Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Ex vivo Live avbildning av lungmetastas och deras mikromiljö

Published: February 3, 2016 doi: 10.3791/53741
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1,3
1Department of Anatomy, University of California, 2Hubrecht Institute-Royal Dutch Academy of Science and University Medical Center Utrecht, 3Department of Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine
* These authors contributed equally

Abstract

Metastas är en viktig orsak för cancerrelaterad sjuklighet och dödlighet. Metastas är en flerstegsprocess och på grund av dess komplexitet, de exakta cellulära och molekylära processer som styr metastatisk spridning och tillväxt är fortfarande svårfångade. Live avbildning möjliggör visualisering av dynamiska och rumsliga interaktioner mellan celler och deras mikromiljö. Fasta tumörer metastaserar vanligen till lungorna. Emellertid den anatomiska lokaliseringen av lungorna utgör en utmaning för intravital avbildning. Detta protokoll ger en relativt enkel och snabb metod för ex vivo levande avbildning av det dynamiska samspelet mellan tumörceller och deras omgivande stroma inom lungmetastaser. Med användning av denna metod kan motiliteten av cancerceller såväl som interaktioner mellan cancerceller och stromaceller i deras mikromiljö visualiseras i realtid under flera timmar. Genom att använda transgena fluorescerande reporter möss, en fluorescerande cellinje, injicerbara fluorescerandemolekyler och / eller antikroppar, multipla komponenter i lungan mikromiljön kan visualiseras, såsom blodkärl och immunceller. Att avbilda olika celltyper, har en roterande skiva konfokalmikroskop som tillåter långsiktig kontinuerlig avbildning med snabb, fyra färgbild förvärv använts. Time-lapse filmer som sammanställts från bilder som samlats in under flera positioner och fokalplan visar interaktioner mellan levande metastaserande och immunceller under minst fyra timmar. Denna teknik kan användas för att ytterligare testa kemoterapi eller målsökande behandling. Dessutom kan detta förfarande anpassas för studiet av andra lungrelaterade patologier som kan påverka lungmikromiljö.

Protocol

Alla förfaranden som beskrivs måste utföras i enlighet med de riktlinjer och regler för användning av ryggradsdjur, inklusive förhandsgodkännande från den lokala Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC).

1. Framställning av lungmetastaser för Ex vivo Live Imaging (Transgena eller injektion i svansvenen)

OBS: Lungmetastaser kan genereras genom användning av genetiskt manipulerade musmodeller eller genom intravenös (iv) injektion av cancerceller.

  1. Generera lungmetastaser för avbildning genom att korsa en genetiskt tumör musmodell i en transgen reporter mus, t ex över bröstcancer musmodell musbrösttumörvirus lång terminal upprepad polyoma mitten T-antigen (MMTV-pymt) 11 i ACTB-ECFP musmodell 12.
    OBS! ACTB-ECFP modellen uttrycker förbättrad cyan fluorescerande protein (ECFP) under β-acti promotor så att alla celler fluorescerar i det blå, GFP kanal. Emellertid cancerceller är den överlägset mest framträdande och visas som en bulk av ECFP-positiva celler under mikroskop. MMTV-pymt musmodell utvecklar en progressiv sjukdom, där brösttumörtillväxt är förknippad med spridning av cancerceller till periferin, i synnerhet till lungorna. I MMTV-pymt möss på FVB / n bakgrund, kan observeras mikrometastaser runt 10-11 veckors ålder. I allmänhet är dessa framsteg macrometastases på cirka 14 veckor 13 års ålder.
    ELLER
  2. Generera experimentella metastaser med hjälp av primära celler eller syngena cellinjer. Användning i primära tumör vitro manipulerade celler eller cellinjer (t ex., Transduktion) följt av intravenös injektion 14.
    1. I korthet, i detta protokoll, injicera ett grönt fluorescerande protein (GFP) uttryckande (+) MMTV-pymt cellinje i fluorescerande reporter möss (ACTB-ECFP) eller vildtyp möss. Sedan,visualisera dessa celler kallas VO-pymt celler 15 med hjälp av gröna, GFP kanal.
      OBS: Den ursprungliga VO-pymt cellinje härleddes vid Vanderbilt ortopedi i Nashville, TN. VO står för Vanderbilt Orthopaedics.
    2. Efter injektion av 10 6 celler (i 200 pl), observera cancercell extravasering omedelbart och upp till några timmar efter injektion; observera mikrometastaser mellan 1-3 veckor efter injektion och upptäcka macrometastases 3 veckor efter injektionen 15.
      OBS: Färre celler kan injiceras för att förlänga tiden från injektion till metastatisk tillväxt.

2. Märkning av komponenter av intresse i metastatisk mikromiljö (transgena och / eller Injicerbara)

OBS: Märkning kan åstadkommas genom att transgena möss och / eller genom olika injicerbara preparat. Se till att använda olika fluorescerande färger för märkning av olika celltyper.

  1. Etikett komponenter i metastaserande mikro hjälp av transgena möss. Korsa den tidigare nämnda mus-tumörmodell (t ex., MMTV-pymt x ACTB-ECFP) in i en transgen musmodell vari stromala celler av intresse är märkta med ett fluorescerande protein som inte är ECFP, eg., C-fms-EGFP 4,16.
    OBS: Förutom visualisering av cancerceller i GFP-kanalen, möjliggör detta visualisering av myeloidceller i GFP kanalen 4.
    OCH / ELLER
  2. Märka olika komponenter i den metastatiska mikromiljö med användning av injicerbara in i transgena fluorescerande reporter möss eller (icke-fluorescerande) vildtyp möss.
    OBS: Flera föreningar kan injiceras för att märka olika komponenter i den metastatiska mikromiljö, t ex, är en AF647-konjugerad Gr-1-antikroppen som används här för att märka neutrofiler och några monocyter 13 och med olika molekylvikt dextraner användsatt märka lungkapillärerna. För framställning av dessa injicerbara se steg 4.

3. Beredning av material före dissekering

  1. 2% agaros
    1. Väg 0,2 g agaros och lägg till 10 ml 1 x PBS. Värm lösningen för upplösning av agarosen. Agaros kommer att stelna vid RT, så bibehålla den i ett 37 ° C vattenbad tills de användes för uppblåsning.
  2. CO2 och temperaturregulator
    1. Kontrollera DDH 2 O i befuktningskammaren. Fylla på när det behövs. Sätt konfiguration plattan i temperaturstadiet hållare (klimatkammare). Slå på CO 2 regulatorn och ställ in CO2 vid 5%. Se till att luftflödet är satt till 0,4 Nl / min.
    2. Öppna luft och CO 2 ventiler. Slå på temperaturreglaget. Se till att temperaturen i klimatkammaren och locket är inställda vid 37 ° C.
    3. Släpp lufttrycket på CO 2 meter. Ta CO 2 ökar, equilibration kan ta upp till 30 min.
  3. Spinning disk konfokalmikroskop
    OBS: Detaljer för mikroskopet set-up har tidigare beskrivits 4,17.
    1. Slå på lasrar (argon laser för 488 nm excitation och den fast beskaffade 405 nm, 561 nm och 640 nm lasrar). Slå på mikroskopet, kameran, i spinnskivan styrenhet, AOTF, laserstyrenheten och kameran styrenheten.
    2. Öppna mikroskop slutare, slå på datorn som kör mikroskopet och öppna programmet.
  4. Framställning av verktyg och dissekering plattform.
    1. Slå på den varma pärla autoklav och låt den nå 250 ° C. Ren 2 par av kirurgiska saxar och pincetter med vatten och tvål. Sterilisera verktyg för att åtminstone 30 sekunder. Låt verktygen svalna. Använd ett lock polystyren som dissektion plattform. Täck den med en bit lab soaker.

4. Beredning av injektioner

OBS: Beroende på halveringstiden och den föredragna svar injicera fluorescerande antikroppar och / eller fluorescerande molekyler antingen omedelbart före djuroffer eller ett par timmar till dagar innan.

  1. Till bilden Gr1-positiva neutrofiler och monocyter, förbereda en spruta med 7 pl av lager AF647-konjugerad Gr-1-antikroppen (1 mg / ml) i 100 | il av steril PBS under huven. Placera en 27 G ½ nålen på sprutan.
  2. Till bildlung kapillärer, förbereda en andra och tredje spruta med 100 | il av antingen 70 kD rodamin-konjugerat dextran (4 mg / ml) eller 10 kD AF647-konjugerat dextran (4 mg / ml). Placera en 27 G ½ nål på sprutor.
  3. Injicera AF647-konjugerade antikroppen lösning IV 5 h före lungorna excision.
  4. Injicera en eller båda dextranlösningar iv omedelbart före lungorna excision.

5. Beredning av lungor för Ex vivo Live Imaging

OBS: Försök att arbeta som steril och noggrann som möjligt för att undvika onödiga utmaningar av immunceller i lungorna.

  1. Injicera musen intraperitoneal (ip) med en dödlig överdos av narkosmedel tillåts av djurprotokoll godkändes av IACUC, t ex., 1 ml 2,5% Avertin. Vänta musen för att sluta andas och vara helt icke-mottaglig för skadlig stimuli (baktass nypa).
    OBS: Halsdislokation och koldioxid eutanasi bör undvikas eftersom det menligt kan påverka lung cellviabilitet.
  2. Immobilisera musen på en dissektion ombord och sterilisera musen med 70% etanol.
  3. Använda kirurgisk sax för att först göra en tvärgående epigastrisk snitt genom huden, följt av ett liknande snitt genom bukhinnan. Håll dissektion kortet i en vertikal position och skär nedåtgående aorta, så att blod pooler ned i buken och inte i brösthålan.
  4. Skväva en liten öppning i membranet för att frigöra vakuum. Skär längs den 10: e och 12: e revbenet för att skära membranet och få visuell åtkomst till lungorna.
  5. Använd kirurgisk sax för att skära in i huden upp till luftstrupen över bröstkorgen men lämna bröstkorgen intakt. Separera huden från bröstkorgen. Exponera luftstrupen genom att ta bort den omgivande bindväv, försiktigt så att inte skada luftstrupen själv (Figur 1A).
  6. Snip en liten öppning approximativt 1 mm i diameter i den exponerade luftstrupen parallellt med broskartade ringar, så nära struphuvudet som möjligt (Figur 1B). Var noga med att inte skära helt genom luftstrupen.
  7. Ta en 20 G nål och försiktigt in nålen 4-5 mm i luftstrupen utan motkraft (figur 1D). I slutet av nålen ska vara synlig genom luftstrupen (Figur 1C). Använd pincett för att stabilisera nålen i luftstrupen. Alternativt kan en sutur knytas around luftstrupen för att hålla nålen på plats.
    OBS: Genom att sätta in för djupt, kan carina vara traumatiserade eller endast en sida av lungorna kan blåsas upp.
  8. Fyll en spruta med 400 | il av 37 ° C 2% låg smälttemperatur agarosgel (tas direkt från ett bad med konstant temperatur). Se till att dissektion styrelse står upp och sakta ingjuta den varma agaros genom nålen in i lungorna, använda ~ 400 | il för att blåsa lungorna.
    OBS: Titta på lungorna blåsa i bröstkorgen. Inte över blåsa lungan eftersom det kommer att brista.
  9. När lungorna är uppblåsta, fyller ~ ⅔ av bröstkorgen, ta bort sprutan och hålla nålen i luftstrupen för att förhindra agaros läcker.
  10. Häll ca 50 ml av 20 ° C PBS över de uppblåsta lungor för att tillåta agarosen inne i lungorna för att ställa in och stelna. Sakta ut kanylen och stänger luftstrupen med pincett för att förhindra icke-stelnade agarosen från att läcka. </ Li>
  11. Exponera lungorna genom att utföra en sternotomi och därefter skära lungorna. För excision av lungorna, håller på till luftstrupen medan skär genom luftstrupen helt. Dra försiktigt luftstrupen upp, skära bort bindväv och matstrupe samtidigt som du drar lungorna ur brösthålan tills lungorna är separerad från mus (figur 1E).
  12. Doppa lungorna i varma RPMI-1640 för att tvätta bort stora mängder blod och försiktigt separera lober med sax och pincett för att klippa lober "huvudstam bronker vid hilum (figur 1F).
  13. Placera lober, med den plana ytan ner för att maximera bildytan, i en brunn på en 24-brunnsbildplatta (figur 1G). Tillsätt 100 pl av 37 ° C RPMI-1640 ovanpå loberna. Placera flera 15 mm cirkulär mikroskop täckskivor ovanpå loberna att förhindra den från att flyta.
  14. Häll varmt PBS i de omgivande brunnarna för att förhindra RPMI-1640 media från avdunstningsorating. Sätt i 24-brunnar i den ekvilibrerade klimatkammaren och upprätthålla lunglober vid 37 ° C med luft och 5% CO2. Sätt i klimatkammaren på scenen av konfokalmikroskop.
    OBS: Andra gasblandningar (t.ex., 5% O2, 5% CO2 i N2 för att undersöka cellbeteende under betingelser av hypoxi / lägre syre) kan också övervägas.

Figur 1
Figur 1. Protokoll för framställning av lungor för levande avbildning. (A) Exponering av luftstrupen efter framställning av musen. (B) Liten klipp görs i den exponerade luftstrupen parallellt med broskringarna. (C) 20 G nål införas 4-5 mm in i luftstrupen. (D) Instillation av 400 | il 2% låg smälttemperatur agarosen in i lungorna. (E) inflated lungor separeras från mus. (F) lober separerade efter inflation. (G) lober placerad i en brunn i en 24-brunnsbildplatta. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

6. Förvärv och analys av bilder

OBS: Bilderna kan förvärvas med en mängd spinning disk konfokala mikroskop som stöds av olika program. I detta protokoll, antingen μManager med en skräddarsydd snurrande skiva konfokalmikroskop eller Zen med ett kommersiellt tillgängligt spinning disk konfokalmikroskop används för bildtagning, medan Imaris används för filmredigering och analys.

  1. Förvärva bilder med hjälp μManager. En detaljerad steg för steg protokoll för förvärv av bilder med hjälp av μManager programvara tidigare beskrivits 18.
    ELLER
  2. få bildermed hjälp av bildanalys program som Zen (se figur S1).
    1. Klicka på "Leta upp fliken och välj objektiv (10x eller 20x) i" Ljus Path "verktyg (Figur S1A, röd ruta). Därefter klickar du på "Eyes - DAPI" att titta på GFP kanal genom okularet (Figur S1A, blå rutan). Lokalisera provet manuellt med mikroskop. Klicka på "Alla Off'after vävnaden är centrum av synfältet.
    2. Klicka på fliken "Förvärv" att ställa in alla parametrar för bildtagning.
    3. I "kanaler" verktyg, klicka på "+" knappen (Figur S1B, röd ruta). En popupmeny visas och söka efter färgämnet (s) som finns i provet i "Dye Database" (Figur S1B). Välj färg och klicka på "Lägg till".
      OBS: Programmet kommer att ställa alla filter som ska optimeras. Ett färgämne kan tas bortgenom att välja det följt genom att klicka på knappen för papperskorgen (figur S1B, gul ruta).
    4. I "Förvärv Mode 'menyn, ställ" binning "till 5x5. Dubbelklicka på ECFP i kanalerna menyn för att välja det. Sänk lasereffekt till 20% så att provet inte kommer att blekt medan du ställer in parametrar för bildtagning.
    5. Kontrollera "plattor" rutan i "Experiment Manager 'sektionen och kakel verktyget visas i" Multidimensional Acquisition "verktygsgruppen (Figur S1C). Klicka på "Avancerade inställningar" för att se den levande bilden från kameran. Klicka på "Lägg till" -knappen i "Positioner avsnittet för att lägga till 4 till 6 positioner experimentet. För att ta bort en position, väljer den positionen och klicka på papperskorgen knappen.
    6. I "Förvärv Parameter" verktygsgruppen, öppna "Focus strategin verktyg och välj" Absolute Fast Z-läge "från rullgardinsmenyn.
    7. Kontrollera Z-Stack rutan i "Experiment Manager 'sektionen och Z-Stack verktyg visas i" Multidimensional Acquisition "verktygsgruppen (Figur S1D). Dubbelklicka på en av positionerna i "Positioner avsnittet och tryck på" Live ". Manuellt först och ställa sista positionen i bildfältet. Ställa in intervallet på 4 ^ m.
      OBS: Programmet kommer att avgöra hur många skivor för den valda intervall och intervall. Helst 5-7 skivor är bekvämt att ge tillräcklig visualisering och snabb bildtagning.
    8. Kontrollera "Time Series" rutan i "Experiment Manager 'avsnittet. Ställ in önskad "Längd" och "Intervall" gånger i "Time Series" verktyg som dök upp i "Multidimensional Acquisition" verktygsgruppen (Figur S1E).
    9. I 'förvärvtion Läge "menyn, ställ" binning "till 2x2. Dubbelklicka på en fluorofor i kanalerna menyn för att välja det och öka lasereffekt till 100%. Tryck "Live" och justera "Exposure Time". Upprepa detta för varje fluorofor.
    10. Kontrollera "Aktivera automatisk Spara rutan. Välj en mapp och skriv in namnet på filen. Alla de förvärvade bilderna sparas automatiskt i den här mappen.
    11. Klicka på "Start Experiment" i "Experiment Manager 'avsnittet för att starta bildtagning.
  3. Efter bildtagning, sammanställa rådata i Imaris programvara. Konvertera bilder till .ims filer och justeringar kan göras. En detaljerad steg för steg protokoll för konvertering av filer, göra justeringar och spara filmer med hjälp av Imaris är tidigare beskrivits 18.
  4. När du sparar filmen, ställ in "Frame Rate" till 5 bilder per sekund (fps).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MMTV-PyMT/FVB mice Jackson Laboratory 2374 Female mice
ACTB-ECFP/FVB mice UCSF Werb lab Female mice
c-fms-EGFP/FVB mice UCSF Werb lab Female mice
FVB mice Jackson Laboratory 1800 Female mice
GFP+ VO-PyMT cells UCSF Werb lab
70,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated Invitrogen D1818 Dilute to  4mg/ml in 1 x PBS and store at -20  °C. Use 0.4 mg per animal. 
10,000 kDa Dextran, Alexa Fluor 647 conjugated Invitrogen D22914 Dilute to  4mg/ml in 1 x PBS and store at -20  °C. Use 0.4 mg per animal. 
Anti-mouse Gr-1 antibody Alexa Fluor 647 UCSF Monoclonal antibody core Stock 1mg/ml. Use 7 ug per animal.
Anesthetic Anesthesia approved by IACUC, used for anesthesia and/or euthanesia
1X PBS UCSF cell culture facility
PBS, USP sterile  Amresco INC K813-500ML Ultra pure grade for i.v. injection
Styrofoam platform Will be used as dissection board
Fine scissors sharp  Fine Science Tools 14060-11
Forceps Roboz Surgical Store RS-5135
Hot bead sterilizer Fine Science Tools 18000-45 Turn ON 30min before use
Air UCSF
Oxygen UCSF
Carbon dioxide UCSF
1 mL syringe without needle  BD 309659
27 G x 1/2 needle   BD 305109 for i.v. injection
20 G x 1 needle, short bevel   BD 305178
Low-melting-temperature agarose  Lonza 50111 To make 10 ml of solution, weigh 0.2 g of agarose, add to 10 ml 1 x PBS, and heat to dissolve. Agarose will solidify at room temperature, so maintain in a 37 °C water bath until used for inflation.
RPMI-1640 medium without phenol red Life Technologies 11835-030
24 well Imaging plate  E&K scientific EK-42892
Glass cover slides, 15 mm  Fisher Scientific 22-031-144
Digital CO2 and temperature controller Okolab DGTCO2BX http://www.oko-lab.com
Climate chamber Okolab http://www.oko-lab.com
Cell Observer spinning disk confocal microscope Zeiss
Zen software Zeiss
Inverted microscope Carl Zeiss Inc Zeiss Axiovert 200M
ICCD camera Stanford Photonics XR-Mega-10EX S-30
Spinning disk confocal scan-head Yokogawa Corporation CSU-10b
Imaris Bitplane
mManager Vale lab, UCSF Open-source software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
  2. Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells. Cell stem cell. 16 (3), 225-238 (2015).
  3. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
  4. Egeblad, M., Ewald, A. J., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1 (2-3), 155-167 (2008).
  5. Ellenbroek, S. I. J., van Rheenen, J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nat Rev Cancer. 14 (6), 406-418 (2014).
  6. Looney, M. R., Thornton, E. E., Sen, D., Lamm, W. J., Glenny, R. W., Krummel, M. F. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  7. Thornton, E. E., Krummel, M. F., Looney, M. R. Live imaging of the lung. Cur Protoc Cytom. , (2012).
  8. Thornton, E. E., Looney, M. R., et al. Spatiotemporally separated antigen uptake by alveolar dendritic cells and airway presentation to T cells in the lung. J Exp Med. 209 (6), 1183-1199 (2012).
  9. Mendoza, A., Hong, S. -H., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
  10. Lelkes, E., Headley, M. B., Thornton, E. E., Looney, M. R., Krummel, M. F. The spatiotemporal cellular dynamics of lung immunity. Trends Immunol. 35 (8), 379-386 (2014).
  11. Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Mol Cell Biol. 12 (3), 954-961 (1992).
  12. Hadjantonakis, A. -K., Macmaster, S., Nagy, A. Embryonic stem cells and mice expressing different GFP variants for multiple non-invasive reporter usage within a single animal. BMC Biotechnol. 2, (2002).
  13. Casbon, A. -J., Reynaud, D., et al. Invasive breast cancer reprograms early myeloid differentiation in the bone marrow to generate immunosuppressive neutrophils. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (6), 566-575 (2015).
  14. Donovan, J., Brown, P. Parenteral injections. Curr Protoc Immunol. , (2006).
  15. Halpern, J., Lynch, C. C., et al. The application of a murine bone bioreactor as a model of tumor: bone interaction. Clin Exp Metastas. 23 (7-8), 345-356 (2006).
  16. Sasmono, R. T., Oceandy, D., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  17. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harb Protoc. (2), (2011).
  18. Bonnans, C., Lohela, M., Werb, Z. Real-time imaging of myeloid cells dynamics in ApcMin/+ intestinal tumors by spinning disk confocal microscopy. J Vis Exp. (92), (2014).
  19. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer cell. 21 (4), (2012).
  20. Cheng, N., Lambert, D. L. Mammary transplantation of stromal cells and carcinoma cells in C57BL/6J mice. J Vis Exp. (54), (2011).
  21. Al-Mehdi, A. B., Tozawa, K., Fisher, A. B., Shientag, L., Lee, A., Muschel, R. J. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat Med. 6 (1), 100-102 (2000).
  22. Wong, C. W., Song, C., et al. Intravascular location of breast cancer cells after spontaneous metastasis to the lung. Am J Pathol. 161 (3), 749-753 (2002).
  23. Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
  24. Nelson, K., Bobba, C., Ghadiali, S., Hayes, D. J., Black, S. M., Whitson, B. A. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World J Exp Med. 4 (2), (2014).
  25. Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40 (5), 1151-1159 (2004).
  26. Motoike, T., Loughna, S., et al. Universal GFP reporter for the study of vascular development. Genesis. 28 (2), (2000).
  27. Srivastava, M. K., Andersson, A., et al. Myeloid suppressor cells and immune modulation in lung cancer. Immunotherapy. 4 (3), (2012).
  28. Craig, A., Mai, J., Cai, S., Jeyaseelan, S. Neutrophil recruitment to the lungs during bacterial pneumonia. Infect Immun. 77 (2), 568-575 (2009).
  29. Kreisel, D., Nava, R. G., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).
<em>Ex vivo</em> Live avbildning av lungmetastas och deras mikromiljö
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

van den Bijgaart, R. J. E., Kong,… More

van den Bijgaart, R. J. E., Kong, N., Maynard, C., Plaks, V. Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment. J. Vis. Exp. (108), e53741, doi:10.3791/53741 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter