Summary
Nous décrivons une méthode relativement simple pour ex vivo l'imagerie en direct de la tumeur interactions cellule-stroma dans les métastases du poumon, en utilisant journalistes fluorescentes chez la souris. Utilisation à disque rotatif microscopie confocale, cette technique permet de visualiser les cellules vivantes pendant au moins 4 heures et peut être adapté à l'étude d'autres maladies pulmonaires inflammatoires.
Abstract
Métastases est une cause majeure de morbidité et de mortalité liée au cancer. Métastase est un processus en plusieurs étapes et en raison de sa complexité, les processus cellulaires et moléculaires exacts qui régissent la dissémination métastatique et la croissance sont toujours insaisissable. imagerie en temps réel permet de visualiser les interactions dynamiques et spatiales des cellules et leur microenvironnement. des métastases de tumeurs solides couramment dans les poumons. Cependant, la localisation anatomique des poumons constitue un défi pour l'imagerie intravitale. Ce protocole fournit une méthode relativement simple et rapide pour les ex vivo imagerie en temps réel des interactions dynamiques entre les cellules tumorales et leur stroma environnant dans les métastases pulmonaires. En utilisant cette méthode, la motilité des cellules cancéreuses ainsi que les interactions entre les cellules cancéreuses et les cellules stromales dans leur microenvironnement peuvent être visualisés en temps réel pendant plusieurs heures. En utilisant des souris transgéniques reporter fluorescentes, une lignée de cellules fluorescentes, injectable marqué par fluorescencemolécules et / ou des anticorps, de multiples composants du microenvironnement du poumon peuvent être visualisées, par exemple les vaisseaux sanguins et des cellules immunitaires. À l'image des différents types de cellules, un disque rotatif de microscope confocal qui permet l'imagerie en continu à long terme avec, quatre couleurs rapide acquisition d'images a été utilisé. les films en accéléré compilées à partir d'images collectées sur plusieurs positions et plans focaux montrent les interactions entre métastatique en direct et les cellules immunitaires pendant au moins 4 heures. Cette technique peut être en outre utilisé pour tester la chimiothérapie ou la thérapie ciblée. En outre, cette méthode pourrait être adaptée à l'étude d'autres pathologies liées pulmonaires qui peuvent influer sur le microenvironnement du poumon.
Protocol
Toutes les procédures décrites doivent être effectuées conformément aux directives et règlements pour l'utilisation d'animaux vertébrés, y compris l'approbation préalable de l'institutionnel soins locale Animal Use Commission (IACUC).
1. Génération de métastases pulmonaires pour imagerie ex vivo en direct (transgénique ou veine de la queue Injection)
NOTE: métastases pulmonaires peuvent être générés en utilisant des modèles de souris transgéniques, soit par voie intraveineuse (iv) l'injection des cellules cancéreuses.
- Générer des métastases pulmonaires pour l'imagerie en traversant un modèle murin de tumeur par génie génétique dans une souris rapporteur transgénique, par exemple, traverser le modèle murin de cancer du sein, un antigène de souris par le virus de la tumeur mammaire terminale longue milieu répétées polyome T (MMTV-PyMT) 11 dans ACTB-ECFP souris modèle 12.
NOTE: Le modèle ACTB-ECFP exprime renforcée protéine fluorescente cyan (ECFP) sous la β-acten promoteur de telle sorte que toutes les cellules fluorescentes dans le canal PCP bleu. Cependant, les cellules cancéreuses sont de loin le plus important et apparaissent comme une masse de cellules positives ECFP au microscope. Le modèle de souris MMTV-PyMT développe une maladie progressive, dans lequel la croissance de la tumeur mammaire est associée à la diffusion des cellules cancéreuses de la périphérie, en particulier dans les poumons. Chez les souris MMTV-PyMT sur le FVB / N fond, micrométastases peuvent être observées autour 10-11 semaines d'âge. En général, ces progrès à macrométastases à environ 14 semaines de 13 ans.
OU - Générer des métastases expérimentales en utilisant des cellules primaires ou des lignées cellulaires syngéniques. Utiliser dans les cellules tumorales in vitro primaire manipulé ou des lignées cellulaires (par ex., La transduction), suivie par 14 injection intraveineuse.
- En bref, dans ce protocole, injecter une protéine fluorescente verte (GFP) exprimant (de +) lignée cellulaire MMTV-PyMT dans des souris fluorescentes rapporteurs (ACTB-ECFP) ou des souris de type sauvage. Alors,visualiser ces cellules appelées cellules VO-PyMT 15 en utilisant le canal de la GFP vert.
NOTE: La ligne d'origine cellulaire VO-PyMT a été dérivée à la Vanderbilt Orthopédie à Nashville, TN. VO signifie Vanderbilt Orthopédie. - Après l'injection de 10 6 cellules (dans 200 ul), d'observer immédiatement et jusqu'à l'extravasation des cellules cancéreuses à quelques heures après l'injection; observer micrométastases entre 1-3 semaines après l'injection et de détecter macrométastases 3 semaines après l'injection 15.
NOTE: Moins de cellules peuvent être injectées à prolonger la durée de l'injection à la croissance métastatique.
- En bref, dans ce protocole, injecter une protéine fluorescente verte (GFP) exprimant (de +) lignée cellulaire MMTV-PyMT dans des souris fluorescentes rapporteurs (ACTB-ECFP) ou des souris de type sauvage. Alors,visualiser ces cellules appelées cellules VO-PyMT 15 en utilisant le canal de la GFP vert.
2. L'étiquetage des composants d'intérêt dans le métastatique Microenvironnement (transgénique et / ou injectables)
NOTE: L'étiquetage peut être réalisé par les souris transgéniques et / ou de divers produits injectables. Assurez-vous d'utiliser différentes couleurs fluorescentes pour l'étiquetage des différents types de cellules.
- Les composants Label du microenvironnement métastatique utilisant des souris transgéniques. Traverser le modèle de tumeur de souris a été mentionné précédemment (par ex., MMTV-PyMT x ACTB-ECFP) dans un modèle de souris transgénique dans lequel les cellules stromales d'intérêt sont marquées par une protéine fluorescente qui ne ECFP, par ex., C-fms-EGFP 4,16.
NOTE: En plus de la visualisation de cellules cancéreuses dans le canal PCP, ce qui permet la visualisation de cellules myéloïdes dans le canal 4 de la GFP.
ET / OU - Étiqueter les différents composants de la micro-métastatique injectables en utilisant des souris transgéniques de rapporteur fluorescent (ou non fluorescent) souris de type sauvage.
NOTE: Plusieurs composés peuvent être injectés pour marquer diverses composantes du micro-métastatique, par exemple, un anticorps Gr-1 AF647 conjugué est utilisé ici pour identifier les neutrophiles et les monocytes 13 et des différents dextranes de poids moléculaire sont utilisésétiqueter les capillaires pulmonaires. Pour la préparation de ces produits injectables voir l'étape 4.
3. Préparation du matériel avant la dissection
- 2% d'agarose
- Peser 0,2 g d'agarose et ajouter 10 ml 1 x PBS. Chauffer la solution pour dissoudre la gélose. Agarose se solidifie à température ambiante, afin de maintenir dans un bain-marie à 37 ° jusqu'à l'utilisation de l'inflation.
- CO 2 et du contrôleur de température
- Vérifiez ddH 2 O dans la chambre d'humidification. Remplir en cas de besoin. Insérez la plaque de configuration dans le support de plaque de palier de température (chambre climatique). Allumez le contrôleur CO 2 et régler CO 2 à 5%. Assurez-vous que le débit d'air est fixé à 0,4 Nl / min.
- Ouvrez l'air et de CO 2 soupapes. Mettez le régulateur de température. Assurez-vous que la température de la chambre climatique et le couvercle sont fixés à 37 ° C.
- Relâcher la pression de l'air sur le CO 2 mètres. Vérifiez CO 2 de plus en plus, equilibration peut prendre jusqu'à 30 minutes.
- disque filage microscope confocal
NOTE: Détails du microscope set-up ont été décrits précédemment 4,17.- Allumer les lasers (le laser argon pour 488 nm excitation et à l'état solide 405 nm, 561 nm et 640 nm lasers). Allumer le microscope, la caméra, l'unité de commande de disque en rotation, l'AOTF, l'unité de commande de laser et le dispositif de commande de la caméra.
- Ouvrez le volet de microscope, tourner sur l'ordinateur exécutant le microscope et ouvrir le logiciel.
- Préparation des outils et de la plate-forme de dissection.
- Allumez le stérilisateur à billes chaude et laisser atteindre 250 ° C. Nettoyer 2 paires de ciseaux chirurgicaux et des pinces avec de l'eau et du savon. Stériliser les instruments pendant au moins 30 secondes. Laissez les outils se rafraîchir. Utilisez un couvercle de polystyrène comme plate-forme de dissection. Couvrir avec un morceau de laboratoire suintant.
4. Préparation des injections
NOTE: En fonction de la demi-vie et la réponse préférée, injection marqué par fluorescence des anticorps et / ou des molécules fluorescentes, soit immédiatement avant le sacrifice animal ou un couple d'heures à quelques jours avant.
- Pour neutrophiles l'image Gr1-positifs et les monocytes, préparer une seringue avec 7 ul d'actions AF647 conjugué Gr-1 anticorps (1 mg / ml) dans 100 pi de PBS stérile sous le capot. Placez une aiguille 27 G ½ sur la seringue.
- À l'image des capillaires pulmonaires, préparer une deuxième et une troisième seringue avec 100 ul de 70 kD rhodamine-dextrane conjugué (4 mg / ml) ou de dextran 10 kD AF647-conjugué (4 mg / ml). Placez une aiguille 27 G ½ sur les seringues.
- Injecter l'AF647 conjugué solution d'anticorps iv 5 heures avant l'excision des poumons.
- Injecter une ou deux solutions de dextran iv immédiatement avant l'excision des poumons.
5. Préparation des poumons pour imagerie ex vivo en direct
NOTE: Essayez de travailler comme stérile et minutieuse que possible pour éviter des difficultés inutiles des cellules immunitaires dans les poumons.
- Injecter la souris par voie intrapéritonéale (ip) d'une dose mortelle d'un anesthésique permise par le protocole approuvé par le IACUC animale, par exemple., 1 ml d'Avertin à 2,5%. Attendez que la souris pour arrêter de respirer et être complètement non-réponse à des stimuli nocifs (patte arrière de pincement).
NOTE: La dislocation cervicale et le dioxyde de carbone de l'euthanasie doit être évitée car elle peut affecter négativement la viabilité des cellules du poumon. - Immobiliser la souris sur une planche de dissection et stériliser la souris avec 70% d'éthanol.
- Utilisez des ciseaux chirurgicaux d'abord faire une incision transversale épigastrique à travers la peau, suivie par une incision similaire à travers le péritoine. Tenez la carte de dissection dans une position verticale et couper l'aorte descendante, de sorte que les piscines de sang dans l'abdomen et non pas dans la cavité thoracique.
- Spincer une petite ouverture dans la membrane pour libérer le vide. Couper le long du 10e et 12e côte pour exciser le diaphragme et d'obtenir un accès visuel aux poumons.
- Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour couper la peau jusqu'à la trachée sur la cage thoracique, mais laisser la cage thoracique intacte. Séparer la peau de la cage thoracique. Exposer la trachée en retirant le tissu conjonctif environnant, en faisant attention à ne pas endommager la trachée elle-même (figure 1A).
- Couper une petite ouverture d'environ 1 mm de diamètre dans la trachée parallèlement exposé aux anneaux cartilagineux, au plus près du larynx que possible (figure 1B). Veillez à ne pas couper complètement à travers la trachée.
- Prenez une aiguille 20 G et insérer délicatement l'aiguille 4-5 mm dans la trachée sans force contre (figure 1D). L'extrémité de l'aiguille doit être visible à travers la trachée (figure 1C). Utiliser une pince pour stabiliser l'aiguille dans la trachée. Alternativement, une suture peut être lié around la trachée pour maintenir l'aiguille en place.
NOTE: En insérant trop profonde, la carène peut être traumatisé ou seulement un côté des poumons pourrait être gonflé. - Remplir une seringue avec 400 ul de 37 ° C 2% d'agarose à faible température de fusion (pris directement à partir d'un bain à température constante). Assurez-vous que le conseil de dissection est debout et instiller lentement l'agarose chaud à travers l'aiguille dans les poumons, utilisez ~ 400 pi pour gonfler les poumons.
NOTE: Suivre les poumons de gonflage à l'intérieur de la cage thoracique. Ne pas trop gonfler le poumon comme il se rompt. - Une fois que les poumons sont gonflés, le remplissage ~ ⅔ de la cage thoracique, détacher la seringue et maintenir l'aiguille à l'intérieur de la trachée pour empêcher toute fuite d'agarose.
- Verser environ 50 ml de 20 ° C PBS sur les poumons gonflés pour permettre la gélose dans les poumons de fixer et de se solidifier. Retirer lentement l'aiguille et fermer la trachée avec une pince pour éviter toute non-solidifié agarose de fuir. </ Li>
- Exposer les poumons en effectuant une sternotomie et exciser ensuite les poumons. Pour excision des poumons, tenir à la trachée tout en coupant à travers la trachée complètement. Tirez doucement sur la trachée jusqu'à, couper le tissu conjonctif et de l'œsophage, tout en tirant les poumons de la cavité de la poitrine jusqu'à ce que les poumons est séparée de la souris (figure 1E).
- Plonger les poumons à chaud RPMI-1640 pour laver le sang excessive et séparer délicatement les lobes en utilisant ciseaux et des pinces pour couper la tige principale des bronches des lobes à hile (figure 1F).
- Placer les lobes avec la surface plate afin de maximiser la surface d'imagerie, dans un puits d'une plaque de formation d'image à 24 puits (figure 1G). Ajouter 100 ul de 37 ° C le milieu RPMI-1640 au-dessus des lobes. Placer plusieurs lames de microscope de couverture circulaire 15 mm au-dessus des lobes pour l'empêcher de flotter.
- Verser chaud PBS dans les puits environnants pour empêcher les médias RPMI-1640 de évaporateurcolla-. Insérer la plaque à 24 puits dans la chambre climatique équilibrée et maintenir les lobes pulmonaires à 37 ° C avec de l'air et 5% de CO 2. Insérez la chambre climatique sur la scène du microscope confocal.
NOTE: D'autres mélanges de gaz (par exemple, 5% O 2, 5% de CO 2 en N 2 d'examiner le comportement des cellules dans des conditions d'hypoxie / oxygène plus faible) pourrait également être envisagée.
Figure 1. Le protocole de préparation des poumons pour l'imagerie en temps réel. (A) l'exposition de la trachée après la préparation de la souris. (B) Petit snip faite dans la trachée parallèlement exposé aux anneaux cartilagineux. (C) 20 aiguille G 5.4 mm insérée dans la trachée. (D) L'instillation de 400 ul de 2% à faible température de fusion d'agarose dans les poumons. (E) InflATED poumons séparés de la souris. (F) lobes séparés après inflation. (G) lobes placé dans un puits d'une plaque d'imagerie de 24 puits. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
6. Acquisition et analyse d'images
Remarque: Les images peuvent être acquises avec une variété de disque rotatif microscopie confocale pris en charge par les différents logiciels. Dans ce protocole, soit μManager avec un disque filer microscope confocal sur-mesure ou Zen avec un disque filer microscope confocal disponible dans le commerce est utilisé pour l'acquisition de l'image, tout en Imaris est utilisé pour l'édition et l'analyse vidéo.
- Acquérir des images à l'aide de μManager. Une étape détaillé par le protocole d'étape pour l'acquisition d'images en utilisant un logiciel μManager est décrit précédemment 18.
OU - acquérir des imagesen utilisant un logiciel d'analyse d'image tels que Zen (voir Figure S1).
- Cliquez sur l'onglet «Localiser», et choisissez objectif (10x ou 20x) dans le «Chemin de Lumière 'outil (Figure S1A, boîte rouge). Par la suite, cliquez sur "Eyes - DAPI 'à regarder le canal PCP à travers l'oculaire (Figure S1A, boîte bleue). Localiser l'échantillon manuellement à l'aide du microscope. Cliquez sur "Tout Off'after le tissu est centre du champ de vision.
- Cliquez sur l'onglet «Acquisition» pour régler tous les paramètres d'acquisition d'images.
- Dans l'outil «canaux», cliquez sur le bouton '+' (Figure S1B, boîte rouge). Un menu pop-up apparaît et la recherche pour le colorant (s) présent dans l'échantillon dans la «base de données Dye '(Figure S1B). Sélectionnez le colorant et cliquez sur "Ajouter".
NOTE: Le programme sera mis tous les filtres à être optimisés. Un colorant peut être suppriméen le sélectionnant suivi en cliquant sur le bouton de la corbeille (Figure S1B, boîte jaune). - Dans le menu "Mode d'acquisition ', set' Binning» pour 5x5. Double-cliquez sur ECFP dans le menu des canaux pour le sélectionner. Abaisser la puissance du laser à 20% si l'échantillon ne sera pas blanchie lors de la configuration des paramètres d'acquisition d'images.
- Cochez la case 'Tuiles »dans la section« Experiment Manager' et l'outil de tuiles apparaît dans le groupe de l'outil «multidimensionnelle Acquisition» (Figure S1C). Cliquez sur le bouton 'Configuration avancée' pour voir l'image en direct de la caméra. Cliquez sur le bouton "Ajouter" dans la section "Positions de d'ajouter 4 à 6 positions à l'expérience. Pour supprimer une position, sélectionnez cette position et cliquez sur le bouton de la corbeille.
- Dans le groupe «Acquisition paramètre 'outil, ouvrir l'outil« Stratégie Focus », et sélectionnez« Absolute fixe position Z 'dans la liste déroulante.
- Cochez la case Z-Stack dans la section «Experiment Manager 'et l'outil Z-Stack apparaît dans le groupe de l'outil« multidimensionnelle Acquisition »(Figure S1D). Double-cliquez sur l'une des positions dans la section «positions» et appuyez sur 'Live'. Définir manuellement premier et définir dernière position du domaine de l'imagerie. Définir l'intervalle à 4 pm.
NOTE: Le programme permettra de déterminer le nombre de tranches pour la gamme choisie et l'intervalle. Idéalement, 5-7 tranches sont pratiques pour permettre la visualisation suffisante et acquisition rapide des images. - Cochez la case 'Time Series dans la section «Experiment Manager'. Set souhaité 'Durée' et les temps "intervalle" dans l'outil 'Time Series qui est apparu dans le groupe d'outils «multidimensionnelle Acquisition» (Figure S1E).
- Dans le '' acquisitionMode tion 'menu, mis' Binning »pour 2x2. Double-cliquez sur un fluorophore dans le menu des canaux pour le sélectionner et d'augmenter la puissance du laser à 100%. Appuyez sur 'Live' et régler le «temps d'exposition». Répétez cette opération pour chaque fluorophore.
- Cochez la case 'Activer Auto Save "boîte. Sélectionnez un dossier et tapez le nom du fichier. Toutes les images acquises seront automatiquement enregistrés dans ce dossier.
- Cliquez sur 'Début de l'expérience »dans la section« Experiment Manager' pour lancer l'acquisition d'images.
- Après l'acquisition de l'image, compiler les données brutes dans les logiciels Imaris. Convertir des images en .ims fichiers et des ajustements peuvent être faits. Une étape détaillé par le protocole de l'étape de conversion des fichiers, faire des ajustements et des films d'épargne utilisant Imaris est décrit précédemment 18.
- Lors de l'enregistrement du film, réglez le "Frame Rate" à 5 images par seconde (fps).
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Representative Results
En utilisant la microscopie confocale à disque tournant, les différents systèmes de modèles de souris et injectables, le micro-métastatique peut être visualisée et suivi dans le temps. Utilisation d'un MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; c-fms-EGFP modèle de souris transgénique triple, différents composants cellulaires sont marquées par fluorescence (Figure 2A, Film 1). La structure typique du parenchyme pulmonaire peut être visualisé dans le canal PCP étant donné que toutes les cellules expriment ECFP sous le promoteur de β-actine. / Grandes métastases pulmonaires multicellulaires sont faciles à résoudre que ceux-ci apparaissent comme une masse de cellules au sein de la structure du poumon organisée. Les cellules myéloïdes sont visualisées dans le canal de la GFP par l'intermédiaire c-fms -EGFP expression, qui est le transgène pour une 12-CSFR. Cellules myéloïdes sont très dynamiques comme ils migrent dans tout le domaine de l'imagerie. C-fms cellules -EGFP-positifs sont plus abondantes et migratoire dans le parenchyme pulmonaire par rapport à ceux en contact étroit avec le poumonmétastase. La dynamique de cellules myéloïdes et leurs interactions avec des métastases pulmonaires peuvent être suivis en temps réel pendant plusieurs heures.
Pour examiner l'ensemencement métastatique et de la croissance, un modèle de métastase expérimentale est utilisée (Figure 2B, Movie 2). Les cellules tumorales GFP + VO + PyMT ont été injectés dans un type sauvage, non-reporter souris et on a laissé les semences et la croissance pendant 2 semaines. La structure du poumon est clairement visible dans le canal de la GFP du fait de l'autofluorescence des poumons. Cependant, les cellules VO PyMT sont encore faciles à distinguer de la structure du poumon, car ils ont une forme ronde et supérieur expression de l'EGFP semblent donc plus lumineuse par rapport au parenchyme pulmonaire. VO-PyMT de la motilité cellulaire peut être observé au sein de la lésion métastatique établie.
les interactions cellulaires entre les cellules immunitaires et métastatique dans le microenvironnement du poumon peuvent également être examinés à l'aide du modèle de métastase expérimentale. Deux semaines aprèsinjection de cellules VO-PyMT, marqué par fluorescence Gr-1 647 anticorps conjugués sont injectés iv 5 heures avant l'excision du poumon (figure 2C, Film 3). Sur le côté gauche de la zone d'imagerie, deux Gr-1 + cellules myéloïdes sont en interaction avec une cellule VO-PyMT. Une lésion métastatique est observée dans la partie droite du champ de formation d'image. Au fil du temps, Gr-1 + cellules sont recrutés à la lésion métastatique. En dessous de la lésion métastatique, une des cellules Gr-1 + coopère étroitement avec une cellule VO PyMT. Finalement, la cellule VO-PyMT déloge, dégageant de la cellule + Gr-1.
La combinaison de modèles de souris transgéniques rapporteurs avec le modèle de métastase expérimentale et anticorps injectables étiquetage cellules immunitaires donne un film à trois couleurs. Une semaine après l'injection de cellules VO-PyMT dans une journaliste souris ACTB-ECFP, 647 anticorps conjugués GR-1 marquées par fluorescence sont iv injecté 5 heures avant l'excision des tissus (figure 2D, Film4). GR-1 + cellules migrent vigoureusement dans le champ de vision, tout en un seul GFP + cellule métastatique est visible au centre du champ de l'imagerie.
Injecter différents dextranes fluorescents dans des souris rapporteurs, qui, auparavant, ont été injectés avec des cellules métastatiques, peut produire un film en quatre couleurs (Figure 2E, Films 5-6). Événements précoces de l'ensemencement des métastases peuvent être étudiés lorsque les cellules VO-PyMT sont visualisées immédiatement et 4 heures après l'injection intraveineuse à des souris rapporteurs ACTB-ECFP. L'injection de la rhodamine-conjugué, 70 kD et 10 kD dextrane dextrane conjugué à un marqueur fluorescent 647 permet la visualisation des capillaires pulmonaires. L'utilisation de dextranes inférieure et supérieure de poids moléculaire pourrait être utilisé pour détecter des changements dans la perméabilité des capillaires dans les poumons, étant donné que les molécules de poids moléculaire inférieur extravasent plus rapide par rapport à ceux de poids moléculaire élevé 19. Bien Cellul événements ar peuvent encore être efficacement étudiées, Film 5 est un exemple d'une dérive de tissus. Si nécessaire et dans le cas le tissu ne peut être repositionné au cours de la session d'imagerie, ce qui pourrait être corrigée au cours des analyses de l'acquisition post-image.
Ce système permet à un quadrichromie image continue acquisition rapide, pour suivre différents types de cellules marquées par fluorescence à l'intérieur de la micro-métastatique du poumon. Ce protocole permet également la visualisation des métastases de différentes tailles, des événements liés à l'ensemencement des cellules cancéreuses individuelles de métastases établies. En outre, les cellules tumorales et les mouvements des cellules stromales peuvent être visualisés à l'intérieur du micro-environnement du poumon ainsi que les vaisseaux sanguins. Typiquement, le mouvement cellulaire peut être observé pendant au moins 4 heures à partir du début de la session d'imagerie. L'observation des différents micro-environnements métastatiques dans le même tissu pulmonaire permet d'éviter la variabilité souris à souris.
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Figure 2. Des images représentatives de films acquis par imagerie en temps réel. (A) instantané d'une pile de Z fusionné à partir de film 1 montrant des cellules myéloïdes associées à une métastase pulmonaire (insert jaune) par rapport à ceux qui sont associés avec le parenchyme pulmonaire (insert rouge). (B) instantané d'une pile de Z fusionné à partir de film 2 montrant GFP + cellule métastatique dans un modèle de métastase expérimentale. Arrowhead pointe vers une cellule métastatique mobiles. (C) instantané d'une pile de Z du film 3, montrant la co-localisation des signaux fluorescents à partir d'une GFP + métastases et Gr 1 cellules + visualisés par un anticorps Gr-1 conjugué à une 647 étiquette (flèche rouge). flèche pointe vert à une GFP + cellule métastatique délogé de la masse métastatique. flèche pointe blanche à une cellule + Gr-1 qui a interagi avec la cellule GFP + VO-PyMT mobiles. (D) Instantané deune pile fusionnée Z de film 4 montrant des cellules GFP + VO-PyMT, dans ACTB-ECFP souris. Une cellule VO-PyMT seule est visible au centre (tête de flèche verte). L'animal a été injecté avec Gr-1 647 anticorps conjugué. (E) représentatif Z-empilement de films 5 et 6 montrant des vaisseaux sanguins dans les poumons de souris est sacrifié immédiatement après l'injection de 70 kD rhodamine-dextrane (flèche rouge) ainsi que les cellules GFP + VO + PyMT (vert). Barres d'échelle sont 100 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 1. coups supplémentaires d'écran de logiciel ZEN de la caméra d'acquisition d'images. (A) d'abord, dans l'outil «Chemin de Lumière» le droit objectif devrait être choisi (boîte rouge) et ee tissu être localisée dans le microscope. (B) Configurer les canaux d'acquisition d'images, dans le les chaînes d'outils «Chaînes de peuvent être supprimés (boîte rouge) ou ajouté (boîte jaune). (C) Dans l'outil «Carreaux», différentes positions peut être ajouté à l'expérience. (D) Dans l'outil «Z-Stack», le Z-pile peut être réglée et l'épaisseur des tranches peut être ajustée. (E) dans l'outil 'Time Series, la durée et l'intervalle peut être réglé. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Film 1. (clic pour télécharger). Interactions entre une métastase pulmonaire et sur. arrondi cellules immunitaires en utilisant des souris transgéniques rapporteurs Ce film montre une métastase dans le poumon d'un MMTV-PyMT triple transgénique; ACTB-ECFP; c-fms-EGFP souris dans lesquels toutes les cellules sont marquées avec ECFP et les cellules myéloïdes sont étiquetés avec EGFP. La métastase peut être observée comme une masse de cellules en bleu, contrairement à l'architecture pulmonaire normale. C-fms + cellules myéloïdes migrent à travers l'ensemble du champ de formation d'image. Ce film est une acquisition 1 min 2 h.
Film 2. (clic droit pour télécharger). Motilité cellulaire du cancer dans un modèle de métastase expérimentale. Ce film montre une métastase pulmonaire engendrée par injection intraveineuse de cellules GFP + VO-PyMT (vert) dans un type sauvage, non-reporter, souris. Les poumons ont été récoltés deux semaines après l'injection de VOcellules -PyMT. cellules GFP + se déplacent dans la masse métastatique. Ce film est un 4 h 40 min à long acquisition.
Film 3. (clic droit pour télécharger). Le recrutement de cellules immunitaires visualisés par des anticorps par fluorescence conjugué à établi expérimentalement métastases. Ce film montre une métastase pulmonaire engendrée par injection intraveineuse de cellules GFP + VO-PyMT (vert) dans un type sauvage, non journaliste, souris. Les poumons ont été prélevés deux semaines après que les cellules VO PyMT ont été injectés. Gr-1 + cellules sont marquées avec Gr-1 647 anticorps conjugué et observé dans le canal proche infrarouge (blanc). Notez que Gr-1 cellules sont recrutés pour la métastase GFP +. Ce film est un exemple d'une acquisition à long terme, un total de 11 h 27 min.
Cinéma 4. (clic droit pour télécharger). Motilité des cellules immunitaires visualisés par des anticorps par fluorescence conjugués à une souris rapporteur transgénique injecté avec des cellules métastatiques. Ce film montre une seule cellule GFP + VO-PyMT dans les poumons générée par injection intraveineuse de la for- cellules PyMT (vert) dans une souris ACTB-ECFP. Les poumons ont été récoltés une semaine après cellules VO-PyMT ont été injectés. Gr-1 + cellules sont marquées avec Gr-1 647 anticorps conjugué et observé dans le canal proche infrarouge (blanc). Ce film est un 2 h 40 min à long acquisition.
Film 5. (Clic droitk pour télécharger). cellules métastatiques et les capillaires visualisées par dextranes fluorescents immédiatement après l'injection intraveineuse à une souris rapporteur transgénique. Ce film montre la métastase expérimentale généré par injection intraveineuse de cellules GFP + VO-PyMT (vert) dans une souris ACTB-ECFP avec le injection de rhodamine-conjugué, 70 kD dextran (rouge) et 10 kD dextran conjugué à un marqueur fluorescent 647 (blanc), à l'occasion de vaisseaux sanguins. Ce film est un exemple d'une dérive de tissus et un temps d'acquisition de 18 min.
Film 6. (clic pour télécharger). Cellules métastatiques et les capillaires visualisées par dextranes fluorescents plusieurs heures après l'injection intraveineuse dans une souris transgénique journaliste. Ce film montre la métastase expérimentale générerd par injection intraveineuse de cellules GFP + VO-PyMT (vert) dans une souris ACTB-ECFP avec l'injection de rhodamine conjuguée, 70 kD dextran (rouge) et 10 kD dextran conjugué à un marqueur fluorescent 647 (blanc), à l'occasion de vaisseaux sanguins. Les poumons ont été récupérés 4 heures après l'injection des cellules VO-PyMT. Ce film est une longue acquisition de 19 min.
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Discussion
Ce manuscrit décrit une méthode détaillée pour ex vivo l'imagerie en direct de métastases du poumon chez des souris modèles de métastases. Ce protocole d'imagerie fournit une visualisation directe des interactions tumeur-stroma cellulaire et dynamiques spatiales dans le microenvironnement du poumon. Il est une méthode relativement simple et rapide qui permet l'imagerie fiable de métastases pulmonaires pendant au moins 4 heures. Films acquises à partir de ces expériences peuvent être utilisés pour suivre les processus dynamiques que la motilité cellulaire et les interactions cellulaires.
Deux procédés pour la production de métastases pulmonaires ont été décrits: un modèle de souris transgénique et l'utilisation d'une lignée cellulaire manipulée. Le modèle de souris MMTV-PyMT récapitule la progression du cancer du sein et de métastases pulmonaires spontanées. D'autres techniques qui récapitulent dissémination métastatique sont également disponibles, par exemple., La transplantation orthotopique de cellules dans la glande mammaire 20. Un injecté par voie intraveineuse VO-PyMT cell ligne est utilisé pour imiter l'ensemencement et l'excroissance de la métastase du cancer du sein. Le temps alloué à VO-PyMT cellule excroissance dépend de la préférence expérimental pour le stade de métastases pulmonaires. En fonction du nombre de cellules injectées, micrométastases peuvent être observés dans les quelques jours à 2 semaines après l'injection des cellules VO PyMT.
Pour l'imagerie pulmonaire optimale, un grand soin doit être pris lors du gonflage des poumons. Pour gonflage, l'aiguille ne doit être inséré 4-5 mm dans la trachée. Plus profonde insertion de l'aiguille peut entraîner un gonflement partiel, d'un côté des poumons. En outre, les poumons doivent être surveillés au cours de l'inflation réelle pour éviter une sur-inflation qui peut entraîner des dommages aux tissus. En outre, il est essentiel de garder les poumons aussi stérile que possible afin que les cellules immunitaires dans les poumons ne seront pas contestés.
Pour chaque expérience d'imagerie en temps réel, l'équilibre optimal entre la quantité d'acquisition de données et epotentiel de e de dommages aux tissus causés par une exposition excessive au laser doit être envisagée. Il est important d'optimiser les paramètres d'acquisition de l'image en exécutant des expériences pilotes. En outre, il est recommandé de conserver la puissance du laser vers le bas lors de la recherche pour les champs de vision optimal et / ou de maintenir l'obturateur quand les images ne sont pas acquis.
La motilité du cancer et / ou des cellules immunitaires d'intérêt est l'un des indicateurs de vitalité des cellules. Motilité est sensible à la température, les niveaux d'oxygène, et la phototoxicité 7. Cependant, l'inhibition ou le manque de mobilité ne peuvent pas être liées à des conditions d'imagerie ou des problèmes techniques, mais plutôt biologique. L'inhibition de la motilité peut résulter d'un certain effet thérapeutique ou de l'arrêt des cellules métastatiques juste avant leur prolifération au sein du système microvasculaire du poumon et leur extravasation dans le parenchyme pulmonaire 21,22. Il peut donc être important pour corroborer ces données à l'aide supplémentairetechniques (comme les essais de migration en culture 2D) 23.
En outre, cette méthode ex vivo d'imagerie du poumon est suffisante pour une étude à court terme qui ne nécessite pas la microcirculation du poumon. En utilisant cette méthode, le mouvement du cancer et / ou les cellules immunitaires est observée pendant au moins 4 heures. Avant l'acquisition de l'image, il faut environ 30 minutes pour préparer les poumons et 30-60 min de trouver des positions d'acquisition. Bien que la motilité cellulaire est observée au-delà de 4 h (jusqu'à 11 h, Film 3), l'imagerie prolongée dépend des types de cellules particuliers étudiés, les conditions utilisées (par exemple., Oxygène réduite), et doit être déterminé pour un montage expérimental particulier. En outre, en raison de l'absence de la microcirculation et l'impact possible des changements post-mortem ou au cas où il existe une justification pour un besoin de vérifier les résultats en présence d'une microcirculation intacte, l'imagerie intravitale du poumon avec une fenêtre d'aspiration thoracique peut être utilisé. Cependant, il est still un défi d'effectuer l'imagerie du poumon intravitale sur plusieurs jours en utilisant une fenêtre d'imagerie réalisée dans le cerveau, la glande mammaire et des organes abdominaux 5 en raison de difficultés dans le maintien de la pression négative suffisante. Comme une méthode alternative pour perfusion ex vivo poumons intacts, la méthode du poumon isolé-perfusé a déjà été utilisé pour étudier la métastase pulmonaire. Cependant, ce procédé est souvent utilisé pour de plus grands animaux. Puisque les souris ont de plus petites cavités thoracique, ils posent un véritable défi pour perfusion à compter du 24.
En raison de la diffusion de lumière, la profondeur de la microscopie confocale à disque tournant imagerie est limité. En conséquence, la visualisation de la dynamique des interactions cellulaires et des cellules est limité aux métastases pulmonaires superficielles. Métastases pulmonaires sont enrichis dans la périphérie du poumon puisque les cellules métastatiques sont confinés par les capillaires qui diminuent de taille vers les bords extérieurs du poumon 1. En outre, il est easier de maintenir la viabilité des cellules plus près de la surface du poumon car ils ont un accès privilégié aux médias et de l'oxygène. Pour permettre la visualisation profondément dans les poumons, l'imagerie en temps réel des sections de poumon peut être effectuée. Cependant, beaucoup de mort cellulaire devrait être prévu. Alternativement, la microscopie multiphotonique peut être effectuée, ce qui permet une plus grande pénétration dans les tissus. En outre, l'imagerie multiphotonique génère un signal optique intrinsèque, appelé génération de seconde harmonique (SHG), ce qui permet la visualisation des structures non centro-symétriques dans la matrice extracellulaire tels que le collagène, les fibres 1.
Comme le montre la présente étude, la tumeur et le comportement des cellules immunitaires dans les métastases pulmonaires peuvent être suivies et analysées en utilisant des souris rapporteurs fluorescents, des cellules tumorales manipulées et des traceurs ou des anticorps marqués par fluorescence. Cette méthodologie peut être adaptée pour l'étude d'autres cellules et déterminants dans le microenvironnement métastatique. A cet effet, il existe divers transgenic souris rapporteurs disponibles pour l'étude de cellules stromales, y compris ceux pour les fibroblastes que FSP1 EGFP-4, alpha-SMA-RFP 25 et COL1A1 EGFP-25 ou des cellules endothéliales que Tie2-GFP 26.
Cellules vivantes une coloration sur des coupes de poumon a été réalisée pour visualiser des populations de cellules immunitaires 8. Cette stratégie de coloration peut être adopté comme une alternative pour le multi-couleur de capture d'image. Cependant, la majorité des marqueurs étiqueter souvent populations cellulaires multiples au lieu d'une population de cellules distinctes. Injectables qui sont prises par des populations de cellules spécifiques ou 4 anticorps marqués par fluorescence contre d'autres marqueurs de cellules peuvent être utilisées pour différencier entre les populations. L'utilisation de différentes couleurs fluorescentes pour marquer les différentes cellules d'intérêt est préférable pour l'imagerie. Dans les cas où l'utilisation de différents colorants fluorescents ne peut être effectuée (par ex., En raison de chann d'imagerie limitéeels), il est possible de différents types de cellules d'image avec mêmes reporters fluorescents tant qu'ils sont facilement reconnaissables par la forme et / ou la localisation anatomique.
En plus d'étudier divers types de cellules, plusieurs classes d'agents chimiothérapeutiques sont faiblement fluorescent (tel que la doxorubicine). Ces agents chimiothérapeutiques peuvent en principe être utilisés pour visualiser l'administration de médicaments et de distribution dans les métastases pulmonaires de manière similaire à celle de 19 la tumeur primaire. D'autres agents thérapeutiques ciblés qui pourraient être marquées par fluorescence peuvent également être utilisés ex vivo dans l'imagerie du poumon. En particulier, les données acquises à l'imagerie du poumon pourraient être plus informatif sur lequel les cellules prennent ces médicaments en place et de leur interaction avec d'autres cellules dans le microenvironnement métastatique, en plus de l'extravasation de ces agents thérapeutiques de vaisseaux sanguins actifs. Cette technique peut être en outre utilisé pour l'étude du cancer primitif du poumon ou 27 adapté pour l'étude de l'autre poumonpathologies concernant la PI qui peuvent influer sur le microenvironnement du poumon 28,29.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MMTV-PyMT/FVB mice | Jackson Laboratory | 2374 | Female mice |
| ACTB-ECFP/FVB mice | UCSF Werb lab | Female mice | |
| c-fms-EGFP/FVB mice | UCSF Werb lab | Female mice | |
| FVB mice | Jackson Laboratory | 1800 | Female mice |
| GFP+ VO-PyMT cells | UCSF Werb lab | ||
| 70,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated | Invitrogen | D1818 | Dilute to 4mg/ml in 1 x PBS and store at -20 °C. Use 0.4 mg per animal. |
| 10,000 kDa Dextran, Alexa Fluor 647 conjugated | Invitrogen | D22914 | Dilute to 4mg/ml in 1 x PBS and store at -20 °C. Use 0.4 mg per animal. |
| Anti-mouse Gr-1 antibody Alexa Fluor 647 | UCSF Monoclonal antibody core | Stock 1mg/ml. Use 7 ug per animal. | |
| Anesthetic | Anesthesia approved by IACUC, used for anesthesia and/or euthanesia | ||
| 1X PBS | UCSF cell culture facility | ||
| PBS, USP sterile | Amresco INC | K813-500ML | Ultra pure grade for i.v. injection |
| Styrofoam platform | Will be used as dissection board | ||
| Fine scissors sharp | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Forceps | Roboz Surgical Store | RS-5135 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn ON 30min before use |
| Air | UCSF | ||
| Oxygen | UCSF | ||
| Carbon dioxide | UCSF | ||
| 1 mL syringe without needle | BD | 309659 | |
| 27 G x 1/2 needle | BD | 305109 | for i.v. injection |
| 20 G x 1 needle, short bevel | BD | 305178 | |
| Low-melting-temperature agarose | Lonza | 50111 | To make 10 ml of solution, weigh 0.2 g of agarose, add to 10 ml 1 x PBS, and heat to dissolve. Agarose will solidify at room temperature, so maintain in a 37 °C water bath until used for inflation. |
| RPMI-1640 medium without phenol red | Life Technologies | 11835-030 | |
| 24 well Imaging plate | E&K scientific | EK-42892 | |
| Glass cover slides, 15 mm | Fisher Scientific | 22-031-144 | |
| Digital CO2 and temperature controller | Okolab | DGTCO2BX | http://www.oko-lab.com |
| Climate chamber | Okolab | http://www.oko-lab.com | |
| Cell Observer spinning disk confocal microscope | Zeiss | ||
| Zen software | Zeiss | ||
| Inverted microscope | Carl Zeiss Inc | Zeiss Axiovert 200M | |
| ICCD camera | Stanford Photonics | XR-Mega-10EX S-30 | |
| Spinning disk confocal scan-head | Yokogawa Corporation | CSU-10b | |
| Imaris | Bitplane | ||
| mManager | Vale lab, UCSF | Open-source software |
References
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