Abstract
心外膜細胞株の単層心臓、心筋細胞の増殖を刺激するパラクリン因子を提供し、直接開発や病気の際に心臓血管前駆細胞を貢献しています。多くの要因は、心外膜由来細胞（EPDC）の動員に関与してきたが、彼らのその後の移行および分化を支配するメカニズムはよく理解されていません。ここでは、EPDC運動性および分化を研究するための戦略をin vitroで提示し、ex vivoで 。まず、我々はマウス胎児心臓から成長培養によって一次心外膜細胞を得る方法を説明します。我々はまた、器官培養系において標識EPDCの三次元移動を評価するための詳細なプロトコルを導入します。我々は、心外膜でミオカルディン関連転写因子の遺伝子欠失がEPDC移動を減衰させるこれらの技術を使用して証拠を提供します。このアプローチは、EPDCの候補修飾因子を評価するためのプラットフォームとして機能します生物学とは、心臓の修復に有用であるかもしれないEPDC動員の新規な調節因子を同定するための遺伝的または化学的なスクリーニングを開発するために使用することができます。
Introduction
心外膜は、中皮細胞の単層であるラインハートと影響心臓の発達、成熟および修理。パラクリン信号の高度に調整して交換を通じて、心筋および心外膜の間の密接な対話が心の成長と非筋細胞、心臓系統1の形成に不可欠です。心外膜由来細胞（EPDC）は上皮-間葉転換（EMT）2を介して心外膜細胞のサブセットから出て、心外膜下空間とその下の心筋に侵入し、主に冠動脈の血管壁細胞と心臓線維芽細胞に分化、およびへより少ない程度、内皮細胞および心筋3-9。
心外膜EMTとEPDCの侵入を調節するメカニズムは、分泌リガンド10-13、細胞表面受容体と接着分子14,15、のRegu含む様々な分子の協調作用に起因するとされています頂端-基底極性16,17のレータ、低分子量GTPase 18,19、および転写は2,20,21因子 。 EPDCの移行の分子エフェクターの多くが定義されているが、胚にEPDC動員を刺激する生理学的信号をよりよく理解することは、改善された心臓修復のために成人にこのプロセスを操作するための戦略の開発を加速することができます。
EPDC動員の新規調節因子を同定することを目的とした研究は、この細胞集団の精製または個々の心外膜細胞の移動を追跡するに依存しています。一つまたはWT1、Tcf21、Tbx18、および/ またはAldh1a2含むマーカー遺伝子の組み合わせは、一般に胎児の心外膜1を識別するために使用されます。心外膜マーカーの発現は、心臓の開発の過程で衰えると心外膜細胞がtransdifを受ける際にしばしば失われるしかし、EPDCを移行追跡するためにこれらのマーカーの使用は最適ではありません間葉系細胞へのferentiation。
Cre / loxPシステムのアプリケーションでは、系統追跡記者と連携して、恒久的に心臓の開発中に心外膜とその子孫を標識し、大人7,22,23における虚血性損傷後に有用でした。いくつかの心外膜制限のCre株が生成されていると広くEPDCを標識し、条件付き遺伝子欠失戦略1のために使用されます。これらの研究は、様々な心外膜の系統の特性評価、およびEPDC運動性および分化の重要なメディエーターの同定につながっています。しかし、蓄積証拠も心外膜は、前駆細胞4,24,25の異種集団であることを示唆しています。このように、心外膜細胞のサブセットのみが与えられたCreドライバを使用して標的化することになります。
かかわらずのCre特異性の全体心外膜を標識するためには、研究室の数が伸長CULを利用してきましたチャーシステムまたはエキソビボ器官培養法を忠実に遺伝的系統マーカー26-28の発現に依存することなく、心外膜細胞を単離するか、標識します。 ex vivoでの移行研究のために、胚の心臓は心外膜EMTの前にし、緑色蛍光タンパク質（GFP）発現アデノウイルス（広告/ GFP）9,18を添加した培地で培養分離されています。このアプローチは、効率的な全体心外膜の標識ではなく、Cre介在組換えによって細胞のサブセットを可能にします。ハート培養物は、その後EPDC 28,29の動員を刺激することがEMTの既知の誘導物質にさらされている。 エクスビボおよびin vivoでの分析EPDCの移行を駆動する詳細なメカニズムを探索するために特に有用なアプローチであるin vitroの心外膜外植片培養物によって補完されています。
ここでは、epicardiのインビトロ研究のための一次心外膜細胞を単離するための方法を記載しますアルEMT、ならびにEPDC運動のex vivo分析のための器官培養系。我々は最近、遺伝的にEPDC 9のアクチンベースの移行を操作するために軸をシグナリングミオカルディン関連転写因子（MRTF）/血清応答因子（SRF）を調節することによって、この方法の有用性と堅牢性を実証しました。我々の知見はEPDC移動を規制するために必要な1つの信号経路を強調しながら、これらの方法はまとめEPDC遊走および分化を調整するメカニズムを解明するのに適しています。また、外植片およびエクスビボ培養系は、心臓再生における治療用途にEPDC動員の新規調節因子を同定するために、機能画面で実施することができます。
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Protocol
注：マウスを用いたすべての実験は、ロチェスター大学の動物資源上の大学委員会によって承認されました。
1.心外膜伸長文化アッセイ（図1A）
- 準備
- 5％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシン（ペニシリン/ストレプトマイシン）で199培地（M199）を補完することにより、一次心外膜細胞の単離のための5ミリリットル培地Aを準備します。
- 培地Aプリ暖かい、100mlの37℃の水浴中にハンクス平衡塩溶液（HBSS）。
- コラーゲンコートしたチャンバースライドを30分間室温まで加温することを可能にします。
- チャンバースライドの各ウェルに100μlの培地Aを加え、穏やかに均一にコートコラーゲン表面に回転させます。 8-12ウェルについて繰り返します。コーティングチャンバの後にメディアを取り出します。
- アリコートを50mlのHBSSをそれぞれ含む2つの10 cm 2でプレートにHBSSを事前に温めました。
- 11.5日後に交尾（DPC）で妊娠ダムから胚ハーツを分離します。30
- 腹腔内注射を介して13 mg / mlでケタミン/ 0.88ミリグラム/ 1×ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）でミリリットルキシラジンのカクテル0.5mlでマウスを麻酔。つま先のピンチテストを使用して、適切な麻酔を確認してください。穏やかなピンチマウスが応答するかどうかを判断するのに十分です。任意の動きや足の撤退は、動物が十分に手術を行うために麻酔をかけないことを示します。頸椎脱臼により安楽死させます。
- 腹側を上に直面しているマウスを置き、毛による汚染を減らすために70％エタノールで腹部をスプレー。
- 鉗子で皮膚をつまみ、手術用ハサミで腹部に横切開をカット。しっかりと肌を持ち、その後、頭と尾に向かって反対方向に引き離します。
- 鉗子で腹膜をつまみ、腹腔を露出させるためにハサミでカット。
- 慎重に子宮間膜に沿って切断することにより、脱落膜を除去します。最初に解剖脱落する予め温めたHBSSを転送10cm 2のプレート。
- 胚の間で切断することにより脱落膜を分離します。
- 解剖顕微鏡下で予め温めたHBSSで第10cm 2のプレートに胚を転送します。慎重に胚を刎ねるその後、胚体外組織と卵黄嚢を削除します。
- 鉗子で胸壁をつまみ、胸腔を露出させ、正中線で離れて組織を引き裂きます。
- 心の背後に鉗子を置きます。流出路をつかみ、胚から心を引き出します。まだ接続されている場合、心臓から肺の気道および肺を分離します。
- コラーゲン被覆スライドの1ウェルに心を移し、背側を下に（ 図1B）に置きます。各胚のための手順を繰り返し1.2.7-1.3。
- 一度すべての心臓は、コラーゲンマトリックスに十分な付着を可能にするために、37℃、5％CO 2で30分間、チャンバースライドをインキュベートし、個々のウェルに転送されています。
- 慎重に追加それぞれの心臓の周りに予熱した外植媒体Aの20-50μlの。重要：そうでなければ心はコラーゲン基板から切り離すことができる、または心臓の上のレベルにあまりにも急速にメディアを追加しないでください。
- 培養約24時間37℃、5％CO 2での心臓は心外膜成長を可能にします。注：増殖物は、培養早く3-4として時間（ 図1C）を観察し、主に最小限の間葉細胞汚染（ 図1D、E）で石畳の形態を、表示中皮細胞で構成することができます。代表的な結果は、カメラを備えた解剖顕微鏡を用いて取得しました。
心外膜増殖物2.遺伝的アブレーションとEMTの誘導
注意：承認されたバイオセーフティガイドラインに従って、慎重にアデノウイルスを処理します。
- 水浴中で37℃に15ミリリットルを培地B（M199は、1％FBSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した）とプリ暖かいを準備します。
- の切除のためのフロックス対立遺伝子は、Creリコンビナーゼを発現するアデノウイルスの2.5×10 4 PFU / mlの（広告/ CRE）または対照ウイルスを補充した外植片培地Bを準備します。
注：候補遺伝子のアデノウイルス媒介性過剰発現はまた、機能表現型の利得を評価するために行うことができます。ウイルス力価は、エンドユーザによって決定されるべきです。 - 慎重にピンセットを用いて伸長培養物から心外膜枯渇心を取り除きます。後でRNAの単離および遺伝子発現解析のために-80℃で1.5ミリリットルを800μlのTrizolとチューブとストアへの転送の心。
- 血液細胞および過剰な細胞破片を除去するために、DPBSで各ウェルを洗浄します。
- 各伸長培地に500μlのアデノウイルス（ES）を補充した外植片培地Bを添加し、37℃、5％CO 2で24時間インキュベートします。
- EMTの誘導のために、培地を除去し、Bは、組換えトランスフォーミング増殖因子（TGF）-β1[10ng / mLの]またはビヒクル（4mMのHを補充し、37°Cの外植片の培地を補充ydrochloric酸（塩酸）を含有する1mg / mlのウシ血清アルブミン（BSA））。 37℃、5％CO 2でさらに24時間培養植片。遺伝子/タンパク質発現を続行すると、後続のプロトコルに詳述されるように分析または免疫細胞化学。
注：心外膜EMTの誘導が0.5 ngの/ mlの範囲のTGF-β1の様々な濃度で刺激された- 10ng / mLの26,31-33。リガンドのより高い濃度は、全てのTGF-β受容体への非特異的結合をもたらすことができます。 TGF-β1の濃度は、特定の実験の目標を反映すべきです。
心外膜増殖物の3遺伝子発現解析
- 以前のTrizol（2.2）に保存されている解凍心外膜枯渇心。
- EPDC培養からの培地を吸引し、DPBSで二回洗います。
- 文化を外植する800μlの室温のトリゾールを追加します。
- 部屋のtemperatuで5分間のTrizolで心外膜枯渇心とEPDC培養をインキュベート再。溶解サンプルを均質化するまでピペット10回ダウン。
注：ハーツは完全に均質化し、さらにピペッティングが必要な場合があります。 - 1.5ミリリットルチューブにライセートを移し、製造者の指示に従って全RNAの単離を進めます。 RNAの収量を増加させるために沈殿の前に10μgのグリコーゲンを追加します。与えられた外植片は約0.5〜1.0μgのRNAが得られます。
- DNアーゼIとの混入DNAを取り出して、製造者の指示に従って、0.5μgのmRNAのを逆転写。
- 緑の表1に記載したマーカーSYBRを用いて心外膜外植片および/ または定量的逆転写（定量RT）-PCR 34とEMTの誘導の純度を検証する。ノーマライズmRNAレベル-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）のグリセルアルデヒドおよび使用相対的発現を計算します2 - ΔΔCT法 35。典型的な結果を図2Aに示されています。
- EPDC培養からの培地を吸引し、DPBSで二回洗います。
- 10μlの氷冷タンパク質溶解緩衝液（50mMトリスpH7.5で、150mM塩化ナトリウム、1mMのエチレンジアミン四酢酸のpHは8.0、1％トリトンX-100、1×プロテアーゼ阻害剤カクテル）を各ウェルチャンバーへの追加のチャンバースライドを配置氷。 P200ピペットチップで約底の1/4を切り取り、スライドのから細胞をこすり取るために残りの部分を使用してください。上下にピペット心外膜細胞を溶解し、1.5ミリリットルチューブに転送します。
- 超音波処理は、30秒ONとOFFのサイクルで氷水浴中で5分間、低（160 W）で外植片を溶解しました。
- 万XG、4℃で10分間遠心分離溶解液。上清を新しいチューブに移し、タンパク質アッセイ36を用いてタンパク質濃度を決定します。
注：指定された外植片には、最大1.5μgの総タンパク質を得られます。 2 heartsから外植片をプールすることが私たちを発見したANウェル当たりD・ロード2μgタンパク質は平滑筋αアクチン（ACTA2）およびGAPDH 9を検出するのに十分です。他の標的タンパク質の検出は、エンドユーザによって決定されるように、複数の外植片のサンプルをプールする必要ができます。
心外膜増殖物の5免疫細胞化学
- 外植片培養物からメディアを取り出して、DPBSで二回洗います。
- 静かに、それぞれ、C oを -20℃で、室温で5分間または10分間の外植片を各ウェルに4％（v / v）のパラホルムアルデヒドまたは氷冷メタノール500μlのを追加して修正。製造業者によって推奨されるように、抗体の仕様に応じて修正してください。
- 5分間、3回を固定液を削除し、DPBSで各ウェルをすすぎます。
- 5分間、DPBS中の0.1％の500μL（v / v）のトリトンX-100で細胞を透過性。
- 透過性溶液を除去し、DPBSで5分間、3回すすいでください。
- 室温temperatuで30分間、DPBS中の10％血清で細胞をブロックします再。
- メーカーの推奨や、エンドユーザによって決定されるような最適な条件ごとに、一次抗体染色を続行します。
- 抗体溶液を除去し、DPBSで5分間、3回すすいでください。
- 適切な核色素で、製造元の指示と対比あたりの二次抗体を適用します。
- 抗体溶液を除去し、DPBSで5分間、3回すすいでください。
- 製造者の指示に従ってチャンバースライドの壁を取り除き、細胞に直接水性マウント媒体を追加します。細胞の上にカバーガラスを置き、マニキュアで密封します。倒立共焦点走査顕微鏡を用いて、2D -典型的な結果を図2Bに示されています。
6. ex vivoで培養アッセイ（図3A）
- 準備
- ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）の（1：1）の混合物：使用して、12ミリリットルのex vivo培養培地を準備M199は10％を補っFBSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシン。
- 37℃の水浴中で、前加温エキソビボ培養培地、100mlのHBSS。
- アリコートを24ウェルプレートの8-12ウェルに1mlを予め温め培地。
- 転送は、それぞれ50mlを含有する、2つの10 cm 2でプレートにHBSSをあらかじめ温めました。
- 12.5 DPCで妊娠中のダムから（1.2で説明したように）HBSSでマウス胚性心を分離します。
- ex vivoでの培養培地を含む24ウェルプレートの1ウェルにそれぞれの心を転送します。穏やかに手動で揺動又は付着を防止するために、ロッキングプラットフォームを用いて、37℃、5％CO 2でプレートをインキュベートします。すぐに7.1に進みます。
7. 生体外培養における心外膜標識およびEMT誘導
- 、心外膜にラベルを付ける広告/ GFPの3.0×10 6 pfu / mlでを補充し、37℃ のex vivo培養液の12ミリリットルを調製しました。フロックス対立遺伝子の標的アブレーション、Aの転送6ミリリットルのためにD / GFPは、新しい15ミリリットルコニカルチューブに培地を補いました。広告/ Creを追加または1.5×10 6 pfu / mlの最終濃度にアデノウイルスを制御します。
注意：関数のゲインは、適切なアデノウイルス媒介遺伝子送達を行うことができる分析。 - 慎重P1,000ピペットチップを用いて24ウェルプレートの各ウェルから培地を除去します。
- 静か各ウェルにアデノウイルス（複数可）を補充した培地を追加します。
- 穏やかに揺り動かしながら24時間、37℃、5％CO 2でプレートをインキュベートします。
- EMTの誘導のために、37°C エクスビボを10ng / mlのTGF-β1および20 ng / mlの血小板由来増殖因子（PDGF）-BBまたはビヒクルを含有する培養培地（4mMのHClを含有する1mg / mlのBSAを12mlのを準備）。
- 慎重P1,000ピペットチップを用いて24ウェルプレートの各ウェルから培地を除去します。ゆっくりと1ミリリットルのDPBSで心をすすぎます。
- DPBSを削除し、ex vivoでの文化と心を補充私TGF-β1およびPDGF-BBまたは車両を含むdium。
- 緩やかに揺り動かしながら、37℃、5％CO 2で24時間インキュベートします。
8.凍結保存およびex vivoの免疫組織化学文化
- 凍結保存のために心の準備をします。
- 培養培地を除去し、氷冷DPBSで二回心を洗います。
- 各心臓に4％（v / v）のパラホルムアルデヒドの1ミリリットルを添加して、静かに揺らしながら4℃で2時間固定します。
- 固定液を削除し、DPBSで二回心を洗います。 DPBSで製造した1ミリリットル10％（w / v）のスクロース新鮮なウェルに心を移します。緩やかに揺り動かしながら4℃で一晩プレートをインキュベートします。
- 慎重にDPBSで製造した18％（w / v）のスクロースと新しいウェルに心を移します。緩やかに揺り動かしながら4℃で一晩プレートをインキュベートします。
- 組織凍結培地を含むcryomoldにそれぞれの心を転送します。直ちに-80＆＃で液体窒素とストアを使用してブロックを凍結176; C。
- 正に荷電し、顕微鏡スライド上クライオスタットと場所組織切片を用いて5μmのでセクションの心。ストアは、染色まで-80℃でスライドします。
- サブ心外膜基底膜の検出のためのセクションに免疫組織化学を実行します。
- 室温で少なくとも30分間、スライドを解凍。
- 緩やかに揺り動かしながら5分間、DPBSで2回洗浄することによってセクションを再水和。
- 室温で5分間、PBS中の0.1％（v / v）のトリトンX-100で透過処理部。
- 穏やかに揺り動かしながら5分間二回DPBSでスライドを洗浄します。
- 過剰DPBSをオフブロットおよび疎水性ラベリングペンで染色領域を規定します。室温で30分間、DPBS中の10％血清でブロックセクション。
- ブロック中に希釈：IV型コラーゲン抗体（200 ColIV、1）ブロックを削除し、適用します。調湿室で4℃で一晩インキュベートします。
- 以下のためにDPBSでスライドを3回洗浄穏やかに揺らしながら5分。
- DPBSでスライドに適用されますし、DAPI（5000 1）：蛍光結合二次抗体（1：500）を希釈します。室温で1時間インキュベートします。 GFPは異なる発光及び励起波長で適切な二次抗体を選択してください。
- 穏やかに揺り動かしながら5分間、PBS中でスライドを3回洗浄します。マウントは、取り付け媒体と摺動します。
9.イメージングおよびex vivoの定量文化
- 盲検ユーザ画像を持っているし、染色した切片を定量化します。心外膜（心臓のエッジ）40X倍率で、蛍光または共焦点顕微鏡を使用して、に沿って4-5の任意の場所に指定された心からの画像は、少なくとも5つの非連続した組織切片。典型的な結果が反転共焦点走査顕微鏡を用いて、 図3Bに示されています。
- 手動で指定されたイメージのGFP陽性細胞の総数を数えます。 GFP POとEPDCの移行を識別するColIV心外膜下基底膜内または越えて位置sitive細胞。指定されたイメージのGFP陽性細胞の総数の上にGFP陽性細胞の移行の数として細胞を移行GFPのパーセントを決定します。典型的な結果が反転共焦点走査顕微鏡を用いて、 図3C-Dに示されています。
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Representative Results
心外膜は、効率的に外側の位置を利用することと発達可塑性及びEPDCの固有の遊走挙動を利用して成長培養アッセイを用いて単離することができます。マウス胚性心臓を前にダウンコラーゲンコートしたチャンバースライド上の心外膜EMT培養背側にE11.5で分離されている26（ 図1A、B）。外植心臓は収縮していきます。しかし、心外膜はコラーゲンマトリックスに付着し、培養24時間（ 図1C）内の心筋からオフに移行します。心外膜細胞は、中皮アイデンティティ（ 図1C-E）を示す、敷石状形態を有する心臓から発せられる観察することができます。培養の24時間後に、心外膜枯渇心臓は、遺伝子またはタンパク質発現分析のために除去されます。
epitheli観察に加えて、ら形態、心外膜細胞培養物の純度をさらに心外膜制限遺伝子およびタンパク質マーカーの発現によって確認することができます。心外膜細胞外植片は心外膜枯渇心（ 図2A）と比較して、心外膜と中皮マーカー（Aldh1a2、Tcf21、およびWT1）の強い発現と心筋細胞の遺伝子（Nkx2-5とMYH7）の低発現を示します。さらに身元を確認するために、心外膜細胞培養物は、中皮細胞と細胞間タイトジャンクションにラベルを付けるためにウィルムス腫瘍1（WT1）と透明帯occludensタンパク質1（ZO1）に対する心の除去および抗体で共染色した後、48時間を固定され、それぞれ37,38（ 図2B）。この伸長培養方法は、中皮細胞の比較的高い純度が得られます。ただし、ユーザーが細胞の混入のわずかな割合を観察することができます。線維芽細胞および平滑筋細胞がnucleの顕著な不在と細長い間葉表現型を示しますWT1 ARとタイトジャンクション（ 図2C）を組織しました。非心外膜細胞の汚染の量を制限するためのトラブルシューティングの手法を議論に展開されています。
外植片伸長アッセイは、 インビトロで心外膜生物学を問い合わせるために有用な培養系です。心外膜細胞の可塑性を実証するために、外植片を、間葉系細胞26,28への分化転換を誘導するために、[10ng / mLの】TGF-β1で刺激しました。刺激の24時間後、EPDCは特に文化39（赤図2D）の周囲に、低下しZO1染色および平滑筋αアクチン陽性のストレスファイバー（ACTA2またはSMA）の堅牢なデノボ形成と間葉表現型を採用します。これとは対照的に、外植片の周囲にmonolayeの中心でより定義された細胞間の連絡先（ZO1、緑）でコンフルエント心外膜細胞を繊維集合体を強調するために皮質アクチンのR表示ACTA2タンパク質発現。
EMTを受けることに加えて、EPDC非心筋細胞集団のかなりの割合を構成し、心筋に侵入し、分化します。 EPDCの運動性は、E12.5心臓の外側をGFP 9,18（ 図3A）を発現するアデノウイルスで標識することにより、以前に確立エキソビボ器官培養系を用いて評価することができます。標識の心はEPDCの移行を促進するために、TGF-β1[10ng / mLの]およびPDGF-BB [20 ngの/ mlの]の存在下で3日間さらに培養されます。器官培養物を定期的に培養プレートの表面にex vivoで心臓の付着を防止するために回転されます。 in vitroでのスクラッチアッセイとの双方向の移行とは対照的に、このシステムは、3次元モデルでEPDC運動の全体心外膜及び評価の効率的な標識を可能にします。 EPDCの移行はobserですColIV（赤）心外膜下基底膜16に、または越えてGFP陽性心外膜細胞の浸潤（ 図3B、C）としてVED。このシステムの有用性を例示するために、我々は最近、MRTF / SRFシグナル伝達軸の操作がEPDC 9の運動性に影響を与えることができることを示しています。フロックス対立遺伝子のCre媒介切除（MRTFdKO）によりMrtfaとMrtfbの削除は心外膜下空間にEPDCの移行を減衰させます。逆に、C57BL / 6心の中でMRTF-A（広告/ MRTF-A）の強制発現が増加EPDCの移行とColIV基底膜（ 図3C、D）の破壊につながります。
| 遺伝子 | フォワード | 逆 | NCBIのアク |
| Aldh1a2 | GGCACTGTGTGGATCAACTG | TCACTTCTGTGTACGCCTGC NM_009656 | |
| GAPDH | CGTGCCGCCTGGAGAAAC | TGGGAGTTGCTGTTGAAGTCG | NM_001289726 |
| MYH7 | GTGGCTCCGAGAAAGGAAG | GAGCCTTGGATTCTCAAACG | NM_080728 |
| Nkx2-5 | GACGTAGCCTGGTGTCTCG | GTGTGGAATCCGTCGAAAGT | NM_008700 |
| Tcf21 | CATTCACCCAGTCAACCTGA | CCACTTCCTTCAGGTCATTCTC | NM_011545 |
| WT1 | ATCCGCAACCAAGGATACAG | GGTCCTCGTGTTTGAAGGAA | NM_144783 |
表1：フォワードのシーケンスと心外膜と心筋制限遺伝子発現の解析によって心外膜伸長文化純度の検証に用いたプライマーを逆に遺伝子発現を定量RT-PCRののWiによって決定されます。以下のパラメータ番目：10秒間95℃で変性。 30秒60℃アニーリング。 50倍のサイクルを繰り返します。
図1：伸長文化アッセイ （A）心外膜変調および分析のために推奨されるタイムラインと心外膜成長外植片アッセイの概略図を使用した主心外膜細胞の単離 。 （B - E）外植アッセイ中の種々の時点の代表的な明視野画像。 （B）胚日E11.5のマウスの心臓はコラーゲン基板上に背側を下に配置されています。 （C）心外膜細胞（白矢じり）を培養の3-4時間以内に心をオフに移行を開始します。血液細胞（黒矢印）が近くの蓄積や心外膜成長時に外植片をカバーすることができます。 （D、E）の後に文化の約24時間、心臓を取り出して、心外膜の単層は、チャンバースライドに付着したままです。携帯増殖物は、細胞の敷石状の配列と上皮形態を表示します。スケールバー=250μmである（BD）または50ミクロン（C、E）。 H =心臓、LA =左心房、LV =左心室、OFT =流出路、RA =右心房、RV =右心室。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：心外膜細胞の伸長の純度の評価 （A）心外膜枯渇E11における心筋遺伝子発現（Nkx2-5とMYH7）に比べて成長の文化に心外膜制限マーカー（Tcf21、Aldh1a2、およびWT1）の定量RT-PCR検証。 5心。データrepresen平均T SEM（群当たりn = 8）を±。アスタリスクは、**** P <0.0001でスチューデントT検定を用いて統計的有意性を示します。 （B）非刺激増生心外膜発現のために（赤WT1、）、細胞間タイトジャンクション（ZO1、緑）、および核の代表同時免疫染色（DAPI、青）。 （C）成長培地中の細胞の混入の例。心外膜細胞（アスタリスク）特性中皮アイデンティティ（核WT1、赤）と組織化上皮のタイトジャンクション（ZO1、緑）とパネルの右側に観察されます。センターに隣接するセル（白矢じり）は、最小限の核WT1タンパク質と未組織ZO1染色で微分干渉コントラスト（DIC）イメージング、で示される細長い間葉形態を呈します。 （D）心外膜細胞培養物（1mgの/ mlのBSAで4ミリモルのHCl）ビヒクルで刺激した、またはTGF-β1[10ng / mLの]心外膜を誘導することEMT。 TGF-β1刺激は、外植片の中心に、または単層のエッジまたは周辺部に移動する細胞のストレスファイバーにコンフルエント細胞の皮質領域でACTA2（赤）の強い発現を促進します。細胞接着は、ZO1（緑色）によって標識されています。スケールバー=25μmの（BD）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：EPDC運動性のex vivo評価 （A）ex vivoでの心臓培養アッセイの概略タイムライン。 （B）24時間広告/ GFP（緑色）で形質導入したC57BL / 6 E12.5心臓の代表的な5μmのセクションでは、心臓の外側にラベルを付けます。ex vivoで心がTGF-βでさらに48時間、続いて培養しましたβ1[10ng / mLの]及びPDGF-BB [20 ngの/ mlの] EPDCの移行を刺激します。セクションは、（青DAPI、）心外膜下基底膜および核を標識するColIV（赤）のための共染色した。 エクスビボ心臓培養形態はDICで示されています。 LV =左心室、RV =右心室、RA =右心房。 （C、D）MRTF / SRF規制軸を変調することにより、ex vivoでの遊走アッセイの適用例。この図は、[9]から変更されています。 Mrtfb FL / FL胚およびAd / GFPと対照ウイルスまたは24時間Creリコンビナーゼを発現するアデノウイルスで形質導入したex vivoでの文化は、その後、TGF-β1で刺激した[10 ngの; - / - E12.5心臓をMrtfaから単離しました。 /ミリリットル]およびPDGF-BBさらに48時間、[20 ngの/ mlの]。 EPDC運動（白矢印）に又はColIV（赤）を超えたGFP陽性細胞（緑色）の移動として観察されます。 <中MrtfbのCre介在欠失em>のMrtfa - / - EPDC移動の減衰の背景（MRTFdKO）の結果は、心を制御するために比較しました。逆に、E12.5 C57BL / 6心の中でMRTF-A（広告/ MRTF-A）の発現を強制EPDCの移行を強化します。 （D）％GFP陽性の細胞遊走の定量。データは、SEM（各条件についてはn = 4心）±平均値として提示されています。データは、アスタリスクは、**** P <0.0001でチューキー事後検定によって統計的有意性を示すと共に一方向ANOVAを用いて解析しました。スケールバー=200μmの（B）または25ミクロン（C）。すべての画像は反転共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて得た。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、伸長してプライマリ心外膜細胞を分離し、ex vivoでの心臓培養物中のEPDCの移動を追跡するための詳細な方法を概説します。伸長の文化のために、心外膜枯渇心を除去するための適切な時間は、実験間で多少異なります。一晩のインキュベーションの後、外植片の定期的なモニタリングが心外膜伸長の程度を測定すると、線維芽細胞が出現する前に心を抽出することをお勧めします。純度を保証するために、心は非心外膜系統の蓄積を防止するために、外植の24時間以内に削除する必要があります。流出路とも夾雑細胞型27,40を減らすことができるチャンバースライドに心を転送する前に、両方の心房を離れてトリミング。胎児心が時間と同じ条件下で培養の狭いウィンドウの間にマウスのトイレから隔離されているので、増生が表示されるまでに時間が実験内の別の心臓から比較的類似しています。したがって、すべての心がbの必要があります外植片の大半は心外膜増生を示すときに電子を除去しました。いくつかのケースでは、心外膜細胞は、この外植片が実験から除外されなければならない場合には他のもの、より積極的に収縮され、心臓から効率的に移行されません。
血液細胞の蓄積は、多くの場合、このように、それが困難な増殖物を視覚化すること、心外膜細胞（矢印、 図1C）の平坦な単層を隠すことができます。過剰な血液細胞の寄与を回避するために、心は胚から解剖時に数分間HBSS中に残ることができます。これは、胎児の心臓のための十分な時間がチャンバースライドに転送される前に、心腔内の残留血液を送り出すことができます。あるいは、第一一晩のインキュベーションの後、外植媒体Aと文化を補完することは、いくつかの余分な血液を洗い流すと増生を明らかにするのに役立ちます。表面張力が心を引き起こすことができるようしかし、メディアのレベルが心を超えて上昇しないでください基板から離れて引っ張ります。ロバスト心外膜増殖物は、培養基質としてコラーゲンタイプIを使用して観察されます。しかしながら、他の基質は、生物および/ またはアプリケーション27,40-42によって報告されています。このプロトコルを使用して、一次胎児心外膜細胞は、心臓の除去、毎日培地補充以下の4日間繁栄することができます。しかしながら、培養物のより長い期間を必要とする実験計画は、エンドユーザによって決定されるべきです。心外膜EMTが強く、胚発生の間に活性化されるので、この成長培養技術は、胎児の心外膜細胞の濃縮に限定されます。他のグループは、成人心外膜細胞43,44を分離する方法を記載しています。
ex vivoでの遊走アッセイ、心臓抽出および心外膜細胞標識のために二つの理由からE12.5で推奨されています。まず、E12.5後に単離された心が大きくなっているので、生存能力をサポートするために、より多くの灌流を必要とします。栄養素の単純拡散sが大きい心臓から器官培養物を維持するのに十分ではありません。第二に、心外膜EMTとEPDCの移行がE12.5の周りに起こります。そのため、心外膜はEPDCの検出を最大化するために、心臓抽出した直後に蛍光タンパク質を発現するアデノウイルスで標識されるべきです。また、カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（CFSE）は、以前に心臓の外側にラベルを付け、EPDC移行10,45をトレースすることが報告されています。
伸長アッセイとは対照的に、ex vivo での培養は、心臓の付着および心外膜細胞の成長を防ぐために定期的に揺動されるべきです。培養物はまた、継続的に最低速度設定にロッカーを装備したインキュベーター中で撹拌することができました。ユーザーは、器官培養の数日以内に心臓の形態の変化に気づくでしょうし、心臓分離の72時間を超えて分析を避ける必要があります。このアッセイを使用して、EPDC浸潤は、培養の48〜72時間以内に観察されます。 Cre-loxP系ながら、冠血管系、心筋間質、および心室中隔7,22にEPDCの局在をマッピングするためにインビボで使用されてきた、このex vivoの技術は、サブ心外膜空間のいくつかの細胞層内EPDCの移行に限定されています。したがって、この方法はEPDC運動性および浸潤の調節因子を決定するのではなくEPDCの移行の最終的な宛先を定義するために適しています。
心外膜細胞の単離およびex vivo遊走アッセイは、関数アプローチの損益との組み合わせで、すでにEPDC生物学9,18,46に影響を与える可能性がある候補遺伝子を評価するために有用であることが証明されました。これらの方法はまた、EPDC遊走の新規調節因子を同定するための機能獲得または機能喪失型スクリーンのためのプラットフォームを提供します。この戦略は、蛍光活性化細胞選別または単一細胞RNA配列決定に関連して、また、心外膜の不均一性を精査する機会を提供することができますより詳細にとEPDC分化。最後に、これらの手順の改変は、心臓再生医療のために心外膜細胞とEPDC生物学に影響を与える小分子についてスクリーニングを開発するために使用することができます。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
EMSは、国立衛生研究所（NIH）からの助成金[助成金番号R01HL120919]によってサポートされていました。米国心臓協会（American Heart Association）[助成金番号10SDG4350046]; NIH [助成金番号UL1 TR000042]からロチェスター大学CTSAの賞を受賞。そしてAAB CVRIからスタートアップ資金。 MATは、ハワード・ヒューズ医療研究所メッド・イントゥ・グラッドイニシアティブから医学と歯学のロチェスター校の大学への助成金によって部分的にサポートされていました。 NIHからと制度ルースL.キルシュシュタイン国立研究サービス賞[助成金番号GM068411]。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Hyclone | SH3002201 | DMEM |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Hyclone | SH3003102 | HBSS |
| Medium 199 | Hyclone | SH3025301 | M199 |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Hyclone | SH3002802 | DPBS |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100-106 | FBS |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Hyclone | SV30010 | |
| Corning Biocoat Collagen I, 4-Well Culture Slides | Corning | 354557 | |
| Multiwell 24-well plates | Falcon | 08-772-1 | |
| Dissecting microscope | Leica | M50 | Equipped with Leica KL300 LED might source |
| Confocal miscroscope | Olympus | 1X81 | Equipped with muli-argon laser 405/488/515, FV10-MCPSU laser 405/440/635, 559 laser, and mercury lamp |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Transforming growth factor beta 1 | R&D Systems | 100-B-001 | TGF-β1 |
| Platelet-derived growth factor BB | R&D Systems | 220-BB-010 | PDGF-BB |
| Trizol Reagent | Applied Biosystems | 15596-026 | Caution, hazardous material |
| TURBO DNA-free Kit | Life Technologies | AM1907 | DNaseI |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891 | |
| UltraPure Glycogen | Life Technologies | 10814-010 | |
| SYBR Green | BioRad | 170-8880 | |
| Protease inhibtor cocktail tablets | Roche | 11836170001 | |
| Alexa Goat-anti-rabbit 488 | Life Technologies | A11008 | Secondary antibody |
| Alexa Goat anti-rabbit 594 | Life Technologies | A-11012 | Secondary antibody |
| Alexa Goat anti-mouse 594 | Life Technologies | A-11005 | Secondary antibody |
| Mouse anti-smooth muscle alpha actin, Cy3-conjugated | Sigma-Aldrich | C6198 | monoclonal antibody, clone 1A4 |
| Mouse anti-Wilms tumor 1 (WT1) | Life Technologies | MA1-46028 | monoclonal antibody, clone 6F-H2 |
| Rabbit anti-ZO1 | Life Technologies | 40-2200 | polyclonal antibody |
| Rabbit anti-Collagen Type 4 | Millipore | AB756P | polyclonal antibody |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Life Technologies | D1306 | DAPI |
| Fluorescent mounting medium | DAKO | S3023 | |
| 16% Paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA diluted to 4% in DPBS. Caution, hazardous material |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Tissue Freezing Medium | Triangle Biomedical Sciences | TFM-B | |
| Pap pen | DAKO | S2002 | |
| Disposable mictrotome blades | Sakura Finetek | 4689 | |
| Microscope slides | Globe Scientific | 1358W | positively charged, 25 mm x 75 mm x 1 mm |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Disposable base molds | Fisher Scientific | 22-363-553 | |
| Ketamine | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Akorn | NADA 139-236 |
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