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Artigo de método

Epicárdio Conseqüência Cultura Ensaio e

8.2K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/53750

⸱

18 de março de 2016

 ,  , 
1Aab Cardiovascular Research Institute, University of Rochester School of Medicine and Dentistry, 2Department of Medicine, University of Rochester School of Medicine and Dentistry, 3Department of Pharmacology and Physiology, University of Rochester School of Medicine and Dentistry

Neste artigo

Resumo

Aqui, descrevemos métodos para isolar células epicárdicas primárias de camundongos por um ensaio de cultura de crescimento e avaliar a migração funcional de células derivadas de epicárdio (EPDC) usando um sistema de cultura cardíaca ex vivo. Esses protocolos são adequados para identificar moduladores genéticos e químicos da transição epicárdica epitelial-mesenquimal (EMT) e motilidade.

Resumo

Uma única camada de linhas de células do epicárdio do coração, proporcionando factores parácrinos que estimulam a proliferação de cardiomiócitos e que contribui directamente progenitores cardiovasculares durante o desenvolvimento e a doença. Embora um certo número de factores têm sido implicados na célula (EPDC) mobilização derivado do epicárdio, os mecanismos que regem a sua migração e diferenciação subsequente são mal compreendidos. Aqui, apresentamos in vitro e as estratégias ex vivo para estudar EPDC motilidade e diferenciação. Em primeiro lugar, descreve-se um método de obtenção de células do epicárdio primárias por cultura excrescência do coração embrionário do rato. Nós também introduzir um protocolo detalhado para avaliar a migração tridimensional de EPDC marcado num sistema de cultura de órgãos. Nós fornecemos provas usando essas técnicas que deleção genética dos fatores de transcrição relacionados com myocardin no epicárdio atenua a migração EPDC. Esta abordagem serve como uma plataforma para avaliar modificadores candidatos da EPDCbiologia e pode ser utilizado para desenvolver telas genéticos ou químicas para identificar novos reguladores de EPDC mobilização que possam ser úteis para a reparação cardíaca.

Introdução

O epicárdio é uma única camada de células mesoteliais que reveste o coração e impactos cardíaca desenvolvimento, maturação e reparação. Através de uma troca altamente coordenada de sinais parácrinos, o diálogo íntimo entre o miocárdio e epicárdio é indispensável para o crescimento cardíaco e a formação de não-miócitos cardíacos linhagens 1. Células derivadas de epicárdio (EPDC) emergir a partir de um subconjunto de células do epicárdio através de um epitelial-a-mesenquimal transição (EMT) 2, invadem o espaço subepicárdico e miocárdio subjacente, e se diferenciam em grande parte, em células murais vasculares coronárias e fibroblastos cardíacos, e para uma menor extensão, células endoteliais e cardiomiócitos 3-9.

Os mecanismos que regulam EMT epicárdico e EPDC invasão têm sido atribuídas à acção coordenada de vários ligandos, incluindo as moléculas segregadas 10-13, receptores da superfície das células e moléculas de adesão, 14,15 mentoLators de polaridade apical-basal, 16,17, 18,19 GTPases pequenas, e factores de transcrição 2,20,21. Enquanto muitos dos efectores moleculares de migração EPDC ter sido definida, uma melhor compreensão dos sinais fisiológicos que estimulam EPDC mobilização no embrião pode acelerar o desenvolvimento de estratégias para manipular este processo no adulto para melhorar a reparação cardíaca.

Estudos destinadas a identificação de novos reguladores de EPDC mobilização dependem de purificação desta população de células ou traçando a migração de células do epicárdio individuais. Um ou uma combinação de genes marcadores, incluindo WT1, Tcf21, Tbx18, e / ou ALDH1A2, é vulgarmente utilizada para identificar o epicárdio fetal 1. No entanto, a utilização destes marcadores para controlar a migração EPDC não é óptima quanto a expressão de marcadores do epicárdio diminui ao longo do desenvolvimento do coração e é muitas vezes perdida quando as células do epicárdio submetidos a transdifdiferen- em células mesenquimais.

A aplicação do sistema Cre / loxP, em conjunto com os repórteres de rastreamento de linhagem, tem sido útil na rotulagem permanentemente o epicárdio e seus descendentes durante o desenvolvimento do coração e após a lesão isquêmica no adulto 7,22,23. Várias linhas de Cre-restrito do epicárdio foram geradas e são amplamente usadas para rotular EPDC e para o gene condicional estratégias de exclusão 1. Estes estudos levaram à caracterização de várias linhagens do epicárdio, e a identificação de mediadores críticos de EPDC motilidade e diferenciação. No entanto, evidências acumuladas também sugere o epicárdio é uma população heterogênea de células progenitoras 4,24,25. Deste modo, apenas um subconjunto de células do epicárdio vai ser alvo utilizando um determinado condutor de Cre.

A fim de marcar todo o epicárdio independentemente da especificidade de Cre, um número de laboratórios utilizaram cul excrescênciasistemas tura ou ex vivo métodos de cultura de órgão para isolar fielmente ou marcar as células do epicárdio sem depender da expressão genética de uma linhagem marcadores 26-28. Para ex vivo estudos de migração, corações embrionárias são isoladas antes da EMT epicárdio e cultivadas em meio suplementado com uma proteína verde fluorescente (GFP) -expressing adenovirus (Ad / GFP) 9,18. Esta abordagem permite a marcação eficiente de todo o epicárdio ao invés de um subconjunto de células, a recombinação mediada por Cre. Culturas cardíacos são subsequentemente expostas a indutores conhecidos de EMT para estimular a mobilização de EPDC 28,29. Ex vivo e in vivo são complementadas por análises in vitro Culturas de explantes do epicárdio, que são uma abordagem particularmente útil para explorar mecanismos detalhados condução migração EPDC.

Aqui, descrevemos métodos para isolar as células do epicárdio primárias para estudos in vitro de epicardiai EMT, bem como um sistema de cultura de órgãos ex vivo para análises de EPDC motilidade. Recentemente, demonstrou a utilidade e robustez deste método pelo geneticamente modulando o factor relacionado com myocardin transcrição (MRTF) / factor de resposta do soro (SRF) eixo sinalização para manipular a migração baseado em actina de EPDC 9. Enquanto nossos resultados destacam uma via de sinalização necessária para regular a migração EPDC, estes métodos são adequados para desvendar os mecanismos que coletivamente orquestram a migração EPDC e diferenciação. Além disso, o ex vivo sistemas de cultura de explante e poderia ser implementado em telas funcionais para identificar novos reguladores de EPDC mobilização para aplicações terapêuticas em regeneração cardíaca.

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Protocolo

NOTA: Todas as experiências com camundongos foram aprovados pelo Comitê da Universidade de Recursos Animais da Universidade de Rochester.

1. epicárdica Conseqüência Cultura Ensaio (Figura 1A)

  1. preparativos
    1. Prepare 5 ml de meio A para o isolamento de células do epicárdio primária suplementando o meio 199 (M199) com 5% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina (Pen / Strep).
    2. Pré-aquecido meio A e 100 mL de Hanks Solução Salina Equilibrada (SSHE) num banho de água a 37 ° C.
    3. Permitir lâminas de câmara revestidas com colagénio a aquecer até à temperatura ambiente durante 30 min.
    4. Adicionar 100 ul de meio A a cada poço da câmara de corrediça e rodar cuidadosamente para revestimento uniformemente a superfície do colagénio. Repita o procedimento para 8-12 poços. Remova a mídia depois de câmaras de revestimento.
    5. Aliquota pré-aquecido HBSS em duas placas de 10 cm2 contendo 50 ml de cada vez de HBSS.
  2. Isolar embrionárias Corações de Dam gravida em 11,5 dias post coitum (DPC).30
    1. Anestesiar rato com 0,5 mL de 13 mg / ml de cetamina / 0,88 mg / ml de cocktail de xilazina em 1x de Dulbecco tamponada com fosfato salino (DPBS) através de injecção intraperitoneal. Confirmar anesthetization adequada usando um teste toe pitada. Uma pitada suave é suficiente para determinar se o mouse é sensível. Qualquer movimento ou pata retirar indica que o animal não está suficientemente anestesiados para fazer a cirurgia. Eutanásia por deslocamento cervical.
    2. Coloque o rato que enfrenta o lado ventral para cima e pulverizar o abdômen com 70% de etanol para reduzir a contaminação pelo cabelo.
    3. Comprimir a pele com uma pinça e cortar uma incisão lateral no abdômen com uma tesoura cirúrgica. Segure a pele firmemente e puxe para além de indicações para a cabeça ea cauda de oposição.
    4. Comprima o peritoneu com uma pinça e cortado com uma tesoura para expor a cavidade abdominal.
    5. Remova cuidadosamente a decídua cortando ao longo da mesométrio. Transferir a decidua dissecados para pré-aquecido HBSS no primeiro10 cm 2 prato.
    6. Separe a decídua pelo corte entre embriões.
    7. Transferir um embrião para a segunda placa de 10 cm2 com HBSS pré-aquecido sob um microscópio de dissecação. Remova cuidadosamente o tecido e saco vitelino extraembryonic, então decapitar o embrião.
    8. Beliscar a parede torácica com uma pinça e rasgar o tecido distante na linha média, expondo a cavidade torácica.
    9. Coloque a pinça por trás do coração. Segure a via de saída e puxe o coração longe do embrião. Separar o trato pulmonar e pulmões do coração, se ainda ligado.
  3. Transferir o coração a um único poço da lâmina revestida de colagénio e coloque-o lado dorsal para baixo (Figura 1B). Repetir passos 1.2.7-1.3 para cada embrião.
  4. Uma vez que todos os corações foram transferidas para poços individuais, incubar a corrediça câmara durante 30 min a 37 ° C, 5% de CO2 para permitir a adesão suficiente para a matriz de colagénio.
  5. cuidadosamente adicionar20-50 mL de pré-aquecido meio de explante A volta de cada coração. Importante: Não adicione o meio demasiado depressa ou a um nível acima do coração, caso contrário corações pode soltar-se o substrato de colágeno.
  6. Cultura os corações a 37 ° C, 5% de CO 2 durante cerca de 24 h, para permitir crescimento do epicárdio. Nota: excrescências podem ser observadas tão cedo quanto 3-4 horas de cultura (Figura 1C) e consiste principalmente de células de mesotélio que exibem morfologia de paralelepípedo, com a contaminação de células mesenquimais mínima (Figuras 1D, E). Os resultados representativos foram adquiridos utilizando um microscópio de dissecção equipado com uma câmara.

2. A ablação genética e indução de EMT em epicárdicas excrescências

Cuidado: Pega adenovírus com cuidado de acordo com as diretrizes de biossegurança aprovados.

  1. Preparar 15 ml de meio B (M199 suplementado com 1% FBS e 1% de Pen / Strep) e pré-aquecido a 37 ° C num banho de água.
  2. Para excisãoalelos floxed, prepare explante meio B suplementado com 2,5 x 10 4 ufc / ml de adenovírus que expressam Cre recombinase (Ad / CRE) ou vírus controle.
    Nota: sobreexpressão mediada adenoviral de genes candidatos pode também ser levada a cabo para avaliar o ganho de fenótipos funcionais. títulos virais deve ser determinada pelo utilizador final.
  3. Remova cuidadosamente corações empobrecido-epicárdio de culturas de crescimento usando uma pinça. corações de transferência para tubos de 1,5 ml com 800 ul de Trizol e armazenar a -80 ° C para posterior isolamento do ARN e análise de expressão génica.
  4. Lavar cada poço com DPBS para eliminar as células do sangue e excesso de detritos celulares.
  5. Adicionar 500 ul de explante meio B, suplementado com adenovírus (es) a cada cultura de crescimento e incubar durante 24 horas a 37 ° C, 5% de CO 2.
  6. Para a indução de EMT, remova o material e encher com 37 ° C explante meio B, suplementado com factor de crescimento de transformação recombinante (TGF) -β1 [10 ng / ml] ou veículo (h 4mMácido ydrochloric (HCl) contendo 1 mg / ml de albumina de soro bovino (BSA)). Explantes de cultura para uma 24 horas adicionais a 37 ° C, 5% de CO 2. Proceda com gene / proteína analisa expressão ou imunocitoquímica, conforme detalhado nos protocolos subsequentes.
    Nota: A indução de EMT epicárdica foi estimulada com várias concentrações de TGF-β1 variando de 0,5 ng / mL - 10 ng / ml 26,31-33. Concentrações mais elevadas de ligando pode resultar na ligação não específica a todos os receptores de TGF-β. A concentração de TGF-β1 deve refletir os objetivos experimentais específicos.

Análise Expression 3. Gene de epicárdicas excrescências

  1. corações empobrecido-epicárdio descongelamento previamente armazenadas em Trizol (2.2).
  2. Aspirar meios de culturas EPDC e lavar duas vezes com DPBS.
  3. Adicionar 800 mL Trizol temperatura ambiente para explante culturas.
  4. Incubar corações empobrecido-epicárdio e culturas EPDC em Trizol por 5 min a temperatu quarto ré. Pipeta cima e para baixo dez vezes para homogeneizar a amostra lisadas.
    Nota: Os corações pode exigir mais de pipetagem para homogeneizar completamente.
  5. Transferir os lisados ​​para tubos de 1,5 ml e completar o isolamento de RNA total acordo com as instruções do fabricante. Adicionam-se 10 ug de glicogénio antes da precipitação para aumentar o rendimento de ARN. Um explante dado irá produzir cerca de 0,5-1,0 ug de ARN.
  6. Remover o ADN contaminante, com a ADNase I e a transcrição reversa mRNA de 0,5 ug acordo com as instruções do fabricante.
  7. Validar a pureza de explantes e / ou indução de EMT com transcrição reversa quantitativa do epicárdio (qRT) -PCR 34 utilizando SYBR Green e os marcadores descritos na Tabela 1. Os níveis de ARNm Normalizar a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) e calcular a expressão relativa usando o 2 - método ΔΔCt 35. Os resultados típicos são mostrados na Figura 2A.
title "> 4. análise de proteínas de epicárdicas excrescências

  1. Aspirar meios de culturas EPDC e lavar duas vezes com DPBS.
  2. Adicionar 10 ul de tampão de lise proteína arrefecido com gelo (Tris 50 mM, pH 7,5, cloreto de sódio 150 mM, 1 mM de ácido etilenodiaminotetraacético pH 8,0, 1% de Triton X-100, cocktail 1x inibidor da protease) a cada câmara bem e coloque a lâmina Secção de gelo. Cortar cerca de ¼ do fundo em uma ponta da pipeta P200 e usar a parte restante para raspar as células fora do slide. Pipeta cima e para baixo para as células do epicárdio lisar e transferência para um tubo de 1,5 ml.
  3. Sonicate explantes lisadas em baixa (160 W) durante 5 min em um banho de água gelada com 30 ciclos seg ON e OFF.
  4. Centrifugar os lisados ​​durante 10 minutos a 10000 xg, 4 ° C. Transferir o sobrenadante para um tubo fresco e determinar a concentração de proteína utilizando um ensaio de proteína de 36.
    Nota: A explante dada vai render até 1,5 ug de proteína total. Descobrimos que pooling explantes de dois corações umd carga de proteína de 2 ug por poço é suficiente para detectar o músculo liso α-actina (ACTA2) e GAPDH 9. A detecção de outras proteínas alvo podem exigir reunindo múltiplas amostras de explante tal como determinado pelo utilizador final.

5. Imunocitoqu�ica de epicárdicas excrescências

  1. Remova a mídia da cultura de explantes e lavar duas vezes com DPBS.
  2. Suavemente adicionar 500 uL de paraformaldeído a 4% (v / v) ou de metanol arrefecido em gelo a cada poço e corrigir explantes durante 5 min à temperatura ambiente ou 10 min a -20 ° C, respectivamente. Fix acordo com as especificações de anticorpo, tal como recomendado pelo fabricante.
  3. Remover fixador e lavar cada poço com DPBS três vezes durante 5 min.
  4. Permeabilizar as células com 500 ul de 0,1% (v / v) de Triton X-100 em DPBS durante 5 min.
  5. Remoção da solução de permeabilização e enxaguar com DPBS três vezes por 5 min.
  6. Bloquear as células com soro a 10% em DPBS durante 30 minutos à temperatu quartoré.
  7. Continuar com coloração de anticorpo primário acordo com as recomendações do fabricante e as condições óptimas como determinado pelo utilizador final.
  8. Remoção da solução de anticorpo e lavar com DPBS três vezes durante 5 min.
  9. Aplicar anticorpo secundário por instruções do fabricante e contrastante com um corante nuclear apropriado.
  10. Remoção da solução de anticorpo e lavar com DPBS três vezes durante 5 min.
  11. Remover paredes deslizantes câmara de acordo com as instruções do fabricante e adicionar meio de montagem aquoso directamente para as células. Coloque uma lamela sobre as células e selar com unha polonês. Os resultados típicos são mostrados na Figura 2B - 2D utilizando microscopia confocal invertido.

6. Cultura Ensaio Ex Vivo (Figura 3A)

  1. preparativos
    1. Preparar 12 ml de meio de cultura ex vivo usando um (1: 1) mistura de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM): M199 suplementado com 10%FBS e 1% de Pen / Strep.
    2. Em um banho de água a 37 ° C, pré-aquecido ex vivo meio de cultura e 100 ml de HBSS.
    3. Alíquotas de 1 ml meio de pré-aquecida em 8-12 poços de uma placa de 24 poços.
    4. Transferência de HBSS pré-aquecido a duas 2 placas de 10 cm, contendo 50 ml de cada vez.
  2. Isolar rato corações embrionárias em HBSS (como descrito em 1.2) a partir de vacas prenhes em 12,5 dpc.
  3. Transferir cada coração para um único poço da placa de 24 poços contendo meio de cultura ex vivo. Incubar a placa a 37 ° C, 5% de CO2 com agitação suave manualmente ou utilizando uma plataforma de agitação para evitar a adesão. proceder imediatamente para o passo 7.1.

7. Epicárdica Labeling e EMT Indução em culturas ex vivo

  1. Para identificar o epicárdio, prepare-se 12 ml de meio de cultura C 37 ° ex vivo suplementado com 3,0 x 10 6 ufc / ml de Ad / GFP. Para ablação direccionada de alelos floxed, transferência de 6 ml de umad / GFP suplementado meio de cultura para um novo tubo de 15 ml. Adicionar Ad / Cre ou controlar adenovírus a uma concentração final de 1,5 x 10 6 pfu / ml.
    Nota: O ganho de função análises também pode ser levada a cabo com a entrega de genes mediada por adenovírus apropriado.
  2. Cuidadosamente remover o meio de cultura de cada poço da placa de 24 poços utilizando uma ponta de pipeta P1,000.
  3. Adicionar cuidadosamente meio de cultura suplementado com adenovírus (es) a cada poço.
  4. Incubar a placa a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 24 horas com agitação suave.
  5. Para a indução de EMT, preparar 12 ml de 37 ° C ex vivo meio de cultura contendo 10 ng / ml de TGF-β1 e ml de factor de crescimento de 20 ng / derivado de plaquetas (PDGF) ou -BB veículo (HCl 4 mM contendo 1 mg / ml de BSA ).
  6. Cuidadosamente remover o meio de cultura de cada poço da placa de 24 poços utilizando uma ponta de pipeta P1,000. Lave os corações com 1 ml de DPBS.
  7. Retire os DPBS e encher os corações com a cultura ex vivo medium contendo TGF-β1 e PDGF-BB ou veículo.
  8. Incubar durante 24 horas a 37 ° C, 5% de CO2 com agitação suave.

8. A crioconservação e imuno-histoquímica de culturas ex vivo

  1. Preparar os corações para a criopreservação.
    1. Remover o meio de cultura e lava-se duas vezes com corações DPBS arrefecido com gelo.
    2. Adicionar 1 mL de 4% (v / v) de paraformaldeído a cada coração e fixar durante 2 horas a 4 ° C com agitação suave.
    3. Remover o fixador e lava-se duas vezes com DPBS corações. Transferir os corações para poços frescas com 1 ml de 10% (w / v) de sacarose preparado em DPBS. Incubar a placa durante a noite a 4 ° C com agitação suave.
    4. transferir cuidadosamente corações para novos poços com 18% (w / v) de sacarose preparado em DPBS. Incubar a placa durante a noite a 4 ° C com agitação suave.
    5. Transferir cada coração a uma cryomold contendo meio de congelamento de tecidos. congelar imediatamente blocos usando azoto líquido e armazenar a -80 & #176; C.
  2. Seção corações em 5 mm, utilizando um criostato e colocar secções de tecido em lâminas de microscópio carregados positivamente. Loja desliza a -80 ° C até à coloração.
  3. Realizar imuno-histoquímica em secções de detecção da membrana basal sub-epicárdico.
    1. Descongelar as lâminas durante pelo menos 30 min à temperatura ambiente.
    2. Reidratar as seções por lavagem duas vezes em DPBS durante 5 minutos com balanço suave.
    3. secção permeabilizar com 0,1% (v / v) de Triton X-100 em PBS durante 5 min à temperatura ambiente.
    4. Lavar as lâminas duas vezes em DPBS durante 5 minutos com balanço suave.
    5. Seque o DPBS excesso e definir a região de coloração com uma caneta rotulagem hidrofóbica. secções de bloco com soro a 10% em DPBS durante 30 minutos à temperatura ambiente.
    6. Remova o bloco e aplicar anticorpo colágeno tipo IV (ColIV, 1: 200) diluído em bloco. Incubar durante a noite a 4 ° C numa câmara com humidade controlada.
    7. Lavam-se as lâminas três vezes em DPBS durante5 min com balanço suave.
    8. Dilui-se o anticorpo secundário conjugado com fluorescência (1: 500) e DAPI (1: 5000) em DPBS e aplicam-se as lâminas. Incubar durante 1 h à temperatura ambiente. Escolha um anticorpo secundário apropriado com um comprimento de onda de emissão e de excitação distinta da GFP.
    9. Lavam-se as lâminas três vezes em PBS durante 5 min com agitação suave. Mount slides com meio de montagem.

9. Imagem e Quantificação de culturas ex vivo

  1. Ter uma imagem de usuário cego e quantificar secções coradas. Imagem pelo menos cinco secções de tecido não-consecutivos de um dado coração em 4-5 locais arbitrários ao longo do epicárdio (extremidade do coração), utilizando um microscópio de fluorescência confocal ou na 40X. Os resultados típicos são mostrados na Figura 3B usando microscopia confocal invertido.
  2. contagem manual do número total de células positivas para GFP em uma dada imagem. Identificar migrando EPDC como GFP pocélulas sitive localizados dentro ou fora da membrana basal subepicárdico ColIV. Determinar a percentagem de migração de células de GFP, como o número de células positivas para GFP migrar sobre o número total de células positivas para GFP em uma dada imagem. Os resultados típicos são mostrados na Figura 3C-D, utilizando microscopia confocal invertido.

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Resultados

O epicárdio pode ser eficazmente isolados utilizando um ensaio de cultura de crescimento, tirando partido da sua localização exterior e explorando a plasticidade do desenvolvimento e do comportamento migratório intrínseca de EPDC. Corações embrionárias murinas são isolados em E11.5 antes EMT epicárdico e o lado dorsal para baixo cultivadas em lâminas de câmaras revestidas com colagénio 26 (Figura 1A, B). corações explantados continuará a se contrair; No entant...

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Discussão

Aqui destacamos métodos detalhados para isolar células do epicárdio primária por conseqüência e controlar a migração EPDC em ex vivo culturas cardíacos. Para as culturas conseqüência, o tempo apropriado para remover o coração empobrecido-epicárdio varia ligeiramente entre os experimentos. A monitorização periódica dos explantes após uma incubação durante a noite é recomendado para avaliar a extensão da excrescência do epicárdio e para extrair o coração diante de fibroblastos aparecer. Para garantir a pureza, co...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

EMS foi apoiado por bolsas de Institutos Nacionais de Saúde (NIH) [número de concessão R01HL120919]; a American Heart Association [número de concessão 10SDG4350046]; Universidade de Rochester prêmio CTSA do NIH [número de concessão UL1 TR000042]; e os fundos de inicialização do Aab CVRI. MAT foi apoiado em parte por uma bolsa para a Universidade de Rochester Faculdade de Medicina e Odontologia da Med Into--Grad Iniciativa Howard Hughes Medical Institute; e um Prêmio de Serviço Institucional Ruth L. Kirschstein Nacional de Pesquisa do NIH [número de concessão GM068411].

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Hyclone Médio Eagle Modificado da Dulbecco SH3002201Solução
salina balanceada DMEM Hanks 'HycloneSH3003102HBSS
Medium 199HycloneSH3025301M199
Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato HycloneSH3002802DPBS
Soro Fetal BovinoGêmeos 100-106
FBS Solução de Penicilina/EstreptomicinaHycloneSV30010
Corning Biocoat Collagen I, 4-Well Culture SlidesCorning354557
Multiwell 24-well PlacasFalcon08-772-1
Microscópio de dissecaçãoLeicaM50Equipado com Leica KL300 LED pode ser fonte
MiscroscópioconfocalOlympus1X81Equipado com laser muli-argon 405/488/515, laser FV10-MCPSU 405/440/635, laser 559, e lâmpada de mercúrio
BioruptorDiagenode UCD-200
Fator de crescimento transformador beta 1R& D Systems100-B-001TGF-β 1
Fator de crescimento derivado de plaquetas BBR& D Systems220-BB-010PDGF-BB
Trizol ReagentApplied Biosystems15596-026Cuidado, material perigoso
Kit TURBO sem DNATechnologiesAM1907DNaseI
iScript cDNA Synthesis KitBioRad1708891
UltraPure GlycogenLife Technologies10814-010
SYBR VerdeBioRad170-8880
Comprimidos de coquetel inibidor de proteaseRoche11836170001
Alexa Goat-anti-rabbit 488Life TechnologiesA11008Anticorpo secundário
Alexa Goat anti-rabbit 594Life TechnologiesA-11012Anticorpo secundário
Alexa Goat anti-mouse 594Life TechnologiesA-11005Anticorpo secundário
Camundongo anti-músculo liso alfa actina, Cy3-conjugado Sigma-AldrichC6198, clone 1A4
Tumor anti-Wilms de camundongo 1 (WT1)Life TechnologiesMA1-46028anticorpo monoclonal, clone 6F-H2
Coelho anti-ZO1Life Technologies40-2200anticorpo policlonal
Coelho anti-colágeno tipo 4MilliporeAB756Panticorpo policlonal
4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dicloridrato MeioDAPID1306
DAKOS3023
Solução de paraformaldeído a 16% Ciências deMicroscopia Eletrônica15710PFA diluído a 4% em DPBS. Cuidado, material perigoso
SacaroseSigma-AldrichS0389
Meio de congelamento de tecidosTriângulo Biomedical SciencesTFM-B
Pap canetaDAKOS2002
Lâminas de microtomo descartáveis Sakura Finetek4689
Globe Scientific1358Wcarregadas positivamente, 25 mm x 75 mm x 1 mm
Cryostat LeicaCM1950
FórcepsFine Science Tools11295-00
Tesoura CirúrgicaFine Science Tools91460-11
Moldes de base descartáveisFisher Scientific22-363-553
CetaminaHospiraNDC 0409-2051-05
XylazineAkornNADA 139-236
Life Anticorpo monoclonal de montagem fluorescente da Life Technologies Lâminas de microscópio

Referências

  1. von Gise, A., Pu, W. T. Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease. Circ Res. 110, 1628-1645 (2012).
  2. Martinez-Estrada, O. M., et al. Wt1 is required for cardiovascular progenitor cell formation through transcriptional control of Snail and E-cadherin. Nat Genet. 42, 89-93 (2010).
  3. Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Mentink, M. M., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions. Circ Res. 82, 1043-1052 (1998).
  4. Katz, T. C., et al. Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells. Dev Cell. 22, 639-650 (2012).
  5. Mikawa, T., Gourdie, R. G. Pericardial mesoderm generates a population of coronary smooth muscle cells migrating into the heart along with ingrowth of the epicardial organ. Dev Biol. 174, 221-232 (1996).
  6. Wilm, B., Ipenberg, A., Hastie, N. D., Burch, J. B., Bader, D. M. The serosal mesothelium is a major source of smooth muscle cells of the gut vasculature. Development. 132, 5317-5328 (2005).
  7. Zhou, B., et al. Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart. Nature. 454, 109-113 (2008).
  8. Dettman, R. W., Denetclaw, W., Ordahl, C. P., Bristow, J. Common epicardial origin of coronary vascular smooth muscle, perivascular fibroblasts, and intermyocardial fibroblasts in the avian heart. Dev Biol. 193, 169-181 (1998).
  9. Trembley, M. A., Velasquez, L. S., de Mesy Bentley, K. L., Small, E. M. Myocardin-related transcription factors control the motility of epicardium-derived cells and the maturation of coronary vessels. Development. 142, 21-30 (2015).
  10. Mellgren, A. M., et al. Platelet-derived growth factor receptor beta signaling is required for efficient epicardial cell migration and development of two distinct coronary vascular smooth muscle cell populations. Circ Res. 103, 1393-1401 (2008).
  11. von Gise, A., et al. WT1 regulates epicardial epithelial to mesenchymal transition through beta-catenin and retinoic acid signaling pathways. Dev Biol. 356, 421-431 (2011).
  12. Lavine, K. J., et al. Endocardial and Epicardial Derived FGF Signals Regulate Myocardial Proliferation and Differentiation In Vivo. Dev Cell. 8, 85-95 (2005).
  13. Sanchez, N. S., Barnett, J. V. TGFbeta and BMP-2 regulate epicardial cell invasion via TGFbetaR3 activation of the Par6/Smurf1/RhoA pathway. Cell Signal. 24, 539-548 (2012).
  14. Dettman, R. W., Pae, S. H., Morabito, C., Bristow, J. Inhibition of 4-integrin stimulates epicardial-mesenchymal transformation and alters migration and cell fate of epicardially derived mesenchyme. Dev Biol. 257, 315-328 (2003).
  15. Rhee, D. Y., et al. Connexin 43 regulates epicardial cell polarity and migration in coronary vascular development. Development. 136, 3185-3193 (2009).
  16. Wu, M., et al. Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium. Dev Cell. 19, 114-125 (2010).
  17. Hirose, T., et al. PAR3 is essential for cyst-mediated epicardial development by establishing apical cortical domains. Development. 133, 1389-1398 (2006).
  18. Baek, S. T., Tallquist, M. D. Nf1 limits epicardial derivative expansion by regulating epithelial to mesenchymal transition and proliferation. Development. 139, 2040-2049 (2012).
  19. Lu, J., et al. Coronary smooth muscle differentiation from proepicardial cells requires rhoA-mediated actin reorganization and p160 rho-kinase activity. Dev Biol. 240, 404-418 (2001).
  20. Combs, M. D., Braitsch, C. M., Lange, A. W., James, J. F., Yutzey, K. E. NFATC1 promotes epicardium-derived cell invasion into myocardium. Development. 138, 1747-1757 (2011).
  21. Acharya, A., et al. The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors. Development. 139, 2139-2149 (2012).
  22. Zhou, B., von Gise, A., Ma, Q., Hu, Y. W., Pu, W. T. Genetic fate mapping demonstrates contribution of epicardium-derived cells to the annulus fibrosis of the mammalian heart. Dev Biol. 338, 251-261 (2010).
  23. Zhou, B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. J Clin Invest. 121, 1894-1904 (2011).
  24. Singh, M., Epstein, J. Epicardial Lineages and Cardiac Repair. Journal of Developmental Biology. 1, 141-158 (2013).
  25. Braitsch, C. M., Combs, M. D., Quaggin, S. E., Yutzey, K. E. Pod1/Tcf21 is regulated by retinoic acid signaling and inhibits differentiation of epicardium-derived cells into smooth muscle in the developing heart. Dev Biol. 368, 345-357 (2012).
  26. Austin, A. F., Compton, L. A., Love, J. D., Brown, C. B., Barnett, J. V. Primary and immortalized mouse epicardial cells undergo differentiation in response to TGFbeta. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 366-376 (2008).
  27. Kim, J., Rubin, N., Huang, Y., Tuan, T. L., Lien, C. L. In vitro culture of epicardial cells from adult zebrafish heart on a fibrin matrix. Nat Protoc. 7, 247-255 (2012).
  28. Compton, L. A., Potash, D. A., Mundell, N. A., Barnett, J. V. Transforming growth factor-beta induces loss of epithelial character and smooth muscle cell differentiation in epicardial cells. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 235, 82-93 (2006).
  29. Smith, C. L., Baek, S. T., Sung, C. Y., Tallquist, M. D. Epicardial-derived cell epithelial-to-mesenchymal transition and fate specification require PDGF receptor signaling. Circ Res. 108, 15-26 (2011).
  30. Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos. JOVE. 2, (2007).
  31. Witty, A. D., et al. Generation of the epicardial lineage from human pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 32, 1026-1035 (2014).
  32. Iyer, D., et al. Robust derivation of epicardium and its differentiated smooth muscle cell progeny from human pluripotent stem cells. Development. 142, 1528-1541 (2015).
  33. Takeichi, M., Nimura, K., Mori, M., Nakagami, H., Kaneda, Y. The transcription factors Tbx18 and Wt1 control the epicardial epithelial-mesenchymal transition through bi-directional regulation of Slug in murine primary epicardial cells. PloS one. 8, e57829(2013).
  34. Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. BioTechniques. 39, 75-85 (2005).
  35. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols. 3, 1101-1108 (2008).
  36. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  37. Moore, A. W., McInnes, L., Kreidberg, J., Hastie, N. D., Schedl, A. YAC complementation shows a requirement for Wt1 in the development of epicardium, adrenal gland and throughout nephrogenesis. Development. 126, 1845-1857 (1999).
  38. Kim, J., et al. PDGF signaling is required for epicardial function and blood vessel formation in regenerating zebrafish hearts. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 17206-17210 (2010).
  39. Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J Clin Invest. 119, 1420-1428 (2009).
  40. Dong, X. R., Maguire, C. T., Wu, S. P., Majesky, M. W. Chapter 9 Development of Coronary Vessels. Methods in Enzymology. 445, 209-228 (2008).
  41. Ruiz-Villalba, A., Ziogas, A., Ehrbar, M., Perez-Pomares, J. M. Characterization of epicardial-derived cardiac interstitial cells: differentiation and mobilization of heart fibroblast progenitors. PLoS One. 8, e53694(2013).
  42. Garriock, R. J., Mikawa, T., Yamaguchi, T. P. Isolation and culture of mouse proepicardium using serum-free conditions. Methods. 66, 365-369 (2014).
  43. Smart, N., Riley, P. Derivation of epicardium-derived progenitor cells (EPDCs) from adult epicardium. Curr Protoc Stem Cell Biol. , (2009).
  44. Zhou, B., Pu, W. T. Isolation and characterization of embryonic and adult epicardium and epicardium-derived cells. Methods Mol Biol. 843, 155-168 (2012).
  45. Morabito, C. J., Dettman, R. W., Kattan, J., Collier, J. M., Bristow, J. Positive and negative regulation of epicardial-mesenchymal transformation during avian heart development. Dev Biol. 234, 204-215 (2001).
  46. Grieskamp, T., Rudat, C., Ludtke, T. H., Norden, J., Kispert, A. Notch signaling regulates smooth muscle differentiation of epicardium-derived cells. Circ Res. 108, 813-823 (2011).

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