Summary
نحن تصف طريقة بسيطة نسبيا لخارج الجسم الحي التصوير الحي للورم التفاعلات خلية سدى داخل ورم خبيث في الرئة، وذلك باستخدام صحفيين الفلورسنت في الفئران. باستخدام الغزل القرص مبائر المجهر، هذه التقنية تمكن التصور من الخلايا الحية لمدة 4 على الأقل ساعة ويمكن تكييفها لدراسة الأمراض الرئوية الالتهاب الأخرى.
Abstract
ورم خبيث يشكل سببا رئيسيا للمراضة والوفيات المرتبطة بالسرطان. الانبثاث هي عملية متعددة الخطوات، ونظرا لتعقيدها، والعمليات الخلوية والجزيئية الدقيقة التي تحكم نشر المنتشر والنمو لا تزال بعيدة المنال. تصوير مباشر يسمح التصور من التفاعلات الديناميكية والمكانية للخلايا والمكروية بهم. الأورام الصلبة metastasize عادة إلى الرئتين. ومع ذلك، فإن الموقع التشريحي للرئتين يشكل تحديا لتصوير حيوي داخلي. يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة نسبيا وسريعة لخارج الجسم الحي التصوير الحي للتفاعلات الدينامية بين الخلايا السرطانية وسدى المحيط بهم داخل ورم خبيث في الرئة. باستخدام هذا الأسلوب، والقدرة على الحركة من الخلايا السرطانية فضلا عن التفاعل بين الخلايا السرطانية والخلايا اللحمية في المكروية التي يمكن تصور في الوقت الحقيقي لعدة ساعات. باستخدام المعدلة وراثيا الفئران مراسل الفلورسنت، خط خلية فلوري، عن طريق الحقن fluorescently المسمىجزيئات و / أو الأجسام المضادة، مكونات متعددة من المكروية الرئة يمكن تصور مثل الأوعية الدموية والخلايا المناعية. لصورة أنواع مختلفة من الخلايا، وقد استخدم قرص الغزل المجهر متحد البؤر التي تتيح التصوير المستمر على المدى الطويل مع الحصول على الصور السريع، أربعة ألوان. الوقت الفاصل بين الأفلام التي تم تجميعها من الصور التي تم جمعها خلال مواقف متعددة وطائرات التنسيق تظهر التفاعلات بين النقيلي الحية والخلايا المناعية لا يقل عن 4 ساعة. هذه التقنية يمكن زيادة استخدامها لاختبار العلاج الكيميائي أو العلاج الموجه. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييف هذه الطريقة لدراسة الأمراض ذات الصلة الرئة الأخرى التي قد تؤثر على المكروية الرئة.
Protocol
يجب أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات المذكورة وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح لاستخدام الحيوانات الفقارية، بما في ذلك الحصول على موافقة مسبقة من قبل المؤسسات ورعاية الحيوان المحلية واللجنة الاستخدام (IACUC).
1. الجيل الرئة الانبثاث لخارج الجسم الحي تصوير لايف (المعدلة وراثيا أو الذيل الوريد حقن)
ملاحظة: يمكن أن تتولد الانبثاث الرئة عن طريق استخدام نماذج الماوس المعدلة وراثيا أو عن طريق الوريد (IV) حقن الخلايا السرطانية.
- توليد الانبثاث الرئة للتصوير عن طريق عبور نموذج الفأر الورم وراثيا في الماوس مراسل المعدلة وراثيا، على سبيل المثال، عبر سرطان الثدي نموذج الماوس، ماوس الثديية فيروس الورم محطة الطويلة تكرار-التورام منتصف تي مستضد (MMTV-PyMT) 11 في ACTB-ECFP نموذج الفأر 12.
ملاحظة: نموذج ACTB-ECFP تعرب عن تعزيز البروتين الفلوري سماوي (ECFP) تحت β-عملفي المروج بحيث كل الخلايا يتألق في الزرقاء، قناة CFP. ومع ذلك، فإن الخلايا السرطانية إلى حد بعيد أبرز وتظهر بوصفها الأكبر من الخلايا ECFP إيجابي تحت المجهر. نموذج الفأر MMTV-PyMT يتطور المرض تدريجيا، حيث يرتبط نمو الورم الثديية مع نشر الخلايا السرطانية إلى المحيط، وخاصة إلى الرئتين. في الفئران MMTV-PyMT على FVB / ن الخلفية، micrometastases يمكن ملاحظة حول 10-11 أسابيع من العمر. عموما، هذه التقدم إلى macrometastases في حوالي 14 أسبوعا من العمر 13 عاما.
أو - توليد الانبثاث التجريبية باستخدام الخلايا الأولية أو خطوط الخلايا مسانج. استخدام في المختبر التلاعب الخلايا السرطانية الأولية أو خطوط الخلايا (على سبيل المثال، التنبيغ) تليها حقن د 14.
- لفترة وجيزة، في هذا البروتوكول، حقن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) -expressing (+) خط الخلية MMTV-PyMT في الفئران الفلورسنت مراسل (ACTB-ECFP) أو الفئران wildtype. ثم،تصور هذه الخلايا يشار إلى خلايا VO-PyMT 15 باستخدام الخضراء، قناة GFP.
ملاحظة: تم اشتقاق خط الخلية VO-PyMT الأصلي في جراحة العظام فاندربيلت في ناشفيل، تينيسي. VO لتقف على فاندربيلت العظام. - بعد حقن الخلايا 6 10 (في 200 ميكرولتر)، ومراقبة تسرب الخلايا السرطانية مباشرة وتصل إلى بضعة ساعات بعد الحقن. مراقبة micrometastases بين 1-3 أسابيع بعد الحقن وكشف macrometastases 3 أسابيع بعد الحقن 15.
ملاحظة: أقل الخلايا يمكن حقنها لإطالة وقت من الحقن لنمو النقيلي.
- لفترة وجيزة، في هذا البروتوكول، حقن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) -expressing (+) خط الخلية MMTV-PyMT في الفئران الفلورسنت مراسل (ACTB-ECFP) أو الفئران wildtype. ثم،تصور هذه الخلايا يشار إلى خلايا VO-PyMT 15 باستخدام الخضراء، قناة GFP.
2. وضع العلامات من مكونات الاهتمام في الإنتقالية المكروية (المعدلة وراثيا و / أو الحقن)
ملاحظة: وصفها يمكن أن يتحقق عن طريق الفئران المعدلة وراثيا و / أو عن طريق الحقن المختلفة. تأكد من استخدام الألوان الفلورسنت مختلفة لوضع العلامات على مختلف أنواع الخلايا.
- مكونات تسمية المكروية المتنقل باستخدام الفئران المعدلة وراثيا. عبور نموذج ورم الماوس المذكورة سابقا (على سبيل المثال، MMTV-PyMT س ACTB-ECFP) في نموذج الفأر وراثيا التي وصفت الخلايا اللحمية من الفوائد بنسبة بروتين فلوري الذي لا ECFP، على سبيل المثال.، ج-FMS-EGFP 4،16.
ملاحظة: بالإضافة إلى التصور من الخلايا السرطانية في قناة CFP، وهذا يمكن التصور من خلايا الدم النخاعي في القناة GFP 4.
و / أو - تسمية مختلف مكونات المكروية المتنقل باستخدام الحقن في الفئران مراسل فلوري المعدلة وراثيا أو (غير الفلورسنت) الفئران wildtype.
ملاحظة: العديد من المركبات ويمكن حقن لتسمية مختلف مكونات المكروية المنتشر، على سبيل المثال، يتم استخدام AF647 مترافق GR-1 الضد هنا لتسمية العدلات وتستخدم بعض وحيدات 13 و مختلفة dextrans الوزن الجزيئيلتسمية الشعيرات الدموية في الرئة. لإعداد هذه الحقن راجع الخطوة 4.
3. إعداد المواد قبل تشريح
- 2٪ الاغاروز
- تزن 0.2 غرام من الاغاروز وإضافة إلى 10 مل 1 × برنامج تلفزيوني. الحرارة الحل بحل الاغاروز. Agarose سوف يصلب على RT، لذلك الحفاظ عليه في 37 ° C حمام الماء حتى تستخدم للتضخم.
- CO 2 وتحكم في درجة الحرارة
- تحقق ده 2 O في غرفة الترطيب. إعادة ملء عند الحاجة. إدراج لوحة التكوين في درجة حرارة حامل مرحلة لوحة (غرفة المناخ). تشغيل وحدة تحكم CO 2 ومجموعة CO 2 بنسبة 5٪. تأكد من تعيين معدل تدفق الهواء عند 0.4 نيكولا لانغ / دقيقة.
- فتح الهواء وثاني أكسيد الكربون 2 الصمامات. تشغيل وحدة تحكم في درجة الحرارة. تأكد من ضبط درجة حرارة الغرفة المناخ والغطاء عند 37 درجة مئوية.
- الافراج عن الضغط الجوي على CO 2 متر. تحقق CO 2 زيادة، هquilibration قد يستغرق ما يصل إلى 30 دقيقة.
- الغزل القرص مجهر متحد البؤر
ملاحظة: تفاصيل المجهر انشاء وقد وصفت سابقا 4،17.- بدوره على الليزر (ليزر الأرجون ل488 الإثارة نانومتر ونانومتر الحالة الصلبة 405، 561 نانومتر و 640 نانومتر ليزر). بدوره على المجهر، والكاميرا، وحدة الغزل تحكم القرص، AOTF، وحدة التحكم ليزر وجهاز تحكم الكاميرا.
- فتح مصراع المجهر، بدوره على جهاز كمبيوتر يستخدم المجهر وفتح البرنامج.
- إعداد الأدوات ومنصة التشريح.
- بدوره على حبة تعقيم الساخن والسماح لها تصل إلى 250 درجة مئوية. نظيفة 2 أزواج من مقص جراحي وملقط بالماء والصابون. تعقيم الأدوات لمدة 30 ثانية على الأقل. السماح للأدوات يبرد. استخدام غطاء البوليسترين كمنصة تشريح. تغطية ذلك مع قطعة من معتاد على الثمالة المختبر.
4. إعداد الحقن
ملاحظة: اعتمادا على عمر النصف والاستجابة المفضلة، حقن fluorescently المسمى الأجسام المضادة و / أو جزيئات الفلورسنت إما مباشرة قبل التضحية الحيوانية أو بضع ساعات إلى أيام قبل.
- لالعدلات صورة GR1 إيجابية وحيدات، وإعداد حقنة مع 7 ميكرولتر من الأسهم AF647 مترافق GR-1 الأجسام المضادة (1 ملغ / مل) في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة تحت غطاء محرك السيارة. وضع G ½ إبرة 27 على حقنة.
- إلى الشعيرات الدموية في الرئة الصورة، وإعداد حقنة الثانية والثالثة مع 100 ميكرولتر من إما 70 KD-رودامين مترافق ديكستران (4 ملغ / مل) أو ديكستران 10 دينار كويتي AF647 مترافق (4 ملغ / مل). وضع G ½ إبرة 27 على الحقن.
- حقن محلول الأجسام المضادة الرابع 5 ساعة-AF647 مترافق قبل الختان الرئتين.
- حقن واحد أو كلا حلول ديكستران الرابع مباشرة قبل استئصال الرئتين.
5. إعداد الرئتين لخارج الجسم الحي تصوير لايف
ملاحظة: حاول أن تعمل عقيمة والحذر قدر الإمكان لتجنب التحديات التي لا داعي لها من الخلايا المناعية داخل الرئتين.
- حقن داخل الصفاق الماوس (الملكية الفكرية) مع جرعة زائدة قاتلة من مخدر يسمح به بروتوكول الحيوانية التي وافقت عليها IACUC، على سبيل المثال، 1 مل من 2.5٪ آفيرتين. انتظر الماوس لوقف التنفس ويكون تماما غير استجابة للمؤثرات الضارة (الخلفيتين مخلب قرصة).
ملاحظة: خلع عنق الرحم والقتل الرحيم ثاني أكسيد الكربون التي ينبغي تجنبها لأنها يمكن أن تؤثر تأثيرا ضارا على بقاء الخلية الرئة. - لشل حركة الماوس على لوحة التشريح وتعقيم الفأر مع الايثانول 70٪.
- استخدام مقص جراحي لإجراء أول شق شرسوفي عرضية من خلال الجلد، تليها شق مماثل من خلال الغشاء البريتوني. عقد مجلس تشريح في وضع عمودي وقطع الشريان الأورطي النازل، بحيث حمامات الدم باستمرار في البطن وليس في تجويف الصدر.
- Sارتشف فتحة صغيرة في الحجاب الحاجز للافراج عن فراغ. قطع على طول الضلع 10TH وال12 لاستئصال الحجاب الحاجز والحصول البصرية إلى الرئتين.
- استخدام مقص جراحي لقطع الجلد تصل إلى القصبة الهوائية فوق القفص الصدري ولكن ترك القفص الصدري سليمة. فصل الجلد من القفص الصدري. فضح القصبة الهوائية عن طريق إزالة الأنسجة الضامة المحيطة بها، والحرص على عدم الإضرار القصبة الهوائية نفسه (الشكل 1A).
- قص فتحة صغيرة حوالي 1 ملم في القطر في موازاة القصبة الهوائية تتعرض لحلقات غضروفية، وأقرب إلى الحنجرة ممكن (الشكل 1B). يجب الحرص على عدم قطع تماما من خلال القصبة الهوائية.
- خذ 20 G إبرة وإدراج بلطف ملم إبرة 4-5 في القصبة الهوائية دون أي قوة مضادة (1D الشكل). وينبغي أن تكون نهاية الإبرة وضوحا من خلال القصبة الهوائية (الشكل 1C). استخدام ملقط لتثبيت الإبرة في القصبة الهوائية. بدلا من ذلك، قد تكون مرتبطة خياطة آرواوند القصبة الهوائية لعقد إبرة في المكان.
ملاحظة: من خلال إدخال عميق جدا، وكارينا قد تكون صدمة أو جانب واحد فقط من الرئتين قد يكون مبالغا فيه. - حقنة ملء مع 400 ميكرولتر من 37 درجة مئوية 2٪ الاغاروز منخفضة ذوبان في درجة الحرارة (مأخوذة مباشرة من حمام درجة حرارة ثابتة). تأكد من أن لوحة تشريح واقفا وغرس ببطء الاغاروز الدافئ من خلال إبرة في الرئتين، واستخدام ~ 400 ميكرولتر لتضخيم الرئتين.
ملاحظة: ووتش الرئتين تضخيم داخل القفص الصدري. لا تبالغ في تضخيم الرئة لأنها سوف تمزق. - بمجرد تضخم الرئتين، وملء ~ ⅔ من القفص الصدري، فصل حقنة والحفاظ على إبرة داخل القصبة الهوائية لمنع أي الاغاروز من تسرب.
- صب حوالي 50 مل من 20 درجة مئوية في برنامج تلفزيوني على الرئتين مبالغ للسماح للالاغاروز داخل الرئتين لوضع وتوطيد. ببطء إزالة الإبرة وإغلاق القصبة الهوائية مع ملقط لمنع أي غير عزز الاغاروز من تسرب. </ لى>
- فضح الرئتين عن طريق إجراء القص وبعد استئصال الرئة. لاستئصال الرئتين، الابقاء على القصبة الهوائية في حين قطع طريق القصبة الهوائية تماما. برفق القصبة الهوائية فوق، قطع النسيج الضام والمريء في حين سحب الرئتين من تجويف الصدر حتى يتم فصل الرئتين من الفأرة (الشكل 1E).
- تزج الرئتين في حارة RPMI-1640 ليغسل الدم المفرط وفصل بلطف الفص باستخدام مقص وملقط لقطع القصبات الهوائية الجذعية الرئيسية الفصوص 'في نقير (الشكل 1F).
- وضع فصوص، مع سطح مستو وصولا الى تحقيق أقصى قدر من سطح التصوير، في بئر من 24-جيدا لوحة التصوير (الشكل 1G). إضافة 100 ميكرولتر من 37 درجة مئوية RPMI-1640 على قمة الفصوص. وضع عدة 15 مم غطاء المجهر دائري الشرائح على قمة الفصوص لمنعها من العائمة.
- صب برنامج تلفزيوني الدافئ في الآبار المحيطة بها لمنع وسائل الإعلام RPMI-1640 من EVAPorating. إدراج 24 لوحة جيدا في غرفة المناخ معايرتها والحفاظ على فصوص الرئة عند 37 درجة مئوية مع الهواء و 5٪ CO 2. أدخل غرفة المناخ على مرحلة من مراحل المجهر متحد البؤر.
ملاحظة: خليط الغاز الأخرى (على سبيل المثال، 5٪ O 2 و 5٪ CO 2 في N 2 لدراسة سلوك الخلية تحت ظروف نقص الأكسجة / انخفاض الأكسجين) ويمكن أيضا أخذها بعين الاعتبار.
الشكل 1. بروتوكول لإعداد الرئتين للتصوير الحية. (A) تعرض القصبة الهوائية بعد إعداد الماوس. (ب) القصاصة الصغيرة المحرز في موازاة القصبة الهوائية تتعرض لحلقات غضروفية. (C) 20 G إبرة 4-5 ملم في القصبة الهوائية. (D) تقطير من 400 ميكرولتر 2٪ منخفضة ذوبان درجة الحرارة الاغاروز إلى الرئتين. (E) Inflالرئتين ATED فصل من الماوس. (F) فصوص فصل بعد التضخم. (G) الفصوص وضعت في بئر من لوحة التصوير 24-جيدا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
6. اكتساب وتحليل الصور
يمكن الحصول على الصور مع مجموعة متنوعة من الغزل القرص المجاهر مبائر بدعم من البرامج المختلفة: ملاحظة. في هذا البروتوكول، ويستخدم إما μManager مع قرص الغزل المجهر حسب الطلب متحد البؤر أو زن مع المتاحة تجاريا الغزل القرص مجهر متحد البؤر لاقتناء الصور، في حين يتم استخدام Imaris لتحرير الأفلام والتحليل.
- الحصول على صور باستخدام μManager. خطوة مفصلة من قبل بروتوكول خطوة لاقتناء الصور باستخدام برنامج μManager يوصف سابقا 18.
أو - الحصول على صوراستخدام صورة برامج التحليل مثل زن (انظر الشكل S1).
- انقر فوق علامة التبويب "تحديد موقع" و، واختيار الهدف (10X أو 20X) في 'مسار الضوء "أداة (الشكل S1A، مربع أحمر). وفي وقت لاحق، انقر على 'عيون - دابي "للنظر في قناة CFP من خلال العدسة (الشكل S1A، المربع الأزرق). إضفاء الطابع المحلي على عينة يدويا باستخدام المجهر. انقر على "جميع Off'after النسيج هو مركز مجال الرؤية.
- انقر على علامة التبويب "شراء" لتعيين كافة المعلمات من أجل الحصول على الصور.
- في أداة "قنوات"، انقر فوق الزر '+' (الشكل S1B، مربع أحمر). تظهر القائمة المنبثقة والبحث عن الصبغة (ق) في العينة في "قاعدة صبغ" (الشكل S1B). حدد صبغ وانقر على 'إضافة'.
ملاحظة: سيقوم البرنامج وضع جميع المرشحات على الوجه الأمثل. يمكن حذف صبغةعن طريق تحديده تليها النقر على زر سلة المهملات (الشكل S1B، المربع الأصفر). - في قائمة "الوضع اكتساب، مجموعة 'Binning" ل5X5. انقر مرتين على ECFP في قائمة القنوات لتحديده. خفض قوة الليزر إلى 20٪ وذلك حتى لا يكون ابيض العينة أثناء إعداد المعلمات لاقتناء الصور.
- ضع علامة في المربع "بلاط" في قسم "مدير تجربة" وتظهر أداة البلاط في "متعددة الأبعاد اقتناء" مجموعة أداة (الشكل S1C). انقر على زر "الإعداد المتقدم" لعرض صورة حية من كاميرا. انقر على زر "إضافة" في قسم "المراكز" لإضافة 4-6 مواقف للتجربة. لحذف الموقف، وتحديد هذا الموقف، وانقر على زر سلة المهملات.
- في المجموعة أداة "اكتساب المعلمة"، افتح الأداة "استراتيجية التركيز"، واختر "مطلقالبريد ثابت Z-موقف "من القائمة المنسدلة.
- ضع علامة في المربع Z-المكدس في قسم 'مدير تجربة "وأداة Z-المكدس يظهر في مجموعة أداة" متعددة الأبعاد اقتناء "(الشكل S1D). انقر مرتين على أحد المواقع في قسم "المراكز" واضغط على "لايف". يدويا تعيين أول وتحديد موقف الأخير من مجال التصوير. تعيين الفاصل الزمني في 4 ميكرون.
ملاحظة: سيقوم البرنامج تحديد عدد شرائح للمجموعة المختارة والفاصلة. من الناحية المثالية، 5-7 شرائح هي مريحة للسماح التصور الكافي والحصول على الصور سريعا. - تحقق مربع "السلاسل الزمنية" في قسم "مدير تجربة". مجموعة المرجوة "مدة وأوقات الاستراحة في أداة" السلاسل الزمنية "التي ظهرت في" متعددة الأبعاد اقتناء "مجموعة أداة (الشكل S1E).
- في 'Acquisiنشوئها وضع "القائمة، حدد" Binning "ل2X2. انقر مرتين على fluorophore في قائمة القنوات لتحديده، وزيادة قوة الليزر إلى 100٪. اضغط على "لايف" وضبط "الوقت التعرض. كرر ذلك كل fluorophore.
- تحقق "تمكين السيارات حفظ" مربع. تحديد مجلد واكتب في اسم الملف. سيتم حفظ جميع الصور المكتسبة تلقائيا في هذا المجلد.
- انقر على "تجربة ابدأ" في قسم "مدير تجربة" لبدء الحصول على الصور.
- بعد الحصول على الصور، تجميع البيانات الخام في برنامج Imaris. تحويل الصور إلى .ims الملفات ويمكن إجراء التعديلات. خطوة مفصلة من قبل بروتوكول خطوة لتحويل الملفات، إجراء تعديلات وتوفير الأفلام باستخدام Imaris يوصف سابقا 18.
- عند حفظ الفيلم، مجموعة 'معدل الإطار' إلى 5 إطار في الثانية (fps).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام الغزل القرص مبائر المجهري، ومختلف النظم نموذج الفأر والحقن، المكروية المنتشر يمكن تصور وتتبع مع مرور الوقت. باستخدام MMTV-PyMT. ACTB-ECFP. وصفت ج-FMS-EGFP الثلاثي نموذج الفأر وراثيا، والمكونات الخلوية المختلفة fluorescently (الشكل 2A، فيلم 1). هيكل نموذجي لحمة الرئة يمكن تصور في قناة CFP لأن جميع خلايا تعبر عن ECFP تحت المروج β الأكتين. وحلت أكبر الانبثاث الرئة / متعددة الخلايا بسهولة لأن هذه تبدو وكأنها الأكبر من الخلايا داخل بنية الرئة المنظمة. وتصور خلايا الدم النخاعي في القناة GFP إلى c-FMS -EGFP التعبير، وهو التحوير لCSFR-1 12. خلايا الدم النخاعي هي ديناميكية للغاية لأنها تهاجر في جميع أنحاء مجال التصوير. ج-FMS خلايا -EGFP الإيجابية هي أكثر وفرة والهجرة في لحمة الرئة بالمقارنة مع تلك الموجودة في اتصال وثيق مع الرئةورم خبيث. يمكن اتباعها ديناميات خلايا الدم النخاعي وتفاعلاتها مع الانبثاث الرئة في الوقت الحقيقي لعدة ساعات.
لدراسة البذر المنتشر والنمو، ويتم استخدام نموذج الانبثاث التجريبية (الشكل 2B، فيلم 2). تم حقن الخلايا السرطانية GFP + VO-PyMT إلى wildtype، الماوس عدم مراسل والسماح للالبذور وتنمو لمدة 2 أسابيع. هيكل الرئة واضحة للعيان في القناة GFP بسبب تألق ذاتي من الرئتين. ومع ذلك، فإن الخلايا VO-PyMT لا تزال يمكن تمييزها بسهولة من بنية الرئة لأن لديهم شكل دائري وأعلى التعبير EGFP بالتالي تظهر أكثر إشراقا بالمقارنة مع لحمة الرئة. VO-PyMT الحركة الخلوية يمكن ملاحظتها داخل الآفة النقيلي المعمول بها.
ويمكن أيضا أن التفاعلات الخلوية بين النقيلي والخلايا المناعية في الرئة المكروية أن تدرس باستخدام نموذج الانبثاث التجريبية. بعد أسبوعينحقن الخلايا VO-PyMT، fluorescently المسمى GR-1 647 مترافق الأضداد هي رابعا حقن 5 ساعة قبل استئصال الرئة (الشكل 2C، فيلم 3). على الجانب الأيسر من مجال التصوير، وهما GR-1 + خلايا الدم النخاعي يتفاعلون مع خلية VO-PyMT. لوحظ آفة المنتشر على الجانب الأيمن من الملعب في التصوير. مع مرور الوقت، يتم تجنيد خلايا + GR-1 إلى الآفة النقيلي. تحت الآفة النقيلي، واحدة من الخلايا GR-1 + يتفاعل بشكل وثيق مع خلية VO-PyMT. في نهاية المطاف، يزيح الخلية VO-PyMT، فك الارتباط من + خلية GR-1.
الجمع بين مراسل نماذج الماوس المعدلة وراثيا مع نموذج الانبثاث التجريبية والأجسام المضادة عن طريق الحقن وصفها الخلايا المناعية ينتج فيلم ثلاثة ألوان. أسبوع واحد بعد حقن الخلايا VO-PyMT إلى مراسل الماوس ACTB-ECFP، fluorescently المسمى GR-1 647 مترافق الأضداد هي رابعا حقن 5 ساعة قبل استئصال الأنسجة (الشكل 2D، فيلم4). GR-1 + تهاجر الخلايا بقوة داخل مجال الرؤية، في حين أن GFP واحد + خلية المنتشر مرئيا في وسط الميدان التصوير.
يمكن حقن dextrans الفلورسنت مختلفة في الفئران المراسل، الذي تم حقن سابقا مع الخلايا المتنقل، تسفر عن فيلم أربعة ألوان (الشكل 2E، أفلام 5-6). الأحداث في وقت مبكر في البذر من ورم خبيث يمكن دراستها عندما تصور خلايا VO-PyMT فورا و4 ساعات بعد الحقن الرابع في الفئران مراسل ACTB-ECFP. حقن-مترافق رودامين، 70 دينار كويتي ديكستران و 10 دينار كويتي ديكستران مترافق إلى علامة فلوري 647 يسمح التصور من الشعيرات الدموية في الرئة. من المحتمل أن تستخدم استخدام الدنيا والعليا dextrans الوزن الجزيئي للكشف عن تغيرات في نفاذية الشعيرات الدموية في الرئتين، منذ أقل الجزيئات الوزن الجزيئي يتسرب أسرع بالمقارنة مع ارتفاع الوزن الجزيئي منها 19. على الرغم من أن cellul لا تزال الأحداث AR دراستها على نحو فعال، الفيلم 5 مثال من الانجراف الأنسجة. إذا لا يمكن تعديل أوضاعها اللازمة وفي حالة الأنسجة أثناء الدورة والتصوير، ويمكن تصحيح هذا خلال يحلل بعد استملاكها الصورة.
هذا النظام تمكن السريع، أربعة ألوان الحصول على الصور متواصلة لمتابعة أنواع مختلفة من الخلايا fluorescently المسمى داخل المكروية النقيلي الرئة. كما يسمح هذا البروتوكول التصور من ورم خبيث من أحجام مختلفة، من الأحداث المتعلقة البذر من الخلايا السرطانية واحدة لالانبثاث المعمول بها. وعلاوة على ذلك، الخلايا السرطانية وحركة خلايا انسجة يمكن تصور داخل المكروية الرئة جنبا إلى جنب مع الأوعية الدموية. عادة، حركة الخلوية يمكن ملاحظة لا يقل عن 4 ساعة من بداية جلسة التصوير. مراقبة microenvironments النقيلي مختلفة داخل نفس أنسجة الرئة يساعد على تجنب التقلبات الماوس إلى ماوس.
الإقليم الشمالي "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما ">
الشكل 2. صور الممثل من الأفلام التي اكتسبها التصوير الحي. (A) لقطة من Z كومة المدمجة من الفيلم 1 تظهر خلايا الدم النخاعي المرتبطة ورم خبيث في الرئة (إدراج الأصفر) مقابل تلك التي ترتبط مع لحمة الرئة (إدراج الأحمر). (ب) لقطة من Z كومة المدمجة من فيلم 2 تظهر GFP + خلية المنتشر في نموذج الانبثاث التجريبية. يشير السهم إلى خلية النقيلي متحركة. (C) لقطة من كومة Z من فيلم 3 تظهر شارك في توطين إشارات الفلورسنت من GFP + ورم خبيث وGR-1 + خلايا تصور من قبل الأجسام المضادة GR-1 مترافق إلى 647 كلمة دلالية (رأس السهم الأحمر). نقطة رأس السهم الأخضر لGFP + خلية النقيلي الذي طردهم من معظم النقيلي. نقطة رأس السهم الأبيض إلى GR-1 + الخلية التي تفاعلت مع الخلية GFP + VO-PyMT متحركة. (D) لقطة منوZ كومة المدمجة من الفيلم 4 تظهر الخلايا GFP + VO-PyMT، في ACTB-ECFP الماوس. خلية VO-PyMT واحدة مرئيا في المركز (رأس السهم الأخضر). تم حقن الحيوان مع GR-1 647 الضد مترافق. (E) الممثل Z-كومة من الأفلام 5 و 6 تبين الأوعية الدموية في الرئة من الفئران التضحية فورا بعد الحقن من 70 دينار كويتي رودامين-ديكستران (رأس السهم الأحمر) جنبا إلى جنب مع الخلايا GFP + VO-PyMT (الخضراء). الحانات هي مقياس 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
التكميلية الشكل 1. قطات الشاشة من برنامج الكاميرا ZEN لاقتناء الصور. (A) أولا، في أداة 'مسار الضوء "ينبغي اختيار الهدف المناسب (المربع الأحمر) وعشرأن تكون مترجمة الأنسجة الإلكترونية في المجهر. (ب) تكوين قنوات الحصول على الصور، في (المربع الأحمر) يمكن حذف القنوات أداة "قنوات" أو إضافتها (المربع الأصفر). (C) في أداة "بلاط"، يمكن إضافة وظائف مختلفة لهذه التجربة. (D) في أداة "Z-ستاك"، وكومة Z يمكن تعيين ويمكن تعديل سماكة شرائح. (E) في الأداة "السلاسل الزمنية"، يمكن تعيين المدة والفاصل الزمني. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الفيلم 1. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل). التفاعلات بين ورم خبيث في الرئة وسور. تقريب الخلايا المناعية باستخدام الفئران المعدلة وراثيا مراسل يظهر هذا الفيلم ورم خبيث في الرئة من ثلاث رميات المعدلة وراثيا MMTV-PyMT. ACTB-ECFP. وصفت ج-FMS-EGFP الماوس التي وصفت جميع الخلايا مع ECFP وخلايا الدم النخاعي مع EGFP. الانبثاث يمكن يحتفل به بوصفه الأكبر من الخلايا في الزرقاء على النقيض من العمارة رئة طبيعية. ج-FMS + خلايا الدم النخاعي تهاجر في جميع أنحاء مجال التصوير كله. هذا الفيلم هو 2 ساعة اكتساب 1 دقيقة.
فيلم 2. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل). حركية الخلايا السرطانية في نموذج الانبثاث التجريبية. ويبين هذا الفيلم ورم خبيث في الرئة الناتجة عن حقن الرابع من الخلايا GFP + VO-PyMT (الأخضر) في wildtype وعدم مراسل، والماوس. وكان حصاد الرئتين بعد أسبوعين من حقن VO خلايا -PyMT. خلايا GFP + تتحرك ضمن الجزء الأكبر النقيلي. هذا الفيلم هو 4 ساعة 40 دقيقة اكتساب طويلة.
فيلم 3. (حق انقر للتحميل). التوظيف من الخلايا المناعية التي تصور الأجسام المضادة fluorescently، مترافق إلى إنشاء تجريبيا ورم خبيث. ويبين هذا الفيلم ورم خبيث في الرئة الناتجة عن حقن الرابع من الخلايا GFP + VO-PyMT (الأخضر) في wildtype، وعدم مراسل، والماوس. تم حصاد الرئتين بعد أسبوعين تم حقن الخلايا VO-PyMT. GR-1 + الخلايا المسمى مع GR-1 647 الضد مترافق والتي لوحظت في قناة الأشعة تحت الحمراء القريبة (أبيض). لاحظ أنه يتم تجنيد GR-1 الخلايا إلى ورم خبيث GFP +. هذا الفيلم هو مثال على عملية استحواذ على المدى الطويل، ما مجموعه 11 ساعة 27 دقيقة.
ther.within صفحة = "دائما"> 
فيلم 4. (حق انقر للتحميل). على الحركة من الخلايا المناعية التي تصور الأجسام المضادة fluorescently مترافق في الماوس مراسل المعدلة وراثيا حقن الخلايا المتنقل. ويبين هذا الفيلم خلية GFP + VO-PyMT واحدة في الرئة الناتجة عن حقن الرابع من VO- خلايا PyMT (الأخضر) إلى الماوس ACTB-ECFP. تم حصاد الرئتين أسبوع واحد بعد أن تم حقن الخلايا VO-PyMT. GR-1 + الخلايا المسمى مع GR-1 647 الضد مترافق والتي لوحظت في قناة الأشعة تحت الحمراء القريبة (أبيض). هذا الفيلم هو 2 ساعة 40 دقيقة اكتساب طويلة.
فيلم 5. (كليك يمينك للتحميل). الخلايا والشعيرات الدموية الإنتقالية التي تصور dextrans الفلورسنت مباشرة بعد حقن الرابع في الماوس مراسل المعدلة وراثيا. ويبين هذا الفيلم الانبثاث التجريبية التي تم إنشاؤها بواسطة حقن الرابع من الخلايا GFP + VO-PyMT (الأخضر) إلى الماوس ACTB-ECFP جنبا إلى جنب مع حقن-مترافق رودامين، 70 دينار كويتي ديكستران (الأحمر) و 10 دينار كويتي ديكستران مترافق إلى 647 بطاقة الفلورسنت (أبيض)، وذلك بمناسبة الأوعية الدموية. هذا الفيلم هو مثال من الانجراف الأنسجة وهو اكتساب 18 دقيقة طويلة.
فيلم 6. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل). الخلايا والشعيرات الدموية الإنتقالية التي تصور dextrans الفلورسنت عدة ساعات بعد الحقن الرابع في الماوس مراسل المعدلة وراثيا. ويبين هذا الفيلم الانبثاث التجريبي توليدد عن طريق الحقن الرابع من الخلايا GFP + VO-PyMT (الأخضر) إلى الماوس ACTB-ECFP جنبا إلى جنب مع حقن-رودامين مترافق، 70 دينار كويتي ديكستران (الأحمر) و 10 دينار كويتي ديكستران مترافق إلى علامة فلوري 647 (أبيض)، للاحتفال الأوعية الدموية. تم انتشال الرئتين 4 ساعات بعد الحقن من الخلايا VO-PyMT. هذا الفيلم هو اكتساب 19 دقيقة طويلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
توضح هذه المخطوطة طريقة مفصلة لخارج الجسم الحي التصوير الحي من ورم خبيث في الرئة في نماذج الفئران من ورم خبيث. يوفر هذا البروتوكول التصوير والتصوير المباشر للتفاعلات ورم الخلايا سدى ديناميكية والمكانية داخل المكروية الرئة. وهي طريقة سهلة وسريعة نسبيا التي تسمح التصوير موثوق بها من ورم خبيث في الرئة لا يقل عن 4 ساعة. أفلام تم الحصول عليها من هذه التجارب يمكن استخدامها لتتبع عمليات حيوية، حركية الخلية والتفاعلات الخلوية.
وصفت طريقتين لتوليد ورم خبيث في الرئة: نموذج الفأر وراثيا واستخدام خط خلية التلاعب بها. نموذج الفأر MMTV-PyMT يلخص تطور سرطان الثدي والرئة ورم خبيث عفوية. غيرها من التقنيات التي ألخص انتشار النقيلي وتتوفر أيضا، على سبيل المثال، زرع مثلي من الخلايا في الغدة الثديية 20. وحقنها عن طريق الوريد VO-PyMT جويستخدم خط الذراع لتقليد البذر ونمو الانبثاث سرطان الثدي. بدل الوقت لVO-PyMT خلية ثمرة يعتمد على تفضيل التجريبي للمرحلة الانبثاث الرئة. اعتمادا على عدد من حقن الخلايا، micrometastases يمكن ملاحظتها في غضون عدة أيام إلى 2 أسابيع بعد حقن الخلايا VO-PyMT.
للتصوير الرئة الأمثل، يجب توخي الحذر الشديد أثناء تضخم الرئتين. التضخم السليم، ينبغي إدخال الإبرة فقط 4-5 ملم في القصبة الهوائية. الإدراج أعمق من الإبرة يمكن أن يؤدي إلى الجزئي، والتضخم من جانب واحد من الرئتين. وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن يكون شاهد الرئتين خلال التضخم الفعلي لمنع الإفراط في التضخم التي قد تؤدي إلى تلف الأنسجة. وعلاوة على ذلك، فإنه من المهم للحفاظ على الرئة معقمة قدر الإمكان بحيث لا يمكن الطعن الخلايا المناعية في الرئة.
لكل تجربة التصوير الحية، والتوازن الأمثل بين كمية الحصول على البيانات والعشرينتحتاج إلى النظر فيها إمكانات ه من تلف الأنسجة الناتجة عن التعرض المفرط ليزر. ومن المهم لتحسين إعدادات الحصول على الصور عن طريق إجراء التجارب الرائدة. أيضا، فمن المستحسن للحفاظ على قوة الليزر أسفل في حين تبحث عن حقول المثلى للعرض و / أو للحفاظ على مصراع عندما لا يتم الحصول على الصور.
والحركة من السرطان و / أو الخلايا المناعية من الفائدة هي واحدة من مؤشرات حيوية الخلية. الحركة حساسة للحرارة، ومستويات الأكسجين، والضيائية 7. ومع ذلك، قد لا تكون ذات صلة تثبيط أو عدم القدرة على الحركة لظروف التصوير أو القضايا الفنية، ولكن البيولوجية إلى حد ما. تثبيط الحركة قد تنجم عن تأثير علاجي معين أو من إلقاء القبض على الخلايا المتنقل قبيل انتشارها داخل الأوعية الدموية الدقيقة في الرئة والتسرب الخاصة بهم في حمة الرئة 21،22. ولذلك قد يكون من المهم أن تثبت هذه البيانات باستخدام إضافيةتقنيات (كما المقايسات الهجرة في الثقافة 2D) 23.
وعلاوة على ذلك، وهذا خارج الحي الرئة طريقة التصوير غير كافية لدراسة قصيرة الأجل التي لا تتطلب دوران الأوعية الدقيقة في الرئة. باستخدام هذه الطريقة، لوحظ حركة السرطان و / أو الخلايا المناعية لا يقل عن 4 ساعة. قبل الحصول على الصور، ويستغرق حوالي 30 دقيقة لإعداد الرئتين و30-60 دقيقة للعثور على وظائف لاقتناء. على الرغم من أن لوحظ حركية الخلية وراء 4 ساعات (تصل إلى 11 ساعة، فيلم 3)، والتصوير لفترة طويلة يعتمد على أنواع الخلايا معينة درس، وشروط استخدامها (على سبيل المثال، انخفاض الأكسجين)، وينبغي أن تحدد لإعداد تجريبي معين. وعلاوة على ذلك، نظرا لعدم وجود دوران الأوعية الدقيقة والأثر المحتمل للتغيرات بعد الوفاة أو في حالة وجود مبررات الحاجة للتحقق من النتائج في وجود دوران الأوعية الدقيقة سليمة، والتصوير حيوي داخلي الرئة مع نافذة شفط الصدري يمكن الاستفادة منها. ومع ذلك، فمن الأمراض المنقولة جنسياليرة لبنانية تحديا لأداء التصوير الرئة حيوي داخلي عبر أيام متعددة باستخدام نافذة التصوير كما يؤديها في الدماغ، الغدة الثديية وأعضاء البطن 5 بسبب صعوبات في الحفاظ على الضغط السلبي كافيا. كطريقة بديلة للنضح من خارج الحي الرئتين سليمة، تم استخدام أسلوب الرئة معزولة perfused-سابقا لدراسة الانبثاث الرئوي. ومع ذلك، غالبا ما تستخدم هذه الطريقة للحيوانات أكبر. منذ الفئران لها تجاويف الصدر أصغر، فإنها تشكل تحديا حقيقيا لنضح فعال 24.
ونظرا لتشتت الضوء، وعمق التصوير المجهري الغزل القرص مبائر محدودة. ونتيجة لذلك، يقتصر التصور ديناميات الخلايا والتفاعلات الخلوية لورم خبيث في الرئة سطحية. يتم إثراء الانبثاث الرئوي في محيط الرئة منذ تقتصر الخلايا المتنقل عن طريق الشعيرات الدموية التي تقل في حجمها نحو الحافات الخارجية للرئة 1. وعلاوة على ذلك، هو عصامSIER للحفاظ على سلامة الخلايا أقرب إلى سطح الرئة لأنها كانت تفضل الوصول إلى وسائل الإعلام والأكسجين. للسماح التصور أعمق في الرئتين، والتصوير المباشر لأقسام الرئة يمكن أن يؤديها. ومع ذلك، ينبغي أن يتوقع قدرا كبيرا من موت الخلايا. بدلا من ذلك، يمكن إجراء الفحص المجهري multiphoton، مما يسمح للمزيد من اختراق الأنسجة. وبالإضافة إلى ذلك، والتصوير multiphoton يولد إشارة ضوئية الجوهرية، ودعا الجيل التوافقي الثاني (مجموعات المساعدة الذاتية)، والذي يسمح التصور من الهياكل غير centrosymmetric في المصفوفة خارج الخلية، مثل الكولاجين 1 الألياف.
كما هو مبين في هذه الدراسة، الورم وسلوك الخلايا المناعية في الانبثاث الرئة يمكن اتباعها وتحليلها باستخدام الفئران مراسل فلوري، والخلايا السرطانية التلاعب واستشفاف fluorescently المسمى أو الأجسام المضادة. يمكن تعديل هذه المنهجية لدراسة الخلايا والمحددات الأخرى داخل المكروية النقيلي. تحقيقا لهذه الغاية، هناك العديد آرالفئران مراسل ansgenic المتاحة للدراسة الخلايا اللحمية بما في ذلك تلك المتعلقة الليفية كما FSP1-EGFP 4، ألفا-SMA-طلب تقديم العروض 25 و Col1a1-EGFP 25 أو الخلايا البطانية كما Tie2-GFP 26.
وقد تم إجراء تلطيخ الخلايا على أقسام الرئة الحية لتصور السكان الخلايا المناعية 8. هذه الاستراتيجية تلطيخ يمكن اعتمادها كبديل لمتعددة الألوان التقاط الصور. ومع ذلك، معظم علامات في كثير من الأحيان تسمية السكان الخلية متعددة بدلا من السكان خلية متميزة. الحقن التي يتم تناولها من قبل السكان خلية معينة 4 أو الأجسام المضادة fluorescently المسمى ضد علامات خلية إضافية يمكن استخدامها لمزيد من التفريق بين السكان. ويفضل استخدام الألوان الفلورسنت مختلفة لتسمية الخلايا مختلفة من الفائدة للتصوير. في الحالات التي يكون فيها استخدام الأصباغ الفلورية مختلفة لا يمكن أن يؤديها (على سبيل المثال، بسبب محدودية chann التصويرإلس)، فمن الممكن أن صورة أنواع مختلفة من الخلايا مع الصحفيين الفلورسنت نفسه طالما أنها يمكن تمييزها بسهولة عن طريق الشكل و / أو توطين التشريحية.
بالإضافة إلى دراسة مختلف أنواع الخلايا، فئات عديدة من المعالجة الكيميائية هي الفلورسنت ضعيفة (مثل دوكسوروبيسين). هذه المعالجة الكيميائية يمكن من حيث المبدأ أن تستخدم لتصور تسليم الأدوية وتوزيعها في الانبثاث الرئة بطريقة مماثلة كما في الورم الرئيسي 19. ويمكن أيضا العلاجات المستهدفة الأخرى التي يمكن fluorescently المسمى استخدامها في فيفو السابقين التصوير الرئة. والجدير بالذكر، أن البيانات التي يحصل عليها مع التصوير الرئة يكون أكثر إفادة حول الخلايا التي تأخذ المتابعة هذه الأدوية وتفاعلها مع الخلايا الأخرى داخل المكروية المتنقل بالإضافة إلى التسرب من هذه العلاجات من الأوعية الدموية نشطة. هذه التقنية يمكن زيادة استخدامها لدراسة سرطان الرئة الأولية 27 أو تكييفها لدراسة الرئة الأخرىالأمراض ذات الصلة ب التي قد تؤثر على المكروية الرئة 28،29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MMTV-PyMT/FVB mice | Jackson Laboratory | 2374 | Female mice |
| ACTB-ECFP/FVB mice | UCSF Werb lab | Female mice | |
| c-fms-EGFP/FVB mice | UCSF Werb lab | Female mice | |
| FVB mice | Jackson Laboratory | 1800 | Female mice |
| GFP+ VO-PyMT cells | UCSF Werb lab | ||
| 70,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated | Invitrogen | D1818 | Dilute to 4mg/ml in 1 x PBS and store at -20 °C. Use 0.4 mg per animal. |
| 10,000 kDa Dextran, Alexa Fluor 647 conjugated | Invitrogen | D22914 | Dilute to 4mg/ml in 1 x PBS and store at -20 °C. Use 0.4 mg per animal. |
| Anti-mouse Gr-1 antibody Alexa Fluor 647 | UCSF Monoclonal antibody core | Stock 1mg/ml. Use 7 ug per animal. | |
| Anesthetic | Anesthesia approved by IACUC, used for anesthesia and/or euthanesia | ||
| 1X PBS | UCSF cell culture facility | ||
| PBS, USP sterile | Amresco INC | K813-500ML | Ultra pure grade for i.v. injection |
| Styrofoam platform | Will be used as dissection board | ||
| Fine scissors sharp | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Forceps | Roboz Surgical Store | RS-5135 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn ON 30min before use |
| Air | UCSF | ||
| Oxygen | UCSF | ||
| Carbon dioxide | UCSF | ||
| 1 mL syringe without needle | BD | 309659 | |
| 27 G x 1/2 needle | BD | 305109 | for i.v. injection |
| 20 G x 1 needle, short bevel | BD | 305178 | |
| Low-melting-temperature agarose | Lonza | 50111 | To make 10 ml of solution, weigh 0.2 g of agarose, add to 10 ml 1 x PBS, and heat to dissolve. Agarose will solidify at room temperature, so maintain in a 37 °C water bath until used for inflation. |
| RPMI-1640 medium without phenol red | Life Technologies | 11835-030 | |
| 24 well Imaging plate | E&K scientific | EK-42892 | |
| Glass cover slides, 15 mm | Fisher Scientific | 22-031-144 | |
| Digital CO2 and temperature controller | Okolab | DGTCO2BX | http://www.oko-lab.com |
| Climate chamber | Okolab | http://www.oko-lab.com | |
| Cell Observer spinning disk confocal microscope | Zeiss | ||
| Zen software | Zeiss | ||
| Inverted microscope | Carl Zeiss Inc | Zeiss Axiovert 200M | |
| ICCD camera | Stanford Photonics | XR-Mega-10EX S-30 | |
| Spinning disk confocal scan-head | Yokogawa Corporation | CSU-10b | |
| Imaris | Bitplane | ||
| mManager | Vale lab, UCSF | Open-source software |
References
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
- Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells. Cell stem cell. 16 (3), 225-238 (2015).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Egeblad, M., Ewald, A. J., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1 (2-3), 155-167 (2008).
- Ellenbroek, S. I. J., van Rheenen, J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nat Rev Cancer. 14 (6), 406-418 (2014).
- Looney, M. R., Thornton, E. E., Sen, D., Lamm, W. J., Glenny, R. W., Krummel, M. F. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
- Thornton, E. E., Krummel, M. F., Looney, M. R. Live imaging of the lung. Cur Protoc Cytom. , (2012).
- Thornton, E. E., Looney, M. R., et al. Spatiotemporally separated antigen uptake by alveolar dendritic cells and airway presentation to T cells in the lung. J Exp Med. 209 (6), 1183-1199 (2012).
- Mendoza, A., Hong, S. -H., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
- Lelkes, E., Headley, M. B., Thornton, E. E., Looney, M. R., Krummel, M. F. The spatiotemporal cellular dynamics of lung immunity. Trends Immunol. 35 (8), 379-386 (2014).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Mol Cell Biol. 12 (3), 954-961 (1992).
- Hadjantonakis, A. -K., Macmaster, S., Nagy, A. Embryonic stem cells and mice expressing different GFP variants for multiple non-invasive reporter usage within a single animal. BMC Biotechnol. 2, (2002).
- Casbon, A. -J., Reynaud, D., et al. Invasive breast cancer reprograms early myeloid differentiation in the bone marrow to generate immunosuppressive neutrophils. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (6), 566-575 (2015).
- Donovan, J., Brown, P. Parenteral injections. Curr Protoc Immunol. , (2006).
- Halpern, J., Lynch, C. C., et al. The application of a murine bone bioreactor as a model of tumor: bone interaction. Clin Exp Metastas. 23 (7-8), 345-356 (2006).
- Sasmono, R. T., Oceandy, D., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harb Protoc. (2), (2011).
- Bonnans, C., Lohela, M., Werb, Z. Real-time imaging of myeloid cells dynamics in ApcMin/+ intestinal tumors by spinning disk confocal microscopy. J Vis Exp. (92), (2014).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer cell. 21 (4), (2012).
- Cheng, N., Lambert, D. L. Mammary transplantation of stromal cells and carcinoma cells in C57BL/6J mice. J Vis Exp. (54), (2011).
- Al-Mehdi, A. B., Tozawa, K., Fisher, A. B., Shientag, L., Lee, A., Muschel, R. J. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat Med. 6 (1), 100-102 (2000).
- Wong, C. W., Song, C., et al. Intravascular location of breast cancer cells after spontaneous metastasis to the lung. Am J Pathol. 161 (3), 749-753 (2002).
- Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Nelson, K., Bobba, C., Ghadiali, S., Hayes, D. J., Black, S. M., Whitson, B. A. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World J Exp Med. 4 (2), (2014).
- Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40 (5), 1151-1159 (2004).
- Motoike, T., Loughna, S., et al. Universal GFP reporter for the study of vascular development. Genesis. 28 (2), (2000).
- Srivastava, M. K., Andersson, A., et al. Myeloid suppressor cells and immune modulation in lung cancer. Immunotherapy. 4 (3), (2012).
- Craig, A., Mai, J., Cai, S., Jeyaseelan, S. Neutrophil recruitment to the lungs during bacterial pneumonia. Infect Immun. 77 (2), 568-575 (2009).
- Kreisel, D., Nava, R. G., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).
