Abstract
Detta protokoll beskriver de specifika tekniker som används för karakteriseringen av reducerande änden (RE) och inre område glykosyl-sekvens (er) av heteroxylans. De-stärkta vete frövitan cellväggar isolerades såsom en alkohol-olöslig återstod (AIR) 1 och sekventiellt extraherades med vatten (W-sol Fr) och 1 M KOH innehållande 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) såsom beskrivits av Ratnayake et al. (2014) 2. Två olika metoder (se sammanfattningen i figur 1) har antagits. I det första, är intakta W-sol AXS behandlades med 2AB att märka den ursprungliga RE huvudkedjan sockerrest och behandlas sedan med en endoxylanas för att generera en blandning av 2AB-märkt RE och inre område reducerande oligosackarider, respektive. I ett andra tillvägagångssätt, är den KOH-sol Fr hydrolyseras med endoxylanas att först generera en blandning av oligosackarider, vilka därefter märkta med 2AB. De enzymatiskt frigjorda ((un) taggade) oligosackarider från bådaW och KOH-sol Frs därefter metylerade och den detaljerade strukturanalys av både inhemska och metylerade oligosackarider utförs genom att använda en kombination av MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS och ESI-MS n. Endoxylanas diger KOH-sol AXS kännetecknas också av kärnmagnetisk resonans (NMR) som också ger information om den anomera konfigurationen. Dessa tekniker kan appliceras på andra klasser av polysackarider med användning av de lämpliga endo-hydrolaser.
Introduction
Heteroxylans är en familj av polysackarider som är de dominerande icke-cellulosahaltiga polysackarider av de primära väggar gräs och de sekundära väggarna i alla angiospermer 3-6. Xylan huvudkedjor skiljer sig åt i deras typer och mönster av substitution med glykosyl (glukuronsyra (GlcA), arabinos (Araf)) och icke-glykosyl (O-acetyl, ferulasyra) rester beroende på vävnadstyp, utvecklingsstadium och arter 7.
Väggar från vete (Triticum aestivum L.) endosperm främst består av arabinoxylaner (AXS) (70%) och (1 → 3) (1 → 4) -β-D-glukaner (20%) med mindre mängder av cellulosa och heteromannans (2% vardera) 8. Xylan ryggraden kan vara på olika un-substituerad och övervägande mono-substituerad (primärt O-2 positionen och i mindre utsträckning O-3-position) och di-substituerade (O-2 och O-3 positioner) med α-L-Ara f resterna 9. Den reducerande änden (RE) av heteroxylaner från dikotyledoner (t.ex. Arabidopsis thaliana) 10 och gymnospermer (t.ex. gran (Picea abies)) 11 innehåller en karakteristisk tetrasackarid glykosyl-sekvens; -β-D-Xyl p - (1 → 3) -α-L-Rha p - (1 → 2) -α-D-Gal p A- (1 → 4) -D-Xyl s. Att förstå heteroxylan biosyntes och funktion (biologisk och industriell), är det viktigt att fullständigt sekvensera xylan ryggraden att förstå vilka typer och de mönster av substitutioner såväl som sekvensen för den reducerande änden (RE).
Specifika metoder som används för den strukturella karakteriseringen av reducerande ände (RE) och inre område glykosyl-sekvens (er) av heteroxylans beskrivs i detta manuskript. Teknikerna är beroende av fluoroforen märkning (med två aminobensamid (2AB)) den reducerande änden (RE) i heteroxylan kedjan före enzymatisk (endoxylanas) hydrolys. Detta tillvägagångssätt, särskilt för RE sekvensering, varrapporterades först av York laboratorium 10,12-13 men nu utvidgas till att omfatta inre regionen sekvensering och är en kombination av etablerade tekniker som är lika anpassningsbar till alla heteroxylans oberoende av deras källa till isolering. Detta tillvägagångssätt kan också tillämpas på andra typer av polysackarider med hjälp av (i förekommande fall) lämpliga endo-hydrolaser.
I föreliggande studie, var de-stärkta vete frövitan cellväggar isolerades som en alkohol-olöslig återstod (AIR) och sekventiellt extraherades med vatten (W-sol Fr) och 1 M KOH innehållande 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) såsom beskrivits i Ratnayake et al. (2014) 2. De frigjorda oligosackariderna från både W- och KOH-sol Frs är därefter metylerade och den detaljerade strukturanalys av både de nativa och metylerade oligosackarider utförs med användning av en kombination av MALDI-TOF-MS, ESI-QTOF-MS-kopplad med HPLC med online-kromatografisk separation med användning av en RP C-18-kolonnoch ESI-MS n. Endoxylanas diger KOH-sol AXS präglades också av kärnmagnetisk resonans (NMR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Märkning av den reducerande änden (RE) sockerrest av W-sol AXS med 2-aminobensamid (2AB)
- Inkubera W-sol AXS med 2AB (0,2 M) i närvaro av 1 M NaBH3CN (natriumcyanoborhydrid) (pH 5,5) under 2 h vid 65 ° C för att omvandla de reducerande ändarna hos kedjorna polysackarid ryggraden till sina fluorescerande derivat.
OBSERVERA: Följande steg ska utföras i dragskåp som NaBH3CN släpper giftig cyanidgasen när den är i kontakt med vatten.- Väg upp NaBH3CN (62,8 mg) och lös i vatten (1 ml) i ett mikrocentrifugrör (1,5 ml) för att framställa en 1 M NaBH3CN lösning. Upplösa 2AB-reagens (27,2 mg) i en M NaBH3CN-lösning (1 ml) genom upphettning vid 65 ° C och justera pH-värdet hos reaktionsblandningen (0,2 M 2AB, 1 M NaBH3CN) till pH 5,5 med 10% ättiksyra.
- Tillsätt 200 pl av reaktionsblandningen (0,2 M 2AB, 1 M NaBH3CN) till W-sol AXS (1 mg) i ett glasrör med ett lock och blanda med hjälp av en vortexblandare. Inkubera i 2 h vid 65 ° C i ett dragskåp. Kyla suspensionen till RT och tillsätt 4 vol. absolut etanol.
- Placera suspension i ett kylrum (4 ° C) O / N för att fälla ut polysackarider.
- Centrifug (1500 x g, 10 min, RT) för att avlägsna supernatanten. Tvätta pelleten i stor omfattning med absolut etanol (4x), aceton (1 x) och metanol (1 x), centrifugering mellan varje tvätt. Vakuumtorka vid 40 ° CO / N.
Obs: Omfattande tvättning avlägsnar också rest 2AB.
2. Generering av xylo-oligosackarider från 2 AB Märkt W-sol AXS
- Upplösa 2AB märkt W-sol AXS (1 mg) i 500 | il natriumacetatbuffert (100 mM, pH 5) i ett mikrocentrifugrör (1,5 ml). Tillsätt 4 enheter av endoxylanas (GH 11, [M1]) och inkubera vid 37 ° C i 16 h.
- Förstöra enzymaktivitet genom värmning av reaktions Mixture under 10 min i ett kokande vattenbad. Kyla suspensionen till RT och överföra till glasrör med ett lock. Lägg 4 vol. absolut etanol och placera suspensionen i ett kylrum (4 ° C) O / N för att fälla ut eventuella osmälta polysackarider.
- Centrifug (1500 x g, 10 min, RT) för att separera osmälta polysackarider (pellet) och endoxylanas genererade xylo-oligosackarider (supernatant). Dekantera supernatanten i ett rent glasrör och placera den i ett varmt vattenbad (40 ° C).
- Indunsta etanolen under en ström av kvävgas till en slutpunkt volym (~ 500 | il). Frysa supernatanten vid -80 ° C under 4 timmar och torka den frysta supernatanten i en frystork för att återvinna xylo-oligosackarider.
3. Generering av xylo-oligosackarider från KOH-sol AXS och 2AB Märkning
- Behandla KOH-sol AXS med endoxylanas (GH 11 [M1]) för att generera xylo-oligosackarider som beskrivits ovan (avsnitt 2.1-2.4).
- behandla endoxylanase genererade xylo-oligosackarider från KOH-sol AXS med 2AB reaktionsblandning (0,2 M 2AB, 1 M NaBH3CN) enligt beskrivningen ovan (avsnitt 1.1.1-1.1.2).
- Dekantera supernatanten i ett rent glasrör och placera den i ett varmt vattenbad (40 ° C). Indunsta etanolen under en ström av kvävgas till en slutpunkt volym (~ 500 | il). Frysa supernatanten vid -80 ° C under 4 timmar och torka den frysta supernatanten i en frystork för att återvinna xylo-oligosackarider.
4. MALDI-TOF-MS
- Framställning av MALDI-matris Lösning
- Tillsätt en liten skopa av 2, 5-dihydroxbenzoic syra (DHB) till 50% acetonitril (500 ml) innehållande 0,1% myrsyra i ett rör (MALDI-matrislösning). Blanda med hjälp av en virvel, om det löser sig snabbt, lägga till ytterligare en liten skopa DHB. Obs: Ideal koncentration av MALDI-matris lösning är 10 mikrogram / l -1.
- Framställning av MALDI-mål-tavla
- Deponera aqueooss oligosackarid (native) prover (5-10 pg) (W-sol och / eller KOH-sol) på en MALDI-måltavla. Lägga 0,3 pl MALDI-matrislösning med användning av en separat spets och blanda genom att pipettera upp och ner. Låta blandningen torka vid RT.
ANMÄRKNING: torkade proverna bör bestå av långa nålformade kristaller som pekar mot mitten av fläcken. Om insättningen är klibbig och / eller kladdig provet kan antingen vara alltför koncentrerad eller bestå av salter, är det osannolikt att producera bra spektra sådana insättningar och provet ska renas ytterligare. - Införa målplattan in i MS källan och verka i positiv (+ ive) jonläge. Justera acceleratorspänningen till 19,0 kV vid jonkällan 1 och 16,3 kV vid jonkällan 2. Justera lasereffekten till högre än 70%. Välj prov plats på MALDI-målplattan och klicka på Start för att börja laserskott.
Obs: Alla delar av målet kommer inte att ge signaler. En särskild plats kommer bara att ge en signal för några laserskott antingen på grundutarmning av provet / matrisblandning eller egenskaperna hos kristallen.- Flytta lasern till olika delar av målet under förvärv och i genomsnitt ca 200 slumpmässig spektra att erhålla tillfredsställande signal-till-brus.
- Deponera aqueooss oligosackarid (native) prover (5-10 pg) (W-sol och / eller KOH-sol) på en MALDI-måltavla. Lägga 0,3 pl MALDI-matrislösning med användning av en separat spets och blanda genom att pipettera upp och ner. Låta blandningen torka vid RT.
5. ESI-QTOF-MS
- Analysera endoxylanas genererade oligosackarider (nativ) med användning av nano-HPLC i kombination med en elektrospray (ESI) kvadrupol time of flight (QTOF) MS instrument med nätet kromatografisk separation med användning av en RP C-18 kolonn (75 | im x 150 mm; 3,5 ^ m vulst storlek).
- Överför endoxylanas genererade vatten oligosackarider blandningen i en flaska och placera i HPLC auto provtagaren. Programmera elueringsgradient av 5-80% med de mobila faserna 0,1% (volym / volym) myrsyra i vatten och 0,1% (volym / volym) myrsyra i acetonitril, respektive under 60 min.
- Justera flödeshastigheten till 0,2 | j, l / min. Justera positiva-ion-läget i skannings intervalletav 300-1,600 m / z och en scan-hastighet av 0,5 skanningar / sekund med hjälp av ESI källförhållanden enligt följande: gardin gas 10, GS1 4, källtemperatur 100 ° C, jonspray spänning 2300 V, och de-klustring potential 50 V. Kör LC kromatografiska programmet och eluera oligosackarider. Den resulterande totala jonkromatogram (TIC) sparas automatiskt av programmet.
- Öppna den sparade TIC och välj extrakt kromatogrammet. Skriv de förväntade massorna (t.ex. 271, 403, 535, 667, 799 och 931 m / z) på kommandoraden. Scan kromatogrammet genom att klicka på Enter. Bearbeta valda jon skannar av kromatogrammet uppgifter ESI-QTOF MS med hjälp av programvara enligt tillverkarens anvisningar 14.
6. ESI-MS n
- Infoga en till två | il per-O-metylerad oligosackarid (metyleras såsom beskrivits av Pettolino et al. 1) provet i 50% acetonitril i en nanosprayspets med hjälp av en spruta. Trimnanosprayspetsen med användning av en glaskniv att passa in i den diskreta nanosprut hållare monterad till MS.
- Ställ in Massa enligt den förväntade massområdet (200-1,500 m / z) och gardin gas till 10, Jonspray spänning vid 1900 V och polaritet till positiv.
- Tryck på förvärva knappen för att öppna relevant fönster, mata in data filnamn för att erhålla en total jon scan (ESI-MS 1). Tryck sedan på STOP-knappen.
- Ändra scantyp från produkt jon att fragmentera en topp av intresse. Ange massan av intresse (t.ex. 885 m / z) att fragmentera och justera massområde (200-900 m / z). Tryck på förvärva knappen och justera kollisionsenergin (upp och / eller nedåt på fliken föreningen) för att uppnå hela fragmentering av moderjon (885 m / z) och skaffa ett fragment jon scan (ESI-MS 2).
- Ange massan av fragment jon av intresse (t.ex. 711 m / z) och justera massområde (200-720 m / z). Tryck på Hämta end justera kollisionsenergin för att uppnå hela fragmentering av prekursor jon (711 m / z) och skaffa ett fragment jon scan (ESI-MS 3).
7. H 1 NMR-spektroskopi
- Lös endoxylanas genererade blandning av oligosackarider (KOH-sol, nativa form) (~ 500 mikrogram) i D2O (1,0 ml, 99,9%) i ett teströr av plast (15 ml). Frysa suspensionen vid -80 ° C under 4 timmar och torka den frusna suspensionen i en frystork för att återvinna xylo-oligosackarider.
- Upprepa 7,1 två gånger för att fullt ut utbyta H 2 O med D 2 O.
- Lös upp torkade oligosackarider i D2O (0,6 ml, 99,9%) och tillsätt 0,5 | il av aceton (5% i D2O) som en intern standard. Överför deutererade oligosackariderna i NMR-provröret.
- Håll röret innehållande provet NMR från toppen och för in provröret i en plast spinner. Placera spinnaren i provet djupmåttet. push eller dra provröret för att justera djupet på provet för att säkerställa att centrumlinjen av provet övre och undre djupmätare är lika.
- Ta bort djupmåttet och för in provet i den automatiska provtagaren ansluten till en 600 MHz NMR-spektrometer utrustad med en Cryo-sond.
- Logga in och öppna spektrometer styrprogram. Ange prov filnamnet. Öppna en befintlig datamängd och sedan använda "EDC" för att spara den under ett nytt namn. Skriv in positionsnumret av provet i den automatiska provtagaren och tryck "ENTER".
Notera: Genom att trycka på knappen "ENTER" kommer att släppa provröret försiktigt magnetöppningen där den kommer att placeras på toppen av sonden. - Ställ in önskad provtemperaturen genom att skriva "edte" på kommandoraden. Vänta på provtemperaturen för att nå det önskade värdet innan man går vidare till nästa steg. Ange "låsa" på kommandoraden och välj lämpligt lösningsmedel (D2O). Vänta tills & #34; lås färdig "meddelande att visas längst ned i fönstret.
- Skriv "atmm" på kommandoraden och klicka på "optimera" på toppen av atmm menyraden. Välj start för avstämning och matchning av sonden för den valda kanalen (1 H i detta fall).
- Skriv "topshim" på kommandoraden för mellanlägg process där smärre justeringar görs magnetfältet tills likformigt magnetfält uppnås runt sample.Acquire signalen genom att skriva "ZG" på kommandoraden och ange.
- Analysera spektra med hjälp av programvara 15 enligt tillverkarens instruktioner med en H kemiskt skift i förhållande till en intern standard av aceton vid 2,225 ppm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Endoxylanas digestion av 2AB-märkt W-sol AXS genererar en blandning av 2AB-märkt RE oligosackarider och en serie av un-märkt (utan 2AB etikett) oligosackarider härledda från de inre regionerna av xylan kedjan (figur 1; från Ratnayake et al. 2). En serie av kromatografiska metoder används sedan för att fraktionera komplexa blandning av isomerer. Slutligen MS-tekniker används för att identifiera de isomera strukturer som sedan sekvense av MS n tekniker. Här presenterar vi en representant, snarare än omfattande, exempel på tillvägagångssättet.
Signalerna i MALDI-TOF-MS-spektrum av oligosackarider härledda från 2AB-märkt nativ W-sol AXS (figur 2A) innefattar en mycket rikligt förekommande pseudomolekylär jon serie vid m / z 701, 833, och 965 som representerar en serie av omärkt neutral inreregion oligosackarider med 5-7 pentosyl rester (P 5-7), respektive. En serie av signaler vid m / z 745, 877, och 1009, att ange att en omärkt sura oligosackarid serien, med P 4-6 + HexA 1 (Hexuronic syra), är också närvarande i denna fraktion (Figur 2A). Pseudo-molekylära joner vid m / z 821 och 953 indikerar närvaron av den 2AB märkta original RE oligosackarider P 5-6 + 2AB, respektive.
ESI-QTOF-MS-analys för de infödda oligosackarider med en on-line kromatografisk fraktionering av oligosackarider genom RP C-18 HPLC utförs sedan. Figur 2B och 2C visar de valda jon skannar, extraherade från ESI-QTOF-MS total jon kromatogram (TIC), av oligosackarider släpptes av endoxylanas från W-sol Fr AXS. Signalerna innefattar en pseudo-molekylär jon serien tilldelas som [M + NH4] + vid m/ z 696, 828, 960, 1092, 1224, och 1356 representerande en serie av inre region neutrala oligosackarider med 5-10 pentosyl rester (P 5-10), respektive (figur 2b). Flera isomera strukturer är möjliga för en oligosackarid av en definierad massa (se nedan ESI-MS n analys). Därav de många toppar för var och en av molekyljonen skannar är möjligt eftersom observerats i figur 2B. Pseudo-molekylära joner som tilldelats som [M + H] + vid m / z 271, 403, 535, 667, 799, och 931 indikerar närvaron av en 2AB märkt RE oligosackarid serie P 1-6 + 2AB, respektive (Figur 2C) . De signaler som detekteras som [M + H] + joner vid m / z 613, 745, 877, 1009, 1141, och 1273 anger närvaron av en sur oligosackarider med P 3-8 + HexA 1, respektive (figur 2C). I commelenid monokotyledoner kan xylan ryggraden också vara substituerade med fenolsyror,primärt ferulasyra (och även p -coumaric syra), som har samma molekylmassa som glukuronsyra och kan detekteras i W-sol AXS över vete endosperm cellväggar. Men ytterligare analys av F- och KOH-sol AXS med hjälp av ESI-MS n (och sammansättningsanalyser med GC-MS av TMS-derivat efter metanolys, visas inte här) bekräftar de sura oligosackarider med P 3-8 + HexA en i vete frövitan AXS.
De signaler som tilldelats som [M + H] + joner av ESI-Q-TOF fullständig sökning spektrum av området mellan 3,10 till 3,48 min (Figur 2D) innefattar serien av 2AB märkt RE oligosackarider: m / z 271, 403, 535, 667, 799, 931, 1063, och 1195 (P 1-8 + 2AB, respektive). En serie av pseudo-molekylära joner i ESI-Q-TOF fullständig genomsökning spektrum av området mellan 3,59-4,05 min (Figur 2E) representerar det inre området sura oligosackarider observerad som både [M + Na] + joner: m / z 613, 745, 877, 1009, och 1141 (P 3-7 + HexA 1, respektive) och [M + NH4] + joner: m / z 740, 872, 1004, 1136, och 1268 (P 4-8 + HexA en, respektive).
För att sekvensera de individuella oligosackarider, utförde vi ESI-MS n på per-O-metylerade oligosackarider i stället för på de nativa oligosackarider erhållna från W-sol och KOH-sol AXS eftersom det är utmanande att entydigt tilldela strukturer genom sekvensering av nativa oligosackarider . Dessutom, också kräver större mängder material. Metylering av oligosackariderna utfördes såsom beskrivits av Pettolino et al. 1. ESI-MS n undersökningar utförda på RE neutral oligosackarid alditoler härrör från KOH-sol AXS, och 2AB märkt neutral RE oligosackarid härledd från W-sol AXS beskrivs below som ett exempel för att hjälpa till vid tolkning av spektra och härledda strukturer. Samma tillvägagångssätt kan tillämpas på alla de oligosackarider som genereras från enzymatisk hydrolys. De fragmentjoner i ESI-MS n spektra identifierades som Y och B-joner enligt Domon & Costello. 16 Un-metylerade hydroxylgrupp (er) som alstras under gasfas fragmentering av per-O-metylerade oligosackarider i MS n tillhandahåller en 14Da massa skillnad "ärr" som kan användas för att identifiera förgreningsmönstret och glykosyl-sekvenserna. 12-13 Varje ärr som genereras av fragmentering händelsen markeras som en heldragen linje (figur 3 och 4). Eftersom flera isomera strukturer är möjliga för en bestämd massa, sedan i dessa isomera strukturer, Y och B-joner är märkta i rött och svart, respektive.
ESI-MS 2, ESI-MS 3 och ESI-MS 4 SPECTra av per-O-metylerad RE neutral oligo-glykosyl alditol genereras från fragmentering av pseudo-molekyljonen m / z 885 (P 4 + Xyl ol) visas i Figur 3. ESI-MS 2 spektrum innehåller rikligt Y joner vid m / z 711, 551, och 391 som genereras av förlust av en, två och tre pentosyl rester, respektive, från moderjoner. Den rikliga m / z 711-jon kan genereras av antingen förlust av en icke-reducerande terminala änden Xyl rest eller genom förlust av en terminal sidokedja Ara återstod. Den diagnostiska Y m / z 391 jon i den resulterande spektrum kan genereras från förlusten av tre icke-reducerande änden Xyl restprodukter från RE oligosackarid som har en sidokedja Ara rester på RE Xyl ol rest eller RE oligosackarid som har en sidokedjan Ara återstod på 2: a Xyl rester från RE Xyl ol återstod. Även om det finns en formell möjlighet att andra strukturer, såsomXYL 4 -Xyl ol och (Ara) Xyl-Xyl-Xyl-Xyl ol skulle ge upphov till detta fragmentjon dessa strukturer exkluderas från beaktande som specificiteten hos endo-xylanas användes för att klyva polysackariden skulle antingen skada eller inte klyva vid glykosidlänken intill en grenpunkt, respektive. På motsvarande sätt kan den diagnostiska Y m / z 551 jon genereras från förlusten av två icke-reducerande änden Xyl restprodukter från RE oligosackarid som har sidokedjan Ara rester på antingen RE Xyl ol rest eller RE oligosackarid som har sido kedja Ara rest på den näst sista Xyl återstod. Sålunda kan fyra möjliga isomera strukturer föreslås (Figur 3: I, II, III och IV). Den rikliga Y jon m / z 377 (se figur 3: Ia och IIa) och B-jon m / z 503 (se figur 3: Ia, Ib, IVa och IVb) genereras från ytterligare fragmentering av isomera prekursor m/ z 711 jonen är också observerats i detta spektrum. ESI-MS 3-spektrum (Figur 3) registreras av fragmentering av isomera prekursor m / z 711 joner ingår en huvudtopp vid m / z 537 (Y joner P 2 + Xyl ol med två ärr, som genereras från föregångaren jon Ia Ib, Ila, IIb, Illa, IIIb, IVa och IVb) och m / z 391 (Y joner P 1 + Xyl ol med ett ärr, som genereras från föregångaren jon IIb, Illa, IIIb, IVa och IVb). Dessa två huvudtoppar (m / z 537 och m / z 391) kan genereras genom förlusten av en och två icke-reducerande terminala Xyl rester respektive från den isomera prekursor m / z 711 jon genereras från fragmenteringen av pseudo -molecular moderjonen m / z 885 (P 4 + Xyl ol) under ESI-MS 2. Relativt lägre förekomst toppar vid m / z 377 (Y jon av P 1 + Xyl ol med två ärr; genereras från precursor jon la och Ila) och 551 (Y joner P 2 + Xyl ol med ett ärr, som genereras från föregångaren jon Ib och IIb) observerades också i detta spektrum.
ESI-MS 4 av fragmenteringen av den isomera prekursor m / z 551 joner ingår en huvudtopp vid m / z 377 (Y joner P 1 + Xyl ol med två ärr) och m / z 391 (Y joner P 1 + Xyl ol med ett ärr) som genereras från prekursorn jon av strukturerna i och II. Därför samlade bevis tyder på att RE glykosyl sekvensen består av Ara sidokedja bunden till RE Xyl ol återstod (diagnostisk fragmentering väg m / z 885 → 711 → 551 → 391 Figur 3II), Ara sidokedja bunden till både RE Xyl ol och den näst sista (1 st Xyl rester från RE Xyl ol) Xyl återstod (diagnostisk fragmentering väg m / z 885 → 711 → 537 → 391 Figur 3III), Ara sidokedja bunden till den näst sista (1 st Xyl från RE Xyl ol) Xyl återstod (diagnostisk fragmentering väg m / z 885 → 711 → 537 → 377, figur 3I) och ara sidokedja fäst på 2: a Xyl rester från RE Xyl ol (Figur 3IV).
Närvaron av dessa joner bekräftar de föreslagna isomera strukturerna I, II, III och IV och den neutrala RE oligosackarid struktur: - [Ara f - (1 → 3)] (+/-) -Xyl p - (1 → 4) - [Ara f - (1 → 3)] (+/-) -Xyl p - (1 → 4) - [Ara f - (1 → 3)] (+/-) -Xyl s.
ESI-MS 2 spektrum av per-O-metylerat 2AB märkt RE oligosackarid genereras från fragmUtformning av den kvasi-molekylära [M + Na] + jon vid m / z 871 (P 4 + 2AB) visas i fig 4. Detta spektrum innehåller den mest förekommande Y jon vid m / z 697 (P 3 + 2AB med en ärr), m / z 537 (P 2 + 2AB med ett ärr) och m / z 377 (P 1 + 2AB med ett ärr), genererad av en förlust av antingen en, två eller tre icke-reducerande pentosyl rester, respektive. Med m / z 697-jon kan genereras av antingen förlust av en icke-reducerande terminala änden Xyl rest eller genom förlust av en terminal Ara rest medan m / z 537-jon kan endast alstras av förlusten av två terminala Xyl rester . Den diagnostiska fragmentering pathway (m / z 871 → 697 → 537 → 377) föreslog att förekomsten av linjära un-grenade xylan ryggraden oligosackarid (er) vid RE motsvarar den kvasi-molekylär jon m / z 871 (P 4 + 2AB ). Men den linjära un-grenade xylosyl ryggrad (P 4 + 2AB) är susceptible till platsspecifik endoxylanas för ytterligare digerering. Därför två isomera m / z 697 joner kan existera. Således två möjliga isomera strukturer föreslås (Figur 4: I och II). I dessa isomera strukturer Y och B-joner är märkta i rött och svart, respektive. ESI-MS tre spektrum registrerades från fragmentering av isomera prekursor m / z 697 jon genererar m / z 523 jon (Y joner P 2 + 2AB med två ärr, Figur 4, strukturer Ia, Ib, Ila och IIb), m / z 363-jon (Y jon av P 1 + 2AB med två ärr, fig 4, struktur Ila) och Y jon vid m / z 377 (P 1 + 2AB med ett ärr, fig 4, strukturer la och Ib). Fragmentet jon vid m / z 377 kan bara uppstå från den föreslagna strukturen I och fragmentet jonen vid m / z 363 kan bara uppstå från den föreslagna strukturen II. Den samtidiga förekomsten av dessa två joner bekräftar de föreslagna strukturerna I och II. Sålunda RE glykosyl sekvensen av xylan kedja av vete frövitan AXS består av en Ara grenen fäst till RE Xyl återstoden (fragmentering pathway m / z 871 → 697 → 523 → 363) och / eller näst sista Xyl återstod (fragmentering pathway m / z 871 → 697 → 523 → 377).
NMR-analys av AXS
MS-baserade analyser ger ingen information om vare sig den anomera konfiguration (α / β) eller D / L-konfiguration av det socker som måste erhållas genom andra metoder, inklusive enzymatisk och fysisk (t.ex. NMR) den. För heteroxylans med den karakteristiska RE reducerade tetrasackarid (Xyl-Rha-GALA-Xyl ol), innehåller NMR-spektrum anomera signaler som leder till identifiering och sekvensering av denna RE oligosackarid. Vi beskriver användningen av 600 MHz 1D 1 H-NMR-spektroskopi som ett enda steg metod för att DEThermelin den fullständiga glykosyl-sekvensen av vetet endosperm AX RE oligosackarid på KOH-sol Fr, inklusive den anomera konfigurationen (α / β) och D / L-konfiguration av sockerarterna den. Resonanser tilldelades på grundval av offentliggjorda uppdrag av vete AX oligosackarider 17-18 (Figur 5, tabell 1). Den 1 H-NMR-spektrumet för AX heras från vete endosperm domineras av de anomeriska kemiska skift vid 5,39, 5,27 och 5,22 ppm som är tilldelade till protonen av en terminal α-L-Ara f rest, bunden till O-3 positionen (T-α-L-Ara f → 3 S) av de var för sig grenade (1,4) -β-Xyl p ryggradsrester och båda O-3 och O-2 positioner (t-α-L-Ara f → 3 D och T-α-L-Ara f → 2 D) av dubbelt grenade (1,4) -β-Xyl p ryggradsrester, respektive (figur 5 och tabell 1).
f ^ 3 S + D) H1 signal av α-L-Ara f sidokedja bunden till O-3 positionen av var för sig grenad β-D-Xyl p återstoden med angränsande dubbelt grenad β-D-Xyl s. Signalen vid 5,29 är tilldelad till den (T-α-L-Ara f → 3 D + D) H1-signal i f-sidokedjan α-L-Ara fäst vid O-3 positionen av den dubbelt grenad β-D-Xyl p återstoden med angränsande dubbelt grenad β-D-Xyl s. signalen vid 5,24 är tilldelad till den (T-α-L-Ara f → 2 D + D) H1-signal av α-L-Ara f sidokedja bunden till O-2 positionen av den dubbelt grenad β-D-Xyl p återstoden med angränsande dubbelt grenad β-D-Xyl s.
Figur 2. MALDI-TOF MS (A) och ESI-QTOF MS (B - E) analys av nativa oligosackarider som frisätts av endoxylanas från 2AB märkt W-sol AXS såsom skisseras i figur 1. MALDI-TOF MS-spektrum: (A) ( signalerna a re identifierats som [M + Na] + additionsjoner); Utvalda ion avsökningar av ESI-QTOF MS kromatogram: B = P 5-10 härrör från interna region oligosackarider (Signalerna är identifierade som [M + NH4] + addukt joner); C = P 1-6 + 2AB härledda från RE oligosackarider (signalerna är identifierade som [M + H] + addukt joner) & P 3-8 G härledda från sura oligosackarider (signalerna är identifierade som [M + Na] + addukt joner), D = ESI-Q-TOF fullständig scan-spektrum: regionen mellan 3,10-3,48 min, E = ESI-Q-TOF fullständiga scan-spektrum: regionen mellan 3,59-4,05 min (signalerna är identifierade som både [M + Na] + och [M + NH4] + addukt joner ); P = pentosyl enhet (antingen Ara eller Xyl); G = uronosyl återstod (GlcA); RE = reduktionsänden oligosackarider; 2AB = 2 aminobensamid; EIC: utvinns jonkromatogram. ad / 53.748 / 53748fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. ESI-MS 2, ESI-MS 3 och ESI-MS fyra spektra av per-O-metylerad RE neutral glykosyl alditol (P 4 + Xyl ol) - m / z 885. Signalerna tilldelas som [M + Na] + pseudo molekylär jon addukter. Eftersom flera isomera strukturer för en definierad massa är möjligt då i isomera strukturer Y och B-joner är märkta i rött och svart, respektive. Varje "ärr" som genereras av fragmentering händelsen är markerad som en heldragen linje. X = xylosyl rest; A = arabinosyl återstod. ESI-MS tre spektra har reproducerats med tillstånd från Ratnayake et al. (2014) 2.748fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. ESI-MS 2 och ESI-MS tre spektra för per-O-metylerade 2AB märkta neutrala RE oligosackarid (P 4 + 2AB) - m / z 871. Signalerna tilldelas som [M + Na] + pseudo -molecular jon addukter. Eftersom flera isomera strukturer för en definierad massa är möjliga i isomera strukturer, Y- och B-joner märkta i rött och svart respektive. Varje "ärr" som genereras av fragmentering händelsen är markerad som en heldragen linje. X = xylosyl rest; A = arabinosyl återstod. Denna siffra har reproducerats med tillstånd från Ratnayake et al. (2014) 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. anomeriska regionen av 600 MHz 1D 1 H-NMR-spektrum av de AX oligosackarider som genereras av endoxylanas behandling av KOH- Sol Fr. 1 H kemiskt skift refererade till en intern standard av aceton vid 2,225 ppm. T-α-L-Ara f ^ 3 S: H1-signal i f-sidokedjan α-L-Ara fäst vid O-3 positionen av var för sig grenad β-D-Xyl p rest; T-α-L-Ara f → 2 D: H1-signal i f-sidokedjan α-L-Ara fäst vid O-2 positionen av den dubbelt grenad β-D-Xyl p rest; T-α-L-Ara f → 3 D: H1-signal i f-sidokedjan α-L-Ara fäst vid O-3 positionen av den dubbelt grenad β-D-Xyl p rest; T-α-L-Ara f → 3 S + D: H1-signal i f-sidokedjan α-L-Ara fäst vid O-3 positionen av var för sig grenad β-D-Xyl p rest med angränsande dubbelt grenad β-D- xyl p; T-α-L-Ara f → 2 D + D: H1-signal i f-sidokedjan α-L-Ara fäst vid O-2 positionen av den dubbelt grenad β-D-Xyl p rest med angränsande dubbelt grenad β-D -Xyl p; T-α-L-Ara f → 3 D + D: H1-signal i f-sidokedjan α-L-Ara fäst vid O-3 positionen av den dubbelt grenad β-D-Xyl p rest med angränsande dubbelt grenad β-D -Xyl p; 2-α-L-Ara f ^ 3 S: H1 signal 2-α-L-Ara f sidokedja rest bunden till O-3 position enskilt grenade β-D-Xyl p rest; Klicka här för att seen större version av denna siffra.
| rester socker | H-1 / C-1 | H-2 / C-2 | H-3 / C-3 | H-4 / C-4 | H-5 ekv / C-5 | H-5 ax / C-5 |
| T-α-L-Araf → 3 S | 5,396 / 107,6 | 4,16 | 3,95 | 4,3 | 3,82 | 3,72 |
| T-α-L-Araf | 5,415 / | 4,18 | 3,95 | |||
| → 3 S + D | ||||||
| T-α-L-Araf → 2 D | 5,223 / | 4,16 | 3,97 | 3,82 | 3,74 | |
| T-α-L-Araf → 2 D + D | 5,243 / | 4,16 | 3,98 | |||
| T-α-L-Araf → 3 D | 5,272 / 108,9 | 4,18 | 3,96 | 4,26 | 3,79 | 3,74 |
| T-α-L-Araf → 3 D + D | 5,298 / | 4,18 | 3,96 | |||
| 2-α-L-Araf → 3 S | 5,548 / 106,4 | 4,27 | 4,06 | 4,3 | 3,82 | |
| a-Xylp (minska) | 5,185 / 91,9 | 3,55 | 3,72 | |||
| p-Xylp (minska) | 4,580 / 96,6 | 3,29 | 3,48 | 3,64 | 4,06 | 3,38 |
| β-4-Xylp | 4,470 / | 3,32 | 3,58 | |||
| p -4-Xylp + S | 4,461 | 3,31 | 3,56 | 3,75 | 4,08 | 3,36 |
| β-4-Xylp + D | 4,448 | 3,31 | 3,56 | 3,75 | 4,08 | 3,36 |
| p-3,4-Xylp | 4,518 / | 3,44 | 3,85 | |||
| S + β-3,4-Xylp | 4,514 / | 3,47 | 3,75 | 3,86 | 4,14 | 3,43 |
| D + β-3,4-Xylp | 4,505 | |||||
| p-3,4-Xylp + S | 4,492 | 3,45 | 3,74 | |||
| β-3,4-Xylp + D | 4,482 | 3,45 | 3,74 | |||
| P-2,3,4-Xylp | 4,638 | |||||
| S + β-2,3,4-Xylp | 4,627 | 3,59 | 3,87 | 3,88 | ||
| D + β-2,3,4-Xylp | 4,616 | |||||
| P-2,3,4-Xylp + S | 4,593 | |||||
| β-2,3,4-Xylp + D | 4,593 | |||||
| Kemiska skift rapporteras i förhållande till inre aceton, ö 2,225. | ||||||
| S = Enkla grenad β-Xylp | ||||||
| S + D = Enkla grenad β-Xylp + Dubbelt grenad β-Xylp | ||||||
| D = Dubbelt grenad β-Xylp | ||||||
| D + D = Dubbelt grenad β-Xylp + Dubbelt grenad β-Xylp | ||||||
Tabell 1. 1 H-NMR-signaler för de xylo-oligosackarider som genereras av endoxylanas behandling av vete endosperm KOH-sol Fr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De flesta matris fas cellväggs polysackarider har till synes slumpmässigt substituerade ryggrader (med både glykosyl och icke-glykosylrester) som är mycket varierande beroende på växtarter, utvecklingsstadium och vävnadstyp 3. Eftersom polysackarider är sekundära genprodukter deras sekvens inte mall härledd och det finns därför ingen enskild analytisk metod, såsom finns för nukleinsyror och proteiner, för deras sekvensering. Tillgången på renade kopplingsspecifika hydrolytiska enzymer har gett ett kraftfullt verktyg för att bryta ned polysackarider till oligosackarider som sedan kan kromatografiskt fraktion, och när den används i kombination med kemiska och fysikaliska metoder helt sekvenseras. Utmaningen är att sedan återmontera dessa komplexa blandningar i den ursprungliga polysackariden sekvens- en som fortfarande att vara framgångsrikt behandlas.
Här beskriver vi en metod (vars ordning ansökan can varieras) som bygger på integration av etablerade enzymatiska, kemiska och fysikaliska metoder för strukturbestämning av både den reducerande änden (RE) och inre område glykosyl sekvens (er) heteroxylans. En ytterligare kompletterande teknik som inte beskrivs här som har visat sig vara mycket användbar för att karakterisera oligosackarider är PACE (polysackarid analys av kolhydrat gelelektrofores) som utvecklats av Dupree 19 gruppen och det kan enkelt integreras i detta protokoll om utrustningen är tillgänglig. Vidare variationer på LC kromatografi kan också vara användbara, såsom tandem inline hydrofil interaktion kromatografi (HILIC) följt av RP-kromatografi erbjuder möjligheten att separera både omärkta / taggade oligosackarider i ett enda steg. Teknikerna lita på märkning (med två aminobensamid (2AB)) den reducerande änden (RE) i heteroxylan kedjan före enzymatisk (endoxylanas) hydrolys. Två olika metoder (se sammanfattningen iFigur 1) har antagits. I det första, är intakta W-sol AXS behandlades med 2AB att märka den ursprungliga RE huvudkedjan sockerrest och behandlas sedan med en endoxylanas för att generera en blandning av 2AB-märkt RE och inre område reducerande oligosackarider, respektive. I en andra tillvägagångssätt KOH-sol Fr hydrolyseras med endoxylanas att först generera en blandning av oligosackarider som därefter märkta med 2AB. I detta senare scenario ursprungliga RE av KOH-sol AX inte skulle märkas med 2AB eftersom det hade reducerats till glykosyl-alditolen under alkaliextraktionssteget som innehöll reduktions, natriumborhydrid (NaBH4). Därför 2AB-märkta oligosackarider genererade post-xylanas matsmältning, kommer härröra från "interna" oligosackarider och den ursprungliga RE oligosackarid kommer att innehålla en RE alditol utan 2AB tagg (se figur 1). Detta tillvägagångssätt kan också tillämpas på andra typer av polysackarider usjunga (i förekommande fall) lämpliga endo-hydrolaser.
MS-baserad metod avsevärt förbättras genom metylering av oligosackariderna genereras efter endoxylanas behandling eftersom FN-metylerade hydroxylgrupp (er) som alstras under gasfas fragmentering av per-O-metylerade oligosackarider i MS n ger en 14Da massa skillnad "ärr "som kan användas för att underlätta identifieringen av förgreningsmönstret och glykosyl sekvensen. 5-6 identiteten av pentosyl rester (och alla sockerrest) kan inte göras från MS-data ensam men kommer från att ha kunskap om sammansättning av molekylen; Om detta inte är tillgänglig då de relevanta monosackarid och länk analyser måste göras innan du köper dessa uppdrag i MS n. Dessutom signalerna som motsvarar RE sur oligosackarid alditol, genereras från KOH-sol Fr (Xyl 3 -MeGlcA-Xylitol: m / z 761) och lmaracteristic dicot xylan RE glykosyl-sekvensen (Xyl 2 -Rha-GALA-Xylitol: m / z 761), om den är närvarande, inte kan särskiljas som båda har samma molekylmassa i nativ form, men kan skiljas från deras MS fragmentering ( MS n) spektra som utförs bäst på metylerade oligosackarider. Slutligen, MS-baserad teknik kan inte ge information om antingen anomeriska konfigurationen (α / β) i glykosidbindning eller D / L-konfiguration av sugars- this måste bestämmas genom alternativa metoder, inklusive enzymatisk och fysisk (t.ex. NMR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 aminobenzamide (2AB) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | A89804 | |
| sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 247677 | Hazardous, handle with care |
| sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 156159 | Hazardous, handle with care |
| endo-1,4-β-Xylanase M1 (from Trichoderma viride) (120101a) | Megazyme (www.megazyme.com) | E-XYTR1 | |
| Deuterium Oxide (D2O) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 151882 | |
| Freeze dryer (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus) | |||
| RP C18 Zorbax eclipse plus column | Agilent | (2.1×100 mm; 1.8 µm bead size) | |
| MicroFlex MALDI-TOF MS (Model - MicroFlex LR) | (Bruker Daltonics, Germany) | ||
| (ESI) -(QTOF) MS (Model # 6520) | (Agilent, Palo Alto, CA ) | ||
| ESI-MSn - ion-trap (Model # 1100 HCT) | (Agilent, Palo Alto, CA). | ||
| Bruker Avance III 600 MHz -NMR | Bruker Daltonics, Germany | ||
| Topspin (version 3.0)-Biospin- software | Bruker | ||
| GC-MS (Model # 7890B) | Agilent |
References
- Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B., Bacic, A. Determining the polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. 7, 1590-1607 (2012).
- Ratnayake, S., Beahan, C. T., Callahan, D. L., Bacic, A. The reducing end sequence of wheat endosperm cell wall arabinoxylans. Carbohydr. Res. 386, 23-32 (2014).
- Bacic, A., Harris, P. J., Stone, B. A. The Biochemistry of Plants, Vol. 14, Carbohydrates. Preiss, J. 14, Academic Press. San Diego. 297-371 (1988).
- York, W. S., O'Neill, M. A. Biochemical control of xylan biosynthesis - which end is up? Plant Biol. 11, 258-265 (2008).
- Fincher, G. B. Revolutionary times in our understanding of cell wall biosynthesis and remodeling in the grasses. Plant Physiol. 149, 27-37 (2009).
- Faik, A. Xylan Biosynthesis: News from the Grass. Plant Physiol. 153, 396-402 (2010).
- Scheller, H. V., Ulskov, P. Hemicelluloses. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 263-289 (2010).
- Bacic, A., Stone, B. A (1→3)- and (1→4)-linked β-D-glucan in the endosperm cell-wall of wheat. Carbohydr. Res. 82 (13), 372-377 (1980).
- Comino, P., Collins, H., Lahnstein, J., Beahan, C., Gidley, M. J. Characterisation of soluble and insoluble cell wall fractions from rye, wheat and hull-less barley endosperm flours. Food Hydrocolloids. 41, 219-226 (2014).
- Pena, M. J., et al. Arabidopsis irregular xylem8 and irregular xylem9: Implicationsfor the Complexity of Glucuronoxylan Biosynthesis. Plant Cell. 19, 549-563 (2007).
- Andersson, S. I., Samuelson, O., Ishihara, M., Shimizu, K. Structure of the reducing end-groups in Spruce xylan. Carbohydr. Res. 111, 283-288 (1983).
- Mazumder, K., York, W. S. Structural analysis of arabinoxylans isolated from ball-milled switchgrass biomass. Carbohydr. Res. 345, 2183-2193 (2010).
- Kulkarni, A. R., et al. The ability of land plants to synthesize glucuronoxylans predates the evolution of tracheophytes. Glycobiol. 22 (2012), 439-451 (2012).
- Agilent MassHunter Workstation Software - Quantitative Analysis Familiarization Guide. , Agilent Technologies. Available from: http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G3335_90061_Quant_Familiarization-EN.pdf (2010).
- Topspin User Manual. , Bruker. Available from: http://www.nmr.ucdavis.edu/docs/user_manual_topspin_ts30.pdf (2010).
- Domon, B., Costello, C. E. A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentation in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates. Glycoconjugate. J. 5, 397-409 (1988).
- Hoffmann, R. A., Leeflang, B. R., De Barse, M. M. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. Characterisation by 1H-n.m.r. spectroscopy of oligosaccharides, derived from arabinoxylans of white endosperm of wheat, that contain the elements ----4)[alpha-L-Araf-(1----3)]-beta-D-Xylp-(1---- or ----4)[alpha- L-Araf-(1----2)][alpha-L-Araf-(1----3)]-beta-D-Xylp-(1----. Carbohydr. Res. 221, 63-81 (1991).
- Gruppen, H., Hoffmann, R. A., Kormelink, F. J. M., Voragen, A. G. J., Kamerling, J. P., Vliegenthart, J. F. Characterisation by 1H NMR spectroscopy of enzymically derived oligosaccharides from alkali-extractable wheat-flour arabinoxylan. Carbohydr. Res. 233, 45-64 (1992).
- Kosik, O., Bromley, J. R., Busse-Wicher, M., Zhang, Z., Dupree, P. Studies of enzymatic cleavage of cellulose using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE). Methods Enzymol. 510, 51-67 (2012).
