Summary
我们描述用于离体肺转移中的肿瘤细胞-基质相互作用的实时成像的相对简单的方法，利用荧光报告小鼠。使用纺丝盘共焦显微镜，该技术使活细胞的可视化的至少4小时，并可以适用于研究其它炎性肺部疾病。
Abstract
转移是癌症相关的发病率和死亡率的一个主要原因。转移是一个多步骤的过程，并且由于其复杂性，支配转移性传播和增长的确切细胞和分子过程仍然难以捉摸。实时成像使细胞微环境的动态性和空间相互作用的可视化。实体瘤通常转移至肺部。然而，肺的解剖位置姿势到活体成像的一个挑战。这个协议提供了用于离体肿瘤细胞和肺转移中其周围基质之间的动态相互作用的实时成像的相对简单和快速的方法。使用这种方法，在其微环境的癌细胞的癌症细胞和基质细胞之间的运动，以及相互作用可以实时可视化数小时。通过使用转基因荧光报道小鼠，荧光细胞系，可注射荧光标记的分子和/或抗体，肺微环境的多个组件可以被可视，如血管和免疫细胞。到图象的不同类型的细胞，一旋转盘共聚焦显微镜，它允许快速，四色图像采集长期连续成像已被使用。从收集到的多个位置和焦平面图像编译时间推移电影显示活转移性和免疫细胞之间的相互作用至少4小时。这种技术可以进一步用于测试化疗或靶向治疗。此外，这种方法可以适用于其它肺相关疾病可能影响肺微环境的研究。
Protocol
中描述的所有程序必须按照与使用脊椎动物，包括由当地机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的准则和规定进行。
1.产生肺转移瘤防爆体内实时成像（转基因或尾静脉注射）
注：肺转移可通过利用遗传工程小鼠模型或通过静脉内（IV）注射癌细胞产生。
- 通过杂交的基因工程肿瘤小鼠模型成转基因记者鼠标，例如，生成用于成像肺转移，穿过乳腺癌小鼠模型中，小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复序列，多瘤中间T抗原（MMTV-PyMT）11到ACTB-ECFP小鼠模型12。
注：ACTB-ECFP模型表达β幕下增强青色荧光蛋白（ECFP）在启动使得所有的细胞发出荧光的蓝色，CFP通道。然而，肿瘤细胞是迄今为止最突出并显示为在显微镜下的堆积ECFP阳性细胞。的MMTV-PyMT小鼠模型开发一种进行性疾病，其乳腺肿瘤的生长与癌细胞传播到外围相关，特别是到肺部。在上FVB / N背景MMTV-PyMT小鼠中，微可以约10-11周龄被观察到。一般来说，这些进步macrometastases在14周13岁 。
要么 - 生成使用原代细胞或同基因细胞系的实验转移。使用在随后静脉注射14 体外操纵原发肿瘤细胞或细胞系（例如，转导）。
- 简要地说，在这个协议中，注入一个绿色荧光蛋白（GFP）-expressing（+），MMTV-PyMT细胞系成荧光报道小鼠（ACTB-ECFP）或野生型小鼠。然后，可视化使用绿色，GFP通道，这些细胞被称为VO-PyMT细胞15。
注：原VO-PyMT细胞系在骨科范德比尔特纳什维尔的。 VO表示范德比尔特骨科。 - 以下10 6个细胞的注射（200微升），立即向上观察癌细胞外渗到注射后的几个小时;注射后观察1-3周之间的微小转移灶和注射后15检测macrometastases 3周。
注：较少的细胞可以被注射到延长从注射到转移生长的时间。
- 简要地说，在这个协议中，注入一个绿色荧光蛋白（GFP）-expressing（+），MMTV-PyMT细胞系成荧光报道小鼠（ACTB-ECFP）或野生型小鼠。然后，可视化使用绿色，GFP通道，这些细胞被称为VO-PyMT细胞15。
2.标签在转移性微环境利益成分（转基因和/或注射剂）
注意：标记可以通过转基因小鼠和/或通过各种注射来实现。确保使用不同的荧光色为各种细胞类型的标签。
- 使用转基因小鼠的转移性微环境的标签组件。越过前面提到的小鼠肿瘤模型（例如，MMTV-PyMT点¯xACTB-ECFP）插入，其中所关注的基质细胞通过荧光蛋白，其是不ECFP，例如，C-fms的-EGFP标记的转基因小鼠模型4,16。
注：除癌细胞在CFP通道的可视化，这使骨髓细胞的可视化在GFP 通道 4。
AND / OR - 标签使用注射到转基因荧光报告小鼠或（非荧光）的野生型小鼠中的转移性微环境的各种组件。
注意：一些化合物可以注射来标记转移性微环境，例如，一个AF647共轭Gr-1抗体在这里用于标记的中性粒细胞和单核细胞的一些13和不同分子量右旋糖酐使用的各种部件标签肺毛细血管。用于制备这些注射参见步骤4。
3.材料的制备解剖前
- 2％琼脂糖
- 称取0.2克琼脂糖，并添加至10ml 1×PBS。加热该溶液以溶解琼脂糖。琼脂糖将巩固在室温，因此它保持在37℃水浴直至用于通货膨胀。
- 的 CO 2和温度控制器
- 检查的DDH 2 O在加湿室。在需要的时候笔芯。将配置板进入下阶段的板夹（气候箱）。转动的 CO 2控制器上，并在5％的设定的 CO 2。确保气流速率设定为0.4升/分钟。
- 打开空气和CO 2阀。转温度控制器上。确保气候室的温度和盖都设置在37℃。
- 释放的 CO 2米气压力。检查二氧化碳增加，Equilibration可能需要长达30分钟。
- 旋转盘共聚焦显微镜
注：在显微镜设置的细节先前已经描述4,17。- 开启激光器（氩激光为488纳米激发和固态405纳米，561纳米和640纳米激光器）。打开显微镜，照相机，纺丝盘控制单元，AOTF中，激光控制单元和摄像机控制器。
- 打开显微镜快门，打开电脑上运行的显微镜和打开软件。
- 工具和平台解剖准备。
- 打开热珠灭菌，让它达到250℃。清洁2对手术剪刀和镊子用水和肥皂。消毒的工具为至少30秒。让工具冷却。使用聚苯乙烯作为盖夹层平台。用一块实验室透雨的覆盖。
4.注射的制备
注意：根据半衰期，优选的响应，注射荧光标记的抗体和/或荧光分子或之前立即处死动物或前几个小时到几天。
- 到图像Gr1的阳性嗜中性粒细胞和单核细胞，制备具有库存AF647共轭Gr-1抗体的7微升（1毫克/毫升）到罩下加入100μl无菌PBS的注射器。广场上的注射器27 G½针头。
- 到图像肺毛细血管，准备用100μl任一70 kD的若丹明共轭葡聚糖（4毫克/毫升）或10 kD的AF647共轭葡聚糖（4毫克/毫升）的第二和第三注射器。广场上的注射器27 G½针头。
- 注射前，肺部的切除的AF647标记的抗体溶液IV 5小时。
- 注入四之前立即肺部的切除一个或两个葡聚糖溶液。
5.准备肺部前体内实时成像
注：尽量上班无菌和小心，尽量避免肺部内的免疫细胞的不必要的挑战。
- 与由IACUC批准的动物协议， 如：允许麻醉致死过量注入小鼠腹膜内（IP），将1ml 2.5％阿佛丁的。等待鼠标停止呼吸，完全不响应伤害性刺激（后肢捏）。
注：颈椎脱位和二氧化碳安乐死应该避免，因为它可以不利地影响肺细胞生存力。 - 固定在清扫板鼠标和消毒用70％乙醇鼠标。
- 用手术剪先使通过皮肤的横向胃脘切口，然后通过腹膜类似的切口。保持夹层板在垂直位置并切断降主动脉，使血液池向下腹部而不是在胸腔。
- 小号消灭在膜片释放真空的小开口。沿10和第12肋骨切切除膈肌，并获得了肺部视觉访问。
- 用手术剪刀切开皮肤至气管在胸腔，但留下胸腔完好。独立于胸腔皮肤。通过去除周围结缔组织，注意不要损伤气管本身（ 图1A）暴露气管。
- 剪断的小开口在平行于软骨环暴露气管直径约为1毫米，如靠近喉部尽可能（图1B）。要小心，不要通过气管完全切断。
- 取一个20G的针和轻轻插入针4-5毫米进气管没有任何反力（图1D）。针的端部应通过气管（图1C）可见。使用镊子稳定气管针。或者，缝线可以阿罗绑UND气管以保持针就位。
注：通过插入过深，隆突可能会受到创伤，或只有一个肺的一侧可能被夸大。 - 填的注射器用400μl37℃的2％低熔点温度琼脂糖（直接从恒温浴中取出）的。确保夹层板站起来，慢慢地灌输通过针进入肺内温暖琼脂糖，使用〜400微升膨胀肺部。
注：观看肺部胸腔内充气。不要过分夸大，因为它会破裂的肺。 - 一旦肺充气，充〜胸廓的⅔，拆下注射器和保持气管内的针，以防止任何琼脂糖泄漏。
- 倒在充气肺部大约50ml 20℃的PBS，以允许肺部内的琼脂糖设置和固化。慢慢用镊子取出针并关闭气管，以防止任何非固化琼脂糖泄漏。</ LI>
- 通过执行胸骨切开术暴露肺部并随后切除肺。对于肺切除，保住气管，同时通过气管切割彻底。轻轻拉动气管上，切去结缔组织和食道同时拉动肺出胸腔直到肺部从小鼠（图1E）分离。
- 沉浸在温暖的RPMI-1640肺部洗掉过量的血液，并通过使用剪刀和镊子切断裂片'主茎支气管在脐（图1F）的裂片轻轻分开。
- 放置裂片，与扁平表面向下最大化成像表面，在24孔成像板（图1G）的孔中。添加在叶前100微升37℃RPMI-1640。放置在叶片的顶部几15毫米圆形显微镜盖玻片以防止其浮动。
- 倾温PBS到周围井，以防止从EVAP所述的RPMI-1640培养基orating。插入24孔板进平衡气候室并保持在37℃的肺叶与空气和5％的CO 2。插入气候室上的共焦显微镜的阶段。
注意：其他气体的混合物（例如，5％O 2，5％CO 2的N 2以检查缺氧/低氧气的条件下，细胞的行为）也可以考虑。
图1.协议的准备肺部实时成像的。（A）准备鼠标后气管暴露。在平行于软骨环暴露气管制成（B）的小剪断。 （C），20G的针头插入4-5毫米的进气管。 （D）的400微升的2％低熔点温度琼脂糖到肺部的灌输。 （E）INFLated肺部鼠标分开。充气后（F）裂片分离。 （G）叶放置在一个24孔成像板的好。 请点击此处查看该图的放大版本。
6.采集和图像分析
注：图像可以与各种纺丝通过各种软件程序支持的磁盘共焦显微镜的获取。在这个协议中，无论是与一个特制的旋转盘共聚焦显微镜或禅与市售的旋转盘聚焦显微镜μManager用于图像采集，而了Imaris用于电影编辑和分析。
- 获取使用μManager图像。收购使用μManager软件映像的详细分步协议是前面所述18。
要么 - 获取图像使用图像分析软件，如禅（ 见图S1）。
- 点击“查找”选项卡，并选择在“光路” 工具 （图S1A，红色框）目标（10倍20倍或）。随后，点击“眼睛- DAPI'看看通过目镜（图S1A，蓝盒）CFP通道。本地化样品使用显微镜手动。点击“所有Off'after组织是视野的中心。
- 点击“捕获”选项卡，设置图像采集的所有参数。
- 在“渠道”工具，单击“+”按钮（图S1B，红色框）。一个弹出菜单显示和搜索染料（S）目前在“染料数据库”（图S1B）的样本。选择染料，然后单击“添加”。
注：该计划将设置为优化所有过滤器。染料可以删除通过选择依次点击垃圾桶按钮 （图S1B，黄框）。 - 在“采集模式”菜单中，将“像素合并”到5x5的。在渠道上菜单上ECFP双击将其选中。降低激光功率到20％，使样品不会同时进行图像采集设置的参数进行漂白。
- 选中“瓷砖”框在“实验管理”部分，瓷砖工具出现在“多维收购”工具组（ 图S1C）英寸点击“高级设置”按钮，从摄像机查看实时图像。在“位置”部分，点击“添加”按钮，4〜6个位置添加到实验。要删除的位置，选择位置，单击垃圾箱按钮。
- 在“采集参数”工具组中，打开了“聚焦战略”工具，然后选择“绝对E固定从下拉列表中Z位置“。
- 检查的Z-Stack框在“实验管理”部分和的Z-Stack工具出现在“多维收购”工具组（ 图S1D）英寸上的一个位置双击在“位置”部分，然后按'活'。手动先设置和设置的摄像视场的最后位置。于4微米的设置间隔。
注意：程序将确定切片为选定的范围和时间间隔的数目。理想的情况下，5-7片方便，以便有足够的可视化和快速的图像采集。 - 检查在“实验管理”部分的“时间序列”对话框。设置所需的“时间”和“间隔”中的“时间序列”的工具，出现在“多维收购”工具组（ 图S1E）的时间。
- 在'习得化模式“菜单中，将”像素合并“2×2。在通道菜单中荧光双击选中它并增加激光功率为100％。按“现场”，并调整“曝光时间”。重复此为每个荧光基团。
- 选中“启用自动保存”复选框。在文件名选择一个文件夹和类型。所有采集的图像会自动保存此文件夹中。
- 在“实验管理”部分，点击“开始试验”开始图像采集。
- 图像采集后，编译了Imaris软件的原始数据。将图像转换为.ims文件，并可以进行调节。对于文件的转换，进行调整，并使用了Imaris保存电影的详细分步协议是前面所述18。
- 当保存影片，设定每秒（fps）的“帧率”5张。
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Representative Results
使用纺丝盘共焦显微镜，各种小鼠模型系统和注射剂，转移微环境可以可视化并随时间跟踪。使用MMTV-PyMT; ACTB-ECFP;的c-FMS-EGFP三重转基因小鼠模型，不同的细胞组分的荧光标记（图2A，电影1）。肺实质的典型结构可以在CFP通道由于所有细胞中的β肌动蛋白启动子下表达的ECFP可视化。这些表现为大部分肺组织结构中细胞的大/多肺转移是很容易解决。髓细胞可视化在至c-fms的 GFP的通道-EGFP的表达，这是用于CSFR-1 12的转基因。骨髓细胞，因为它们在整个成像领域迁移很有活力。C-FMS-EGFP阳性细胞更丰富，肺实质迁徙相比，那些与肺紧密联系转移。骨髓细胞和它们与肺转移相互作用的动力学可以遵循在几个小时实时。
要检查转移性播种和生长，实验转移模型被使用（ 图2B， 电影2）。的GFP + VO-PyMT肿瘤细胞注射入野生型，非记者鼠标和允许种子并生长2周。肺的结构是在GFP通道清晰可见，由于肺的自发荧光。然而，VO-PyMT细胞仍然从肺结构容易区分，因为它们具有一个圆形的形状和更高的EGFP表达从而出现相比肺实质为更亮。 VO-PyMT细胞运动可在既定的转移性病灶内被观察到。
还可以使用的实验性转移模型中检查转移和免疫细胞在肺中的微环境之间的细胞相互作用。两周后VO-PyMT细胞注射，荧光标记的Gr-1 647标记的抗体是静脉注射肺切除（图2C， 电影3）前5小时。在成像领域的左侧，二的Gr-1 +骨髓细胞与VO-PyMT细胞相互作用。转移性病灶在影像领域的右侧观察。随着时间的推移，GR-1 +细胞被募集到转移性病灶。下面的转移性病灶，所述的Gr-1 +细胞中的一个紧密一个VO-PyMT细胞相互作用。最终，VO-PyMT细胞被驱逐，从GR-1 +细胞分离。
与实验转移模型和标记的免疫细胞注射的抗体相结合的记者转基因小鼠模型产生了三色的电影。注射VO-PyMT细胞成ACTB-ECFP记者小鼠后一周，荧光标记的Gr-1 647标记的抗体是静脉注射的组织切除（图2D， 电影之前5小时4）。的Gr-1 +细胞大力迁移的视野内，而一个单一的GFP +转移性细胞是在摄像视场的中心可见。
注入不同的荧光葡聚糖成报告小鼠，这在以前的转移性细胞注射，可以产生四色电影（图2E， 影5-6）。在转移的早期播种事件可以当VO-PyMT细胞会立即显现，并静脉注射到ACTB-ECFP记者小鼠后4小时进行研究。罗丹明缀合，70 kD的葡聚糖和10 kD的葡聚糖偶联至647荧光标记的注入允许肺毛细血管的可视化。较低和较高分子量的葡聚糖的使用可能被用于检测在肺毛细血管的通透性的变化，因为较低分子量的分子外渗更快相比于高分子量的那些19。虽然cellul芳事件仍然可以有效地研究， 电影5是组织漂移的一个例子。如果必要和的情况下的组织不能在成像会话期间被重新定位，这可能在后图像采集分析进行校正。
该系统允许快速，四色的连续图像采集到肺转移性微环境中按照不同的荧光标记的细胞类型。该协议还允许不同尺寸的转移的可视化，从与单个癌细胞既定转移的播种事件。此外，肿瘤细胞和间质细胞的运动，可以在肺微环境中与血管沿可视化。通常，蜂窝式移动可以观察到至少4小时从成像会话的开始。不同转移微环境的相同肺组织内观察有助于避免鼠标到小鼠变性。
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从通过实时成像获取的电影图2代表性图像：（A）从电影1示出对与肺实质（红色插入）有关的那些具有肺转移（黄色插入）有关的骨髓细胞合并ž堆栈快照。 （B）从电影2合并ž堆栈快照示出了在实验性转移模型的GFP +转移性细胞。箭头指向一个能动转移性细胞。 （C）从电影3为Z堆叠的快照示出了从通过缀合至647标记（红色箭头）一个Gr-1抗体显现一个GFP +转移和Gr-1 +细胞的荧光信号的共定位。绿色箭头指向的GFP +转移性细胞从转移性散装抛下。白色箭头指向与能动GFP + VO-PyMT细胞相互作用一个的Gr-1 +细胞。 （四）快照从电影4合并ž堆栈显示GFP + VO-PyMT细胞，ACTB-ECFP鼠标。单VO-PyMT细胞是在中心（绿色箭头）可见。将动物用的Gr-1 647缀合的抗体注射。 （E）的电影5和6示出了在小鼠的肺血管的代表性Z堆叠注射70 kD的罗丹明-葡聚糖（红色箭头）的与GFP + VO-PyMT细胞（绿色）沿后立即处死。比例尺是100微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
禅相机软件收购图像的补充图1.屏幕截图。（ 一）首先 ，在“光路”工具正确的目标，应选择（红色框）和日Ë组织显微镜进行本地化。 （B）进行图像采集配置渠道，在“渠道”渠道工具可以删除（红色框）或增加（黄色框）。 （C）在 “砖”工具，不同的位置可被添加到实验中。 （D）在 '的Z-Stack“工具，该Z堆叠可以设置和片的厚度可以调整。 （五）在“时间序列”的工具，持续时间和间隔时间可以设置。 请点击此处查看该图的放大版本。
电影1（点击下载）。相互作用肺转移和之间河畔。四舍五入使用转基因报告小鼠免疫细胞这部电影显示了三转基因MMTV-PyMT的肺部转移 ; ACTB-ECFP;的c-FMS-EGFP小鼠中，所有的细胞都标有ECFP和骨髓细胞标记用EGFP。转移可以被观察为在蓝色对比的正常肺结构的堆积单元。 的c-fms的 +骨髓细胞在整个摄像视野迁移。这部电影是一个2小时1分钟采集。
电影2（点击下载）。癌症细胞运动在实验转移模型。这部电影显示了GFP + VO-PyMT（绿色）细胞静脉注射生成到野生型，非记者，鼠标肺转移。肺VO注射两周后收获-PyMT细胞。 GFP +细胞的转移性批量内移动。这部电影是4小时40分钟长的采集。
电影3.（右键点击下载）。诚招通过荧光标记的抗体可视化，以建立实验转移的免疫细胞。这部电影显示了GFP + VO-PyMT细胞（绿色）静脉注射产生的肺转移到野生型，非记者，鼠标。肺收获两周VO-PyMT细胞注射后。的Gr-1 +细胞都标有GR-1 647缀合的抗体和在近红外信道（白色）观察。注意的Gr-1细胞被募集到GFP +转移。这部电影是一个长期收购，共11个小时27分钟的一个例子。
电影4.（点击下载）。能动性在转基因小鼠记者转移性细胞注射荧光标记的抗体可视化的免疫细胞。这部电影是表示通过本VO-的静脉注射产生的肺单个GFP + VO-PyMT细胞PyMT细胞（绿色）到ACTB-ECFP鼠标。肺收获一周后VO-PyMT细胞注射。的Gr-1 +细胞都标有GR-1 647缀合的抗体和在近红外信道（白色）观察。这部电影是2小时40分钟长的采集。
电影5.（右CLICk以下载）。静脉注射成转基因记者小鼠后，立即通过荧光葡聚糖可视转移性细胞和毛细血管。该动画显示由GFP + VO-PyMT细胞（绿色）的静脉注射用沿生成到一个ACTB-ECFP小鼠实验性转移罗丹明缀合，70 kD的葡聚糖（红）和10 kD的葡聚糖偶联至647荧光标记（白色），注射标记血管。这部电影是一个组织漂移的例子，是一个18分钟长的采集。
电影6.（右击下载）。通过静脉注射到转基因小鼠记者几个小时后，荧光右旋糖酐可视化转移性细胞和毛细血管。这部电影显示了实验性转移产生通过静脉注射的GFP + VO-PyMT细胞（绿色）的成ACTB-ECFP小鼠罗丹明缀合的，70 kD的葡聚糖（红）和10 kD的葡聚糖偶联至647荧光标记（白色）的喷射沿D，以标记血管。肺的VO-PyMT细胞注射后取出4小时。这部电影是一个19分钟长的采集。
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Discussion
这份手稿描述了转移的小鼠模型体外肺转移的实时成像的详细方法。该成像协议提供了肺的微环境中的动态和空间肿瘤细胞 - 基质相互作用的直接可视化。它是一个相对容易的和快速的方法，它允许为至少4小时的肺转移的可靠的成像。从这些实验中获得的影可以用来跟踪动态过程如细胞运动和细胞相互作用。
被描述为肺转移的产生方法有两种：一种基因工程小鼠模型和使用一个被操纵的细胞系。该MMTV-PyMT小鼠模型概括乳腺癌的进展和自发肺转移。该重述转移扩散的其它技术也是可用的，例如，在乳腺20个细胞原位移植。一个静脉注射VO-PyMTÇELL线是用来模仿播种和乳腺癌转移的产物。为VO-PyMT细胞生长的时间裕量取决于实验偏爱肺转移的阶段。取决于注射细胞的数目，微转移可以在几天内VO-PyMT细胞注射后观察到2周。
为了达到最佳的肺成像，必须十分小心肺的膨胀期间作出。为了正确通货膨胀，针应该只插入4-5毫米到气管。针插入较深可导致肺部局部的，片面的通货膨胀。此外，肺部应的实际膨胀期间观看，以防止过度膨胀，可能导致组织损伤。此外，它是保持肺无菌尽可能以便肺中的免疫细胞将不会受到挑战是至关重要的。
对于每个实时成像实验，数据采集和第量之间的最佳平衡需要考虑过度引起激光曝光的组织损伤电子潜力。它通过运行试验的实验来优化图像采集的设置是重要的。此外，建议保持激光功率下降，同时搜索的视图最佳字段和/或以保持快门关闭时，不会获得的图像。
癌症和/或感兴趣的免疫细胞的运动是的指标细胞活力之一。运动是温度，氧水平，并且光毒性7敏感。然而，运动性的抑制或缺乏可以不与成像条件或技术问题而生物。运动的抑制可能导致一定的治疗效果或转移性细胞之前，为了肺微血管内的扩散和他们的外渗进入肺实质21,22逮捕。因此它可能是重要的，以证实使用附加这样的数据技术（如二维培养迁移实验）23。
此外，该离体肺成像方法是足够的，不需要肺微循环障碍短期研究。使用这种方法，癌症和/或免疫细胞运动观察至少4小时。此前图像采集，大约需要30分钟来准备肺和30-60分钟找到收购的立场。虽然细胞运动是超过4小时观察到（高达11小时， 电影3），长时间成像取决于所研究的特定细胞类型，使用的条件（例如，降低的氧），并且应针对特定的实验装置来确定。此外，由于缺乏微循环和死后的变化可能带来的影响，或万一有为需要验证在一个完整的微循环的存在的结果的理由，以胸椎吸入窗口肺活体成像可以使用。然而，这是STILL一个挑战保持足够的负压，由于执行困难横跨使用成像窗口中脑，乳腺和腹腔脏器进行5多天活体肺显像。作为完整的体外肺灌注的替代方法，该离体-灌注肺方法以前用于研究肺转移。但是，这种方法通常用于较大的动物。由于小鼠有较小的胸腔，它们对有效灌注24一个真正的挑战。
由于光散射，纺丝盘共焦显微镜的成像深度是有限的。其结果是，细胞动力学和细胞相互作用的可视化被限制于浅的肺转移。肺转移在肺外周富集自转移性细胞通过其减少的尺寸朝向肺1的外边缘的毛细管密闭。此外，它是EA锡埃尔保持细胞的活力更接近，因为它们倾向于访问媒体和氧肺表面。以允许更深可视进入肺部，可以进行肺切片的实时成像。然而，应当预期的细胞死亡的相当大的量。可替代地，多光子显微镜可以进行，从而允许更大的组织穿透。另外，多光子成像产生的特性的光信号，称为二次谐波产生（SHG），它允许非中心对称结构的细胞外基质，例如胶原1纤维的可视化。
如在本研究中所示，肿瘤和免疫细胞的行为在肺转移可以遵循并使用荧光报告小鼠，操纵肿瘤细胞和荧光标记的示踪物或抗体进行分析。这个方法可以被修改为其它细胞和决定因素的转移性微环境内的研究。为此，有各种各样的TR可用于基质细胞的研究包括对成纤维细胞为FSP1-EGFP 4，α-SMA-25 RFP和COL1A1-EGFP 25或内皮细胞的Tie2-GFP 26 ansgenic记者老鼠。
活肺切片细胞染色已经进行可视化的免疫细胞群8。这种染色策略可以采纳为多色图像捕获的替代方法。然而，大多数标记物经常标记多个细胞群一不同的细胞群的代替。由特定细胞群4或针对其他细胞标记的荧光标记的抗体溶于注射可以用于群体进一步区分。的不同的荧光颜色来标记感兴趣的各种细胞的使用是优选的用于成像。在不能进行使用不同的荧光染料（例如，由于有限的成像陈荫罴例ELS），是可能的图像不同细胞类型具有相同荧光报告，只要它们是由形状和/或解剖定位容易区别。
除了研究各种细胞类型，几类化疗药物是弱荧光（如阿霉素）。这些化学治疗原则上可以用于可视化以类似的方式给药，并在肺转移的分布在原发肿瘤19。可能被荧光标记的其他靶向治疗也可在离体肺成像中使用。值得注意的是，与肺成像采集的数据可以是关于哪个单元卷取这些药物和它们与除了从活性血管这些治疗剂的外渗转移性微环境内的其它细胞相互作用提供更多的信息。可进一步用于原发性肺癌27的研究或适于其他肺部的研究这种技术相关疾病可能影响肺的微环境28,29。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MMTV-PyMT/FVB mice | Jackson Laboratory | 2374 | Female mice |
| ACTB-ECFP/FVB mice | UCSF Werb lab | Female mice | |
| c-fms-EGFP/FVB mice | UCSF Werb lab | Female mice | |
| FVB mice | Jackson Laboratory | 1800 | Female mice |
| GFP+ VO-PyMT cells | UCSF Werb lab | ||
| 70,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated | Invitrogen | D1818 | Dilute to 4mg/ml in 1 x PBS and store at -20 °C. Use 0.4 mg per animal. |
| 10,000 kDa Dextran, Alexa Fluor 647 conjugated | Invitrogen | D22914 | Dilute to 4mg/ml in 1 x PBS and store at -20 °C. Use 0.4 mg per animal. |
| Anti-mouse Gr-1 antibody Alexa Fluor 647 | UCSF Monoclonal antibody core | Stock 1mg/ml. Use 7 ug per animal. | |
| Anesthetic | Anesthesia approved by IACUC, used for anesthesia and/or euthanesia | ||
| 1X PBS | UCSF cell culture facility | ||
| PBS, USP sterile | Amresco INC | K813-500ML | Ultra pure grade for i.v. injection |
| Styrofoam platform | Will be used as dissection board | ||
| Fine scissors sharp | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Forceps | Roboz Surgical Store | RS-5135 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn ON 30min before use |
| Air | UCSF | ||
| Oxygen | UCSF | ||
| Carbon dioxide | UCSF | ||
| 1 mL syringe without needle | BD | 309659 | |
| 27 G x 1/2 needle | BD | 305109 | for i.v. injection |
| 20 G x 1 needle, short bevel | BD | 305178 | |
| Low-melting-temperature agarose | Lonza | 50111 | To make 10 ml of solution, weigh 0.2 g of agarose, add to 10 ml 1 x PBS, and heat to dissolve. Agarose will solidify at room temperature, so maintain in a 37 °C water bath until used for inflation. |
| RPMI-1640 medium without phenol red | Life Technologies | 11835-030 | |
| 24 well Imaging plate | E&K scientific | EK-42892 | |
| Glass cover slides, 15 mm | Fisher Scientific | 22-031-144 | |
| Digital CO2 and temperature controller | Okolab | DGTCO2BX | http://www.oko-lab.com |
| Climate chamber | Okolab | http://www.oko-lab.com | |
| Cell Observer spinning disk confocal microscope | Zeiss | ||
| Zen software | Zeiss | ||
| Inverted microscope | Carl Zeiss Inc | Zeiss Axiovert 200M | |
| ICCD camera | Stanford Photonics | XR-Mega-10EX S-30 | |
| Spinning disk confocal scan-head | Yokogawa Corporation | CSU-10b | |
| Imaris | Bitplane | ||
| mManager | Vale lab, UCSF | Open-source software |
References
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