Aqui, descrevemos métodos para isolar células epicárdicas primárias de camundongos por um ensaio de cultura de crescimento e avaliar a migração funcional de células derivadas de epicárdio (EPDC) usando um sistema de cultura cardíaca ex vivo. Esses protocolos são adequados para identificar moduladores genéticos e químicos da transição epicárdica epitelial-mesenquimal (EMT) e motilidade.
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Artigo de método
Epicárdio Conseqüência Cultura Ensaio e
Neste artigo
Resumo
Resumo
Uma única camada de linhas de células do epicárdio do coração, proporcionando factores parácrinos que estimulam a proliferação de cardiomiócitos e que contribui directamente progenitores cardiovasculares durante o desenvolvimento e a doença. Embora um certo número de factores têm sido implicados na célula (EPDC) mobilização derivado do epicárdio, os mecanismos que regem a sua migração e diferenciação subsequente são mal compreendidos. Aqui, apresentamos in vitro e as estratégias ex vivo para estudar EPDC motilidade e diferenciação. Em primeiro lugar, descreve-se um método de obtenção de células do epicárdio primárias por cultura excrescência do coração embrionário do rato. Nós também introduzir um protocolo detalhado para avaliar a migração tridimensional de EPDC marcado num sistema de cultura de órgãos. Nós fornecemos provas usando essas técnicas que deleção genética dos fatores de transcrição relacionados com myocardin no epicárdio atenua a migração EPDC. Esta abordagem serve como uma plataforma para avaliar modificadores candidatos da EPDCbiologia e pode ser utilizado para desenvolver telas genéticos ou químicas para identificar novos reguladores de EPDC mobilização que possam ser úteis para a reparação cardíaca.
Introdução
O epicárdio é uma única camada de células mesoteliais que reveste o coração e impactos cardíaca desenvolvimento, maturação e reparação. Através de uma troca altamente coordenada de sinais parácrinos, o diálogo íntimo entre o miocárdio e epicárdio é indispensável para o crescimento cardíaco e a formação de não-miócitos cardíacos linhagens 1. Células derivadas de epicárdio (EPDC) emergir a partir de um subconjunto de células do epicárdio através de um epitelial-a-mesenquimal transição (EMT) 2, invadem o espaço subepicárdico e miocárdio subjacente, e se diferenciam em grande parte, em células murais vasculares coronárias e fibroblastos cardíacos, e....
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Protocolo
NOTA: Todas as experiências com camundongos foram aprovados pelo Comitê da Universidade de Recursos Animais da Universidade de Rochester.
1. epicárdica Conseqüência Cultura Ensaio (Figura 1A)
- preparativos
- Prepare 5 ml de meio A para o isolamento de células do epicárdio primária suplementando o meio 199 (M199) com 5% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina (Pen / Strep).
- Pré-aquecido meio A e 100 mL de Hanks Solução Salina Equilibrada (SSHE) num banho de água a 37 ° C.
- Permitir lâminas de câmara revestidas com colagénio a aquecer até à temperatura ambiente durante 30 min.
- Adicionar 100....
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Resultados
O epicárdio pode ser eficazmente isolados utilizando um ensaio de cultura de crescimento, tirando partido da sua localização exterior e explorando a plasticidade do desenvolvimento e do comportamento migratório intrínseca de EPDC. Corações embrionárias murinas são isolados em E11.5 antes EMT epicárdico e o lado dorsal para baixo cultivadas em lâminas de câmaras revestidas com colagénio 26 (Figura 1A, B). corações explantados continuará a se contrair; No entant.......
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Discussão
Aqui destacamos métodos detalhados para isolar células do epicárdio primária por conseqüência e controlar a migração EPDC em ex vivo culturas cardíacos. Para as culturas conseqüência, o tempo apropriado para remover o coração empobrecido-epicárdio varia ligeiramente entre os experimentos. A monitorização periódica dos explantes após uma incubação durante a noite é recomendado para avaliar a extensão da excrescência do epicárdio e para extrair o coração diante de fibroblastos aparecer. Para garantir a pureza, co.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
EMS foi apoiado por bolsas de Institutos Nacionais de Saúde (NIH) [número de concessão R01HL120919]; a American Heart Association [número de concessão 10SDG4350046]; Universidade de Rochester prêmio CTSA do NIH [número de concessão UL1 TR000042]; e os fundos de inicialização do Aab CVRI. MAT foi apoiado em parte por uma bolsa para a Universidade de Rochester Faculdade de Medicina e Odontologia da Med Into--Grad Iniciativa Howard Hughes Medical Institute; e um Prêmio de Serviço Institucional Ruth L. Kirschstein Nacional de Pesquisa do NIH [número de concessão GM068411].
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Hyclone Médio Eagle Modificado da Dulbecco | SH3002201 | Solução | |
| salina balanceada DMEM Hanks ' | Hyclone | SH3003102 | HBSS |
| Medium 199 | Hyclone | SH3025301 | M199 |
| Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato | Hyclone | SH3002802 | DPBS |
| Soro Fetal Bovino | Gêmeos | 100-106 | |
| FBS Solução de Penicilina/Estreptomicina | Hyclone | SV30010 | |
| Corning Biocoat Collagen I, 4-Well Culture Slides | Corning | 354557 | |
| Multiwell 24-well Placas | Falcon | 08-772-1 | |
| Microscópio de dissecação | Leica | M50 | Equipado com Leica KL300 LED pode ser fonte |
| Miscroscópio | confocalOlympus | 1X81 | Equipado com laser muli-argon 405/488/515, laser FV10-MCPSU 405/440/635, laser 559, e lâmpada de mercúrio |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Fator de crescimento transformador beta 1 | R& D Systems | 100-B-001 | TGF-β 1 |
| Fator de crescimento derivado de plaquetas BB | R& D Systems | 220-BB-010 | PDGF-BB |
| Trizol Reagent | Applied Biosystems | 15596-026 | Cuidado, material perigoso |
| Kit TURBO sem DNA | Technologies | AM1907 | DNaseI |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891 | |
| UltraPure Glycogen | Life Technologies | 10814-010 | |
| SYBR Verde | BioRad | 170-8880 | |
| Comprimidos de coquetel inibidor de protease | Roche | 11836170001 | |
| Alexa Goat-anti-rabbit 488 | Life Technologies | A11008 | Anticorpo secundário |
| Alexa Goat anti-rabbit 594 | Life Technologies | A-11012 | Anticorpo secundário |
| Alexa Goat anti-mouse 594 | Life Technologies | A-11005 | Anticorpo secundário |
| Camundongo anti-músculo liso alfa actina, Cy3-conjugado | Sigma-Aldrich | C6198 | , clone 1A4 |
| Tumor anti-Wilms de camundongo 1 (WT1) | Life Technologies | MA1-46028 | anticorpo monoclonal, clone 6F-H2 |
| Coelho anti-ZO1 | Life Technologies | 40-2200 | anticorpo policlonal |
| Coelho anti-colágeno tipo 4 | Millipore | AB756P | anticorpo policlonal |
| 4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dicloridrato | Meio | DAPI | D1306 |
| DAKO | S3023 | ||
| Solução de paraformaldeído a 16% Ciências de | Microscopia Eletrônica | 15710 | PFA diluído a 4% em DPBS. Cuidado, material perigoso |
| Sacarose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Meio de congelamento de tecidos | Triângulo Biomedical Sciences | TFM-B | |
| Pap caneta | DAKO | S2002 | |
| Lâminas de microtomo descartáveis | Sakura Finetek | 4689 | |
| Globe Scientific | 1358W | carregadas positivamente, 25 mm x 75 mm x 1 mm | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| Fórceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Tesoura Cirúrgica | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Moldes de base descartáveis | Fisher Scientific | 22-363-553 | |
| Cetamina | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Akorn | NADA 139-236 |
Referências
- von Gise, A., Pu, W. T. Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease. Circ Res. 110, 1628-1645 (2012).
- Martinez-Estrada, O. M., et al. Wt1 is require....
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Reimpressões e permissões
