab | http://www.oko-lab.com | |
| Cell Observer spinning disk confocal microscope | Zeiss | ||
| Zen software | Zeiss | ||
| Inverted microscope | Carl Zeiss Inc | Zeiss Axiovert 200M | |
| ICCD camera | Stanford Photonics | XR-Mega-10EX S-30 | |
| Spinning disk confocal scan-head | Yokogawa Corporation | CSU-10b | |
| Imaris | Bitplane | ||
| mManager | Vale lab, UCSF | Open-source software |
References
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