Summary
Vi beskriver en forholdsvis enkel fremgangsmåde til ex vivo billeddannelse af tumor celle-stroma interaktioner inden lunge metastase, udnytte fluorescerende reportere i mus. Brug af spinning-disk konfokal mikroskopi, denne teknik muliggør visualisering af levende celler i mindst 4 timer, og kan tilpasses til at studere andre inflammatoriske lungesygdomme.
Abstract
Metastase er en væsentlig årsag til cancer-relaterede sygelighed og dødelighed. Metastase er en flertrins proces, og på grund af sin kompleksitet, de nøjagtige cellulære og molekylære processer, der styrer metastatisk spredning og vækst er stadig undvigende. Live-imaging tillader visualisering af de dynamiske og rumlige interaktioner af celler og deres mikromiljø. Faste tumorer almindeligvis metastaserer til lungerne. Men den anatomiske placering af lungerne udgør en udfordring for intravital billeddannelse,. Denne protokol giver en forholdsvis enkel og hurtig metode til ex vivo levende billeddannelse af de dynamiske interaktioner mellem tumorceller og deres omgivende stroma inden lunge metastase. Under anvendelse af denne fremgangsmåde kan motilitet af cancerceller samt vekselvirkninger mellem cancerceller og stromale celler i deres mikromiljø visualiseres i realtid i flere timer. Ved at anvende transgene fluorescerende reporter mus, en fluorescerende cellelinie, injicerbar fluorescensmærketmolekyler og / eller antistoffer, flere komponenter af lungen mikromiljø kan visualiseres, såsom blodkar og immunceller. At afbilde forskellige celletyper, har en roterende skive konfokalt mikroskop, der tillader langvarig, kontinuerlig billeddannelse med hurtig, firefarvet billedregistrering blevet anvendt. Time-lapse film kompileret fra billeder indsamlet over flere positioner og fokalplaner viser samspillet mellem levende metastatisk og immunceller i mindst 4 timer. Denne teknik kan yderligere anvendes til at teste kemoterapi eller målrettet terapi. Desuden kunne denne fremgangsmåde tilpasses til studiet af andre lunge-relaterede patologier, der kan påvirke lunge mikromiljø.
Protocol
Alle beskrevne procedurer skal udføres i overensstemmelse med retningslinjer og regler for brug af hvirveldyr, herunder forudgående godkendelse af den lokale Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC).
1. generation af lungemetastaser for Ex vivo Live-Imaging (Transgene eller haleveneinjektion)
BEMÆRK: lungemetastaser kan genereres ved anvendelse af genetisk manipulerede musemodeller eller ved intravenøs (iv) injektion af cancerceller.
- Generere lungemetastaser til afbildning ved at krydse en gensplejset tumor musemodel i en transgen reporter mus, f.eks krydse brystkræft musemodel musebrysttumorvirus lange terminale gentagelse-polyoma middle T-antigen (MMTV-PyMT) 11 ind ACTB-ECFP musemodel 12.
BEMÆRK: ACTB-ECFP model udtrykker forbedret cyan fluorescerende protein (ECFP) under β-acti promotor, således at alle celler fluorescerer i det blå, CFP kanal. Men kræftceller er langt de mest fremtrædende og fremstå som en hovedparten af ECFP-positive celler under mikroskopet. MMTV-PyMT musemodel udvikler en fremadskridende sygdom, hvor brysttumor vækst er forbundet med udbredelsen af cancerceller til periferien, især til lungerne. I MMTV-PyMT mus på FVB / n baggrund, kan mikrometastaser observeres omkring 10-11 ugers alderen. Generelt er disse fremskridt macrometastases på omkring 14 ugers alderen 13.
ELLER - Generere eksperimentelle metastaser anvender primære celler eller syngene cellelinier. Bruge in vitro manipuleret primære tumorceller eller cellelinier (f.eks., Transduktion) efterfulgt af iv injektion 14.
- Kort fortalt i denne protokol, injicere et grønt fluorescerende protein (GFP) udtrykkende (+) MMTV-PyMT cellelinje i fluorescerende reporter mus (ACTB-ECFP) eller vildtype mus. Så,visualisere disse celler kaldet VO-PyMT celler 15 ved hjælp af den grønne, GFP-kanal.
BEMÆRK: Den originale VO-PyMT cellelinje blev afledt ved Vanderbilt Ortopædiske i Nashville, TN. VO står for Vanderbilt Ortopædi. - Efter injektion af 10 6 celler (i 200 pi), straks og op observere cancercelle ekstravasation til et par timer efter injektion; observere mikrometastaser mellem 1-3 uger efter injektion og detektere macrometastases 3 uger efter injektion 15.
BEMÆRK: Færre celler kan injiceres at forlænge tiden fra injektion til metastatisk vækst.
- Kort fortalt i denne protokol, injicere et grønt fluorescerende protein (GFP) udtrykkende (+) MMTV-PyMT cellelinje i fluorescerende reporter mus (ACTB-ECFP) eller vildtype mus. Så,visualisere disse celler kaldet VO-PyMT celler 15 ved hjælp af den grønne, GFP-kanal.
2. Mærkning af komponenter af interesse i Metastatisk mikromiljø (Transgene og / eller Injectables)
BEMÆRK: Mærkning kan opnås ved transgene mus og / eller ved forskellige injectables. Sørg for at bruge forskellige fluorescerende farver til mærkning af forskellige celletyper.
- Label komponenter af den metastatiske mikromiljø under anvendelse af transgene mus. Kryds tidligere nævnte muse tumormodel (f.eks., MMTV-PyMT x ACTB-ECFP) i en transgen musemodel, hvor stromacellerne af interesse mærkes af et fluorescerende protein, som ikke er ECFP, f.eks., C-fms-EGFP 4,16.
BEMÆRK: Ud over visualisering af kræftceller i kanalen FFP, dette muliggør visualisering af myeloide celler i GFP kanal 4.
OG / ELLER - Mærke forskellige komponenter i den metastatiske mikromiljø hjælp injectables i transgene fluorescerende reporter mus eller (ikke-fluorescerende) vildtypemus.
BEMÆRK: Flere forbindelser kan injiceres at mærke forskellige komponenter i den metastatiske mikromiljø, f.eks er en AF647-konjugeret Gr-1-antistof anvendes her til at mærke neutrofiler og nogle monocytter 13 og forskellige molekylvægt dextraner anvendesat mærke lung kapillærer. Til fremstilling af disse injicerbare se trin 4.
3. Forberedelse af materialer Før Dissection
- 2% agarose
- Afvej 0,2 g agarose og tilføje til 10 ml 1 x PBS. Opvarm opløsningen til at opløse agarosen. Agarose vil størkne ved stuetemperatur, så holde den i et 37 ° C vandbad indtil anvendelse for inflation.
- CO 2 og temperaturregulator
- Tjek Hedeselskabet 2 O i befugtning kammer. Refill efter behov. Sæt konfiguration plade i temperatur fase plade holder (klimakammer). Tænd for CO 2 controller og indstille CO2 ved 5%. Sørg for, at luftstrømmen er fastsat til 0,4 Nl / min.
- Åbn luft og CO 2 ventiler. Tænd temperaturregulatoren. Kontroller temperaturen i klimakamret og låget er sat ved 37 ° C.
- Slip lufttryk på CO 2 meter. Check CO 2 stigende, equilibration kan tage op til 30 min.
- Spinning disk konfokalt mikroskop
BEMÆRK: Nærmere oplysninger om mikroskopopstilling er tidligere blevet beskrevet 4,17.- Tænd laserne (argon laser til 488 nm excitation og solid state 405 nm, 561 nm og 640 nm lasere). Tænd for mikroskopet, kameraet, den roterende kontrol disk enhed, AOTF, laser styreenhed og kameraet controller.
- Åbn mikroskop lukkeren, tænde computeren kører mikroskopet og åbne softwaren.
- Forberedelse af de værktøjer og dissektion platform.
- Tænd for varme perle sterilisator og lad den nå 250 ° C. Clean 2 par kirurgiske sakse og pincet med vand og sæbe. Sterilisere redskaberne i mindst 30 sek. Lad værktøjerne køle ned. Brug en polystyren låg som dissektion platform. Dæk den med et stykke lab soaker.
4. Fremstilling af injektioner
BEMÆRK: Afhængigt af halveringstid og den foretrukne reaktion, injicere fluorescensmærkede antistoffer og / eller fluorescerende molekyler enten umiddelbart før dyr offer eller et par timer til dage før.
- Til billedet Gr1-positive neutrofiler og monocytter, udarbejde en sprøjte med 7 pi lager AF647-konjugeret Gr-1 antistof (1 mg / ml) i 100 ul sterilt PBS under kølerhjelmen. Placer en 27 G ½ kanyle på sprøjten.
- Til Billed lung kapillærer, forberede en anden og tredje sprøjte med 100 pi af enten 70 kD rhodamin-konjugeret dextran (4 mg / ml) eller 10 kD AF647-konjugeret dextran (4 mg / ml). Placer en 27 G ½ nål på sprøjterne.
- Sprøjt AF647 antistof løsning iv 5 timer før lunger 'excision.
- Indsprøjtes ene eller begge dextranopløsninger iv umiddelbart før lunger 'excision.
5. Udarbejdelse af lunger for Ex vivo Live-Imaging
BEMÆRK: Prøv at arbejde som steril og omhyggelig som muligt for at undgå unødvendige udfordringer i de immunceller inden lungerne.
- Sprøjt musen intraperitoneal (ip) med en dødelig overdosis af et bedøvelsesmiddel tilladt af dyret protokol godkendt af IACUC, f.eks., 1 ml 2,5% Avertin. Vent på musen til at stoppe vejrtrækning og være fuldstændig ikke-reagerer på skadelige stimuli (bagpote knivspids).
BEMÆRK: Cervikal dislokation og kuldioxid eutanasi bør undgås, da det skadeligt kan påvirke levedygtighed lunge celle. - Immobilisere musen på en dissektion bord og sterilisere mus med 70% ethanol.
- Brug kirurgiske sakse til først lave en tværgående epigastriske indsnit gennem huden, efterfulgt af en lignende snit gennem bughinden. Hold dissektion i lodret position og skære den nedadgående aorta, så blodet puljer ned i maven og ikke i brysthulen.
- Snappe en lille åbning i membranen for at frigøre vakuum. Skåret langs det 10. og 12. ribbe for at udskære membranen og få visuel adgang til lungerne.
- Brug kirurgiske saks til at klippe huden op til luftrøret over brystkassen, men overlader brystkassen intakt. Adskil huden fra brystkassen. Expose luftrøret ved at fjerne det omgivende bindevæv, pas på ikke at beskadige luftrøret selv (figur 1A).
- Snip en lille åbning ca. 1 mm i diameter i den udsatte luftrøret parallelt med bruskspidserne ringe, så tæt på strubehovedet som muligt (figur 1B). Pas på ikke at skære helt igennem luftrøret.
- Tage en 20 G nål og sæt forsigtigt nålen 4-5 mm i trachea uden nogen modkraft (figur 1D). Den ende af nålen bør være synligt gennem luftrøret (figur 1C). Brug pincet til at stabilisere nålen i luftrøret. Alternativt kan en sutur være bundet around luftrøret til at holde nålen på plads.
BEMÆRK: Ved at indsætte for dybt, kan carina få traumer eller kun den ene side af lungerne kan blive oppustet. - Fyld en sprøjte med 400 pi 37 ° C 2% lavtsmeltende temperatur agarose (taget direkte fra en konstant temperatur-bad). Sørg for, at dissektion bord står op og langsomt indgyde den varme agarose gennem nålen i lungerne, bruge ~ 400 pi at puste lungerne.
BEMÆRK: Se lungerne oppumpning inde i brystkassen. Må ikke over-puste lungerne, da det vil briste. - Når lungerne er oppustet, påfyldning ~ ⅔ af brystkassen, frigøre sprøjten og holde kanylen inde i luftrøret for at forhindre enhver agarose i at lække.
- Hæld ca. 50 ml 20 ° C PBS over oppustede lungerne for at tillade agarose inde lungerne til at indstille og størkne. Fjern langsomt nålen og lukke luftrøret med pincet for at undgå enhver ikke-størknet agarose lække. </ Li>
- Udsætte lungerne ved at udføre en sternotomi og efterfølgende udskære lungerne. For excision af lungerne, holde på luftrøret, mens der skæres gennem luftrøret helt. Træk forsigtigt luftrøret op, skæres bindevævet og spiserøret væk, mens trække lungerne ud af brysthulen, indtil lungerne adskilles fra mus (figur 1E).
- Fordybe lungerne i varmt RPMI-1640 til at vaske overdreven blod og forsigtigt adskille fligene ved hjælp saks og pincet til at skære lapper 'hovedstammen bronkie på hilum (figur 1F).
- Placer lapper, med den flade overflade ned for at maksimere afbildningsoverfladen, i en brønd på en 24-brønds imaging plate (figur 1G). Tilsættes 100 pi 37 ° C RPMI-1640 oven på lapperne. Placer flere 15 mm cirkulære mikroskop dækslides oven på lapper at forhindre det flydende.
- Hæld varm PBS ind i de omgivende brønde for at forhindre RPMI-1640-medier fra evaporatorisk fremstillede. Sæt 24-brønds plade i den ækvilibrerede klimakamret og opretholde lungelapperne ved 37 ° C med luft og 5% CO2. Sæt klimakammer på scenen af den konfokal mikroskop.
BEMÆRK: Andre gasblandinger (f.eks 5% O 2, 5% CO2 i N2 undersøge celle adfærd under forhold med hypoxi / lavere ilt) kan også overvejes.
Figur 1. Protokol til fremstilling af lungerne for levende billeddannelse. (A) Eksponering af trachea efter fremstilling af musen. (B) Lille klip lavet i den udsatte luftrøret parallelt med bruskspidserne ringe. (C) 20 G nål indsat 4-5 mm ind i luftrøret. (D) instillation af 400 pi 2% lavtsmeltende temperatur agarose i lungerne. (E) Inflated lunger adskilt fra musen. (F) Lobes adskilt efter inflation. (G) lapper placeret i en brønd i en 24-brønd imaging plate. Klik her for at se en større version af dette tal.
6. Køb og analyse af billeder
BEMÆRK: Billeder kan erhverves med en bred vifte af spinning disk konfokale mikroskoper, der understøttes af forskellige software-programmer. I denne protokol, er enten μManager med en skræddersyet spinning disk konfokal mikroskop eller Zen med et kommercielt tilgængeligt spinning disk konfokal mikroskop bruges til erhvervelse billede, mens Imaris bruges til film redigering og analyse.
- Anskaf billeder ved hjælp μManager. En detaljeret trinvis protokol for køb af billeder ved hjælp af μManager software er beskrevet tidligere 18.
ELLER - Anskaf billederanvendelse af billedanalyse software såsom Zen (se figur S1).
- Klik på "Find" fanen, og vælg objektiv (10x eller 20x) i "Light Path 'værktøj (figur S1A, rød boks). Efterfølgende skal du klikke på 'Eyes - DAPI "at se på den fælles fiskeripolitik kanal gennem okularet (figur S1A, blå boks). Lokalisere prøven manuelt ved hjælp af mikroskop. Klik på 'Alle Off'after vævet er centrum for synsfeltet.
- Klik på fanen 'Acquisition' for at indstille alle parametre for billedoptagelse.
- I "Kanaler" værktøj, skal du klikke på '+' knappen (Figur S1B, rød boks). En pop-up-menuen vises, og søge efter farvestoffet (er) til stede i prøven i "Dye database '(figur S1B). Vælg farvestof og klik på 'Tilføj'.
BEMÆRK: Programmet vil sætte alle filtre skal optimeres. En farvestof kan slettesved at vælge den fulgte ved at klikke på papirkurven knappen (Figur S1B, gul boks). - I "Acquisition Mode 'menuen, sæt' udsmidningen" til 5x5. Dobbeltklik på ECFP i menuen kanaler at vælge det. Sænk laser magt til 20%, så prøven ikke bliver bleget, mens opsætning af parametrene for billedoptagelse.
- Kontroller "Fliser" boksen i "Experiment Manager" sektionen og fliser værktøjet vises i "Multidimensional Acquisition 'værktøj gruppe (figur S1c). Klik på knappen 'Avanceret opsætning "for at se live-billedet fra kameraet. Klik på "Tilføj" knappen i »positioner afsnittet at tilføje 4 til 6 positioner til eksperimentet. For at slette en position, skal du vælge denne stilling og klikke på papirkurven knappen.
- I "Acquisition Parameter 'værktøj gruppe, skal du åbne' Focus Strategy 'værktøj, og vælg' Absolute Fast Z-position "fra dropdown listen.
- Kontroller Z-Stack boksen i "Experiment Manager" sektion og Z-Stack værktøj vises i "Multidimensional Acquisition 'værktøj gruppe (figur S1D). Dobbeltklik på en af positionerne i "positioner" sektionen og tryk på 'Live ". Manuelt indstillet først og sæt sidste position af imaging feltet. Indstil intervallet ved 4 pm.
BEMÆRK: Programmet vil bestemme antallet af skiver for det valgte interval og interval. Ideelt, 5-7 skiver er bekvemme at give tilstrækkelig visualisering og hurtig erhvervelse image. - Kontroller "Time Series 'kasse i" Experiment Manager "sektionen. Indstil den ønskede "Varighed" og "Interval" gange i "Time Series 'værktøj, der dukkede op i" Multidimensional Acquisition' værktøj gruppe (figur S1E).
- I 'anskaftion Mode 'menuen, sæt' udsmidningen "til 2x2. Dobbeltklik på en fluorofor i menuen kanaler til at vælge det og øge laser magt til 100%. Tryk på 'Live "og juster" Exposure Time'. Gentag dette for hver fluorofor.
- Tjek 'Aktiver Auto Save' kassen. Vælg en mappe og skriv navnet på filen. Alle de erhvervede billeder vil automatisk blive gemt i denne mappe.
- Klik på 'Start Experiment' i 'Experiment Manager "sektionen for at starte købet billede.
- Efter overtagelsen billede, kompilere de rå data i Imaris software. Konverter billeder til .ims filer og justeringer kan foretages. En detaljeret trinvis protokol for konvertering af filer, justeringer og gemme film ved hjælp Imaris er tidligere beskrevet 18.
- Når du gemmer filmen, indstille 'Frame Rate "til 5 billeder pr sekund (fps).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Brug spinning-disk konfokalmikroskopi, diverse mus modelsystemer og injectables, kan det metastatiske mikromiljø visualiseres og spores over tid. Ved hjælp af en MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; c-fms-EGFP triple transgen musemodel, forskellige cellulære komponenter er fluorescensmærket (Figur 2A, Movie 1). Den typiske struktur af lungeparenkym kan visualiseres i FFP kanalen da alle celler udtrykker ECFP under β-actinpromotoren. Større / flercellede lungemetastaser let løst så disse vises som en hovedparten af celler i organiseret lunge struktur. Myeloide celler visualiseres i GFP kanal, gennem c-fms -EGFP udtryk, som er transgenet for CSFR-1 12. Myeloide celler er meget dynamisk, når de trækker hele billedfeltet. C-fms -EGFP-positive celler er mere rigelige og vandrende i lungeparenkym sammenlignet med dem i tæt kontakt med lungenmetastase. Dynamikken i myeloide celler og deres interaktioner med lungemetastaser kan følges i realtid i flere timer.
At undersøge metastatisk såning og vækst, er en eksperimentel metastase model, der anvendes (figur 2B, Movie 2). GFP + VO-PyMT tumorceller blev injiceret i en vildtype, ikke-reporter mus og fik lov til frø og vokse i 2 uger. Strukturen af lungen er klart synlig i GFP kanal grund autofluorescens af lungerne. Imidlertid VO-PyMT celler er stadig lette at skelne fra lungestrukturen da de har en rund form og højere EGFP ekspression således synes lysere sammenlignet med lungeparenkymet. VO-PyMT cellulære motilitet kan observeres inden for det etablerede metastatisk læsion.
Cellulære interaktioner mellem metastatiske og immunceller i lungen mikromiljø kan også undersøges ved hjælp af den eksperimentelle metastase-model. To uger efterinjektion af VO-PyMT celler, fluorescensmærket Gr-1 647 konjugerede antistoffer er iv injiceret 5 timer før lunge excision (figur 2C, Movie 3). På venstre side af imaging felt, er to Gr-1 + myeloide celler interagerer med en VO-PyMT celle. En metastatisk læsion iagttages på højre side af det billeddannende område. Over tid er Gr-1 + celler rekrutteret til den metastatiske læsion. Nedenfor den metastatiske læsion, en af Gr-1 + celler tæt interagerer med en VO-PyMT celle. Til sidst, VO-PyMT celle løsner, frigøre fra Gr-1 + celle.
Kombinere reporter transgene musemodeller med den eksperimentelle metastase-model og injicerbare mærkning af antistoffer immunceller giver en trefarvet film. En uge efter injektionen af VO-PyMT celler i en ACTB-ECFP reporter mus, fluorescensmærkede Gr-1 647 konjugerede antistoffer er iv injiceret 5 timer før vævet excision (figur 2D, Movie4). Gr-1 + celler migrerer kraftigt inden for synsfeltet, mens en enkelt GFP + metastatisk celle er synlig ved midten af det billeddannende område.
Injektion forskellige fluorescerende dextraner i reporter mus, der tidligere blev injiceret med metastatiske celler, kan give en fire-farve film (figur 2E, Film 5-6). Tidlige begivenheder i såning af metastase kan studeres, når VO-PyMT celler visualiseres straks og 4 timer efter intravenøs injektion i ACTB-ECFP reporter mus. Injektionen af rhodamin-konjugeret, 70 kD dextran og 10 kD dextran konjugeret til et 647 fluorescerende tag kan visualiseringen af lungekapillærerne. Brugen af lavere og højere molekylvægt dextraner kan potentielt anvendes til at detektere ændringer i permeabiliteten af kapillærerne i lungerne, fordi de lavere molekylvægt molekyler ekstravasere hurtigere i forhold til de højmolekylære dem 19. selvom cellul ar begivenheder kan stadig effektivt undersøgt, Movie 5 er et eksempel på et væv afdrift. Hvis der ikke kan flyttes nødvendigt, og i tilfældet vævet under billedbehandling session, kan dette korrigeres under erhvervelse efter billedet analyser.
Dette system muliggør en hurtig, firefarvet erhvervelse kontinuerlig billede for at følge forskellige fluorescens-mærkede celletyper i lungen metastatisk mikromiljø. Denne protokol tillader også visualisering af metastaser i forskellige størrelser, fra begivenheder relateret til såning af enkelte kræftceller til etablerede metastaser. Desuden kan tumorceller og stromaceller bevægelse visualiseres i lungen mikromiljø sammen med blodkar. Typisk kan cellulær bevægelse observeres i mindst 4 timer fra starten af det billeddannende session. Observationen af forskellige metastatiske mikromiljøer under samme lungevæv bidrager til at undgå muse-til-mus variabilitet.
nt "fo: holde-together.within-page =" altid ">
Figur 2. Repræsentative billeder fra film erhvervet af levende billeddannelse. (A) Snapshot af en fusioneret Z stak fra film 1 viser myeloide celler i forbindelse med en lunge metastase (gul insert) versus dem, der er forbundet med lungeparenkymet (rød indsats). (B) Snapshot af en fusioneret Z stak fra film 2, der viser GFP + metastatisk celle i en eksperimentel metastase-model. Arrowhead peger på en bevægelige metastatisk celle. (C) øjebliksbillede af en Z stak fra filmen 3 viser co-lokalisering af fluorescerende signaler fra en GFP + metastase og Gr-1 + celler visualiseret ved en Gr-1-antistof konjugeret til en 647 tag (rød pilespids). Grøn pilespids peger på en GFP + metastatisk celle, der fjernes fra den metastatiske hovedparten. Hvide pilespids peger på en Gr-1 + celle, der interagerede med den bevægelige GFP + VO-PyMT celle. (D) Snapshot afen fusioneret Z stak fra film 4 viser GFP + VO-PyMT celler, i ACTB-ECFP mus. En enkelt VO-PyMT celle er synlig i centrum (grøn pilespids). Dyret blev injiceret med Gr-1 647 konjugeret antistof. (E) repræsentant Z-stak af film 5 og 6 viser blodkar i lungen hos mus aflivet umiddelbart efter injektion af 70 kD rhodamin-dextran (rød pilespids) sammen med GFP + VO-PyMT celler (grøn). Scale barer er 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende Figur 1. skærmbilleder af ZEN kamera software til køb af billeder. (A) Først i 'Light Path' værktøj bør vælges den rette mål (røde felt) og the væv være lokaliseret i mikroskopet. (B) Konfigurer kanaler for erhvervelse billede, i "kanaler" værktøj kanaler kan slettes (rød boks) eller tilføjet (gul boks). (C) I "Fliser" værktøj, kan forskellige positioner føjes til eksperimentet. (D) I "Z-Stack 'værktøj, kan Z-stakken indstilles, og tykkelsen af skiverne kan justeres. (E) I "Time Series 'værktøj, Varighed og Interval kan indstilles. Klik her for at se en større version af dette tal.
Movie 1. (Højreklik for at downloade). Interaktioner mellem en lunge metastase og sur. afrunding immune celler under anvendelse af transgene reporter mus Denne film viser en metastase i lungen i en tripel-transgen MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; c-fms-EGFP mus, hvor alle celler er mærket med ECFP og myeloide celler mærkes med EGFP. Metastaser kan observeres som en hovedparten af celler i blåt i modsætning til den normale lunge arkitektur. C-FMS + myeloide celler migrerer gennem hele billedfeltet. Denne film er en 2 hr 1 min erhvervelse.
Movie 2. (Højreklik for at downloade). Cancer celle motilitet i en eksperimentel metastase-model. Denne film viser en lunge metastase genereret ved iv injektion af GFP + VO-PyMT (grøn) celler i en vildtype, ikke-reporter, mus. Lunger blev høstet to uger efter injektion af VO-PyMT Celler. GFP + celler flytter inden for metastatisk bulk. Denne film er en 4 hr 40 min lange erhvervelse.
Movie 3. (Højreklik for at downloade). Rekruttering af immunceller visualiseret ved fluorescens-konjugerede antistoffer til eksperimentelt etablerede metastaser. Denne film viser en lunge metastase genereret ved iv injektion af GFP + VO-PyMT celler (grøn) i en vildtype, ikke- reporter, mus. Lunger blev høstet to uger efter VO-PyMT celler blev injiceret. Gr-1 + celler mærkes med Gr-1 647 konjugeret antistof og observeret i det nærinfrarøde kanal (hvid). Bemærk, at Gr-1 celler rekrutteres til GFP + metastaser. Denne film er et eksempel på en langsigtet erhvervelse, i alt 11 timer 27 min.
Movie 4. (Højreklik for at downloade). Motilitet af immunceller visualiseret ved fluorescens-konjugerede antistoffer i en transgen reporter mus injiceret med metastatiske celler. Denne film viser en enkelt GFP + VO-PyMT celle i lungen genereres ved iv injektion af erhvervs- PyMT celler (grøn) i en ACTB-ECFP mus. Lunger blev høstet en uge efter VO-PyMT celler blev injiceret. Gr-1 + celler mærkes med Gr-1 647 konjugeret antistof og observeret i det nærinfrarøde kanal (hvid). Denne film er en 2 hr 40 min lange erhvervelse.
Movie 5. (Højre klikk til download). metastatiske celler og kapillærer visualiseret ved fluorescerende dextraner umiddelbart efter iv injektion i en transgen reporter mus. Denne film viser eksperimentel metastase genereret ved iv injektion af GFP + VO-PyMT celler (grøn) i en ACTB-ECFP mus sammen med injektion af rhodamin-konjugeret, 70 kD dextran (rød) og 10 kD dextran konjugeret til et 647 fluorescerende tag (hvid), for at markere blodkar. Denne film er et eksempel på et væv drift og er en 18 min lang erhvervelse.
Movie 6. (Højreklik for at downloade). Metastatiske celler og kapillærer visualiseret ved fluorescerende dextraner flere timer efter iv injektion i en transgen reporter mus. Denne film viser eksperimentelle metastaser generered ved iv injektion af GFP + VO-PyMT celler (grøn) til en ACTB-ECFP mus sammen med injektion af rhodamin-konjugeret, 70 kD dextran (rød) og 10 kD dextran konjugeret til et 647 fluorescerende tag (hvid), for at markere blodårer. Lunger blev hentet 4 timer efter injektion af VO-PyMT celler. Denne film er en 19 min lang erhvervelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette håndskrift beskriver en detaljeret metode til ex vivo levende billeddannelse af lunge metastase i musemodeller af metastaser. Denne billedbehandling protokol giver en direkte visualisering af de dynamiske og rumlige tumor celle-stroma interaktioner inden lungerne mikromiljø. Det er en forholdsvis let og hurtig metode, der tillader pålidelig billeddannelse af lungemetastase i mindst 4 timer. Film erhvervet fra disse forsøg kan anvendes til at spore dynamiske processer som cellemotilitet og cellulære interaktioner.
To fremgangsmåder til generering af lunge metastase blev beskrevet: en gensplejset musemodel og anvendelsen af en manipuleret cellelinie. MMTV-PyMT musemodel rekapitulerer brystkræft progression og spontan lunge metastase. Andre teknikker, rekapitule- metastatisk spredning er også tilgængelige, f.eks., Ortotopisk transplantation af celler i mælkekirtlen 20. En intravenøst injiceret VO-PyMT cell linje bruges til at efterligne såning og udvækst af brystkræft metastase. Tiden godtgørelse for VO-PyMT celleudvækst afhænger af den eksperimentelle præference for den fase af lunge metastase. Afhængig af antallet af injicerede celler, kan mikrometastaser iagttages fra flere dage til 2 uger efter VO-PyMT celle injektion.
For optimal lunge billedbehandling, skal man være meget omhyggelig under inflation af lungerne. For korrekt inflation, bør nålen kun indsættes 4-5 mm ind i luftrøret. Dybere indføring af nålen kan resultere i en delvis, ensidig inflation af lungerne. Desuden bør lungerne blive overvåget under selve inflation for at forhindre over-inflation, som kan resultere i vævsskader. er desuden af afgørende betydning for at holde lungerne så steril som muligt, så immuncellerne i lungen ikke vil blive udfordret.
For hvert levende billedbehandling eksperiment, den optimale balance mellem mængden af køb og th dataskal overvejes e potentiale af vævsskader forårsaget af overdreven laser eksponering. Det er vigtigt at optimere indstillingerne for billedoptagelse ved at køre pilotforsøg. Også, anbefales det at holde laser power ned mens du søger efter optimale synsfelter og / eller til at holde lukkeren fra, når billederne ikke er anskaffet.
Motiliteten af canceren og / eller immunceller af interesse er en af indikatorerne for celle vitalitet. Motilitet er følsom over for temperatur, ilt niveauer, og fototoksicitet 7. Imidlertid kan hæmning eller manglende motilitet ikke være relateret til billedbehandling betingelser eller tekniske spørgsmål, men snarere biologisk. Inhibering af motilitet kan skyldes en vis terapeutisk virkning eller fra anholdelsen af metastatiske celler lige før deres spredning i mikrovaskulaturen af lungen og deres ekstravasation ind lungeparenkymet 21,22. Det kan derfor være vigtigt at underbygge disse data ved hjælp af yderligereteknikker (som migration analyser i 2D kultur) 23.
Desuden er denne ex vivo lunge billeddannelse metode er tilstrækkeligt til en kortvarig undersøgelse, der ikke kræver lunge mikrocirkulationen. Ved anvendelse af denne metode, observeres bevægelsen af cancer og / eller immunceller i mindst 4 timer. Forud for erhvervelse billede, det tager omkring 30 minutter at forberede lungerne og 30-60 min for at finde positioner for erhvervelse. Selvom der er observeret cellemotilitet ud over 4 timer (op til 11 timer, Movie 3), langvarig billeddannelse afhænger af de særlige celletyper undersøgt, de anvendte betingelser (f.eks., Reduceres oxygen), og bør bestemmes for en bestemt forsøgsopstilling. På grund af manglen på mikrocirkulationen og den mulige virkning af postmortem ændringer eller hvis der er en begrundelse for et behov for at kontrollere resultaterne i tilstedeværelse af en intakt mikrocirkulationen, kan lungerne intravital billeddannelse med en thorax sug vindue udnyttes. Det er imidlertid still en udfordring at udføre intravital lunge imaging på tværs af flere dage ved hjælp af en billeddannende vindue som udføres i hjernen, mælkekirtler og abdominale organer 5 på grund af vanskeligheder med at opretholde tilstrækkelig undertryk. Som en alternativ fremgangsmåde til perfusion af intakte ex vivo lunger, blev isoleret-perfunderede lunge metode tidligere anvendt til at studere pulmonal metastase. Imidlertid er denne fremgangsmåde ofte til større dyr. Da mus har mindre thorax hulrum, de udgør en reel udfordring for effektiv perfusion 24.
På grund af lysspredning, den billeddannende dybden af spinning-disk konfokal mikroskopi er begrænset. Som følge heraf er visualisering af celle- dynamik og cellulære interaktioner begrænset til overfladisk lunge metastase. Lungemetastaser er beriget i lungeperiferien eftersom metastatiske celler er begrænset af kapillærerne, som nedsætter i størrelse mod den ydre margener af lungen 1. Desuden er det easays at opretholde levedygtigheden af cellerne tættere på overfladen af lungen, som de har foretrukket adgang til medier og oxygen. For at tillade dybere visualisering i lungerne, kan udføres direkte billeddannelse af lunge sektioner. Imidlertid bør betydelig celledød forventes. Alternativt kan multifoton mikroskopi udføres, giver større væv penetration. Desuden multifoton billeddannelse genererer en iboende optisk signal, kaldet anden-harmonisk generation (SHG), der tillader visualisering af ikke-centrosymmetrisk strukturer i den ekstracellulære matrix, såsom collagen 1 fibre.
Som vist i denne undersøgelse, kan tumor og immun celle adfærd i lungemetastaser følges og analyseres under anvendelse af fluorescerende reporter-mus, som håndteres tumorceller og fluorescens-mærkede sporstoffer eller antistoffer. Denne metode kunne ændres for studiet af andre celler og determinanter i metastatisk mikromiljø. Til dette formål er der forskellige stansgenic reporter mus til rådighed for stromacelle- undersøgelse herunder for fibroblaster som FSP1-EGFP 4, alpha-SMA-RFP 25 og COL1A1-EGFP 25 eller endotelceller som Tie2-GFP 26.
Cellefarvning på levende lungesnit er blevet udført for at visualisere immuncellepopulationer 8. Denne farvning strategi kan vedtages som et alternativ til multi-farve billedoptagelse. Imidlertid flertal af markører ofte mærke multiple cellepopulationer i stedet for en særskilt cellepopulation. Injectables, der tages op af specifikke cellepopulationer 4 eller fluorescensmærkede antistoffer mod yderligere cellemarkører kan anvendes til yderligere at skelne mellem populationer. Brugen af forskellige fluorescerende farver til at mærke de forskellige celler af interesse foretrækkes til billeddannelse. I de tilfælde, hvor der ikke kan udføres anvendelsen af forskellige fluorescerende farvestoffer (fx., På grund af begrænset imaging kanaliELS), er det muligt at afbilde forskellige celletyper med samme fluorescerende reportere, så længe de er lette at skelne ved form og / eller anatomisk lokalisering.
Ud over at studere forskellige celletyper, adskillige klasser af kemoterapeutika er svagt fluorescerende (såsom doxorubicin). Disse kemoterapeutiske midler kan i princippet anvendes til at visualisere lægemiddelafgivelse og distribution i lunge metastase på en tilsvarende måde som i den primære tumor 19. Andre målrettede lægemidler, der kan fluorescensmærkede, kan også anvendes i ex vivo lunge billeddannelse. Navnlig kunne data indhentet med lungen billeddannelse være mere informative om hvilke celler take-up disse lægemidler og deres interaktion med andre celler i den metastatiske mikromiljø foruden den ekstravasation af disse terapeutiske midler fra aktive blodkar. Denne teknik kan yderligere anvendes til undersøgelse af primær lungecancer 27 eller tilpasset til studiet af andre lunge-relaterede patologier, der kan påvirke lungerne mikromiljø 28,29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MMTV-PyMT/FVB mice | Jackson Laboratory | 2374 | Female mice |
| ACTB-ECFP/FVB mice | UCSF Werb lab | Female mice | |
| c-fms-EGFP/FVB mice | UCSF Werb lab | Female mice | |
| FVB mice | Jackson Laboratory | 1800 | Female mice |
| GFP+ VO-PyMT cells | UCSF Werb lab | ||
| 70,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated | Invitrogen | D1818 | Dilute to 4mg/ml in 1 x PBS and store at -20 °C. Use 0.4 mg per animal. |
| 10,000 kDa Dextran, Alexa Fluor 647 conjugated | Invitrogen | D22914 | Dilute to 4mg/ml in 1 x PBS and store at -20 °C. Use 0.4 mg per animal. |
| Anti-mouse Gr-1 antibody Alexa Fluor 647 | UCSF Monoclonal antibody core | Stock 1mg/ml. Use 7 ug per animal. | |
| Anesthetic | Anesthesia approved by IACUC, used for anesthesia and/or euthanesia | ||
| 1X PBS | UCSF cell culture facility | ||
| PBS, USP sterile | Amresco INC | K813-500ML | Ultra pure grade for i.v. injection |
| Styrofoam platform | Will be used as dissection board | ||
| Fine scissors sharp | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Forceps | Roboz Surgical Store | RS-5135 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn ON 30min before use |
| Air | UCSF | ||
| Oxygen | UCSF | ||
| Carbon dioxide | UCSF | ||
| 1 mL syringe without needle | BD | 309659 | |
| 27 G x 1/2 needle | BD | 305109 | for i.v. injection |
| 20 G x 1 needle, short bevel | BD | 305178 | |
| Low-melting-temperature agarose | Lonza | 50111 | To make 10 ml of solution, weigh 0.2 g of agarose, add to 10 ml 1 x PBS, and heat to dissolve. Agarose will solidify at room temperature, so maintain in a 37 °C water bath until used for inflation. |
| RPMI-1640 medium without phenol red | Life Technologies | 11835-030 | |
| 24 well Imaging plate | E&K scientific | EK-42892 | |
| Glass cover slides, 15 mm | Fisher Scientific | 22-031-144 | |
| Digital CO2 and temperature controller | Okolab | DGTCO2BX | http://www.oko-lab.com |
| Climate chamber | Okolab | http://www.oko-lab.com | |
| Cell Observer spinning disk confocal microscope | Zeiss | ||
| Zen software | Zeiss | ||
| Inverted microscope | Carl Zeiss Inc | Zeiss Axiovert 200M | |
| ICCD camera | Stanford Photonics | XR-Mega-10EX S-30 | |
| Spinning disk confocal scan-head | Yokogawa Corporation | CSU-10b | |
| Imaris | Bitplane | ||
| mManager | Vale lab, UCSF | Open-source software |
References
- Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
- Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells. Cell stem cell. 16 (3), 225-238 (2015).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Egeblad, M., Ewald, A. J., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1 (2-3), 155-167 (2008).
- Ellenbroek, S. I. J., van Rheenen, J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nat Rev Cancer. 14 (6), 406-418 (2014).
- Looney, M. R., Thornton, E. E., Sen, D., Lamm, W. J., Glenny, R. W., Krummel, M. F. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
- Thornton, E. E., Krummel, M. F., Looney, M. R. Live imaging of the lung. Cur Protoc Cytom. , (2012).
- Thornton, E. E., Looney, M. R., et al. Spatiotemporally separated antigen uptake by alveolar dendritic cells and airway presentation to T cells in the lung. J Exp Med. 209 (6), 1183-1199 (2012).
- Mendoza, A., Hong, S. -H., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
- Lelkes, E., Headley, M. B., Thornton, E. E., Looney, M. R., Krummel, M. F. The spatiotemporal cellular dynamics of lung immunity. Trends Immunol. 35 (8), 379-386 (2014).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Mol Cell Biol. 12 (3), 954-961 (1992).
- Hadjantonakis, A. -K., Macmaster, S., Nagy, A. Embryonic stem cells and mice expressing different GFP variants for multiple non-invasive reporter usage within a single animal. BMC Biotechnol. 2, (2002).
- Casbon, A. -J., Reynaud, D., et al. Invasive breast cancer reprograms early myeloid differentiation in the bone marrow to generate immunosuppressive neutrophils. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (6), 566-575 (2015).
- Donovan, J., Brown, P. Parenteral injections. Curr Protoc Immunol. , (2006).
- Halpern, J., Lynch, C. C., et al. The application of a murine bone bioreactor as a model of tumor: bone interaction. Clin Exp Metastas. 23 (7-8), 345-356 (2006).
- Sasmono, R. T., Oceandy, D., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harb Protoc. (2), (2011).
- Bonnans, C., Lohela, M., Werb, Z. Real-time imaging of myeloid cells dynamics in ApcMin/+ intestinal tumors by spinning disk confocal microscopy. J Vis Exp. (92), (2014).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer cell. 21 (4), (2012).
- Cheng, N., Lambert, D. L. Mammary transplantation of stromal cells and carcinoma cells in C57BL/6J mice. J Vis Exp. (54), (2011).
- Al-Mehdi, A. B., Tozawa, K., Fisher, A. B., Shientag, L., Lee, A., Muschel, R. J. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat Med. 6 (1), 100-102 (2000).
- Wong, C. W., Song, C., et al. Intravascular location of breast cancer cells after spontaneous metastasis to the lung. Am J Pathol. 161 (3), 749-753 (2002).
- Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Nelson, K., Bobba, C., Ghadiali, S., Hayes, D. J., Black, S. M., Whitson, B. A. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World J Exp Med. 4 (2), (2014).
- Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40 (5), 1151-1159 (2004).
- Motoike, T., Loughna, S., et al. Universal GFP reporter for the study of vascular development. Genesis. 28 (2), (2000).
- Srivastava, M. K., Andersson, A., et al. Myeloid suppressor cells and immune modulation in lung cancer. Immunotherapy. 4 (3), (2012).
- Craig, A., Mai, J., Cai, S., Jeyaseelan, S. Neutrophil recruitment to the lungs during bacterial pneumonia. Infect Immun. 77 (2), 568-575 (2009).
- Kreisel, D., Nava, R. G., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).
