Summary
Se describe un método relativamente simple para ex vivo de imágenes en vivo de las interacciones célula-estroma tumoral dentro de la metástasis de pulmón, utilizando reporteros fluorescentes en ratones. Uso de hilado de disco microscopía confocal, esta técnica permite la visualización de células vivas durante al menos 4 horas y podría adaptarse para estudiar otras condiciones inflamatorias pulmonares.
Abstract
La metástasis es una causa importante de morbilidad y mortalidad relacionada con el cáncer. La metástasis es un proceso de múltiples etapas y debido a su complejidad, los procesos celulares y moleculares exactos que gobiernan la diseminación metastásica y el crecimiento siguen siendo difícil de alcanzar. Imágenes en vivo permite la visualización de las interacciones dinámicas y espaciales de las células y su microambiente. Los tumores sólidos metástasis comúnmente a los pulmones. Sin embargo, la localización anatómica de los pulmones plantea un reto a intravital de imágenes. Este protocolo proporciona un método relativamente sencillo y rápido para la ex vivo de imágenes en vivo de las interacciones dinámicas entre las células tumorales y su estroma circundante dentro de la metástasis pulmonar. Usando este método, la motilidad de las células cancerosas, así como las interacciones entre las células cancerosas y las células del estroma en su microambiente pueden ser visualizados en tiempo real durante varias horas. Mediante el uso de ratones transgénicos fluorescentes reportero, una línea de células fluorescentes, inyectable marcado con fluorescenciamoléculas y / o anticuerpos, múltiples componentes de la microambiente de pulmón pueden ser visualizados, tal como los vasos sanguíneos y las células inmunes. Para la imagen de los diferentes tipos de células, se ha utilizado un disco giratorio microscopio confocal que permite formación de imágenes continuo a largo plazo con la adquisición rápida de imágenes, de cuatro colores. películas a intervalos compilados a partir de imágenes recogidas a través de múltiples posiciones y planos focales muestran las interacciones entre metastásico en vivo y células inmunes durante al menos 4 horas. Esta técnica se puede utilizar además para probar la quimioterapia o la terapia dirigida. Además, este método podría ser adaptado para el estudio de otras patologías relacionadas con los pulmones que pueden afectar el microambiente de pulmón.
Protocol
Todos los procedimientos descritos deben realizarse de conformidad con las directrices y regulaciones para el uso de animales vertebrados, incluyendo la aprobación previa de la Atención Institucional local de Animales y el empleo (IACUC).
1. Generación de metástasis pulmonar ex vivo para imágenes en vivo (transgénica o vena de la cola de inyección)
NOTA: Las metástasis pulmonares se pueden generar mediante la utilización de modelos de ratones genéticamente modificados o (iv) la inyección intravenosa de las células cancerosas.
- Generar metástasis pulmonares para formación de imágenes mediante el cruce de un modelo de ratón del tumor mediante ingeniería genética en un ratón transgénicos reportero, por ejemplo, cruzar el cáncer de mama modelo de ratón, virus del tumor mamario terminal larga del antígeno media de repetición-polioma T de ratón (MMTV-PYMT) 11 en ACTB-ECFP modelo de ratón 12.
NOTA: El modelo ACTB-ECFP expresa mayor proteína fluorescente cian (ECFP) bajo la β-acten el promotor de tal manera que todas las células emiten fluorescencia en el canal azul de la PPC. Sin embargo, las células cancerosas son, con mucho, el más destacado y aparecen como una masa de células ECFP-positivo bajo el microscopio. El modelo de ratón MMTV-PYMT desarrolla una enfermedad progresiva, en el que el crecimiento de tumor de mama está asociada con la difusión de las células cancerosas a la periferia, sobre todo a los pulmones. En los ratones MMTV-PYMT en la FVB / n de fondo, las micrometástasis se pueden observar alrededor de 10-11 semanas de edad. En general, estos avances a macrometástasis en alrededor de 14 semanas de edad de 13 años.
O - Generar metástasis experimentales utilizando células primarias o líneas celulares singénicas. El uso en células tumorales primarias in vitro manipulado o líneas celulares (por ejemplo., La transducción), seguido de la inyección iv 14.
- En resumen, en este protocolo, inyectar una proteína verde fluorescente (GFP) expresando (+) línea celular MMTV-PYMT en ratones fluorescentes reportero (ACTB-ECFP) o ratones de tipo salvaje. Entonces,visualizar estas células conocidas como células VO-15 utilizando el PYMT, canal verde GFP.
NOTA: La línea celular original VO-PYMT se derivó en el Vanderbilt Ortopedia en Nashville, TN. VO significa Vanderbilt Ortopedia. - Después de la inyección de 10 6 células (en 200 l), observe la extravasación de células de cáncer de inmediato y hasta unas pocas horas después de la inyección; observar las micrometástasis entre 1-3 semanas después de la inyección y detectar macrometástasis 3 semanas después de la inyección de 15.
NOTA: menos células se pueden inyectar para prolongar el tiempo de inyección para el crecimiento metastásico.
- En resumen, en este protocolo, inyectar una proteína verde fluorescente (GFP) expresando (+) línea celular MMTV-PYMT en ratones fluorescentes reportero (ACTB-ECFP) o ratones de tipo salvaje. Entonces,visualizar estas células conocidas como células VO-15 utilizando el PYMT, canal verde GFP.
2. El etiquetado de los componentes de interés en el microambiente metastásico (transgénico y / o inyectables)
NOTA: El etiquetado se puede lograr por los ratones transgénicos y / o por varios inyectables. Asegúrese de utilizar diferentes colores fluorescentes para el etiquetado de los diversos tipos de células.
- Los componentes Label del microambiente metastásico utilizando ratones transgénicos. Cruzar el modelo de tumor de ratón se ha mencionado anteriormente (por ejemplo., MMTV-PYMT x ACTB-ECFP) en un modelo de ratón transgénico en el que las células del estroma de interés son etiquetados por una proteína fluorescente que no es ECFP, por ejemplo., C-fms-EGFP 4,16.
NOTA: Además de la visualización de las células cancerosas en el canal de CFP, esto permite la visualización de las células mieloides en el canal de GFP 4.
Y / O - Etiqueta de diversos componentes del microambiente metastásico usando los inyectables en ratones reportero fluorescente transgénicos o (no fluorescentes) ratones de tipo salvaje.
NOTA: Varios compuestos se puede inyectar para etiquetar diversos componentes del microambiente metastásico, por ejemplo, un anticuerpo Gr-1 AF647 conjugado se utiliza aquí para etiquetar los neutrófilos y se utilizan algunos monocitos 13 y diferentes dextranos de peso molecularpara etiquetar los capilares pulmonares. Para la preparación de estos inyectables ver paso 4.
3. Preparación de Materiales antes de la disección
- 2% de agarosa
- Pesar 0,2 g de agarosa y añadir a 10 ml 1 x PBS. Calentar la solución para disolver la agarosa. Agarosa se solidifica a temperatura ambiente, por lo que mantener en un baño de agua a 37 ° hasta su utilización para la inflación.
- CO 2 y controlador de temperatura
- Compruebe ddH2O en la cámara de humidificación. Vuelva a llenar cuando sea necesario. Introduzca la placa de configuración en la temperatura soporte de la placa etapa (cámara climática). Encienda el controlador de CO2 y fijar CO 2 al 5%. Asegúrese de que el caudal de aire se fija en 0,4 Nl / min.
- Abra el aire y CO 2 válvulas. Encienda el controlador de temperatura. Asegúrese de que la temperatura de la cámara climática y la tapa se fijan a 37 ° C.
- Liberar la presión del aire sobre el CO de 2 metros. Verificar CO 2 creciente, equilibration puede tardar hasta 30 minutos.
- disco giratorio microscopio confocal
NOTA: Los detalles de la configuración de microscopio se han descrito previamente 4,17.- Encienda el láser (láser de argón durante excitación de 488 nm y el de estado sólido de 405 nm, 561 nm y 640 nm láseres). Encienda el microscopio, la cámara, la unidad de control de disco giratorio, el AOTF, la unidad de control de láser y el controlador de la cámara.
- Abrir el obturador microscopio, encienda el equipo que ejecuta el microscopio y abrir el software.
- Preparación de las herramientas y la plataforma de la disección.
- A su vez en el esterilizador de cuentas en caliente y se deja llegar a 250 ° C. Limpias 2 pares de tijeras quirúrgicas y pinzas con agua y jabón. Esterilizar las herramientas durante al menos 30 segundos. Deje que las herramientas se enfrían. Use una tapa de poliestireno como plataforma de disección. Se cubre con un trozo de remojo laboratorio.
4. Preparación de inyecciones
NOTA: Dependiendo de la vida media y la respuesta preferida, inyecte la etiqueta fluorescente anticuerpos y / o moléculas fluorescentes ya sea inmediatamente antes de su sacrificio de un animal o de un par de horas a días antes.
- Para neutrófilos imagen Gr1-positivos y monocitos, preparar una jeringa con 7 l de anticuerpo de la Gr-1 AF647 conjugado (1 mg / ml) en 100 l de PBS estéril bajo el capó. Colocar una aguja 27 G ½ en la jeringa.
- Para capilares pulmonares imagen, preparar una segunda y tercera jeringa con 100 l de o bien 70 kD rodamina conjugado con dextrano (4 mg / ml) o dextrano 10 kD AF647-conjugado (4 mg / ml). Coloque una aguja de 27 G ½ de las jeringas.
- Inyectar el AF647-conjugado anticuerpo solución iv 5 horas antes de la escisión pulmones.
- Inyectar una o ambas soluciones de dextrano iv inmediatamente anteriores a la escisión pulmones.
5. Preparación de los pulmones ex vivo para imágenes en vivo
NOTA: Trate de trabajar como estéril y cuidado posible para evitar problemas innecesarios de las células inmunes dentro de los pulmones.
- Inyectar la intraperitoneal ratón (ip) con una sobredosis letal de anestésico permitido por el protocolo de los animales aprobado por el IACUC, por ejemplo., 1 ml de 2,5% Avertin. Espere a que el ratón para detener la respiración y ser completamente no responden a estímulos nocivos (trasera pizca de la pata).
NOTA: La dislocación cervical y la eutanasia de dióxido de carbono deben evitarse ya que puede afectar negativamente a la viabilidad celular de pulmón. - Inmovilizar el ratón sobre una tabla de disección y esterilizar el ratón con etanol al 70%.
- Con unas tijeras quirúrgicas para hacer primero una incisión epigástrico transversal a través de la piel, seguido de una incisión similar a través del peritoneo. Mantenga la placa de disección en posición vertical y cortar la aorta descendente, de modo que la sangre se acumula en el abdomen y no en la cavidad torácica.
- Scortar una pequeña abertura en el diafragma para liberar el vacío. Corte a lo largo de la costilla 10 y 12 para cortar el diafragma y obtener acceso visual a los pulmones.
- Use las tijeras quirúrgicas para cortar la piel hasta la tráquea a través de la caja torácica pero deja intacta la caja torácica. Se separa la piel de la caja torácica. Exponer la tráquea mediante la eliminación del tejido conectivo circundante, teniendo cuidado de no dañar la tráquea en sí (Figura 1A).
- Cortar una pequeña abertura de aproximadamente 1 mm de diámetro en la tráquea expuesta paralelo a los anillos cartilaginosos, tan cerca de la laringe como sea posible (Figura 1B). Tenga cuidado de no cortar completamente a través de la tráquea.
- Tome una aguja 20 G e inserte suavemente la aguja 4-5 mm en la tráquea sin ninguna fuerza contraria (Figura 1D). El extremo de la aguja debe ser visible a través de la tráquea (Figura 1C). El uso de fórceps para estabilizar la aguja en la tráquea. Como alternativa, una sutura puede ser atado aroUnd la tráquea para mantener la aguja en su lugar.
NOTA: Mediante la inserción demasiado profunda, la carina puede ser traumatizada o sólo un lado de los pulmones puede ser inflado. - Llene una jeringa con 400 l de 37 ° C 2% de agarosa de baja temperatura de fusión (tomada directamente de un baño de temperatura constante). Asegúrese de que la tabla de disección está de pie y lentamente inculcar la agarosa caliente a través de la aguja en los pulmones, usar ~ 400 l para inflar los pulmones.
NOTA: Vea los pulmones se inflan dentro de la caja torácica. No sobre-inflar el pulmón, ya que se rompa. - Una vez que los pulmones se inflan, llenando ~ ⅔ de la caja torácica, separar la jeringa y mantener la aguja en el interior de la tráquea para evitar cualquier agarosa de fugas.
- Verter aproximadamente 50 ml de 20 ° C PBS más de los pulmones inflados para permitir que la agarosa en el interior de los pulmones para establecer y solidificar. extraer la aguja lentamente y cerrar la tráquea con una pinza para evitar cualquier no solidificado de agarosa se escape. </ Li>
- Exponer a los pulmones mediante la realización de una esternotomía y posteriormente extirpar los pulmones. Para la escisión de los pulmones, se aferran a la tráquea durante el corte a través de la tráquea por completo. Tire suavemente de la tráquea hacia arriba, cortar el tejido conectivo y el esófago mientras tira de los pulmones fuera de la cavidad del pecho hasta que los pulmones se separa del ratón (Figura 1E).
- Sumergir los pulmones en caliente RPMI-1640 para lavar el exceso de sangre y separar suavemente los lóbulos mediante el uso de tijeras y pinzas para cortar bronquio principal los lóbulos 'en el hilio (Figura 1F).
- Coloque los lóbulos, con la superficie plana hacia abajo para maximizar la superficie de formación de imágenes, en un pocillo de una placa de imagen de 24 pocillos (Figura 1G). Añadir 100 l de 37 ° C RPMI-1640 en la parte superior de los lóbulos. Coloque varias cubierta se desliza microscopio circular 15 mm en la parte superior de los lóbulos para evitar que se flotante.
- Verter PBS caliente en los pozos de los alrededores para evitar que los medios de comunicación RPMI-1640 de EVAPperorando. Insertar la placa de 24 pocillos en la cámara climática equilibrada y mantener los lóbulos pulmonares a 37 ° C con aire y 5% de CO 2. Inserte la cámara climática en la platina del microscopio confocal.
NOTA: Otras mezclas de gas (por ejemplo, 5% de O2, 5% de CO2 en N2 para examinar el comportamiento de células en condiciones de hipoxia / oxígeno inferior) también podría ser considerado.
Figura 1. Protocolo para la preparación de los pulmones para imágenes en directo. (A) La exposición de la tráquea después de la preparación del ratón. (B) Pequeño recorte realizado en la tráquea expuesta paralelo a los anillos cartilaginosos. (C) 20 G aguja insertada 4-5 mm en la tráquea. (D) La instilación de 400 l 2% de baja temperatura de fusión de agarosa en los pulmones. (E) Inflpulmones ATED separados del ratón. (F) Los lóbulos separados después de la inflación. (G) lóbulos colocado en un pocillo de una placa de imagen de 24 pocillos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
6. Adquisición y Análisis de Imágenes
NOTA: Las imágenes pueden ser adquiridas con una variedad de hilado disco microscopio confocal con el apoyo de varios programas de software. En este protocolo, ya sea μManager con un disco giratorio microscopio confocal por encargo o Zen con un microscopio confocal de girar el disco disponible en el mercado se utiliza para la adquisición de la imagen, mientras que Imaris se utiliza para la edición y el análisis de la película.
- Adquirir imágenes con μManager. Un detallado paso a paso el protocolo para la adquisición de imágenes utilizando el software μManager se ha descrito previamente 18.
O - adquirir imágenesutilizando software de análisis de imágenes como Zen (ver Figura S1).
- Haga clic en la pestaña 'Localiza', y selecciona objetivo (10x o 20x) en la herramienta 'Light Path' (Figura S1 A, cuadro rojo). Posteriormente, haga clic en 'Ojos - DAPI' para mirar el canal de PPC a través del ocular (Figura S1 A, caja azul). Localizar la muestra manualmente con el microscopio. Haga clic en 'Todo Off'after el tejido es el centro del campo de visión.
- Haga clic en la pestaña 'Adquisición' para ajustar todos los parámetros de adquisición de imágenes.
- En la herramienta de "canales", haga clic en el botón '+' (Figura S1 B, cuadro rojo). Un menú emergente aparece y buscar el colorante (s) presente en la muestra en el "tinte de base de datos '(Figura S1B). Seleccione el tinte y haga clic en "Añadir".
NOTA: El programa seleccionará todos los filtros sean optimizados. Un colorante puede ser eliminadoseleccionándolo siguió haciendo clic en el botón de la papelera (Figura S1B, caja amarilla). - En el menú 'Modo de adquisición', set 'Binning' de 5x5. Haga doble clic en ECFP en el menú de canales para seleccionarlo. Bajar la potencia del láser y el 20% por lo que la muestra no se blanquea al configurar los parámetros de adquisición de imágenes.
- Marque la casilla 'Azulejos' en la sección 'Experimento Administrador' y la herramienta azulejos aparece en el 'Multidimensional Adquisición' grupo de herramientas (Figura S1C). Haga clic en el botón "Configuración avanzada" para ver la imagen en directo de la cámara. Haga clic en el botón "Añadir" en la sección "Posiciones" para añadir 4 a 6 posiciones para el experimento. Para eliminar una posición, seleccione esa posición y haga clic en el botón de la papelera.
- En el grupo de herramientas 'Adquisición de parámetros', abra la herramienta 'estrategia de enfoque' y seleccione 'Absolute fijo Z-position 'de la lista desplegable.
- Marque la casilla Z-Stack en la sección "Experimento Administrador 'y la herramienta Z-pila aparece en el grupo de la herramienta' Multidimensional Adquisición '(Figura S1D). Haga doble clic en una de las posiciones en la sección "posiciones" y pulse "en directo". establecer manualmente primero y establecer última posición del campo de la imagen. Ajuste el intervalo en 4 micras.
NOTA: El programa determinará el número de cortes para la gama elegida y el intervalo. Idealmente, 5-7 rebanadas son convenientes para permitir suficiente la visualización y la rápida adquisición de imágenes. - Marque la casilla 'Time Series' en la sección 'Experimento Administrador'. De ajuste deseado "duración" y los tiempos de "intervalo" en la herramienta 'Time Series' que apareció en el 'Multidimensional Adquisición' grupo de herramientas (Figura S1E).
- En el 'AcquisiModo de la 'menú, establece' Binning 'de 2x2. Haga doble clic en un fluoróforo en el menú de canales para seleccionarlo y aumentar la potencia del láser a 100%. Pulse 'Live' y ajustar el "tiempo de exposición". Repita este procedimiento para cada fluoróforo.
- Marque la casilla "Activar Auto Guardar '. Seleccione una carpeta y escriba el nombre del archivo. Todas las imágenes obtenidas se guardarán automáticamente en esta carpeta.
- Haga clic en "Start Experimento 'en la sección' Experimento Administrador 'para iniciar la adquisición de imágenes.
- Después de la adquisición de imágenes, compilar los datos en bruto en el software Imaris. Convertir imágenes para .ims archivos y se pueden hacer ajustes. Un detallado paso a paso el protocolo para la conversión de archivos, haciendo ajustes y Almacenamiento de películas utilizando Imaris se ha descrito previamente 18.
- Al guardar la película, establecer el "Frame Rate" 5 fotogramas por segundo (fps).
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Representative Results
Usando el hilado disco microscopía confocal, diversos sistemas modelo del ratón y los inyectables, el microambiente metastásico puede ser visualizado y seguimiento en el tiempo. El uso de un MMTV-PYMT; ACTB-ECFP; c-fms-EGFP triple modelo de ratón transgénico, diferentes componentes celulares están marcadas fluorescentemente (Figura 2A, Película 1). La estructura típica del parénquima pulmonar puede ser visualizado en el canal de CFP ya que todas las células expresan ECFP bajo el promotor β-actina. metástasis pulmonares mayores / multicelulares son fáciles de resolver ya que éstos aparecen como una masa de células dentro de la estructura pulmonar organizada. Células mieloides se visualizan en el canal de GFP a través de c-fms-EGFP expresión, que es el transgén para CSFR-1 12. Células mieloides son muy dinámica a medida que migran a lo largo del campo de la imagen. C-fms células EGFP-positivas son más abundantes y migratoria en el parénquima de pulmón en comparación con los que están en estrecho contacto con el pulmónmetástasis. La dinámica de las células mieloides y sus interacciones con metástasis de pulmón pueden ser seguidos en tiempo real durante varias horas.
Para examinar la siembra metastásica y el crecimiento, un modelo de metástasis experimental se utiliza (Figura 2B, Película 2). Se inyectaron las células tumorales GFP + VO-PYMT en un tipo salvaje, de ratón no reportero y permite a las semillas y crecer durante 2 semanas. La estructura del pulmón es claramente visible en el canal de GFP debido a la autofluorescencia de los pulmones. Sin embargo, las células VO-PYMT son todavía fácilmente distinguible de la estructura de pulmón, ya que tienen una forma redonda y una mayor expresión de EGFP por lo tanto aparecen más brillantes en comparación con el parénquima pulmonar. VO-PYMT motilidad celular se puede observar dentro de la lesión metastásica establecido.
interacciones celulares entre metastásico y las células inmunes en el microambiente pulmonar también pueden ser examinadas usando el modelo experimental de metástasis. Dos semanas después deinyección de células VO-PYMT, marcado con fluorescencia Gr-1 647 anticuerpos conjugados son inyectados iv 5 horas antes de la escisión de pulmón (Figura 2C, Película 3). En el lado izquierdo de la campo de la imagen, dos Gr-1 + células mieloides están interactuando con una célula VO-PYMT. Una lesión metastásica se observa en el lado derecho del campo de imagen. Con el tiempo, las células Gr-1 + son reclutados a la lesión metastásica. Por debajo de la lesión metastásica, una de las células Gr-1 + estrechamente interactúa con una célula VO-PYMT. Con el tiempo, la célula VO-PYMT desaloja, desconectarse de la célula + Gr-1.
Combinando reportero modelos de ratones transgénicos con el modelo de metástasis experimental y anticuerpos inyectables Etiquetado de las células inmunes se obtiene una película de tres colores. Una semana después de la inyección de las células VO-PYMT en un ratón reportero ACTB-ECFP, marcados con fluorescencia GR-1 647 anticuerpos conjugados son inyectados iv 5 horas antes de la extirpación de tejido (Figura 2D, Película4). células Gr-1 + migran vigorosamente dentro del campo de visión, mientras que un solo GFP + células metastásico es visible en el centro del campo de imagen.
La inyección de diferentes dextranos fluorescentes en ratones reportero, que previamente fueron inyectados con células metastásicas, se puede producir una película de cuatro colores (Figura 2E, Películas 5-6). Eventos tempranos en la siembra de la metástasis se pueden estudiar cuando las células VO-PYMT se visualizan inmediatamente y 4 horas después de la inyección iv en ratones reportero ACTB-ECFP. La inyección de conjugado con rodamina, 70 kD dextrano y 10 kD dextrano conjugado con un marcador fluorescente 647 permite la visualización de los capilares pulmonares. El uso de dextranos de peso molecular inferior y superior potencialmente podría utilizarse para detectar cambios en la permeabilidad de los capilares en los pulmones, ya que las moléculas de menor peso molecular extravasan más rápido en comparación con los de alto peso molecular 19. Aunque Cellul eventos ar todavía se pueden estudiar de manera eficaz, la película 5 es un ejemplo de una deriva de tejido. Si es necesario y en el caso de que el tejido no se puede cambiar de posición durante la sesión de imágenes, esto podría ser corregido durante el análisis de la adquisición de la imagen posterior.
Este sistema permite a una de cuatro colores adquisición rápida, imagen continua para seguir diferentes tipos de células marcadas con fluorescencia en el microambiente de pulmón metastásico. Este protocolo también permite la visualización de la metástasis de diferentes tamaños, de eventos relacionados con la siembra de las células cancerosas individuales a metástasis establecidas. Además, las células tumorales y las células del estroma movimiento pueden ser visualizados en el microambiente de pulmón junto con los vasos sanguíneos. Típicamente, el movimiento celular se observa durante al menos 4 horas desde el inicio de la sesión de formación de imágenes. La observación de diferentes microambientes metastásicas dentro del mismo tejido pulmonar ayuda a evitar la variabilidad de un ratón a ratón.
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Figura 2. Imágenes representativas de las películas adquiridas por imágenes en vivo. (A) instantánea de una pila Z fusionada de la película 1 que muestra células mieloides asociados con una metástasis de pulmón (inserto amarillo) frente a los asociados con el parénquima pulmonar (inserto rojo). (B) Instantánea de una pila Z resultante de la fusión de la película 2 que muestra GFP + metastásico de células en un modelo experimental de metástasis. Punta de flecha apunta a una célula metastásica móviles. (C) Instantánea de una pila Z de la película 3 que muestra co-localización de las señales fluorescentes a partir de una GFP + metástasis y Gr-1 + células se visualizaron mediante un anticuerpo Gr-1 conjugado con un tag 647 (punta de flecha roja). Verde punta de flecha a una GFP + metastásico de células que se desprendió de la mayor metastásico. Blanco punta de flecha a una celda + Gr-1 que interactúa con la célula GFP + VO + PYMT móviles. (D) Instantánea deuna pila fusionada Z de la película 4 que muestra células GFP + VO + PYMT, en ACTB-ECFP ratón. Una sola célula VO-PYMT es visible en el centro (punta de flecha verde). El animal se inyectó con Gr-1 647 anticuerpo conjugado. (E) Representante Z-pila de películas 5 y 6 muestran los vasos sanguíneos en los pulmones de los ratones sacrificados inmediatamente después de la inyección de 70 kD rodamina-dextrano (punta de flecha roja) junto con las células GFP + VO + PYMT (verde). Las barras de escala son 100 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Complementarios Figura 1. Pantalla de disparos de software de la cámara ZEN para la adquisición de imágenes. (A) En primer lugar, en la herramienta 'Light Path' el objetivo correcto debería ser elegido (cuadro rojo) y THtejidos e localizarse en el microscopio. (B) Configuración de los canales de adquisición de imágenes, en el (cuadro rojo) canales de herramientas "canales" se pueden eliminar o añadido (caja amarilla). (C) En la herramienta de 'azulejos', diferentes posiciones se puede añadir al experimento. (D) En la herramienta de "Z-Stack ', el Z-pila se puede ajustar y el espesor de las rebanadas puede ser ajustado. (E) En la herramienta 'Time Series', la duración y el intervalo se pueden ajustar. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
1. Película (Haga clic derecho para descargar). Las interacciones entre una metástasis de pulmón y sur. redondeo células inmunes utilizando reportero ratones transgénicos Esta película muestra una metástasis en el pulmón de un triple-transgénicos MMTV-PYMT; ACTB-ECFP; c-FMS-EGFP ratón en el que todas las células se marcan con ECFP y células mieloides se etiquetan con EGFP. La metástasis se puede observar como una mayor parte de las células en azul en contraste con la arquitectura de pulmón normal. C-fms + células mieloides migran a lo largo de todo el campo de la imagen. Esta película es una adquisición de 2 horas 1 min.
2. Película (Haga clic derecho para descargar). Motilidad de las células del cáncer en un modelo experimental de metástasis. Esta película muestra una metástasis pulmonar generado por la inyección intravenosa de células GFP + VO + PYMT (verde) en un tipo salvaje, no reportera, ratón. Los pulmones se recogieron dos semanas después de la inyección de VO-PyMT células. células GFP + se mueven dentro de la masa metastásica. Esta película es un 4 hr 40 min adquisición de largo.
3. Película (Haga clic derecho para descargar). El reclutamiento de células inmunes visualizadas por fluorescencia anticuerpos conjugados a establecido experimentalmente metástasis. Esta película muestra una metástasis pulmonar generado por la inyección intravenosa de células GFP + VO + PYMT (verde) en un tipo salvaje, no reportero, ratón. Los pulmones se recogieron dos semanas después de que las células se inyectaron VO-PYMT. Gr-1 + células se marcan con Gr-1 647 anticuerpo conjugado y la observada en el canal infrarrojo cercano (blanco). Tenga en cuenta que las células Gr-1 son reclutados a la metástasis GFP +. Esta película es un ejemplo de una adquisición a largo plazo, con un total de 11 h 27 min.
4. Película (Haga clic derecho para descargar). La motilidad de las células inmunes visualizados por los anticuerpos con fluorescencia conjugados en un ratón transgénico reportero inyectados con células metastásicas. Esta película muestra una sola célula GFP + VO + PYMT en el pulmón generada por la inyección intravenosa de VO PYMT células (verde) en un ratón ACTB-ECFP. Los pulmones se recogieron una semana después se inyectaron células VO-PYMT. Gr-1 + células se marcan con Gr-1 647 anticuerpo conjugado y la observada en el canal infrarrojo cercano (blanco). Esta película es un 2 hr 40 min adquisición de largo.
5. Película (click derechok para descargar). Las células metastásicas y capilares visualizadas por dextranos fluorescentes inmediatamente después de la inyección intravenosa en un ratón transgénicos reportero. Esta película muestra la metástasis experimental generada por la inyección intravenosa de células GFP + VO + PYMT (verde) en un ratón ACTB-ECFP junto con el inyección de conjugado con rodamina, 70 kD dextrano (rojo) y 10 kD dextrano conjugado con un marcador fluorescente 647 (blanco), para marcar los vasos sanguíneos. Esta película es un ejemplo de una deriva de tejido y es una adquisición largo 18 min.
6. Película (Haga clic derecho para descargar). Las células metastásicas y capilares visualizadas por dextranos fluorescentes varias horas después de la inyección iv en un ratón transgénico reportero. Esta película muestra experimental de metástasis generard mediante inyección iv de células GFP + VO-PYMT (verde) en un ratón ACTB-ECFP junto con la inyección de rodamina conjugado, 70 kD dextrano (rojo) y 10 kD dextrano conjugado con un marcador fluorescente 647 (blanco), para marcar vasos sanguineos. Los pulmones se recuperaron 4 hr después de la inyección de las células VO-PYMT. Esta película es una adquisición largo de 19 minutos.
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Discussion
Este manuscrito describe un método detallado para la ex vivo de imágenes en vivo de metástasis de pulmón en modelos de ratón de la metástasis. Este protocolo de formación de imágenes proporciona una visualización directa de las interacciones célula-tumor del estroma dinámicas y espaciales dentro del microambiente de pulmón. Es un método relativamente fácil y rápido que permite obtener imágenes fiables de metástasis de pulmón durante al menos 4 horas. Películas adquiridos a partir de estos experimentos se pueden utilizar para realizar un seguimiento de procesos dinámicos como la motilidad celular y las interacciones celulares.
Se describen dos métodos para la generación de metástasis de pulmón: un modelo de ratón de ingeniería genética y el uso de una línea celular manipulada. El modelo de ratón MMTV-PYMT recapitula la progresión del cáncer de mama y metástasis de pulmón espontánea. Otras técnicas que recapitular diseminación metastásica también están disponibles, por ejemplo., El trasplante ortotópico de células en la glándula mamaria 20. Un inyectado por vía intravenosa VO + c PYMTell línea se utiliza para imitar la siembra y el crecimiento de la metástasis del cáncer de mama. El tiempo permitido para crecimiento externo celular VO-PYMT depende de la preferencia experimental para la etapa de metástasis de pulmón. Dependiendo del número de células inyectadas, las micrometástasis se pueden observar dentro de varios días a 2 semanas después de la inyección de células VO-PYMT.
Para imágenes pulmonar óptimo, el gran cuidado debe tomarse durante el inflado de los pulmones. Para la inflación adecuada, la aguja sólo se debe insertar 4-5 mm en la tráquea. Más profundo inserción de la aguja puede dar lugar a la inflación parcial, de un solo lado de los pulmones. Además, los pulmones deben ser observados durante la inflación efectiva para prevenir el exceso de inflación que puede dar lugar a daños en los tejidos. Por otra parte, es fundamental para mantener el pulmón tan estéril como sea posible para que no tendrán el reto de las células inmunes en el pulmón.
Para cada experimento de imágenes en vivo, el equilibrio óptimo entre la cantidad de adquisición de datos y THe potencial de daño tisular causado por la exposición al láser excesiva necesita ser considerado. Es importante optimizar los ajustes de adquisición de imágenes mediante la ejecución de experimentos piloto. Además, se recomienda mantener la potencia del láser hacia abajo, mientras que la búsqueda de los campos de visión óptimo y / o para mantener el obturador cuando las imágenes no se adquieren.
La motilidad del cáncer y / o las células inmunes de interés es uno de los indicadores para la vitalidad de la célula. Motilidad es sensible a la temperatura, niveles de oxígeno, y fototoxicidad 7. Sin embargo, la inhibición o la falta de motilidad no pueden estar relacionados con las condiciones de formación de imágenes o cuestiones técnicas, sino más bien biológico. La inhibición de la motilidad puede resultar de un cierto efecto terapéutico o de la detención de las células metastásicas justo antes de su proliferación dentro de la microvasculatura del pulmón y su extravasación en el parénquima pulmonar 21,22. Por lo tanto, puede ser importante para corroborar estos datos utilizando adicionaltécnicas (como los ensayos de migración en cultivo 2D) 23.
Por otra parte, este método de imagen pulmonar ex vivo es suficiente para un estudio a corto plazo que no requiere la microcirculación pulmonar. Usando este método, se observa el movimiento del cáncer y / o células del sistema inmune por lo menos durante 4 hr. Antes de la adquisición de la imagen, se tarda unos 30 minutos para preparar los pulmones y 30-60 minutos para encontrar posiciones para la adquisición. Aunque se observa la motilidad celular más allá de 4 horas (hasta 11 horas, Película 3), imágenes prolongado depende de los tipos particulares de células estudiadas, las condiciones utilizadas (por ejemplo., La reducción de oxígeno), y debe ser determinado por un sistema experimental particular. Por otra parte, debido a la falta de la microcirculación y el posible impacto de los cambios post mortem o en caso de que haya una justificación para la necesidad de verificar los resultados en la presencia de un microcirculación intacta, la intravital de imágenes de pulmón con una ventana de succión torácica pueden ser utilizados. Sin embargo, es still un reto para realizar las imágenes de pulmón intravital a través de múltiples días utilizando una ventana de proyección de imagen tal como se realizó en el cerebro, glándula mamaria y órganos abdominales 5 debido a las dificultades en el mantenimiento de suficiente presión negativa. Como un método alternativo para la perfusión de los ex vivo pulmones intactos, el método de pulmón perfundido aislado fue utilizado anteriormente para estudiar la metástasis pulmonar. Sin embargo, este método se usa a menudo para animales más grandes. Dado que los ratones tienen pequeñas cavidades torácica, que suponen un verdadero reto para la perfusión a partir del 24.
Debido a la dispersión de la luz, la profundidad de imagen de la microscopía confocal de giro del disco es limitado. Como consecuencia de ello, la visualización de la dinámica de células y las interacciones celulares se limita a la metástasis de pulmón superficial. Las metástasis pulmonares se enriquecen en la periferia del pulmón ya que las células metastásicas se limitan por los capilares que disminuyen en tamaño hacia los márgenes exteriores del pulmón 1. Además, es eaSIER para mantener la viabilidad de las células cerca de la superficie del pulmón, ya que han preferido el acceso a los medios de comunicación y de oxígeno. Para permitir la visualización más profundamente en los pulmones, imágenes en vivo de las secciones de pulmón se puede realizar. Sin embargo, se debe esperar cantidad considerable de la muerte celular. Alternativamente, la microscopía multifotónica puede llevarse a cabo, permitiendo una mayor penetración en el tejido. Además, la imagen multifotónica genera una señal óptica intrínseca, llamado generación del segundo armónico (SHG), que permite la visualización de las estructuras acentrosimétricos en la matriz extracelular, tales como 1 fibras de colágeno.
Como se muestra en este estudio, tumor y el comportamiento de células inmunes en las metástasis de pulmón pueden ser seguidos y analizados mediante el reportero ratones fluorescentes, las células tumorales manipuladas y trazadores o anticuerpos marcados con fluorescencia. Esta metodología podría ser modificada para el estudio de otras células y factores determinantes en el microambiente metastásico. Con este fin, hay varios transgenic ratones reportero disponibles para el estudio de células estromales incluidos los de fibroblastos como FSP1 EGFP-4, alfa-SMA-RFP 25 y COL1A1-EGFP 25 o células endoteliales como Tie2-GFP 26.
La tinción de células en secciones de pulmón en vivo se ha realizado para visualizar poblaciones de células inmunes 8. Esta estrategia de tinción puede ser adoptado como una alternativa para multicolor de captura de imágenes. Sin embargo, la mayoría de los marcadores con frecuencia etiquetar múltiples poblaciones de células en lugar de una población de células distinta. Los inyectables que son absorbidos por las poblaciones de células específicas 4 o anticuerpos marcados con fluorescencia contra marcadores de células adicionales pueden ser utilizados para diferenciar aún más entre poblaciones. El uso de diferentes colores fluorescentes para etiquetar las diferentes células de interés se prefiere para la imagen. En los casos en que no se puede realizar el uso de diferentes tintes fluorescentes (por ejemplo., Debido a la formación de imágenes limitada channels), es posible de imagen diferentes tipos de células con los mismos reporteros fluorescentes, siempre que son fácilmente distinguibles por la forma y / o localización anatómica.
Además de estudiar diversos tipos de células, varias clases de agentes quimioterapéuticos son débilmente fluorescente (tal como doxorrubicina). Estos agentes quimioterapéuticos pueden en principio ser utilizados para visualizar la administración de fármacos y la distribución en la metástasis de pulmón en una manera similar como en el tumor primario 19. Otras terapias dirigidas que podrían ser etiquetados con fluorescencia también se pueden usar en formación de imágenes ex vivo de pulmón. En particular, los datos adquiridos con la formación de imágenes de pulmón podrían ser más informativo sobre el cual las células asimilación de estos fármacos y su interacción con otras células en el microambiente metastásico además de la extravasación de estos agentes terapéuticos de los vasos sanguíneos activos. Esta técnica se puede utilizar además para el estudio de cáncer de pulmón primario 27 o adaptado para el estudio de otro pulmónpatologías relacionados con la PI que pueden afectar el microambiente de pulmón 28,29.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MMTV-PyMT/FVB mice | Jackson Laboratory | 2374 | Female mice |
| ACTB-ECFP/FVB mice | UCSF Werb lab | Female mice | |
| c-fms-EGFP/FVB mice | UCSF Werb lab | Female mice | |
| FVB mice | Jackson Laboratory | 1800 | Female mice |
| GFP+ VO-PyMT cells | UCSF Werb lab | ||
| 70,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated | Invitrogen | D1818 | Dilute to 4mg/ml in 1 x PBS and store at -20 °C. Use 0.4 mg per animal. |
| 10,000 kDa Dextran, Alexa Fluor 647 conjugated | Invitrogen | D22914 | Dilute to 4mg/ml in 1 x PBS and store at -20 °C. Use 0.4 mg per animal. |
| Anti-mouse Gr-1 antibody Alexa Fluor 647 | UCSF Monoclonal antibody core | Stock 1mg/ml. Use 7 ug per animal. | |
| Anesthetic | Anesthesia approved by IACUC, used for anesthesia and/or euthanesia | ||
| 1X PBS | UCSF cell culture facility | ||
| PBS, USP sterile | Amresco INC | K813-500ML | Ultra pure grade for i.v. injection |
| Styrofoam platform | Will be used as dissection board | ||
| Fine scissors sharp | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Forceps | Roboz Surgical Store | RS-5135 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn ON 30min before use |
| Air | UCSF | ||
| Oxygen | UCSF | ||
| Carbon dioxide | UCSF | ||
| 1 mL syringe without needle | BD | 309659 | |
| 27 G x 1/2 needle | BD | 305109 | for i.v. injection |
| 20 G x 1 needle, short bevel | BD | 305178 | |
| Low-melting-temperature agarose | Lonza | 50111 | To make 10 ml of solution, weigh 0.2 g of agarose, add to 10 ml 1 x PBS, and heat to dissolve. Agarose will solidify at room temperature, so maintain in a 37 °C water bath until used for inflation. |
| RPMI-1640 medium without phenol red | Life Technologies | 11835-030 | |
| 24 well Imaging plate | E&K scientific | EK-42892 | |
| Glass cover slides, 15 mm | Fisher Scientific | 22-031-144 | |
| Digital CO2 and temperature controller | Okolab | DGTCO2BX | http://www.oko-lab.com |
| Climate chamber | Okolab | http://www.oko-lab.com | |
| Cell Observer spinning disk confocal microscope | Zeiss | ||
| Zen software | Zeiss | ||
| Inverted microscope | Carl Zeiss Inc | Zeiss Axiovert 200M | |
| ICCD camera | Stanford Photonics | XR-Mega-10EX S-30 | |
| Spinning disk confocal scan-head | Yokogawa Corporation | CSU-10b | |
| Imaris | Bitplane | ||
| mManager | Vale lab, UCSF | Open-source software |
References
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