Abstract
이 프로토콜은 단부 (RE) 및 heteroxylans 내부 영역 글리코 서열 (들)을 감소시키는 특성을 위해 사용되는 특정 기술을 설명한다. 탈 먹인 밀 배유 세포벽은 알코올 불용성 (W 졸 천을)로 추출 잔사 (AIR) 1 순차적 Ratnayake 외 기재된 바와 같이 1 M KOH 1 %의 NaBH 4 (KOH 졸 천을)를 함유로서 단리 하였다 등. (2014) 2. 두 개의 서로 다른 접근 방법은 (그림 1의 개요 참조)를 채택하고 있습니다. 처음에는 그대로 W 졸 AX를 원래 RE 골격 쇄 당 잔기 태그를 2AB로 처리하고 2AB 표지 RE 각각 올리고당을 감소 내부 영역의 혼합물을 생성하는 endoxylanase로 처리 하였다. 두 번째 접근에서, KOH 졸 천을 먼저 2AB 연속적으로 표시되는 당사슬의 혼합물을 생성하는 가수 분해 endoxylanase. 모두에서 enzymically 발표 ((UN) 태그) 올리고당W- 및 KOH 졸 FRS는 MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS 및 ESI-MS n의 조합을 사용하여 수행 한 다음 메틸화 모두 천연 및 메틸화 올리고당의 상세한 구조 분석이다. Endoxylanase는 KOH 졸 AX를도 또한 아노 머 구성에 대한 정보를 제공하고, 핵 자기 공명 (NMR)에 의해 특징 분해. 이러한 기술은 적합한 엔도 가수 분해 효소를 사용하여 폴리 사카 라이드의 다른 클래스에 적용될 수있다.
Introduction
Heteroxylans는 잔디의 주요 벽과 모든 피자 식물 3-6의 2 차 벽의 주된 비 셀룰로오스 다당류있는 다당류의 가족입니다. 크 실란 백본은 유형과 글리코 (글루 쿠 론산 (GlcA), 아라비 노스 (Araf)) 및 비 - 글리코 (O 아세틸, 페룰 산) 조직 유형, 발달 단계 및 종 7에 따라 잔류와 대체 패턴에 차이가 있습니다.
밀에서 벽 (밀 및 aestivum L.) 배젖은 주로 아라비 (AX를) (70 %) 및 (1 → 3)로 구성되어 있습니다 (1 → 4) -β-D 글루칸 (20 %) 셀룰로오스 heteromannans 소량으로 (2 % 씩) 8. 자일란 백본 주로 (주로 O-2 위치 및 정도는 덜 O-3 위치)로 치환 된 모노 - 및 디 - 치환 된 α-L-아와 (O-2, O-3 위치) 다양 - 미 치환 될 수 있고 F 잔류 9. 환원 말단 (RE) 이종의(예를 들면, 가문비 스 (Picea의 구상)) (예를 들어, 애기 장대) dicots에서 크 실란 10 겉씨 11 특징 테트라 사카 라이드의 글리코 시퀀스를 포함 -β-D-Xyl 피 - (1 → 3) -α-L-라곤 피 - (1 → 2) -α-D-갈 P는 A- (1 → 4) -D-Xyl 피. heteroxylan 생합성 기능 (생물 산업)를 이해하기 위해서는 충분히 종류 및 치환 패턴뿐만 아니라 환원 말단 (RE)의 순서를 이해하는 자일란 골격을 시퀀싱하는 것이 중요하다.
단부 (RE) 및 heteroxylans 내부 영역 글리코 서열 (들)을 감소시키는 구조 특성에 사용될 특정 기술이 논문에 기재되어있다. 기술은 효소 (endoxylanase) 가수 분해 전의 heteroxylan 사슬의 환원 말단 (RE) (2- 아미노 벤즈 아미드 (2AB)에) 태그를 형광체에 의존한다. 특히 RE 서열이 접근했다먼저 뉴욕 실험실 10,12-13에 의해보고하지만 지금은 격리 자신의 소스의 독립적 인 모든 heteroxylans에 동일하게 적용 할 설립 기술의 조합을 내부 영역의 염기 서열을 포함하도록 확장하고 있습니다. 이 방법은 (가능) 적절한 엔도 가수 분해 효소를 사용하여 폴리 사카 라이드의 다른 클래스에 적용될 수있다.
설명한 바와 같이, 본 연구에서는 디 먹인 밀 배유 세포벽 물 (W 졸 천을)로 추출 알콜 불용성 잔사 (AIR)와 순차적으로 분리하고 1M KOH 1 %의 NaBH 4 (KOH 졸 프랑)을 함유 한 Ratnayake에서 외. (2014) 2. W- 및 KOH 졸 FRS 모두로부터 방출 된 올리고당은 함께 HPLC로 ESI-QTOF-MS 결합 MALDI-TOF-MS의 조합을 사용하여 수행 한 다음 메틸화 모두 천연 및 메틸화 올리고당의 상세한 구조 분석이다 RP C-18 컬럼을 사용하여 온라인 크로마토 그래피 분리및 ESI-MS 없음. Endoxylanase는 KOH 졸 AX를 또한 핵 자기 공명 (NMR)에 의해 분석되었다 분해.
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Protocol
2- 아미노 벤즈 아미드와 W-졸 AX를의 감소 끝 1. 라벨은 (RE) 설탕 잔류 물 (2AB)
- 이들 형광 유도체 다당류 골격 사슬의 환원 말단을 변환하는 65 ° C에서 2 시간 동안 1 M의 NaBH 3 CN (시아 노 수소화 붕소 나트륨) (PH 5.5)의 존재하에 2AB (0.2 M)과 W-졸 AX를 부화.
주의 :이 물과 접촉 할 때의 NaBH 3 CN 독성 시아 나이드 기체를 방출 할 때 다음 단계 퓸 후드에서 수행되어야한다.- 을 NaBH 3 CN (62.8 mg)을 칭량하고, 1 M의 NaBH 3 CN 용액을 조제 물에 microcentrifuge 관 (1.5 mL) 중의 (1 ㎖)에 녹인다. (65)에서 가열 한 M을 NaBH 3 CN 용액 (1 ml)에 2AB 시약 (27.2 ㎎)을 녹이고 ° C 10 % 아세트산으로 pH 5.5, 반응 혼합물 (0.2 M 2AB 1 M의 NaBH 3 CN)의 pH를 조정.
- W-그래서에 반응 혼합물의 200 μL (0.2 M 2AB 1 M의 NaBH 3 CN)를 추가캡 유리관에서 패 AX를 (1 mg) 및은 볼텍스 믹서를 사용하여 혼합한다. 65에서 2 시간 동안 품어 흄 후드에서 C를 °. RT에 정지 쿨 4 권을 추가합니다. 무수 에탄올.
- 감기 저장소에 다당류를 침전 (4 ° C) O / N을 정지 놓습니다.
- 원심 분리기 (1,500 XG, 10 분, RT)은 상층 액을 제거합니다. 각 세척 사이에 원심 분리, 무수 에탄올 (4 배), 아세톤 (1 배) 및 메탄올 (1 배)로 광범위하게 펠렛을 씻으십시오. 40 ° CO / N에서 진공 건조.
참고 : 광범위한 세척도 잔류 2AB을 제거합니다.
2 AB 레이블 된에서 Xylo 올리고당의 2 세대 W-졸 AX를
- 2AB는 마이크로 원심 튜브에서 아세트산 나트륨 완충액 500 μL (100 mm의 pH를 5) (1.5 ml)에 W-AX를 졸 (1 mg)을 표지 녹인다. endoxylanase의 4 단위 (GH (11), [M1]) 추가 37 부화 16 시간 동안 C를 °.
- 반응 믹스트을 가열하여 효소 활성을 파괴끓는 물을 욕조에 10 분 동안 URE. RT에 정지 쿨과 모자를 유리 튜브에 전송할 수 있습니다. 4 권을 추가합니다. 절대 에탄올과 냉장의 서스펜션을 배치 (4 ° C) O / N은 소화되지 않은 다당류를 침전한다.
- 원심 분리기 (1,500 XG, 10 분, RT)은 소화되지 않은 다당류 (펠렛)를 분리하고 endoxylanase은 (뜨는) xylo 올리고당을 생성합니다. 깨끗한 유리 튜브에 뜨는을 가만히 따르다과 따뜻한 물을 욕조 (40 ° C)에 배치합니다.
- 종료점 부피 (~ 500 μL)을 질소 기류하에 에탄올을 증발시켰다. 4 시간 동안 -80 ° C에서 뜨는을 동결하고 xylo 올리고당을 복구하는 동결 건조기에서 냉동 뜨는을 건조.
KOH-졸 AX를하고 2AB의 라벨에서 Xylo 올리고당의 3 세대
- (섹션 2.1-2.4) 전술 한 바와 같이 xylo 올리고당을 생성하는 endoxylanase와 KOH-졸 AX를 (GH (11), [M1]을) 취급합니다.
- endox 치료ylanase은 (섹션 1.1.1-1.1.2) 전술 한 바와 같이 2AB 반응 혼합물 (0.2 M 2AB, 1 M을 NaBH 3 CN)과 KOH-졸 AX를에서 xylo 올리고당을 생성합니다.
- 깨끗한 유리 튜브에 뜨는을 가만히 따르다과 따뜻한 물을 욕조 (40 ° C)에 배치합니다. 종료점 부피 (~ 500 μL)을 질소 기류하에 에탄올을 증발시켰다. 4 시간 동안 -80 ° C에서 뜨는을 동결하고 xylo 올리고당을 복구하는 동결 건조기에서 냉동 뜨는을 건조.
4. MALDI-TOF-MS
- MALDI-매트릭스 솔루션의 제조
- 튜브 (MALDI 매트릭스 용액)을 0.1 % 포름산을 함유하는 50 % 아세토 니트릴 (500 ㎖)에 2,5- dihydroxbenzoic 벤조산 (DHB)의 작은 국자를 추가한다. 신속 용해 경우, DHB의 또 다른 작은 국자를 추가, 소용돌이를 사용하여 섞는다. 참고 : MALDI-매트릭스 솔루션의 최적 농도는 10 μg의 인 / μL -1.
- MALDI-대상 플레이트의 제조
- aqueo을 증착우리가 (기본) 샘플 (5 ~ 10 μg의)을 올리고당 MALDI-타겟 판 위에 (W-졸 및 / 또는 KOH-졸). 별도의 팁을 사용하여 0.3 ㎕를 MALDI-매트릭스 솔루션을 추가로 pipetting 아래로 섞는다. 혼합물을 실온에서 건조하도록 허용합니다.
참고 : 제대로 건조 샘플이 자리의 중심을 향해 가리키는 긴 바늘 모양의 결정으로 구성되어야합니다. 입금 스티커 및 / 또는 더럽혀진 경우 샘플이 너무 농축 또는 그의 염으로 구성 될 수도 있고, 이러한 침전물은 양호한 스펙트럼을 생성 할 가능성이 샘플을 추가로 정제한다. - MS는 소스로 표적 판을 소개하고 양 (+ 필자) 이온 모드로 동작한다. 이온 소스 (1)에서 19.0 kV로, 이온 소스 (2)에서 16.3로 kV의 가속 전압을 조정은 70 % 이상으로 레이저 출력을 조정한다. MALDI-대상 접시에 샘플 지점을 선택하고 레이저 촬영을 시작하기 위해 시작을 클릭합니다.
참고 : 대상의 모든 영역 신호를 생성하지 않습니다. 특정 장소 만에 하나 때문에 몇 레이저 샷에 대한 신호를 줄 것이다샘플 / 매트릭스 혼합물 또는 결정의 특성 고갈.- 만족스러운 신호 - 대 - 잡음을 구하는 취득 평균 동안 약 200 무작위 스펙트럼을 타겟의 상이한 영역에 레이저를 이동.
- aqueo을 증착우리가 (기본) 샘플 (5 ~ 10 μg의)을 올리고당 MALDI-타겟 판 위에 (W-졸 및 / 또는 KOH-졸). 별도의 팁을 사용하여 0.3 ㎕를 MALDI-매트릭스 솔루션을 추가로 pipetting 아래로 섞는다. 혼합물을 실온에서 건조하도록 허용합니다.
5. ESI-QTOF-MS
- RP를 사용하여 전기 분무 이온화 (ESI) 온라인 크로마토 그래피 분리와 비행 (QTOF) MS 악기의 사중 극자 시간과 함께 나노 HPLC를 사용하여 endoxylanase 생성 된 올리고당 (기본)을 분석 C-18 컬럼 (75 μm의는 X 150mm, 3.5 μm의 비드 크기).
- 유리 병에 endoxylanase 생성 된 수성 올리고당 혼합물을 전송하고 HPLC 오토 샘플러에 배치합니다. 60 분에 걸쳐 각각 아세토 니트릴의 이동상을 0.1 % (v / v)의 물, 포름산 0.1 % (v / v)의 포름산 5-80%의 용출 구배를 프로그램.
- 0.2 μL / 분의 유속을 조정한다. 스캔 범위에서 긍정적 인 이온 모드를 조정커튼 가스 (10) GS1 4 원 온도 100 ℃ 이온 분무 전압 2300 V, 잠재적 50 디 클러스터링 : 300-1,600 m / z 다음과 같이 초 ESI 소스 조건을 사용하여 0.5g / 주사의 주사 속도 V.를 실행 LC 크로마토 그래피 프로그램과 용출 올리고당. 그 결과 총 이온 크로마토 그램 (TIC)는 소프트웨어에 의해 자동으로 저장됩니다.
- 저장된 TIC를 열고 추출 크로마토 그램을 선택합니다. 명령 줄에서 예상 질량 (예를 들어, 271, 403, 535, 667, 799 및 931m / Z)를 입력합니다. 입력을 클릭하여 스캔 크로마토 그램. 제조자의 지시에 따라 (14) 소프트웨어를 사용하여 ESI-QTOF MS 크로마토 그램 데이터의 선택 이온 스캔 처리한다.
6. ESI-MS N
- 주사기를 사용하여의 nanospray 팁에 50 % 아세토 니트릴 샘플 당 O 메틸화 올리고당 1~2 μL를 넣고 (Pettolino 외. (1)에 의해 기술 된 바와 같이 메틸화). 손질유리 커터를 사용하여 나노 분무 팁은 MS에 부착 된 개별 나노 분무 홀더에 맞게.
- 긍정적으로 예상 질량 범위 (200-1,500 m / z)와 커튼 가스 (10), ionspray 전압 1,900 V의 극성에 따라 질량을 설정합니다.
- 관련 창을 열고 총 이온 스캔 (ESI-MS 1)를 얻었다 데이터 파일 이름을 입력 획득 버튼을 누릅니다. 그 다음 STOP 버튼을 누릅니다.
- 관심의 피크를 단편화하는 제품 이온에서 스캔 유형을 변경합니다. 관심의 질량을 입력합니다 (예 : 885m / z) 조각화 및 질량 범위 (200~900m / Z)를 조절합니다. 획득 버튼을 누르면 부모 이온의 전체 조각 (885m / Z)를 달성하고 조각 이온 스캔 (ESI-MS 2) 취득 (위 / 아래로 화합물 탭) 충돌 에너지를 조정합니다.
- 관심 (예를 들어, 711m / z)의 조각 이온의 질량을 입력하고 질량 범위를 조정 (200~720m / z). 획득 버튼의을 눌러전구체 이온의 전체 조각 (711m / z)를 달성 단편 이온 스캔 (ESI-MS (3))를 취득하는 충돌 에너지를 조정 거라고.
7. H 1 NMR 분광학
- D 2 O의 플라스틱 시험관 (1.0 ㎖, 99.9 %) (15 ml)에 올리고당 endoxylanase 생성 혼합물 (KOH 졸, 기본 체) (~ 500 μg의)을 녹인다. 4 시간 동안 -80 ° C에서 현탁액을 동결하고 xylo 올리고당을 복구하는 동결 건조기에서 동결 된 현탁액을 건조.
- 완전 D 2 O로 H 2 O를 교환하기 위해 7.1 회 반복
- D 2 O에 (0.6 ml를, 99.9 %)을 건조 올리고당을 분해하고 내부 표준으로 아세톤 0.5 μL (D 2 O 5 %)를 추가합니다. NMR의 샘플 튜브에 중수 소화 올리고당을 전송합니다.
- 상단에 의한 NMR 튜브를 포함하는 샘플을 잡고 플라스틱 스피너에서 샘플 튜브를 삽입합니다. 샘플 깊이 게이지의 회 전자를 놓습니다. 고름H는 샘플 상하 깊이 게이지의 중심선이 동일하도록 시료의 깊이를 조절하기 위해 시료 튜브를 당기거나.
- 깊이 게이지를 제거하고 냉동 프로브가 장착 된 600 MHz의 NMR 분광계에 부착 된 자동 샘플러로 샘플을 삽입합니다.
- 로그인 및 오픈 분광계 제어 소프트웨어. 샘플 파일 이름을 입력합니다. 기존 데이터 집합을 열고 다음 새 이름으로 저장 "EDC"명령을 사용합니다. 자동 샘플러의 샘플의 위치 번호를 입력하고 "ENTER"키를 누릅니다.
참고 :이 프로브의 상부에 위치한다 자석 구멍에 조심스럽게 샘플 튜브를 드롭 것 "ENTER"버튼을 누르면. - 명령 줄에서 "edte"를 입력하여 원하는 샘플 온도를 설정합니다. 다음 단계로 진행하기 전에 원하는 값에 도달하기 위해 시료 온도 기다린다. 입력 명령 행에서 "잠금"적절한 용매를 선택 (D 2 O). & # 기다립니다(34); 창 하단에 표시 완료 "메시지를 잠급니다.
- 명령 줄에서 "ATMM"를 입력하고 ATMM 메뉴 바의 상단에있는 "최적화"를 클릭합니다. 선택된 채널 (이 경우 1 H)에 대한 조정 및 프로브의 매칭 시작을 선택합니다.
- 균일 한 자기장이 명령 줄에서 "ZG"를 입력하고 입력하여 sample.Acquire 주위에 신호를 얻을 때까지 약간의 조정이 자기장에 대한되는 shimming 프로세스에 대한 명령 줄에서 "topshim"를 입력합니다.
- 2.225 ppm으로 아세톤 내부 표준에 언급 한 H 화학 시프트 제조업체의 지시에 따라 소프트웨어 (15)를 사용하여 스펙트럼을 분석한다.
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Representative Results
AX를가 2AB 표지 RE 올리고당의 혼합물 및 자일란 쇄 (도 1의 내부 영역으로부터 유래되지 않은 표지 (2AB 라벨없는) 올리고당의 시리즈를 생성 W-졸 Endoxylanase 소화 2AB는 표지]에서 Ratnayake 외. 2). 크로마토 그래피 방법의 시리즈는 이성질체의 착체 혼합물을 분별하기 위해 사용된다. 최종적으로, MS 기술은 다음 기술에 의해 해당 MS 서열화 된 이성질체 구조를 식별하기 위해 사용된다. 여기에서 우리는 오히려 접근 방식의 포괄적 인 예보다, 대표을 제시한다.
2AB 표지 네이티브 W 졸 AX를 (도 2A)로부터 유래 당사슬의 MALDI-TOF-MS 스펙트럼 신호는 표지 된 일련 나타내는 매우 풍부한 의사 - 분자 이온 (M)의 직렬 / z 701, 833 및 965를 포함 내부 중립각각 5-7 pentosyl 잔류 물 (P 5-7)와 지역 올리고당. m / z 745, 877, 및 1009에서의 일련의 신호는 P + 4-6 헥사 일 (Hexuronic 산)로하는 표지 된 산성 올리고당 시리즈되어 있음을,이 부분 (도 2A)으로 존재한다. m / z 821과 953에서 의사 분자 이온은 각각 2AB 표지 원래 RE 올리고당의 P 5-6 + 2AB의 존재를 나타냅니다.
RP C-18 HPLC에 의한 올리고당 류의 온 - 라인 크로마토 그래피 분별로 네이티브 올리고당의 ESI-QTOF-MS 분석 한 후,도 2b 및도 2c. 실시 ESI-QTOF-MS 총 이온 추출 선택된 이온 스캔을 도시한다 크로마토 그램 (TIC), W-졸 프랑 AX를에서 endoxylanase 발표 한 올리고당. 신호는 [M + NH 4]로 + m에 할당 된 의사 - 분자 이온 시리즈를 포함/ 각각 5 ~ 10 pentosyl 잔류 물 (P 5-10), (그림 2B)과 내부 영역 중립 올리고당의 시리즈를 대표하는 Z 696, 828, 960, 1092, 1224 및 1356. 여러 이성질체 구조는 정의 된 질량의 올리고당 (ESI-MS N 분석 아래 참조)이 가능하다. 도 2b에서 관찰 된 바와 같이, 분자, 이온 스캔마다 따라서, 다수의 피크들이 가능하다. [M + H] + m에서 / z 271, 403, 535, 667, 799 및 931로 할당 의사 분자 이온은 2AB의 존재 RE 당사슬 시리즈 P에게 + 2AB 1-6 표지 나타내는 각각 (도 2C) . 로 감지 된 신호는 [M + H]는 + m / z 613, 745, 877, 1009, 1141 및 1273에서의 이온은 각각 P 3-8 + 헥사 (1) (도 2c)을 갖는 산성 올리고당의 존재를 나타낸다. commelenid 외떡잎에서, 자일란 골격은 페놀 산으로 치환 될 수 있고,주로 페룰 산 (또한 P -coumaric 산) 글루 쿠 론산과 같은 분자량을 가지고 밀 배유 세포벽의 W-졸 AX를 검출 할 수있다. 그러나, ESI-MS N 사용 W- 및 KOH-졸 AX를 더 분석 (및 조성은 메탄 다음 TMS 유도체의 GC-MS로 분석;하지 여기에 표시) 밀 배젖에서 P 3-8 + 헥사 1 산성 올리고당을 확인 AX를.
[M + H]가 + 3.10-3.48 분 사이의 영역의 ESI-Q-TOF 전체 검사 스펙트럼의 이온 (그림 2D)이 2AB의 시리즈는 RE 올리고당 레이블이 포함로 할당 신호 : m / z 271, 403, 535, 667, 799, 931, 1063 및 1195 (P 1-8 + 2AB, 각각). 3.59-4.05 분 사이의 영역의 ESI-Q-TOF 스펙트럼 전체 스캔 유사 분자 이온 시리즈 (도 2e)을 내부 영역 산성 올리고당 관찰 대표D 모두 [M + 나] + 이온과 같은 : m / z 613, 745, 877, 1009 및 1141 (P 3-7 각각 + 헥사 1) 및 [M + NH 4] + 이온 : m / z 740, 872, 1004, 1136 및 1268 (P 각각 4-8 + 헥사 1).
각 당사슬을 시퀀싱하기 위해, 우리는 ESI-MS를 수행 N에 당 O 메틸화 올리고당 오히려 명백하게 천연 당사슬을 시퀀싱하여 구조를 할당 도전 때문에 W-졸 KOH 졸 AX를 얻은 천연 당사슬보다 . 또한, 같은 재료의 더 큰 양을 필요로한다. Pettolino 등에 의해 설명 된대로 올리고당 메틸화 행했다. 1. ESI-MS N KOH-졸 AX를에서 파생 된 RE 중립 올리고당 알디 톨 수행 연구 및 2AB는 W-졸 AX를에서 파생 된 중립 RE 올리고당은 벨로을 설명하는 표시일례의 스펙트럼 및 추론 구조의 해석을 지원하기로 w 동일한 방법은 효소 적 가수 분해로부터 생성 된 모든 올리고당 류에 적용 할 수있다. ESI-MS N 스펙트럼의 단편 이온 당 O 메틸화 올리고당 MS 16 비 - 메틸화 수산기 (들)의 기상 분할 중에 발생. 도몬 및 코스텔로에있어서 Y 및 B 이온으로 식별 n은 제공했다 분지 패턴 및 글리코 서열. 12-13 분열 이벤트에 의해 생성 된 각 상처를 식별 할 수 14Da 질량 차이 "상처"는 실선으로 표시된다 (도 3 및도 4). 여러 이성질체 구조가 정의 된 질량 가능 한, 다음 이러한 이성질체 구조에서, Y와 B 이온은 각각 빨간색과 검은 색 표시되어 있습니다.
ESI-MS 2, ESI-MS (3) 및 ESI-MS 사 SPECT의사 분자 이온 m / z 885의 분열에서 생성 된 당-O-메틸화 RE 중립 올리고 글리코 알디 톨의 라 (P 4 Xyl 올 +) 그림 3에 표시됩니다. ESI-MS (2) 스펙트럼이 풍부한 Y를 포함 m / z 711, 551 및 391에서 이온은 어미 이온으로부터 각각 하나, 둘, 셋 pentosyl 잔기의 손실에 의해 발생. 풍부한 m / z 711 이온은 비 환원성 말단의 Xyl 잔기의 손실 말단 측쇄 아 잔기의 손실에 의해 하나에 의해 생성 될 수있다. 얻어진 스펙트럼에서 진단 Y의 m / z 391 이온의 손실로부터 생성 될 수있는 세 개의 비 환원 RE Xyl의 올 잔기 또는이있는 RE 올리고당의 측쇄 아 잔기를 가지는 RE 올리고당으로부터 단부 Xyl 잔류 재생 에너지 Xyl의 올 잔류 물에서 2 차 Xyl 잔류 물에 사이드 체인 아라 잔류 물. 공식적인 가능성이있다하더라도 그와 같은 다른 구조,이 야기 할 것 4 -Xyl의 올, 및 (아라) Xyl-Xyl-Xyl-Xyl의 올 Xyl 이러한 구조 이온 단편은 각각 분 지점에 인접하는 글리코 시드 결합에서 절단이 저하하거나하지 않을 어느 다당류을 절단하는 데 사용되는 엔도 - 크 실라 아제의 특이성으로 고려 대상에서 제외된다. 대응하여, 진단 Y의 m / z 551 이온의 손실을 발생시킬 수있는 두 개의 비 환원 RE Xyl의 올 잔기 또는 측면을 가진 RE 올리고당 하나의 측쇄 아 잔기를 가지는 RE 올리고당으로부터 단부 Xyl 잔류 끝에서 두 번째 Xyl 잔류 물에 체인 아라 잔류 물. 따라서, 네 개의 가능한 이성질체 구조를 제안 할 수있다 (도 3 : I, II, III 및 IV). 풍부한 Y 이온 m / z 377 (그림 3 참조 : 1a 및 IIA)과 B 이온 m / z를 503 (그림 3 참조 : IA, IB, 부가가치세 및 IVb 족) 이성질체 전구체 m의 추가 조각에서 생성 된/ z 711 이온이 스펙트럼에서 관찰된다. P의 이성질체 전구체 m의 분열에 의해 기록 된 ESI-MS (3) 스펙트럼 (그림 3) / z 711 이온 m에서 주요 피크를 포함 / z 537 (Y 이온 2 + Xyl이 상처와 올; IA 이온 전구체로부터 생성 , IB, IIA, IIB, Ⅲa에, IIIb의 부가가치세와 하나의 흉터와 P 1 + Xyl의 올 IVb 족) 및 m / z 391 (Y 이온, IIB, Ⅲa에, IIIb의 부가가치세 이온 전구체로부터 생성 IVb 족). 이러한 두 주요 피크 (m / z 537 및 m / z 391)는 의사의 분열로부터 생성 된 이성질체 전구체 m / z 711 이온에서, 하나, 둘, 각각 단자 Xyl 잔기 비 환원성의 손실에 의해 발생 될 수있다 -molecular 부모 이온 m / ESI-MS 2시 Z 885 (P 4 + Xyl의 올). P의 m에서 상대적으로 낮은 풍부 피크 / z 377 (Y 이온 1 + Xyl이 상처와 올하며 precurso에서 발생연구 이온 IA 한 흉터와 P 2 + Xyl의 올 IIA) 및 551 (Y 이온, IB 및 IIB 이온 전구체로부터 생성 된)이 스펙트럼에서 관찰되었다.
이성체 전구체 m / z의 분열의 ESI-MS (4) (551) 이온이 m에서 주요 피크를 포함 / z 377 (P의 Y 이온이 흉터와 1 + Xyl의 올) 및 m / z 391 (P 1의 Y 이온 전구체 구조 이온 I 및 II에서 발생하는 하나의 흉터 Xyl 올) +. 양쪽에 부착 아 측쇄 다시 Xyl 그러므로 집단 증거는 RE의 글리코 서열 (도 3II 진단 단편화 통로 m / z 885 → 711 → 551 → 391)에 RE Xyl의 올 잔기에 부착 된 아 측쇄 구성 제안 올과 (RE Xyl의 올 1 일 Xyl 잔류 물) 끝에서 두 번째 Xyl의 잔류 물 (진단 분열 통로 m / z 885 → 711 537 → 391 →도 3I) 및도 3III)는, 아라 사이드 체인은 끝에서 두 번째 RE Xyl의 올에서 (1 일 Xyl) Xyl의 잔류 물 (진단 분열 통로 m / z 885 → 711 → 537 → 377에 연결 아라 사이드 체인은 RE Xyl의 올 (그림 3IV)에서 2 차 Xyl 잔류 물에 부착.
[아 F - - (1 → 3) (+/-)는 -Xyl P - (1 → 4)이 이온의 존재가 제안 이성질체 구조 I, II, III 및 IV 중립 RE 당사슬 구조를 확인 - [아라 F - (1 → 3)] (+/-) -Xyl P - (1 → 4) - [아라 F - (1 → 3)] (+/-) -Xyl 페이지.
당-O-메틸화 2AB의 ESI-MS (2) 스펙트럼은 fragm에서 생성 RE 올리고당을 표시m의 준 분자 [M + 나]의 [슬라이드 쇼] + 이온 / z 871 (P 4 + 2AB)는 그림 4.이 스펙트럼은 m / z 697 (P 하나 3 + 2AB에서 가장 풍부한 Y 이온을 포함에 표시됩니다 흉터) 각각 중 1, 2 또는 3 개의 비 환원 pentosyl 잔기의 손실에 의해 생성 된 m / z 537 (P 하나 흉터 하나 흉터) 및 m / z 377 (P 1 + 2AB 2 + 2AB). 제 m / z 697 이온 두 단자 Xyl 잔기의 손실에 의해 발생 될 수있는 비 환원성 말단의 Xyl 잔기 또는 m / z 537 이온 반면 단말 아 잔기의 손실에 의한 손실에 의해 발생 될 수있다 . 진단 프래그먼트 통로 (m / z 871 697 → 377 → 537 →)를 RE에서 선형 비 - 분지 자일란 백본 올리고당 (들)의 존재는 의사 - 분자 이온 (M)에 대응하는 것을 제안 / z 871 (P 4 + 2AB ). 그러나 선형 않은 지형 xylosyl 백본 (P 4 + 2AB)는 susce입니다더 소화 ptible 사이트에 특정 endoxylanase. 따라서 두 개의 이성질체 m / z 697 이온이 존재할 수 있습니다. 따라서 두 가지 이성질체 구조가 제안되고있다 (그림 4 : I 및 II). 이러한 이성질체 구조에서 Y와 B 이온은 각각 빨간색과 검은 색으로 표시됩니다. , m, 이성체 전구체 m / z의 분열에서 기록 된 ESI-MS (3) 스펙트럼은 697 이온 (그림 4, 구조 IA, IB, IIA 및 IIB이 상처 P 2 + 2AB의 Y 이온) m / z에게 523 이온을 생성 / z 363 이온 (두 개의 상처와 P 1 + 2AB의 Y 이온도 4, 구조 IIA) m / z 377에서와 Y 이온 (한 흉터와 P 1 + 2AB도 4, 구조 1A 및 1B). m / z 377에서 단편 이온은 단지 I 및 m / z 363에서 단편 이온만을 제시 II 구조에서 발생할 수있는 제안 된 구조에서 발생할 수있다. 두 이온의 동시 존재를 제안 구조를 확인 I 및 II. 따라서 밀 배젖의 AX를의 크 실란 체인의 RE의 글리코 순서는 RE Xyl의 잔류 물 (조각 경로의 m / z 871 → 697 → 523 → 363) 및 / 또는 끝에서 두 번째 Xyl의 잔류 물 (조각 경로의 m / z에 부착 된 아라 가지로 구성 871 → 697 → 523 → 377).
AX를의 NMR 분석
MS 기반 분석 아노 머 구성 (α / β) 효소 적 또는 물리적 (예를 들면, NMR)을 포함하는 다른 방법에 의해 수득되어야하는 당류의 D / L의 어느 하나의 구성에 대한 정보를 제공하지 않는다. 특성 RE 감소 테트라 사카 라이드 (Xyl-라곤 - GALA-Xyl의 올)와 heteroxylans를 들어, NMR 스펙트럼이 RE 올리고당의 식별 및 시퀀싱을 선도 아노 머 신호가 포함되어 있습니다. 우리는 DET 단일 단계 방법으로 600 메가 헤르츠 (1D) 1 H-NMR 스펙트럼의 사용을 설명아노 머 구성 (α / β)와 설탕의 D / L 구성을 포함하여 KOH-졸 프랑의 밀 배젖 AX의 RE 올리고당의 완전한 글리코 순서를 족제비. 공진은 밀 AX 올리고당 17-18 공표 할당 (도 5, 표 1)에 기초하여 할당 하였다. 밀 내배유로부터 추출 AX의 1 H-NMR 스펙트럼은 O-3 위치에 부착되는 말단 α-L-아라 F 잔기의 양자에 할당 5.39, 5.27 및 5.22 ppm의시 아노 머의 화학적 이동에 의해 지배 단독 분기 (1,4) -β-Xyl 페이지 백본 잔류 물 (T-α-L-아라 F → 3 S) 및 O-3 모두와 O-2 위치 (T-α-L-아라 F → 3 D 및 이중 분기 (1,4) -β-Xyl 페이지 백본 잔류 각각 (그림 5와 표 1)의 T-α-L-아라 F → 2 D).
F → 3 S + D) α-L-아라 (F)의 H1 신호 측쇄 이중 지형 β-D-Xyl 피 인접하여 단독 지형 β-D-Xyl 피 잔기의 O-3 위치에 부착. 5.29에서 신호가 할당된다 (T-α-L-아 F 3 → D + D) 배로 지형 β-D-Xyl의 O-3 위치에 연결된 α-L-아 F 측쇄 H1 신호 이중 분기 β-D-Xyl P는 인접한과 페이지 잔류. 5.24에서의 신호가 할당된다 α-L-아라 F 사이드 체인의 H1의 신호에 연결 (T-α-L-아라 → 2 D + D가 F) 이중 분기 β-D-Xyl 피 인접으로 이중 분기 β-D-Xyl 피 찌꺼기의 O-2 위치.
그림 2. MALDI-TOF MS (A) 및 ESI-QTOF MS (B - E) W-졸 AX를 레이블 2AB에서 endoxylanase 발표 한 천연 올리고당의 분석 그림 1. MALDI-TOF MS 스펙트럼에 설명 된대로 : (A) ( 신호 A를 [M + 나] + 부가 물 이온)로 식별 재; RE에서 파생 된 C = P 1-6 + 2AB, 내부 영역 올리고당에서 파생 된 B = P 5-10 (신호가 [M + NH 4] + 부가 이온으로 식별) 다음 ESI-QTOF MS 크로마토 그램의 선택 이온 스캔 D = ESI-Q-TOF 전체]는 올리고당 (신호가 [M + 나] + 부가 물 이온으로 식별되는) 산성 올리고당으로부터 유도 & P 3-8 G (신호는 [M + H] + 부가 물 이온으로 식별) 3.59-4.05 분 사이 지역 (신호가 모두 [M + 나 +와 [M + NH 4] + 부가 이온으로 식별됩니다 스캔 스펙트럼 : 3.10-3.48 분, E = ESI-Q-TOF 전체 검사 스펙트럼 사이의 영역 ); P = pentosyl 장치 (아라 또는 Xyl 중) G = uronosyl 잔기 (GlcA); 단 올리고당을 감소 = RE; 2AB = 2 아미노 벤즈 아미드; EIC : 추출 된 이온 크로마토 그램. 광고 / 53748 / 53748fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. ESI-MS 2, ESI-MS (3) 및 ESI-MS 당-O-메틸화 RE 중성 글리코의 알디 톨의 4 스펙트럼 (P 4 + Xyl의 올) - 신호가 [M으로 할당 m / z 885 나트륨 +] + 유사 분자 이온 부가 물. 정의 된 질량에 대한 몇 가지 이성질체 구조 이성질체 구조에 후 가능으로 Y와 B 이온은 각각 빨간색과 검은 색 표시되어 있습니다. 분열 이벤트에 의해 생성 된 각각의 "상처"는 실선으로 표시됩니다. X = Xylosyl 잔류 물; A = Arabinosyl 잔류 물. ESI-MS (3) 스펙트럼 Ratnayake 등의 허가를 재현 할 수 있습니다. (2014) 2.748fig3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
당-O-메틸화 2AB의 그림 4. ESI-MS (2) 및 ESI-MS (3) 스펙트럼은 중성 RE 올리고당 표시 (P 4 + 2AB) - m / 신호가 [M + 나]로 할당 된 Z 871 + 의사 -molecular 이온 부가 물. 정의 된 질량에 대한 몇 가지 이성질체 구조 이성질체 구조 가능하다 바와 같이, Y 및 B 이온은 각각 빨간색과 검은 색으로 표시됩니다. 분열 이벤트에 의해 생성 된 각각의 "상처"는 실선으로 표시됩니다. X = Xylosyl 잔류 물; A = Arabinosyl 잔류 물. 이 수치는 Ratnayake 등의 등의 허가를 재현 할 수 있습니다. (2014) 2. 큰 적이있는을 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 이온.
KOH- 솔 천을 endoxylanase의 처리에 의해 생성 된 AX 올리고당의 600 MHz의 1D 1 H-NMR 스펙트럼을도 5 아노 머 영역 2.225 ppm으로 아세톤 내부 표준에 언급 한 H 화학 시프트. T-α-L-F 아 3 → S 다음 단독 지형 β-D-Xyl 피 잔기의 O-3 위치에 연결된 α-L-F 아 측쇄 H1 신호; T-α-L-아라 F → 2 D : 배로 지형 β-D-Xyl 피 찌꺼기의 O-2 위치에 부착 α-L-아라 F 사이드 체인의 H1 신호; T-α-L-아라 F → 3 D : 배로 지형 β-D-Xyl 피 찌꺼기의 O-3 위치에 부착 α-L-아라 F 사이드 체인의 H1 신호; 티-α-L-아 F 3 → S + D :로 단독 지형 β-D-Xyl 피 잔기의 O-3 위치에 연결된 α-L-아 F 측쇄 H1 신호 이중 분지 인접 β-D- Xyl의 피; T-α-L-아라 F → 2 D + D :로 이중 분기 β-D-Xyl 피 찌꺼기의 O-2 위치에 부착 α-L-아라 F 사이드 체인의 H1 신호는 이중 β-D 분기 인접한 -Xyl 피; T-α-L-아라 F → 3 D + D :로 이중 분기 β-D-Xyl 피 찌꺼기의 O-3 위치에 부착 α-L-아라 F 사이드 체인의 H1 신호는 이중 β-D 분기 인접한 -Xyl 피; 2-α-L-아라 F → 3 S 다음 단독으로 분기 β-D-Xyl 피 찌꺼기의 O-3 위치에 부착이-α-L-아라 F 사이드 체인 잔류 H1 신호; 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전.
| 당 잔기 | H-1 / C-1 | H-2 / C-2 | H-3 / C-3 | H-5 / C-4 | H-5 당량 / C-5 | H-AX 5 / C-5 |
| T-α-L-Araf → 3 S | 5.396 / 107.6 | 4.16 | 3.95 | 4.3 | 3.82 | 3.72 |
| T-α-L-Araf | 5.415 / | 4.18 | 3.95 | |||
| → 3 S + D | ||||||
| T-α-L-Araf → 2 D | 5.223 / | 4.16 | 3.97 | 3.82 | 3.74 | |
| T-α-L-Araf → 2 D + D | 5.243 / | 4.16 | 3.98 | |||
| T-α-L-Araf → 3 D | 5.272 / 108.9 | 4.18 | 3.96 | 4.26 | 3.79 | 3.74 |
| T-α-L-Araf → 3 D + D | 5.298 / | 4.18 | 3.96 | |||
| 2-α-L-Araf → 3 S | 5.548 / 106.4 | 4.27 | 4.06 | 4.3 | 3.82 | |
| (감소) - Xylp α | 5.185 / 91.9 | 3.55 | 3.72 | |||
| (감소) - Xylp β | 4.580 / 96.6 | 3.29 | 3.48 | 3.64 | 4.06 | 3.38 |
| β-4-Xylp | 4.470 / | 3.32 | 3.58 | |||
| β -4- Xylp + S | 4.461 | 3.31 | 3.56 | 3.75 | 4.08 | 3.36 |
| β-4-Xylp + D | 4.448 | 3.31 | 3.56 | 3.75 | 4.08 | 3.36 |
| β-3,4-Xylp | 4.518 / | 3.44 | 3.85 | |||
| S + β-3,4- Xylp | 4.514 / | 3.47 | 3.75 | 3.86 | 4.14 | 3.43 |
| D +에의 β-3,4-Xylp | 4.505 | |||||
| β-3,4-Xylp + S | 4.492 | 3.45 | 3.74 | |||
| β-3,4-Xylp + D | 4.482 | 3.45 | 3.74 | |||
| β-2,3,4-Xylp | 4.638 | |||||
| S + β-2,3,4-Xylp | 4.627 | 3.59 | 3.87 | 3.88 | ||
| D의 +의 β-2,3,4-Xylp | 4.616 | |||||
| β-2,3,4-Xylp + S | 4.593 | |||||
| β-2,3,4-Xylp + D | 4.593 | |||||
| 화학 변화가 내부 아세톤에 대해보고, 2.225을 Δ. | ||||||
| S는 단독으로 β-Xylp 분기 = | ||||||
| S + D = 단독 분기 β-Xylp + 이중은 β-Xylp 분지 | ||||||
| D는 이중 β-Xylp 분기 = | ||||||
| D + D = 이중 분기 β-Xylp + 이중은 β-Xylp 분지 | ||||||
밀 배젖 KOH 졸 천을 endoxylanase의 처리에 의해 생성 된 xylo 올리고당 표 1. 1 H-NMR 신호
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Discussion
대부분의 매트릭스 상 세포벽 다당류는 겉으로는 무작위로 매우 다양있는 식물 종, 발달 단계 및 조직 유형 3에 따라 (글리코 및 비 글리코 잔류 모두 포함) 백본을 교체했습니다. 다당류 이차 유전자 산물이기 때문에 그 서열은 주형 유도되지 않고, 핵산과 단백질의 존재와 같은 단일 분석 방법들은 시퀀싱, 따라서 존재하지 않는다. 정제 된 링크 관련 가수 분해 효소의 유용성은 크로마토 그래피 분별 될 수 올리고당 다당을 분해하는 강력한 도구를 제공하고, 화학적 및 물리적 방법과 조합하여 사용될 때 완전히 서열 분석 하였다. 도전은 성공적이 될 해결하기 위해 여전히 원래의 다당류 서열 - 하나에 이러한 복잡한 혼합물을 다시 조립하는 것입니다.
여기에서 우리는 접근 방식 (응용 캘리포니아의 그 순서를 설명N 설립 효소 적, 화학적 환원 말단 (RE) 및 heteroxylans의 내부 영역 글리코 서열 (들) 모두의 구조적 특성에 대한 물리적 기술의 통합에 의존하는) 다양합니다. 올리고당을 특성화하는데 매우 유용 입증되었다 설명을 생략 추가적인 상보 기술은 듀프리 (19) 그룹에 의해 개발 된 PACE (탄수화물 겔 전기 영동에 의해 다당류 분석)이며, 기기를 사용할 수있는 경우 용이이 프로토콜에 통합 될 수있다. 또한, LC 크로마토 변형 또한 / 단일 단계로 분리하는 당사슬 태그 모두 태그 화의 가능성을 제공 RP 크로마토 그래피 탠덤 인라인 소수성 상호 작용 크로마토 그래피 (HILIC)로서 유용 할 수있다. 기술은 효소 (endoxylanase) 가수 분해 전의 heteroxylan 사슬의 환원 말단 (RE) (2- 아미노 벤즈 아미드 (2AB) 포함)에 태그에 의존한다. 두 개의 서로 다른 접근 방식 (요약 참조그림 1)을 채택하고 있습니다. 처음에는 그대로 W 졸 AX를 원래 RE 골격 쇄 당 잔기 태그를 2AB로 처리하고 2AB 표지 RE 각각 올리고당을 감소 내부 영역의 혼합물을 생성하는 endoxylanase로 처리 하였다. 두 번째 접근에서, KOH 졸 천을 먼저 2AB 연속적으로 표시되는 당사슬의 혼합물을 생성하는 가수 분해 endoxylanase. 이 환원제, 수소화 붕소 나트륨 (에 NaBH 4)에 함유되는 알칼리 추출 동안 글리코-알디 톨로 감소했기 때문에 후자의 시나리오에서, KOH 졸 AX 원래 RE는 2AB으로 표시되지 않는다. 따라서, 2AB 표지 올리고당은 2AB 태그없이 RE의 알디 톨이 포함됩니다 "내부"올리고당 원래 RE 올리고당에서 시작되며, 이후 자일라나 소화를 생성한다 (그림 1 참조). 이 접근법은 또한 다당류 U의 다른 클래스에 적용 할 수있다(가능) 적절한 엔도 - 가수 분해 효소를 노래.
N MS에 당 O 메틸화 올리고당 기상 분열 중에 생성 된 비 - 메틸화 히드 록 실기 (들)을 14Da 질량 차이 "흉터를 제공하기 때문에 MS 기반 방식은 크게 endoxylanase 처리 후에 생성 된 올리고당의 메틸화에 의해 향상된 "즉 단독 MS 데이터로부터 만들어 질 수 없다. 분지 패턴의 식별 및 글리코 시퀀스 도와 5-6 pentosyl 잔기 (및 당 잔기)의 ID를 사용하지만 지식을 가지는에서 비롯 될 수있다 분자의 조성물; 이 사용할 수없는 경우 다음 관련 단당류와 연계 분석은 MS의 n은 이러한 과제를하기 전에 수행해야합니다. 또한 KOH 졸 프랑에서 생성 RE 산성 올리고당 알디 톨에 대응하는 신호 (Xyl-3 -MeGlcA 자일리톨 : m / z 761) 및 CHaracteristic 쌍자엽 크 실란 RE의 글리코 시퀀스 (Xyl이 -Rha - 갈라 - 자일리톨 : m / z 761), 존재하는 경우, 기본 형태로 동일한 분자 질량은 모두로 구별 할 수있는 것은 아니지만 자신의 MS 단편화 구별 될 수있다 ( 가장 메틸화 올리고당에 수행되는 MS n)의 스펙트럼. 최종적으로, MS 기반 기술 (α / β)가 글리코 시드 결합 또는 sugars-의 D / L 구성 이것을 포함한 다른 방법에 의해 결정되어야 아노 머 구성 중 하나에 대한 정보를 제공 할 수없는 등 (효소 적 및 물리적 NMR).
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 aminobenzamide (2AB) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | A89804 | |
| sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 247677 | Hazardous, handle with care |
| sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 156159 | Hazardous, handle with care |
| endo-1,4-β-Xylanase M1 (from Trichoderma viride) (120101a) | Megazyme (www.megazyme.com) | E-XYTR1 | |
| Deuterium Oxide (D2O) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 151882 | |
| Freeze dryer (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus) | |||
| RP C18 Zorbax eclipse plus column | Agilent | (2.1×100 mm; 1.8 µm bead size) | |
| MicroFlex MALDI-TOF MS (Model - MicroFlex LR) | (Bruker Daltonics, Germany) | ||
| (ESI) -(QTOF) MS (Model # 6520) | (Agilent, Palo Alto, CA ) | ||
| ESI-MSn - ion-trap (Model # 1100 HCT) | (Agilent, Palo Alto, CA). | ||
| Bruker Avance III 600 MHz -NMR | Bruker Daltonics, Germany | ||
| Topspin (version 3.0)-Biospin- software | Bruker | ||
| GC-MS (Model # 7890B) | Agilent |
References
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