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Chemistry

효소 적, 화학 (메틸화) 및 물리 (질량 분석, 핵 자기 공명) 기법을 사용하여 공장 벽 Heteroxylans의 연속

doi: 10.3791/53748 Published: March 24, 2016

Abstract

이 프로토콜은 단부 (RE) 및 heteroxylans 내부 영역 글리코 서열 (들)을 감소시키는 특성을 위해 사용되는 특정 기술을 설명한다. 탈 먹인 밀 배유 세포벽은 알코올 불용성 (W 졸 천을)로 추출 잔사 (AIR) 1 순차적 Ratnayake 기재된 바와 같이 1 M KOH 1 %의 NaBH 4 (KOH 졸 천을)를 함유로서 단리 하였다 등. (2014) 2. 두 개의 서로 다른 접근 방법은 (그림 1의 개요 참조)를 채택하고 있습니다. 처음에는 그대로 W 졸 AX를 원래 RE 골격 쇄 당 잔기 태그를 2AB로 처리하고 2AB 표지 RE 각각 올리고당을 감소 내부 영역의 혼합물을 생성하는 endoxylanase로 처리 하였다. 두 번째 접근에서, KOH 졸 천을 먼저 2AB 연속적으로 표시되는 당사슬의 혼합물을 생성하는 가수 분해 endoxylanase. 모두에서 enzymically 발표 ((UN) 태그) 올리고당W- 및 KOH 졸 FRS는 MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS 및 ESI-MS n의 조합을 사용하여 수행 한 다음 메틸화 모두 천연 및 메틸화 올리고당의 상세한 구조 분석이다. Endoxylanase는 KOH 졸 AX를도 또한 아노 머 구성에 대한 정보를 제공하고, 핵 자기 공명 (NMR)에 의해 특징 분해. 이러한 기술은 적합한 엔도 가수 분해 효소를 사용하여 폴리 사카 라이드의 다른 클래스에 적용될 수있다.

Introduction

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Heteroxylans는 잔디의 주요 벽과 모든 피자 식물 3-6의 2 차 벽의 주된 비 셀룰로오스 다당류있는 다당류의 가족입니다. 크 실란 백본은 유형과 글리코 (글루 쿠 론산 (GlcA), 아라비 노스 (Araf)) 및 비 - 글리코 (O 아세틸, 페룰 산) 조직 유형, 발달 단계 및 종 7에 따라 잔류와 대체 패턴에 차이가 있습니다.

밀에서 벽 (밀 및 aestivum L.) 배젖은 주로 아라비 (AX를) (70 %) 및 (1 → 3)로 구성되어 있습니다 (1 → 4) -β-D 글루칸 (20 %) 셀룰로오스 heteromannans 소량으로 (2 % 씩) 8. 자일란 백본 주로 (주로 O-2 위치 및 정도는 덜 O-3 위치)로 치환 된 모노 - 및 디 - 치환 된 α-L-아와 (O-2, O-3 위치) 다양 - 미 치환 될 수 있고 F 잔류 9. 환원 말단 (RE) 이종의(예를 들면, 가문비 스 (Picea의 구상)) (예를 들어, 애기 장대) dicots에서 크 실란 10 겉씨 11 특징 테트라 사카 라이드의 글리코 시퀀스를 포함 -β-D-Xyl - (1 → 3) -α-L-라곤 - (1 → 2) -α-D-갈 P는 A- (1 → 4) -D-Xyl 피. heteroxylan 생합성 기능 (생물 산업)를 이해하기 위해서는 충분히 종류 및 치환 패턴뿐만 아니라 환원 말단 (RE)의 순서를 이해하는 자일란 골격을 시퀀싱하는 것이 중요하다.

단부 (RE) 및 heteroxylans 내부 영역 글리코 서열 (들)을 감소시키는 구조 특성에 사용될 특정 기술이 논문에 기재되어있다. 기술은 효소 (endoxylanase) 가수 분해 전의 heteroxylan 사슬의 환원 말단 (RE) (2- 아미노 벤즈 아미드 (2AB)에) 태그를 형광체에 의존한다. 특히 RE 서열이 접근했다먼저 뉴욕 실험실 10,12-13에 의해보고하지만 지금은 격리 자신의 소스의 독립적 인 모든 heteroxylans에 동일하게 적용 할 설립 기술의 조합을 내부 영역의 염기 서열을 포함하도록 확장하고 있습니다. 이 방법은 (가능) 적절한 엔도 가수 분해 효소를 사용하여 폴리 사카 라이드의 다른 클래스에 적용될 수있다.

설명한 바와 같이, 본 연구에서는 디 먹인 밀 배유 세포벽 물 (W 졸 천을)로 추출 알콜 불용성 잔사 (AIR)와 순차적으로 분리하고 1M KOH 1 %의 NaBH 4 (KOH 졸 프랑)을 함유 한 Ratnayake에서 외. (2014) 2. W- 및 KOH 졸 FRS 모두로부터 방출 된 올리고당은 함께 HPLC로 ESI-QTOF-MS 결합 MALDI-TOF-MS의 조합을 사용하여 수행 한 다음 메틸화 모두 천연 및 메틸화 올리고당의 상세한 구조 분석이다 RP C-18 컬럼을 사용하여 온라인 크로마토 그래피 분리및 ESI-MS 없음. Endoxylanase는 KOH 졸 AX를 또한 핵 자기 공명 (NMR)에 의해 분석되었다 분해.

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Protocol

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2- 아미노 벤즈 아미드와 W-졸 AX를의 감소 끝 1. 라벨은 (RE) 설탕 잔류 물 (2AB)

  1. 이들 형광 유도체 다당류 골격 사슬의 환원 말단을 변환하는 65 ° C에서 2 시간 동안 1 M의 NaBH 3 CN (시아 노 수소화 붕소 나트륨) (PH 5.5)의 존재하에 2AB (0.2 M)과 W-졸 AX를 부화.
    주의 :이 물과 접촉 할 때의 NaBH 3 CN 독성 시아 나이드 기체를 방출 할 때 다음 단계 퓸 후드에서 수행되어야한다.
    1. 을 NaBH 3 CN (62.8 mg)을 칭량하고, 1 M의 NaBH 3 CN 용액을 조제 물에 microcentrifuge 관 (1.5 mL) 중의 (1 ㎖)에 녹인다. (65)에서 가열 한 M을 NaBH 3 CN 용액 (1 ml)에 2AB 시약 (27.2 ㎎)을 녹이고   ° C 10 % 아세트산으로 pH 5.5, 반응 혼합물 (0.2 M 2AB 1 M의 NaBH 3 CN)의 pH를 조정.
    2. W-그래서에 반응 혼합물의 200 μL (0.2 M 2AB 1 M의 NaBH 3 CN)를 추가캡 유리관에서 패 AX를 (1 mg) 및은 볼텍스 믹서를 사용하여 혼합한다. 65에서 2 시간 동안 품어   흄 후드에서 C를 °. RT에 정지 쿨 4 권을 추가합니다. 무수 에탄올.
    3. 감기 저장소에 다당류를 침전 (4 ° C) O / N을 정지 놓습니다.
    4. 원심 분리기 (1,500 XG, 10 분, RT)은 상층 액을 제거합니다. 각 세척 사이에 원심 분리, 무수 에탄올 (4 배), 아세톤 (1 배) 및 메탄올 (1 배)로 광범위하게 펠렛을 씻으십시오. 40 ° CO / N에서 진공 건조.
      참고 : 광범위한 세척도 잔류 2AB을 제거합니다.

2 AB 레이블 된에서 Xylo 올리고당의 2 세대 W-졸 AX를

  1. 2AB는 마이크로 원심 튜브에서 아세트산 나트륨 완충액 500 μL (100 mm의 pH를 5) (1.5 ml)에 W-AX를 졸 (1 mg)을 표지 녹인다. endoxylanase의 4 단위 (GH (11), [M1]) 추가 37 부화   16 시간 동안 C를 °.
  2. 반응 믹스트을 가열하여 효소 활성을 파괴끓는 물을 욕조에 10 분 동안 URE. RT에 정지 쿨과 모자를 유리 튜브에 전송할 수 있습니다. 4 권을 추가합니다. 절대 에탄올과 냉장의 서스펜션을 배치 (4 ° C) O / N은 ​​소화되지 않은 다당류를 침전한다.
  3. 원심 분리기 (1,500 XG, 10 분, RT)은 소화되지 않은 다당류 (펠렛)를 분리하고 endoxylanase은 (뜨는) xylo 올리고당을 생성합니다. 깨끗한 유리 튜브에 뜨는을 가만히 따르다과 따뜻한 물을 욕조 (40 ° C)에 배치합니다.
  4. 종료점 부피 (~ 500 μL)을 질소 기류하에 에탄올을 증발시켰다. 4 시간 동안 -80 ° C에서 뜨는을 동결하고 xylo 올리고당을 복구하는 동결 건조기에서 냉동 뜨는을 건조.

KOH-졸 AX를하고 2AB의 라벨에서 Xylo 올리고당의 3 세대

  1. (섹션 2.1-2.4) 전술 한 바와 같이 xylo 올리고당을 생성하는 endoxylanase와 KOH-졸 AX를 (GH (11), [M1]을) 취급합니다.
  2. endox 치료ylanase은 (섹션 1.1.1-1.1.2) 전술 한 바와 같이 2AB 반응 혼합물 (0.2 M 2AB, 1 M을 NaBH 3 CN)과 KOH-졸 AX를에서 xylo 올리고당을 생성합니다.
  3. 깨끗한 유리 튜브에 뜨는을 가만히 따르다과 따뜻한 물을 욕조 (40 ° C)에 배치합니다. 종료점 부피 (~ 500 μL)을 질소 기류하에 에탄올을 증발시켰다. 4 시간 동안 -80 ° C에서 뜨는을 동결하고 xylo 올리고당을 복구하는 동결 건조기에서 냉동 뜨는을 건조.

4. MALDI-TOF-MS

  1. MALDI-매트릭스 솔루션의 제조
    1. 튜브 (MALDI 매트릭스 용액)을 0.1 % 포름산을 함유하는 50 % 아세토 니트릴 (500 ㎖)에 2,5- dihydroxbenzoic 벤조산 (DHB)의 작은 국자를 추가한다. 신속 용해 경우, DHB의 또 다른 작은 국자를 추가, 소용돌이를 사용하여 섞는다. 참고 : MALDI-매트릭스 솔루션의 최적 농도는 10 μg의 인 / μL -1.
  2. MALDI-대상 플레​​이트의 제조
    1. aqueo을 증착우리가 (기본) 샘플 (5 ~ 10 μg의)을 올리고당 MALDI-타겟 판 위에 (W-졸 및 / 또는 KOH-졸). 별도의 팁을 사용하여 0.3 ㎕를 MALDI-매트릭스 솔루션을 추가로 pipetting 아래로 섞는다. 혼합물을 실온에서 건조하도록 허용합니다.
      참고 : 제대로 건조 샘플이 자리의 중심을 향해 가리키는 긴 바늘 모양의 결정으로 구성되어야합니다. 입금 스티커 및 / 또는 더럽혀진 경우 샘플이 너무 농축 또는 그의 염으로 구성 될 수도 있고, 이러한 침전물은 양호한 스펙트럼을 생성 할 가능성이 샘플을 추가로 정제한다.
    2. MS는 소스로 표적 판을 소개하고 양 (+ 필자) 이온 모드로 동작한다. 이온 소스 (1)에서 19.0 kV로, 이온 소스 (2)에서 16.3로 kV의 가속 전압을 조정은 70 % 이상으로 레이저 출력을 조정한다. MALDI-대상 접시에 샘플 지점을 선택하고 레이저 촬영을 시작하기 위해 시작을 클릭합니다.
      참고 : 대상의 모든 영역 신호를 생성하지 않습니다. 특정 장소 만에 하나 때문에 몇 레이저 샷에 대한 신호를 줄 것이다샘플 / 매트릭스 혼합물 또는 결정의 특성 고갈.
      1. 만족스러운 신호 - 대 - 잡음을 구하는 취득 평균 동안 약 200 무작위 스펙트럼을 타겟의 상이한 영역에 레이저를 이동.

5. ESI-QTOF-MS

  1. RP를 사용하여 전기 분무 이온화 (ESI) 온라인 크로마토 그래피 분리와 비행 (QTOF) MS 악기의 사중 극자 시간과 함께 나노 HPLC를 사용하여 endoxylanase 생성 된 올리고당 (기본)을 분석 C-18 컬럼 (75 μm의는 X 150mm, 3.5 μm의 비드 크기).
    1. 유리 병에 endoxylanase 생성 된 수성 올리고당 혼합물을 전송하고 HPLC 오토 샘플러에 배치합니다. 60 분에 걸쳐 각각 아세토 니트릴의 이동상을 0.1 % (v / v)의 물, 포름산 0.1 % (v / v)의 포름산 5-80%의 용출 구배를 프로그램.
    2. 0.2 μL / 분의 유속을 조정한다. 스캔 범위에서 긍정적 인 이온 모드를 조정커튼 가스 (10) GS1 4 원 온도 100 ℃ 이온 분무 전압 2300 V, 잠재적 50 디 클러스터링 : 300-1,600 m / z 다음과 같이 초 ESI 소스 조건을 사용하여 0.5g / 주사의 주사 속도 V.를 실행 LC 크로마토 그래피 프로그램과 용출 올리고당. 그 결과 총 이온 크로마토 그램 (TIC)는 소프트웨어에 의해 자동으로 저장됩니다.
    3. 저장된 TIC를 열고 추출 크로마토 그램을 선택합니다. 명령 줄에서 예상 질량 (예를 들어, 271, 403, 535, 667, 799 및 931m / Z)를 입력합니다. 입력을 클릭하여 스캔 크로마토 그램. 제조자의 지시에 따라 (14) 소프트웨어를 사용하여 ESI-QTOF MS 크로마토 그램 데이터의 선택 이온 스캔 처리한다.

6. ESI-MS N

  1. 주사기를 사용하여의 nanospray 팁에 50 % 아세토 니트릴 샘플 당 O 메틸화 올리고당 1~2 μL를 넣고 (Pettolino 외. (1)에 의해 기술 된 바와 같이 메틸화). 손질유리 커터를 사용하여 나노 분무 팁은 MS에 부착 된 개별 나노 분무 홀더에 맞게.
  2. 긍정적으로 예상 질량 범위 (200-1,500 m / z)와 커튼 가스 (10), ionspray 전압 1,900 V의 극성에 따라 질량을 설정합니다.
  3. 관련 창을 열고 총 이온 스캔 (ESI-MS 1)를 얻었다 데이터 파일 이름을 입력 획득 버튼을 누릅니다. 그 다음 STOP 버튼을 누릅니다.
  4. 관심의 피크를 단편화하는 제품 이온에서 스캔 유형을 변경합니다. 관심의 질량을 입력합니다 (예 : 885m / z) 조각화 및 질량 범위 (200~900m / Z)를 조절합니다. 획득 버튼을 누르면 부모 이온의 전체 조각 (885m / Z)를 달성하고 조각 이온 스캔 (ESI-MS 2) 취득 (위 / 아래로 화합물 탭) 충돌 에너지를 조정합니다.
  5. 관심 (예를 들어, 711m / z)의 조각 이온의 질량을 입력하고 질량 범위를 조정 (200~720m / z). 획득 버튼의을 눌러전구체 이온의 전체 조각 (711m / z)를 달성 단편 이온 스캔 (ESI-MS (3))를 취득하는 충돌 에너지를 조정 거라고.

7. H 1 NMR 분광학

  1. D 2 O의 플라스틱 시험관 (1.0 ㎖, 99.9 %) (15 ml)에 올리고당 endoxylanase 생성 혼합물 (KOH 졸, 기본 체) (~ 500 μg의)을 녹인다. 4 시간 동안 -80 ° C에서 현탁액을 동결하고 xylo 올리고당을 복구하는 동결 건조기에서 동결 된 현탁액을 건조.
  2. 완전 D 2 O로 H 2 O를 교환하기 위해 7.1 회 반복
  3. D 2 O에 (0.6 ml를, 99.9 %)을 건조 올리고당을 분해하고 내부 표준으로 아세톤 0.5 μL (D 2 O 5 %)를 추가합니다. NMR의 샘플 튜브에 중수 소화 올리고당을 전송합니다.
  4. 상단에 의한 NMR 튜브를 포함하는 샘플을 잡고 플라스틱 스피너에서 샘플 튜브를 삽입합니다. 샘플 깊이 게이지의 회 전자를 놓습니다. 고름H는 샘플 상하 깊이 게이지의 중심선이 동일하도록 시료의 깊이를 조절하기 위해 시료 튜브를 당기거나.
  5. 깊이 게이지를 제거하고 냉동 프로브가 장착 된 600 MHz의 NMR 분광계에 부착 된 자동 샘플러로 샘플을 삽입합니다.
  6. 로그인 및 오픈 분광계 제어 소프트웨어. 샘플 파일 이름을 입력합니다. 기존 데이터 집합을 열고 다음 새 이름으로 저장 "EDC"명령을 사용합니다. 자동 샘플러의 샘플의 위치 번호를 입력하고 "ENTER"키를 누릅니다.
    참고 :이 프로브의 상부에 위치한다 자석 구멍에 조심스럽게 샘플 튜브를 드롭 것 "ENTER"버튼을 누르면.
  7. 명령 줄에서 "edte"를 입력하여 원하는 샘플 온도를 설정합니다. 다음 단계로 진행하기 전에 원하는 값에 도달하기 위해 시료 온도 기다린다. 입력 명령 행에서 "잠금"적절한 용매를 선택 (D 2 O). & # 기다립니다(34); 창 하단에 표시 완료 "메시지를 잠급니다.
  8. 명령 줄에서 "ATMM"를 입력하고 ATMM 메뉴 바의 상단에있는 "최적화"를 클릭합니다. 선택된 채널 (이 경우 1 H)에 대한 조정 및 프로브의 매칭 시작을 선택합니다.
  9. 균일 한 자기장이 명령 줄에서 "ZG"를 입력하고 입력하여 sample.Acquire 주위에 신호를 얻을 때까지 약간의 조정이 자기장에 대한되는 shimming 프로세스에 대한 명령 줄에서 "topshim"를 입력합니다.
  10. 2.225 ppm으로 아세톤 내부 표준에 언급 H 화학 시프트 제조업체의 지시에 따라 소프트웨어 (15)를 사용하여 스펙트럼을 분석한다.

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Representative Results

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AX를가 2AB 표지 RE 올리고당의 혼합물 및 자일란 쇄 (도 1의 내부 영역으로부터 유래되지 않은 표지 (2AB 라벨없는) 올리고당의 시리즈를 생성 W-졸 Endoxylanase 소화 2AB는 표지]에서 Ratnayake 외. 2). 크로마토 그래피 방법의 시리즈는 이성질체의 착체 혼합물을 분별하기 위해 사용된다. 최종적으로, MS 기술은 다음 기술에 의해 해당 MS 서열화 된 이성질체 구조를 식별하기 위해 사용된다. 여기에서 우리는 오히려 접근 방식의 포괄적 인 예보다, 대표을 제시한다.

2AB 표지 네이티브 W 졸 AX를 (도 2A)로부터 유래 당사슬의 MALDI-TOF-MS 스펙트럼 신호는 표지 된 일련 나타내는 매우 풍부한 의사 - 분자 이온 (M)의 직렬 / z 701, 833 및 965를 포함 내부 중립각각 5-7 pentosyl 잔류 물 (P 5-7)와 지역 올리고당. m / z 745, 877, 및 1009에서의 일련의 신호는 P + 4-6 헥사 (Hexuronic 산)로하는 표지 된 산성 올리고당 시리즈되어 있음을,이 부분 (도 2A)으로 존재한다. m / z 821과 953에서 의사 분자 이온은 각각 2AB 표지 원래 RE 올리고당의 P 5-6 + 2AB의 존재를 나타냅니다.

RP C-18 HPLC에 의한 올리고당 류의 온 - 라인 크로마토 그래피 분별로 네이티브 올리고당의 ESI-QTOF-MS 분석 한 후,도 2b 및도 2c. 실시 ESI-QTOF-MS 총 이온 추출 선택된 이온 스캔을 도시한다 크로마토 그램 (TIC), W-졸 프랑 AX를에서 endoxylanase 발표 한 올리고당. 신호는 [M + NH 4]로 + m에 할당 된 의사 - 분자 이온 시리즈를 포함/ 각각 5 ~ 10 pentosyl 잔류 물 (P 5-10), (그림 2B)과 내부 영역 중립 올리고당의 시리즈를 대표하는 Z 696, 828, 960, 1092, 1224 및 1356. 여러 이성질체 구조는 정의 된 질량의 올리고당 (ESI-MS N 분석 아래 참조)이 가능하다. 도 2b에서 관찰 된 바와 같이, 분자, 이온 스캔마다 따라서, 다수의 피크들이 가능하다. [M + H] + m에서 / z 271, 403, 535, 667, 799 및 931로 할당 의사 분자 이온은 2AB의 존재 RE 당사슬 시리즈 P에게 + 2AB 1-6 표지 나타내는 각각 (도 2C) . 로 감지 된 신호는 [M + H]는 + m / z 613, 745, 877, 1009, 1141 및 1273에서의 이온은 각각 P 3-8 + 헥사 (1) (도 2c)을 갖는 산성 올리고당의 존재를 나타낸다. commelenid 외떡잎에서, 자일란 골격은 페놀 산으로 치환 될 수 있고,주로 페룰 산 (또한 P -coumaric 산) 글루 쿠 론산과 같은 분자량을 가지고 밀 배유 세포벽의 W-졸 AX를 검출 할 수있다. 그러나, ESI-MS N 사용 W- 및 KOH-졸 AX를 더 분석 (및 조성은 메탄 다음 TMS 유도체의 GC-MS로 분석;하지 여기에 표시) 밀 배젖에서 P 3-8 + 헥사 1 산성 올리고당을 확인 AX를.

[M + H]가 + 3.10-3.48 분 사이의 영역의 ESI-Q-TOF 전체 검사 스펙트럼의 이온 (그림 2D)이 2AB의 시리즈는 RE 올리고당 레이블이 포함로 할당 신호 : m / z 271, 403, 535, 667, 799, 931, 1063 및 1195 (P 1-8 + 2AB, 각각). 3.59-4.05 분 사이의 영역의 ESI-Q-TOF 스펙트럼 전체 스캔 유사 분자 이온 시리즈 (도 2e)을 내부 영역 산성 올리고당 관찰 대표D 모두 [M + 나] + 이온과 같은 : m / z 613, 745, 877, 1009 및 1141 (P 3-7 각각 + 헥사 1) 및 [M + NH 4] + 이온 : m / z 740, 872, 1004, 1136 및 1268 (P 각각 4-8 + 헥사 1).

각 당사슬을 시퀀싱하기 위해, 우리는 ESI-MS를 수행 N에 당 O 메틸화 올리고당 오히려 명백하게 천연 당사슬을 시퀀싱하여 구조를 할당 도전 때문에 W-졸 KOH 졸 AX를 얻은 천연 당사슬보다 . 또한, 같은 재료의 더 큰 양을 필요로한다. Pettolino 등에 의해 설명 된대로 올리고당 메틸화 행했다. 1. ESI-MS N KOH-졸 AX를에서 파생 된 RE 중립 올리고당 알디 톨 수행 연구 및 2AB는 W-졸 AX를에서 파생 된 중립 RE 올리고당은 벨로을 설명하는 표시일례의 스펙트럼 및 추론 구조의 해석을 지원하기로 w 동일한 방법은 효소 적 가수 분해로부터 생성 된 모든 올리고당 류에 적용 할 수있다. ESI-MS N 스펙트럼의 단편 이온 당 O 메틸화 올리고당 MS 16 비 - 메틸화 수산기 (들)의 기상 분할 중에 발생. 도몬 및 코스텔로에있어서 Y 및 B 이온으로 식별 n은 제공했다 분지 패턴 및 글리코 서열. 12-13 분열 ​​이벤트에 의해 생성 된 각 상처를 식별 할 수 14Da 질량 차이 "상처"는 실선으로 표시된다 (도 3 및도 4). 여러 이성질체 구조가 정의 된 질량 가능 한, 다음 이러한 이성질체 구조에서, Y와 B 이온은 각각 빨간색과 검은 색 표시되어 있습니다.

ESI-MS 2, ESI-MS (3) 및 ESI-MS SPECT의사 분자 이온 m / z 885의 분열에서 생성 된 당-O-메틸화 RE 중립 올리고 글리코 알디 톨의 라 (P 4 Xyl +) 그림 3에 표시됩니다. ESI-MS (2) 스펙트럼이 풍부한 Y를 포함 m / z 711, 551 및 391에서 이온은 어미 이온으로부터 각각 하나, 둘, 셋 pentosyl 잔기의 손실에 의해 발생. 풍부한 m / z 711 이온은 비 환원성 말단의 Xyl 잔기의 손실 말단 측쇄 아 잔기의 손실에 의해 하나에 의해 생성 될 수있다. 얻어진 스펙트럼에서 진단 Y의 m / z 391 이온의 손실로부터 생성 될 수있는 세 개의 비 환원 RE Xyl의 올 잔기 또는이있는 RE 올리고당의 측쇄 아 잔기를 가지는 RE 올리고당으로부터 단부 Xyl 잔류 재생 에너지 Xyl의 올 잔류 물에서 2 Xyl 잔류 물에 사이드 체인 아라 잔류 물. 공식적인 가능성이있다하더라도 그와 같은 다른 구조,이 야기 할 것 4 -Xyl의 올, 및 (아라) Xyl-Xyl-Xyl-Xyl의 Xyl 이러한 구조 이온 단편은 각각 분 지점에 인접하는 글리코 시드 결합에서 절단이 저하하거나하지 않을 어느 다당류을 절단하는 데 사용되는 엔도 - 크 실라 아제의 특이성으로 고려 대상에서 제외된다. 대응하여, 진단 Y의 m / z 551 이온의 손실을 발생시킬 수있는 두 개의 비 환원 RE Xyl의 올 잔기 또는 측면을 가진 RE 올리고당 하나의 측쇄 아 잔기를 가지는 RE 올리고당으로부터 단부 Xyl 잔류 끝에서 두 번째 Xyl 잔류 물에 체인 아라 잔류 물. 따라서, 네 개의 가능한 이성질체 구조를 제안 할 수있다 (도 3 : I, II, III 및 IV). 풍부한 Y 이온 m / z 377 (그림 3 참조 : 1a 및 IIA)과 B 이온 m / z를 503 (그림 3 참조 : IA, IB, 부가가치세 및 IVb 족) 이성질체 전구체 m의 추가 조각에서 생성 된/ z 711 이온이 스펙트럼에서 관찰된다. P의 이성질체 전구체 m의 분열에 의해 기록 된 ESI-MS (3) 스펙트럼 (그림 3) / z 711 이온 m에서 주요 피크를 포함 / z 537 (Y 이온 2 + Xyl이 상처와 올; IA 이온 전구체로부터 생성 , IB, IIA, IIB, Ⅲa에, IIIb의 부가가치세와 하나의 흉터와 P 1 + Xyl의 IVb 족) 및 m / z 391 (Y 이온, IIB, Ⅲa에, IIIb의 부가가치세 이온 전구체로부터 생성 IVb 족). 이러한 두 주요 피크 (m / z 537 m / z 391)는 의사의 분열로부터 생성 된 이성질체 전구체 m / z 711 이온에서, 하나, 둘, 각각 단자 Xyl 잔기 비 환원성의 손실에 의해 발생 될 수있다 -molecular 부모 이온 m / ESI-MS 2시 Z 885 (P 4 + Xyl의 올). P의 m에서 상대적으로 낮은 풍부 피크 / z 377 (Y 이온 1 + Xyl이 상처와 올하며 precurso에서 발생연구 이온 IA 한 흉터와 P 2 + Xyl의 IIA) 및 551 (Y 이온, IB 및 IIB 이온 전구체로부터 생성 된)이 스펙트럼에서 관찰되었다.

이성체 전구체 m / z의 분열의 ESI-MS (4) (551) 이온이 m에서 주요 피크를 포함 / z 377 (P의 Y 이온이 흉터와 1 + Xyl의 올)m / z 391 (P 1의 Y 이온 전구체 구조 이온 I 및 II에서 발생하는 하나의 흉터 Xyl 올) +. 양쪽에 부착 아 측쇄 다시 Xyl 그러므로 집단 증거는 RE의 글리코 서열 (도 3II 진단 단편화 통로 m / z 885 → 711 → 551 → 391)에 RE Xyl의 올 잔기에 부착 된 아 측쇄 구성 제안 올과 (RE Xyl의 1 Xyl 잔류 물) 끝에서 두 번째 Xyl의 잔류 물 (진단 분열 통로 m / z 885 → 711 537 → 391 →도 3I) 및도 3III)는, 아라 사이드 체인은 끝에서 두 번째 RE Xyl의 올에서 (1 Xyl) Xyl의 잔류 물 (진단 분열 통로 m / z 885 → 711 → 537 → 377에 연결 아라 사이드 체인은 RE Xyl의 (그림 3IV)에서 2 Xyl 잔류 물에 부착.

[아 F - - (1 → 3) (+/-)는 -Xyl P - (1 → 4)이 이온의 존재가 제안 이성질체 구조 I, II, III 및 IV 중립 RE 당사슬 구조를 확인 - [아라 F - (1 → 3)] (+/-) -Xyl P - (1 → 4) - [아라 F - (1 → 3)] (+/-) -Xyl 페이지.

당-O-메틸화 2AB의 ESI-MS (2) 스펙트럼은 fragm에서 생성 RE 올리고당을 표시m의 준 분자 [M + 나]의 [슬라이드 쇼] + 이온 / z 871 (P 4 + 2AB)는 그림 4.이 스펙트럼은 m / z 697 (P 하나 3 + 2AB에서 가장 풍부한 Y 이온을 포함에 표시됩니다 흉터) 각각 중 1, 2 또는 3 개의 비 환원 pentosyl 잔기의 손실에 의해 생성 된 m / z 537 (P 하나 흉터 하나 흉터) 및 m / z 377 (P 1 + 2AB 2 + 2AB). 제 m / z 697 이온 두 단자 Xyl 잔기의 손실에 의해 발생 될 수있는 비 환원성 말단의 Xyl 잔기 또는 m / z 537 이온 반면 단말 아 잔기의 손실에 의한 손실에 의해 발생 될 수있다 . 진단 프래그먼트 통로 (m / z 871 697 → 377 → 537 →)를 RE에서 선형 비 - 분지 자일란 백본 올리고당 (들)의 존재는 의사 - 분자 이온 (M)에 대응하는 것을 제안 / z 871 (P 4 + 2AB ). 그러나 선형 않은 지형 xylosyl 백본 (P 4 + 2AB)는 susce입니다더 소화 ptible 사이트에 특정 endoxylanase. 따라서 두 개의 이성질체 m / z 697 이온이 존재할 수 있습니다. 따라서 두 가지 이성질체 구조가 제안되고있다 (그림 4 : I 및 II). 이러한 이성질체 구조에서 Y와 B 이온은 각각 빨간색과 검은 색으로 표시됩니다. , m, 이성체 전구체 m / z의 분열에서 기록 된 ESI-MS (3) 스펙트럼은 697 이온 (그림 4, 구조 IA, IB, IIA 및 IIB이 상처 P 2 + 2AB의 Y 이온) m / z에게 523 이온을 생성 / z 363 이온 (두 개의 상처와 P 1 + 2AB의 Y 이온도 4, 구조 IIA) m / z 377에서와 Y 이온 (한 흉터와 P 1 + 2AB도 4, 구조 1A 및 1B). m / z 377에서 단편 이온은 단지 I 및 m / z 363에서 단편 이온만을 제시 II 구조에서 발생할 수있는 제안 된 구조에서 발생할 수있다. 두 이온의 동시 존재를 제안 구조를 확인 I 및 II. 따라서 밀 배젖의 AX를의 크 실란 체인의 RE의 글리코 순서는 RE Xyl의 잔류 물 (조각 경로의 m / z 871 → 697 → 523 → 363) 및 / 또는 끝에서 두 번째 Xyl의 잔류 물 (조각 경로의 m / z에 부착 된 아라 가지로 구성 871 → 697 → 523 → 377).

AX를의 NMR 분석

MS 기반 분석 아노 머 구성 (α / β) 효소 적 또는 물리적 (예를 들면, NMR)을 포함하는 다른 방법에 의해 수득되어야하는 당류의 D / L의 어느 하나의 구성에 대한 정보를 제공하지 않는다. 특성 RE 감소 테트라 사카 라이드 (Xyl-라곤 - GALA-Xyl의 올)와 heteroxylans를 들어, NMR 스펙트럼이 RE 올리고당의 식별 및 시퀀싱을 선도 아노 머 신호가 포함되어 있습니다. 우리는 DET 단일 단계 방법으로 600 메가 헤르츠 (1D) 1 H-NMR 스펙트럼의 사용을 설명아노 머 구성 (α / β)와 설탕의 D / L 구성을 포함하여 KOH-졸 프랑의 밀 배젖 AX의 RE 올리고당의 완전한 글리코 순서를 족제비. 공진은 밀 AX 올리고당 17-18 공표 할당 (도 5, 표 1)에 기초하여 할당 하였다. 밀 내배유로부터 추출 AX의 1 H-NMR 스펙트럼은 O-3 위치에 부착되는 말단 α-L-아라 F 잔기의 양자에 할당 5.39, 5.27 및 5.22 ppm의시 아노 머의 화학적 이동에 의해 지배 단독 분기 (1,4) -β-Xyl 페이지 백본 잔류 물 (T-α-L-아라 F → 3 S) 및 O-3 모두와 O-2 위치 (T-α-L-아라 F → 3 D 및 이중 분기 (1,4) -β-Xyl 페이지 백본 잔류 각각 (그림 5와 표 1)의 T-α-L-아라 F → 2 D).

F → 3 S + D) α-L-아라 (F)의 H1 신호 측쇄 이중 지형 β-D-Xyl 피 인접하여 단독 지형 β-D-Xyl 피 잔기의 O-3 위치에 부착. 5.29에서 신호가 할당된다 (T-α-L-아 F 3 D + D) 배로 지형 β-D-Xyl의 O-3 위치에 연결된 α-L-아 F 측쇄 H1 신호 이중 분기 β-D-Xyl P는 인접한과 페이지 잔류. 5.24에서의 신호가 할당된다 α-L-아라 F 사이드 체인의 H1의 신호에 연결 (T-α-L-아라 2 D + D가 F) 이중 분기 β-D-Xyl 피 인접으로 이중 분기 β-D-Xyl 피 찌꺼기의 O-2 위치.

그림 1

<FO P 클래스 = "jove_content"실험적 접근의 유지-together.within 페이지를 = "1"> 그림 1. 요약 생성, 정화 및 환원 말단 (RE)를 시퀀싱에 사용 된 전략의 요약 및 내부 영역 올리고당. 밀의 배유의 아라비 (AX를)가 표시됩니다. 이 수치는 Ratnayake 등의 등의 허가를 재현 할 수 있습니다. (2014) 2. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. MALDI-TOF MS (A) 및 ESI-QTOF MS (B - E) W-졸 AX를 레이블 2AB에서 endoxylanase 발표 한 천연 올리고당의 분석 그림 1. MALDI-TOF MS 스펙트럼에 설명 된대로 : (A) ( 신호 A를 [M + 나] + 부가 물 이온)로 식별 재; RE에서 파생 된 C = P 1-6 + 2AB, 내부 영역 올리고당에서 파생 된 B = P 5-10 (신호가 [M + NH 4] + 부가 이온으로 식별) 다음 ESI-QTOF MS 크로마토 그램의 선택 이온 스캔 D = ESI-Q-TOF 전체]는 올리고당 (신호가 [M + 나] + 부가 물 이온으로 식별되는) 산성 올리고당으로부터 유도 & P 3-8 G (신호는 [M + H] + 부가 물 이온으로 식별) 3.59-4.05 분 사이 지역 (신호가 모두 [M + 나 +와 [M + NH 4] + 부가 이온으로 식별됩니다 스캔 스펙트럼 : 3.10-3.48 분, E = ESI-Q-TOF 전체 검사 스펙트럼 사이의 영역 ); P = pentosyl 장치 (아라 또는 Xyl 중) G = uronosyl 잔기 (GlcA); 단 올리고당을 감소 = RE; 2AB = 2 아미노 벤즈 아미드; EIC : 추출 된 이온 크로마토 그램. 광고 / 53748 / 53748fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3. ESI-MS 2, ESI-MS (3) 및 ESI-MS 당-O-메틸화 RE 중성 글리코의 알디 톨의 4 스펙트럼 (P 4 + Xyl의 올) - 신호가 [M으로 할당 m / z 885 나트륨 +] + 유사 분자 이온 부가 물. 정의 된 질량에 대한 몇 가지 이성질체 구조 이성질체 구조에 후 가능으로 Y와 B 이온은 각각 빨간색과 검은 색 표시되어 있습니다. 분열 이벤트에 의해 생성 된 각각의 "상처"는 실선으로 표시됩니다. X = Xylosyl 잔류 물; A = Arabinosyl 잔류 물. ESI-MS (3) 스펙트럼 Ratnayake 등의 허가를 재현 할 수 있습니다. (2014) 2.748fig3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
당-O-메틸화 2AB의 그림 4. ESI-MS (2) 및 ESI-MS (3) 스펙트럼은 중성 RE 올리고당 표시 (P 4 + 2AB) - m / 신호가 [M + 나]로 할당 된 Z 871 + 의사 -molecular 이온 부가 물. 정의 된 질량에 대한 몇 가지 이성질체 구조 이성질체 구조 가능하다 바와 같이, Y 및 B 이온은 각각 빨간색과 검은 색으로 표시됩니다. 분열 이벤트에 의해 생성 된 각각의 "상처"는 실선으로 표시됩니다. X = Xylosyl 잔류 물; A = Arabinosyl 잔류 물. 이 수치는 Ratnayake 등의 등의 허가를 재현 할 수 있습니다. (2014) 2. 큰 적이있는을 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 이온.

그림 5
KOH- 솔 천을 endoxylanase의 처리에 의해 생성 된 AX 올리고당의 600 MHz의 1D 1 H-NMR 스펙트럼을도 5 아노 머 영역 2.225 ppm으로 아세톤 내부 표준에 언급 H 화학 시프트. T-α-L-F 아 3 S 다음 단독 지형 β-D-Xyl 피 잔기의 O-3 위치에 연결된 α-L-F측쇄 H1 신호; T-α-L-아라 F → 2 D : 배로 지형 β-D-Xyl 피 찌꺼기의 O-2 위치에 부착 α-L-아라 F 사이드 체인의 H1 신호; T-α-L-아라 F → 3 D : 배로 지형 β-D-Xyl 피 찌꺼기의 O-3 위치에 부착 α-L-아라 F 사이드 체인의 H1 신호; 티-α-L-아 F 3 S + D :로 단독 지형 β-D-Xyl 피 잔기의 O-3 위치에 연결된 α-L-아 F 측쇄 H1 신호 이중 분지 인접 β-D- Xyl의 피; T-α-L-아라 F → 2 D + D :로 이중 분기 β-D-Xyl 피 찌꺼기의 O-2 위치에 부착 α-L-아라 F 사이드 체인의 H1 신호는 이중 β-D 분기 인접한 -Xyl 피; T-α-L-아라 F → 3 D + D :로 이중 분기 β-D-Xyl 피 찌꺼기의 O-3 위치에 부착 α-L-아라 F 사이드 체인의 H1 신호는 이중 β-D 분기 인접한 -Xyl 피; 2-α-L-아라 F → 3 S 다음 단독으로 분기 β-D-Xyl 피 찌꺼기의 O-3 위치에 부착이-α-L-아라 F 사이드 체인 잔류 H1 신호; 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전.

당 잔기 H-1 / C-1 H-2 / C-2 H-3 / C-3 H-5 / C-4 H-5 당량 / C-5 H-AX 5 / C-5
T-α-L-Araf → 3 S 5.396 / 107.6 4.16 3.95 4.3 3.82 3.72
T-α-L-Araf 5.415 / 4.18 3.95
→ 3 S + D
T-α-L-Araf → 2 D 5.223 / 4.16 3.97 3.82 3.74
T-α-L-Araf → 2 D + D 5.243 / 4.16 3.98
T-α-L-Araf → 3 D 5.272 / 108.9 4.18 3.96 4.26 3.79 3.74
T-α-L-Araf → 3 D + D 5.298 / 4.18 3.96
2-α-L-Araf → 3 S 5.548 / 106.4 4.27 4.06 4.3 3.82
(감소) - Xylp α 5.185 / 91.9 3.55 3.72
(감소) - Xylp β 4.580 / 96.6 3.29 3.48 3.64 4.06 3.38
β-4-Xylp 4.470 / 3.32 3.58
β -4- Xylp + S 4.461 3.31 3.56 3.75 4.08 3.36
β-4-Xylp + D 4.448 3.31 3.56 3.75 4.08 3.36
β-3,4-Xylp 4.518 / 3.44 3.85
S + β-3,4- Xylp 4.514 / 3.47 3.75 3.86 4.14 3.43
D +에의 β-3,4-Xylp 4.505
β-3,4-Xylp + S 4.492 3.45 3.74
β-3,4-Xylp + D 4.482 3.45 3.74
β-2,3,4-Xylp 4.638
S + β-2,3,4-Xylp 4.627 3.59 3.87 3.88
D의 +의 β-2,3,4-Xylp 4.616
β-2,3,4-Xylp + S 4.593
β-2,3,4-Xylp + D 4.593
화학 변화가 내부 아세톤에 대해보고, 2.225을 Δ.
S는 단독으로 β-Xylp 분기 =
S + D = 단독 분기 β-Xylp + 이중은 β-Xylp 분지
D는 이중 β-Xylp 분기 =
D + D = 이중 분기 β-Xylp + 이중은 β-Xylp 분지

밀 배젖 KOH 졸 천을 endoxylanase의 처리에 의해 생성 된 xylo 올리고당 1. 1 H-NMR 신호

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Discussion

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대부분의 매트릭스 상 세포벽 다당류는 겉으로는 무작위로 매우 다양있는 식물 종, 발달 단계 및 조직 유형 3에 따라 (글리코 및 비 글리코 잔류 모두 포함) 백본을 교체했습니다. 다당류 이차 유전자 산물이기 때문에 그 서열은 주형 유도되지 않고, 핵산과 단백질의 존재와 같은 단일 분석 방법들은 시퀀싱, 따라서 존재하지 않는다. 정제 된 링크 관련 가수 분해 효소의 유용성은 크로마토 그래피 분별 될 수 올리고당 다당을 분해하는 강력한 도구를 제공하고, 화학적 및 물리적 방법과 조합하여 사용될 때 완전히 서열 분석 하였다. 도전은 성공적이 될 해결하기 위해 여전히 원래의 다당류 서열 - 하나에 이러한 복잡한 혼합물을 다시 조립하는 것입니다.

여기에서 우리는 접근 방식 (응용 캘리포니아의 그 순서를 설명N 설립 효소 적, 화학적 환원 말단 (RE) 및 heteroxylans의 내부 영역 글리코 서열 (들) 모두의 구조적 특성에 대한 물리적 기술의 통합에 의존하는) 다양합니다. 올리고당을 특성화하는데 매우 유용 입증되었다 설명을 생략 추가적인 상보 기술은 듀프리 (19) 그룹에 의해 개발 된 PACE (탄수화물 겔 전기 영동에 의해 다당류 분석)이며, 기기를 사용할 수있는 경우 용이이 프로토콜에 통합 될 수있다. 또한, LC 크로마토 변형 또한 / 단일 단계로 분리하는 당사슬 태그 모두 태그 화의 가능성을 제공 RP 크로마토 그래피 탠덤 인라인 소수성 상호 작용 크로마토 그래피 (HILIC)로서 유용 할 수있다. 기술은 효소 (endoxylanase) 가수 분해 전의 heteroxylan 사슬의 환원 말단 (RE) (2- 아미노 벤즈 아미드 (2AB) 포함)에 태그에 의존한다. 두 개의 서로 다른 접근 방식 (요약 참조그림 1)을 채택하고 있습니다. 처음에는 그대로 W 졸 AX를 원래 RE 골격 쇄 당 잔기 태그를 2AB로 처리하고 2AB 표지 RE 각각 올리고당을 감소 내부 영역의 혼합물을 생성하는 endoxylanase로 처리 하였다. 두 번째 접근에서, KOH 졸 천을 먼저 2AB 연속적으로 표시되는 당사슬의 혼합물을 생성하는 가수 분해 endoxylanase. 이 환원제, 수소화 붕소 나트륨 (에 NaBH 4)에 함유되는 알칼리 추출 동안 글리코-알디 톨로 감소했기 때문에 후자의 시나리오에서, KOH 졸 AX 원래 RE는 2AB으로 표시되지 않는다. 따라서, 2AB 표지 올리고당은 2AB 태그없이 RE의 알디 톨이 포함됩니다 "내부"올리고당 원래 RE 올리고당에서 시작되며, 이후 자일라나 소화를 생성한다 (그림 1 참조). 이 접근법은 또한 다당류 U의 다른 클래스에 적용 할 수있다(가능) 적절한 엔도 - 가수 분해 효소를 노래.

N MS에 당 O 메틸화 올리고당 기상 분열 중에 생성 된 비 - 메틸화 히드 록 실기 (들)을 14Da 질량 차이 "흉터를 제공하기 때문에 MS 기반 방식은 크게 endoxylanase 처리 후에 생성 된 올리고당의 메틸화에 의해 향상된 "즉 단독 MS 데이터로부터 만들어 질 수 없다. 분지 패턴의 식별 및 글리코 시퀀스 도와 5-6 pentosyl 잔기 (및 당 잔기)의 ID를 사용하지만 지식을 가지는에서 비롯 될 수있다 분자의 조성물; 이 사용할 수없는 경우 다음 관련 단당류와 연계 분석은 MS의 n은 이러한 과제를하기 전에 수행해야합니다. 또한 KOH 졸 프랑에서 생성 RE 산성 올리고당 알디 톨에 대응하는 신호 (Xyl-3 -MeGlcA 자일리톨 : m / z 761) 및 CHaracteristic 쌍자엽 크 실란 RE의 글리코 시퀀스 (Xyl이 -Rha - 갈라 - 자일리톨 : m / z 761), 존재하는 경우, 기본 형태로 동일한 분자 질량은 모두로 구별 할 수있는 것은 아니지만 자신의 MS 단편화 구별 될 수있다 ( 가장 메틸화 올리고당에 수행되는 MS n)의 스펙트럼. 최종적으로, MS 기반 기술 (α / β)가 글리코 시드 결합 또는 sugars-의 D / L 구성 이것을 포함한 다른 방법에 의해 결정되어야 아노 머 구성 중 하나에 대한 정보를 제공 할 수없는 (효소 적 및 물리적 NMR).

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 aminobenzamide (2AB) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) A89804
sodium borohydride (NaBH4) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 247677 Hazardous, handle with care
sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 156159 Hazardous, handle with care
endo-1,4-β-Xylanase M1 (from Trichoderma viride) (120101a) Megazyme (www.megazyme.com) E-XYTR1
Deuterium Oxide (D2O) Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 151882
Freeze dryer (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus)
RP C18 Zorbax eclipse plus column  Agilent  (2.1×100 mm; 1.8 µm bead size) 
MicroFlex MALDI-TOF MS   (Model - MicroFlex LR) (Bruker Daltonics, Germany)
(ESI) -(QTOF) MS   (Model # 6520) (Agilent, Palo Alto, CA )
ESI-MSn  - ion-trap  (Model # 1100 HCT) (Agilent, Palo Alto, CA).
Bruker Avance III 600 MHz -NMR Bruker Daltonics, Germany
Topspin (version 3.0)-Biospin- software  Bruker 
GC-MS (Model # 7890B) Agilent 

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References

  1. Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B., Bacic, A. Determining the polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. 7, 1590-1607 (2012).
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효소 적, 화학 (메틸화) 및 물리 (질량 분석, 핵 자기 공명) 기법을 사용하여 공장 벽 Heteroxylans의 연속
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Ratnayake, S., Ford, K., Bacic, A. Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques. J. Vis. Exp. (109), e53748, doi:10.3791/53748 (2016).More

Ratnayake, S., Ford, K., Bacic, A. Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques. J. Vis. Exp. (109), e53748, doi:10.3791/53748 (2016).

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