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Biology

진화 방법에 감독 Published: April 1, 2016 doi: 10.3791/53761
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biocatalysis, Institute of Catalysis, CSIC

Abstract

생체 내 고주파 DNA 상동 재조합에 결합 구성, 복제 및 돌연변이 라이브러리의 발현을 수반하는 처리를위한 응용 바이오 효소를 설계 할 때 사카 cerevisiae를 향하고 진화 매력적인 많은 장점을 제공한다. 여기서는 총 활성을 향상시키는 진균 아릴 알코올 산화 효소 (AAO)의 예에 기초하여 효모 및 화면 변이체 라이브러리를 제작하는 프로토콜을 제시한다. 두 단백질 세그먼트는 무작위 돌연변이에 의해 생체 내 DNA 재조합에 초점을 맞춘 지시 진화 하였다. 각 세그먼트의 측면에 50 ~ BP의 오버행 전체 자율적으로 복제하는 플라스미드에 초래하는 선형화 된 벡터에 AAO 융합 유전자의 정확한 재결합을 허용했다. 기능 AAO 변형 풍부 돌연변이 라이브러리는 S.에서 상영되었다 펜톤 반응을 이용한 고감도 높은 처리량으로 분석 cerevisiae의 상층 액. 의 일반적인 과정S.에서 라이브러리 건설 cerevisiae에 여분의 PCR 반응, 시험 관내 재조합 DNA 및 결찰 단계를 피하고, 여기에 설명 쉽게 많은 다른 진핵 유전자 발전에 적용될 수있다.

Introduction

감독 분자 진화는 효소 1, 2를 설계 할 수있는 강력하고 빠르고 안정적인 방법입니다. 비 자연에서 새로운 반응에, 새로운 기판에 작용 무작위 돌연변이, 재조합 및 검사, 효소의 개선 된 버전을 생성 할 수의 반복 라운드를 통해 환경, 또는 새로운 대사 3-5 목표를 달성하기 위해 셀을 지원한다. 직접 진화에 사용 된 호스트 사이에서, 맥주의 효모 사카로 마이 세스 세레 비지는 원핵 생물의 대응 6,7에서, 그렇지 않으면 사용할 수없는 복잡한 진핵 세포 단백질의 기능 발현을위한 솔루션의 레퍼토리를 제공합니다.

세포 생물학 연구에 철저 사용,이 작은 진핵 모델은 직접 진화 (8)에 의해 효소를 엔지니어링하는 중요한 특성입니다 모두 번역 후 변형, 조작 및 변환 효율의 용이성 측면에서 많은 장점을 가지고있다. 또한, 고주파S.에서 상동 DNA 재조합의 효율적인 증명 판독 장치에 연결 cerevisiae의 복잡한 인공 경로 9-12에 하나의 효소는 다른 시스템의 진화를 촉진, 생체 내에서 라이브러리 생성 및 유전자 조립을위한 가능성의 다양한 열립니다. 우리 연구소는 효모에서 다른 ligninases의 분자 진화 (천연 나무 붕괴시 리그닌의 분해에 관여하는 산화 환원 효소) 13 ~ 14를위한 도구와 전략을 설계 지난 십을 보냈다. 이 통신에서 우리는 준비 S.에서 화면 돌연변이 라이브러리에 대한 자세한 프로토콜을 제시 모델 flavooxidase, 아릴 알코올 산화 효소 세레 비지에 (AAO 15) -, 즉 쉽게 많은 다른 효소로 번역 할 수있다. 효모 전지 장치 (16), 도움을 (상동 생체 그룹화에 의한 돌연변이 유발 조직 된 재조합 과정 모핑) 프로토콜은 초점 지시 진화 방법을 포함한다배양액 (17) 내로 분비 AAO 활성을 검출하기 위해 펜톤 반응을 이용한 다 민감 스크리닝 분석법.

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Protocol

1. 돌연변이 라이브러리 생성

  1. 선택 영역은 가능한 결정 구조 또는 상 동성 모델 (18)에 기초하여 계산 알고리즘의 도움으로 모핑을하여야한다.
    1. 여기에, 임의의 돌연변이와 재조합 (메트로 [α1] -Val109, Phe392 - Gln566), 고성능 PCR에 의한 유전자 (844 bp의)의 나머지를 증폭하는 동안 (그림 1)에 대한 새송이에서 AAO의 두 지역을 대상으로.
      참고 : 여러 세그먼트가 독립 또는 결합 방식으로 16 모핑으로 공부하실 수 있습니다.
  2. 돌연변이 유발 PCR에 의해 대상 영역을 증폭. 정의 된 영역의 PCR 반응을 중첩하여 세그먼트 사이의 영역 (~ 50 bp의 각)를 중복 작성합니다.
    1. DNA 템플릿을 포함하는 50 μL (0.92 NG / μL), 90 나노 올리고 감각 (세그먼트 MI 세그먼트 M-II에 대한 AAO-BP에 대한 RMLN)의 최종 볼륨에서 대상 세그먼트의 돌연변이 PCR을 준비, 90 nM의 a를ntisense 프라이머 (세그먼트 M-II에 대한 세그먼트 MI 및 RMLC에 대한 AAO-92C), 0.3 밀리미터의 dNTPs (0.075 mM의 각), 3 % (v / v)의 디메틸 설폭 사이드 (DMSO), 1.5 밀리미터의 MgCl 2, 0.05 mM의 MnCl 2, 0.05 이 U / μL의 Taq DNA 폴리머 라제. 프라이머 서열은 그림 1에 자세히 설명되어 있습니다.
    2. 다음 PCR 프로그램을 사용하여 2 분 (1주기) 95 ° C를; 45 초, 45 초 동안 50 ° C, 45 초 동안 74 ° C (28 회) 95 ° C; 10 분 (1주기) 74 ° C.
  3. 초고 충실도 중합 효소와 비 돌연변이 영역을 증폭 및 돌연변이 세그먼트 및 / 또는 선형화 벡터 오버행 중복 해당 지역을 포함한다.
    1. 포함 된 50 μL의 최종 부피에 반응 혼합물을 준비 : DNA 템플릿 (0.2 NG / μL), 250 nM의 올리고 의미 HFF, 250 nm의 올리고 안티센스 HFR, 0.8 밀리미터의 dNTPs (0.2 mM의 각), 3 % (v / v)의 디메틸 설폭 (DMSO)와 DNA 중합 효소 iproof 0.02 U / μL. 프라이머 서열에 자세히 설명되어 <강한> 그림 1.
    2. 다음 PCR 프로그램을 사용하여 30 초 (1주기) 98 ° C를; 10 초, 25 초 동안 55 ° C, 45 초 동안 72 ° C (28 회) 98 ° C; 10 분 (1주기) 72 ° C.
      참고 : 1.2에 설명 된 조건 (43) BP (플라스미드-M1 영역)의 1.3 중복으로; 46 BP (M1 지역-HF 영역); 47 BP (HF 영역-M2 영역) 61 BP (M2 인 지역 플라스미드) 효모에서 생체 접합에서 선호하는 (그림 1) 설계되었습니다.
    3. 제조사의 프로토콜에 따라 상업적 겔 추출 키트 (돌연변이 및 비 돌연변이) 모든 PCR 단편을 정제 하였다.
  4. 약 50 염기쌍의 영역을 플 랭킹하는 것은 표적 유전자의 5'- 및 3'- 말단에 상동이 생성되도록 상기 벡터 선형화.
    1. 2 μg의 DNA, 7.5 U의 BamHI, 7.5 U을 XhoI, 버퍼 바 20 μg의 BSA 2 μl를 함유하는 선형 반응 혼합물을 제조20 μL의 최종 부피 m HI 배.
    2. 2 시간 40 분 동안 37 ℃에서 반응 혼합물을 인큐베이션. 그 후, 20 분 동안 80 ℃에서 불 활성화를 진행합니다.
  5. 잔류 원형 플라스미드 (도 2)의 오염을 방지하기 위해, 아가 로스 겔 추출에 의해 선형화 된 벡터를 정제.
    1. 잘 기자로 인접에 반응 믹스의뿐만 아니라 나누어지는 (5 μL) : (V 승, 0.75 %) 세미 예비 저 융점 아가로 오스 겔의 메가 우물에 소화 반응 혼합물을로드합니다.
    2. 실행 DNA 전기 영동 (전극 사이에 5 V / cm, 4 ᵒC)과 메가 웰에 해당하는 아가 로스 겔을 분리하고 1X TAE 4 ᵒC에 저장합니다.
    3. 분자량 사다리 기자와 차선 얼룩. UV 빛 아래 밴드를 시각화합니다. 닉 위치 선형화 된 벡터 곳.
      주 : 정제 선형화 된 벡터의 품질이 criti이므로칼 요인은 효모에서 성공 재조합 및 조립, 반 예비 DNA 전기 영동 젤 염색을 피하십시오. 염료 및 겔 추출 UV 노광의 사용은 생체 내 재조합 효율 저하의 DNA 벡터의 안정성에 영향을 미칠 수있다. 독성 EtBr이 염료에 대한 대안으로, 젤 빨간색과 SYBR 염료는 일반적으로 겔 염색에 사용된다.
    4. UV 광이없는 경우,이 분리 될 수 있도록 염색 리포터 레인 닉의지도를 사용하여 메가 아니라 단편의 선형 벡터를 식별한다.
    5. 아가로 오스에서 선형화 된 벡터를 추출하고 제조 업체의 프로토콜에 따른 상업 겔 추출 키트를 정화.
      참고 : 항생제와 영양 요 마커를 사용하여 높은 복사 에피 솜 셔틀 벡터 : 우리는 효모 GAL1 프로모터의 제어하에, 우라실 독립적 인 암피실린 내성 pJRoC30 벡터를 사용이 예에서.
  6. 같은 몰 마일을 준비PCR을 조각의 xture과 2에서 선형화 된 벡터와 함께 혼합 : 선형화 된 플라스미드없이 100 개 미만 NG로, 1 비율 (몰 라이브러리 / 오픈 벡터의 테스트 다른 비율은 좋은 형질 전환 수율을 달성하기 위해).
    1. 그 농도 및 순도를 결정하기 위하여 PCR 단편을 260 nm 내지 280 nm에서 선형화 된 벡터의 흡광도를 측정한다.
  7. 상업적 효모 형질 전환 키트를 사용하여 DNA 혼합물로 효모 세포를 형질 전환 능력 제조업체의 지시에 따라 (공급 표 참조).
    1. 종속 S. - 여기서, 결핍 된 단백질 분해 효소와 URA3을 사용 cerevisiae의 변형, BJ5465. (아래 참조) 심사 중 내부 표준으로 부모의 고리 화 벡터와 세포를 변형. 또한, PCR 단편의 부재에서 선형화 된 벡터를 변환함으로써 배경을 확인한다.
      주 : 저 초기 분비 수준을 검출하는 경우, S.을 사용BJ5465 같은 cerevisiae의 단백질 분해 효소 결핍 균주 배양 상층 액에서 활성 단백질의 축적을 촉진합니다. 표적 효소를 과당 질화, 글리코 실화가 결핍 된 균주의 사용을 겪는 경우 (예, 오직 작은 만노스 올리고머 부착 할 Δ의 kre2)는 적절한 선택 될 수있다.
  8. 접시 변환 SC 탈락 플레이트상에서 세포 및 3 일 동안 30 ° C에서 그들을 부화. 플레이트 (우라실 보충 SC 드롭 아웃 접시에) URA3 - S. 선별 음성 대조군으로 플라스미드가없는 cerevisiae의 세포 (아래 참조).

분석을 심사 2. 높은 처리량 (그림 3)

  1. 피펫 로봇의 도움으로 잘 당 50 μl의 최소한의 매체 (2,000 클론의 라이브러리를 분석하기 위해 23 판) 멸균 96 웰 플레이트의 적절한 수를 입력합니다.
  2. 판 밖으로 SC-드롭에서 개별 식민지를 선택하고 96 웰 플레이트로 전송.
    1. 각 플레이트에서, 부모의 내부 표준 타입과 잘 URA3와 H1에서와 열 번호 6 접종 - S.을 음성 대조군으로 더 플라스미드 (우라실 보충 SC 매체에서) cerevisiae의 세포.
      참고 : 음 H1은 우라실 보충 드롭 아웃 미디어 구체적으로 가득합니다. 세포가없는 웰 빈 함유 배지는 추가로 멸균 대조군으로서 제조 될 수있다.
  3. 자신의 뚜껑 접시를 덮고 파라 필름에서 그들을 포장. 습기 통에서 30 ° C에서 48 시간, 225 rpm으로 80 %의 상대 습도에 대한 번호판을 품어.
  4. 는 파라 필름을 제거 피펫 로봇의 도움으로 각 웰에 표현 매체의 160 μl를 추가, 번호판을 봉인하고 추가로 24 시간 동안 그들을 품어.
    참고 : 19 다른보고 된 최소 배지 표현 매체가 제조된다. 분비 수준 t, 따라서 연구중인 유전자에 따라 달라질 수있다그 시간은 모든 웰에서 세포 성장을 동기화 각 경우에 최적화되어야 인큐베이션.
  5. 원심 분리기 4 ° C에서 10 분 동안 2,800 X g에서 판 (마스터 판).
  6. 이송 로봇 멀티 스테이션 처리 액을 사용하여 레플리카 플레이트 마스터 플레이트 웰로부터 상층 액 20 μL.
    참고 : 효소 분비를 선호하는 것이 일반적으로 효모에서 이종 발현 (에 사용되는 신호 펩타이드에 의해 표적 단백질의 기본 신호 펩타이드를 교체하는 것이 좋습니다 예를 들면, α 계수 prepro 리더, S.에서 K 1 킬러 독소의 지도자 세레 비지 또는 둘 펩티드 13)이라도 키메라 버전. 대안 적으로, 천연 신호 펩티드 독점적 효모 분비를 위해 전개 될 수있다.
  7. 피펫 로봇의 도움으로 100 mM의 인산 나트륨 완충액 pH 6.0에서 2 mM의 P는 -methoxybenzylalcohol의 20 μl를 추가합니다. 96 우리 짧게 접시를 저어접시 믹서 LL RT에서 30 분 동안이를 부화.
  8. 피펫 로봇으로, 각 복제 판에 FOX 시약 160 μl를 추가하고 잘 FOX 혼합물의 믹서 (최종 농도 짧게 저어 : 100 μM 크 실레 놀 오렌지, 250 μM 철 (NH 4) 2 (SO 4) 2 25 mM의 H 2 SO 4).
    1. 유기 공동 용매 (DMSO, 에탄올, 메탄올) 또는 소르비톨 (17)의 감도를 향상시키기 위해 시약에 여러 가지 첨가제를 추가합니다. 여기서, 100 밀리미터 (도 4)의 최종 농도 소르비톨을 첨가하여 반응을 증폭한다.
  9. 접시 리더에서 560 nm에서 플레이트 (엔드 포인트 모드, t 0)를 참조하십시오.
  10. 색상이 개발 될 때까지 RT에서 접시를 품어 다시 (t 1) 흡수를 측정한다.
    1. 배양 후 애비 값의 차이에서 상대 활성을 계산하고 초기 측정의는 PARE에 정상화각 플레이트에 대한 ntal 유형 (의 Δt 1 - t 0).
  11. 오탐 (false positive)을 배제하기 위해 두 개의 연속 재 상영에 최적의 돌연변이 안타 대상으로 할 수 없다.
    주 : 일반적으로 재 스크리닝 플라스미드 19 신선한 효모 세포를 형질 전환 한 다음, 대장균의 효모, 증폭 및 정제로부터 분리 된 플라스미드를 포함한다. 선택한 각 클론 pentaplicate에서 다시 상영된다.

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Representative Results

P.에서 AAO 속 eryngii는 리그닌을 공격 시작 H 2 O 2와 곰팡이 퍼 옥시다아제를 공급하는 세포 외 flavooxidase입니다. AAO의 두 세그먼트는 활성 및 S.에서의 발현을 향상시키기 위해서 모핑에 의해 집광 지향 진화 하였다 cerevisiae의 19. S.에 의해 숨겨 외국 효소에 관계없이 cerevisiae의 효모에서 돌연변이 라이브러리를 구성하는 조각과 선형화 된 벡터에 자신의 복제 사이의 접합을 선호하는 특정 중복 영역의 엔지니어링에 관한 가장 중요한 문제. 현재의 예에서, 각각의 PCR 반응에 모든 단편은 효모 생체에 접합 촉진 약 50 염기쌍의 오버행을 가지고 있었다. 세그먼트의 개수가 조립 선형화 된 벡터로 클로닝에 재조합 사건의 개수가 종속 (즉, 두 개의 크로스 오버 이벤트 사이에 일어났다그림 1) 3 개의 PCR 세그먼트 비 돌연변이 segment-의 측면에 두 개의 돌연변이 세그먼트 플러스 선형화 된 벡터와 두 개의 추가 크로스 오버은 말한다. 그들은 형질 전환 효율을 개선하지 않지만 우리의 경험에 의하면, 50 염기쌍 이상 중첩 서열은 내부 재조합의 가능성을 감소시킨다.

돌연변이 하중은 활성 및 비활성 변이체 (도 5a)의 랜덤 샘플 염기 서열을 확인하는 또 다른 풍경과 돌연변이 라이브러리를 샘플링 부모 효소 활성의 <10 % 클론의 수를 계산에 의해 조정 하였다. S. 분산 계수를 결정하기위한 cerevisiae의 세포는 부모의 AAO로 형질 전환 및 플레이트 아웃 SC-드롭 도금했다. 개별 콜로니를 포착하고 접종 96 웰 플레이트와 클론의 활동은 신선한 준비에서 평가되었다. 변이원성 샘플2 (DNA 형성 촉매 / MnCl 2 0.05 mm)를 라이브러리 건설 및 심사를위한 출발 지점으로 선택되었다.

AAO의 생물학적 활성은 반응 매질의 H 2 O 2 농도가 증가함에 따라, 우리는 H 2 O 2에 사소한 변화를 정량화하기위한 민감하고 정확한 분석 검색. FOX는 펜톤 반응 (20)에 기초하여 화학적 방법해진다 H 의한 산화 2 O 2 드라이브 청자색 복합체를 형성 크 실레 놀 오렌지와 철의 반응 3+ (O -cresolsulfone-phthalein 3 ', 3' '- 비스 (메틸이) 디 아세테이트의 ε (560) = 1.5 × 10 4 M -1 cm -1). 철 산화 공정은 겉보기 ε와 라디칼의 전파를 증가 분석의 감도를 향상시키기 위해 솔비톨을 첨가하여 증폭 하였다 (560) = 2.25 × 105 M -1 cm -1 (FIgure 4).

이러한 분석의 검출 한계는합니다 (μM 범위) 중으로의 (0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4 μM의 H에서 표준 96 웰 플레이트에서 빈 측정법으로 계산 하였다 2 O 2 )와 S.에서 여러 상층 액을 사용하여 플라스미드 (그림 5B) - cerevisiae의는 URA3 결여. 상기 분석은 반응이 약한 (H 2 O 2의 적어도 최대 30 μM)이었다 소르비톨 존재 선형 선형성이 설탕의 부재보다 지속적이고, 비록 (8 H 2 μM O 2)이었다 (예를 들어,에서 H 2 O 2의 6 μM, 4 배 강화가 그것의 부재 - 어두운 오렌지 - (그림 5B)에 0.24의 흡광도에서 소르비톨 - 깊은 보라색의 존재를 얻었다). 복근과 AAO 농도 사이의 관계가 전자의 양이 증가하여 평가 하였다nzyme (효모 상층 액)에서 선형 응답을 관찰 하였다; R 2 = 0.997 (그림 5C).

FOX 신호 배양액에서 다른 요소들에 의해 명백한 간섭없이 수 시간 동안 안정 하였다 주목할 만하다. FOX의 추정 감도를 상등액에서 AAO 제조 H 2 O 2 ~ 0.4 μM이었다 그 부재의 소르비톨의 존재, 그리고 ~ 2 μM있다.

2000 클론의 돌연변이 라이브러리 구성이 분석에 상영되었다. 여러 AAO 돌연변이는 P는 -methoxybenzyl 알코올 (그림 5D) (19)에 대해 현저하게 개선 분비와 활동 확인되었다.

그림 1
그림 1.. AAO 진화 프로토콜 모핑 AAO 두 개의 상이한 영역을 무작위 돌연변이 및 재조합 대상했다 : M1 (블루 590 염기쌍)의 신호 펩타이드 (SP)을 포함한다; (노란색, 528 bp의) M2. (회색, 844 BP)이 HF 영역은 높은 충실도 중합 효소 증폭되었다. 변이원성 영역이 AAO (PDB ID : 3FIM)의 결정 구조에 매핑되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
PCR 제품 및 선형화 된 벡터의 제조도 2 (A) 분석 아가 로스 겔 (1 % w : v)로. 레인 1 및도 7에 분자량 마커 (1킬로바이트 사다리)를 함유; 밤발 HI 및을 XhoI 선형화 벡터, 레인 2; PCR 세그먼트 M1, 레인 3; PCR 세그먼트 M2, 레인 4; PCR 세그먼트 HF, 레인 5; V에서IVO는 NHE I (영역 MI, HF 및 M-II와 전체 AAO 유전자를 포함)로 선형화 된 재조합 벡터를, 레인 (6) (B) 벡터 선형화, 레인 1, 6 분자 표준 래더 1 이하; 플라스미드 미니 프렙, 레인 2; NHE I, 레인 3 선형화 된 플라스미드; 빵 HI 및을 XhoI, 레인 4 선형화 된 플라스미드; 겔 추출 및 소화 후 청소, 플라스미드 정제를위한 차선 5. (C) 프로토콜에 의해 얻어진 선형 플라스미드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3. 높은 처리량 검사 프로토콜. 프로세스의 개요. 더 큰 적이있는을 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 이온.

그림 4
그림 4는 FOX 방법. 화이트 부패의 곰팡이 • OH 라디칼 수산기를 생산하는 펜톤 반응을 통해 나무의 세포벽을 공격한다. 여우 방법 커플이 반응은 오렌지 (XO)를 크 실레 놀합니다, 그리고 XO-FE 3+ 복합체의 흡광도를 560 nm에서 측정한다. 철의 산화 시약 혼합물에 소르비톨의 첨가에 의해 증폭된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5. 변이원성 풍경 다른 오류가 발생하기 쉬운 PCR 조건과 심사 분석의 유효성 검사를 사용하여 라이브러리를 모핑합니다. (A NG>) 모핑 풍경. 점선은 분석의 변동 계수를 나타내는 반면 무 수평 라인 분석의 부모 타입의 활성을 나타낸다. 백분율은 부모의 효소 활성의 10 % 미만으로 클론의 수를 나타낸다. 활동 내림차순으로 그려진다. (B)을 FOX 검출 한계가 존재 (검은 원)의 H 2 O 2 농도를 증가시키고, 소르비톨없는 (흰색 사각형)으로 평가 하였다. AAO 농도 (형질 전환 체의 상층 액)과 애비의 560nm 사이의 (C) 선형 상관 관계. 각각의 포인트는 8 실험의 평균에 대응하고, 표준 편차를 포함한다. (D) 돌연변이 체 라이브러리 풍경입니다. 다른 곳에서 19보고 선택한 변형 (그림자 광장) rescreened했다. 실선은 AAO 부모 유형의 활동을 보여줍니다.>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이 글에서, 우리는 팁과 트릭의 대부분은 S.의 감독 진화에 의해 효소를 엔지니어링하는 우리의 실험실에서 사용 요약 한 세레 비지에 (예를 들어 AAO 사용)들은 단순히 여기에 기술 된 일반적인 방법에 따라 많은 다른 진핵 효소 시스템과 함께 사용하도록 적응 될 수 있도록.

라이브러리 생성의 측면에서, 모핑 소개 (16) 변경되지 않은 단백질의 나머지 영역을 남기면서 작은 단백질 뻗어 무작위 돌연변이를 재결합하는 빠르고 한 냄비 방법입니다. 몇몇 돌연변이 부하 라이브러리는 용이하게 전체 자율적으로 복제하는 벡터를 생성하기 위해 상기 선형화 된 플라스미드와 함께 제조 및 생체 내에서 재결합 할 수있다. 중첩 서열은 추가 PCR 반응과 시험 관내 결찰 단계 회피 전체 유전자의 단편은 생체 내 재조합을 통해 조립 될 수 있도록 각각의 측면 연신하는 것이 중요하다. 이 페이지에서이 변환 효율을 손상시킬 수 있지만 rotocol, PCR 단편과 교차 이벤트의 주파수는, 중첩 영역의 크기를 감소시킴으로써 증가 될 수있다. 상관없이 돌연변이 PCR에 사용 된 DNA 중합 효소의 돌연변이로드는 이전 구성 작은 돌연변이 라이브러리에게 풍경 (도 5a)를 분석함으로써 조절 될 수있다. GeneMorph II 키트를 사용하는 경우에는 생체 내 재조합 DNA는 특히 제조 업체에 의해 추정 된 돌연변이 부하를 수정할 수 있기 때문에,이 방법을 수행하는 것이 여전히 바람직하다. 일반적인 관점에서, 35되는 돌연변이 풍경 -이 숫자는 표적 단백질 및 활성의 함수 다르지만 스크리닝 총 클론의 50 %가 부모 활성의 10 % 미만이은 지시 진화 캠페인에 적합하다. 통상적으로, 변이체 라이브러리 풍경의 분석은 또한 돌연변이의 랜덤 샘플의 DNA 서열 분석에 의해 확인된다. 현재의 예에서의 TaqDNA 중합 효소 인해 5'proof 판독 엑소 뉴 클레아 제 활성을 → 3 '의 부족에 연결된 높은 에러율로 사용 하였다. Taq를 라이브러리 돌연변이로드 MnCl 2의 상이한 농도의 첨가에 의해 변형되었지만, 언밸런스의 dNTPs 및 / 또는 유전자 템플릿 농도 감소의 사용은 적당한 옵션이다. 세그먼트의 수에서 온 모핑의 고유 제한 재결합한다. 우리의 경험에 따르면, 네 개의 단백질 블록 (선형화 된 벡터와 재조합 영역을 계산 다섯 크로스 오버 이벤트)까지 좋은 변환 수익률과 접합 될 수있다 (~ 변환 반응 당 105 클론). 이 방법은 상당히 쉽게 스크리닝 노력 (21, 22)을 줄이면서 동시에 여러 위치 탐색 (예를 NDT 축퇴 프라이머를 사용하여 또는 22 고유 축 퇴성 코돈을 생성)을 수행 여러 부위 포화 돌연변이 유발로 변형 될 수있다.

"블라인드"선별 프로토콜은 잘 간접 확립 서로 보완적인 분석을 나타내는 매우 민감하고 (2 O 2에 관계없이 효소에 의해 사용되는 기판의 H의 직접적인 검출에 기초하여) 신뢰성 = 프로토콜은 과산화물 (비색 기판에 주로 결합 퍼 옥시다아제를) 검색 할 수 있습니다. 실제로, FOX 분석 일상적 H에게 생물학적 체액 2 O 2를 측정하기 위해 사용되었으며, 지금 쉽게 AAO 효소를 생산하는 다른 H 2 O 2 진화 프로토콜로 변환 할 수있다 (예를 들면, 글루코스 옥시 다제, 셀로 비오스게나 제, 글리 옥살 옥시 다제, 특히 응답이 그렇지 감지하기 어려운 비 자연 기판에 활동에 대한 메탄올 산화 효소).

S. cerevisiae의는 (높은 변환 효율을 제공하기 때문에 진핵 생물 유전자의 지시 진화에 가장 적합한 호스트입니다 최대 1 × 10(6) 형질 전환 / μg의 DNA를)는 N- 및 C- 말단 처리 및 글리코 실화를 포함한 복잡한 번역 후 처리 및 변형 (수행)과은 분비 경로를 통해 배양액에 외래 단백질을 수출. 또한, 잘 구축 된 분자 생물학 도구는 다른 강점 프로모터의 제어하에 단방향 또는 양방향 에피 솜 (비 통합) 셔틀 벡터를 포함하여이 효모, 작업 할 수 있습니다. 마지막으로, 상동 DNA 재결합의 고주파 현재 단일 단백질뿐만 아니라 더 복잡한 효소 경로 8, 12, 13, 23을 발전하기 위해 사용되는 DNA 다이버 시티를 획득하기 위해 개발 될 방법의 범위를 허용했다. 생체 갭 수리이 효모의 증거 판독 장치는 (DNA 서열 동일성의 정도. 60 %로) 다른 유전자 재조합 때 키메라를 생성 할뿐만 아니라 directe에서 가장 자손 / 돌연변이 셔플 사용될 수있다D 진화 캠페인, 또는 이에 접힘과 기능면에서 돌연변이 라이브러리를 풍부하게, 시험 관내에서 진화의 한 라운드 생체 내 재조합 방법을 함께 가지고있다.

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Disclosures

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Culture media
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A0166 CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto Agar Difco 214010
Cloramphenicol Sigma-Aldrich C0378 CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-Galactose Sigma-Aldrich G0750 CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G5767 CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16
D-(+)-Raffinose pentahydrate Sigma-Aldrich 83400 CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51
Peptone Difco 211677
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P0662 CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
Uracil Sigma Aldrich U1128
Yeast Extract Difco 212750
Yeast Nitrogen Base without Amino Acids Difco 291940
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil Sigma-Aldrich Y1501
Name Company Catalog Number Comments
2. PCR Reactions
dNTP Mix Agilent genomics 200415-51 25 mM each
iProof High-Fidelity DNA polymerase Bio-rad 172-5301
Manganese(II) chloride tetrahydrate Sigma-Aldrich M8054 CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91
Taq DNA Polymerase Sigma-Aldrich D4545 For error prone PCR
Name Company Catalog Number Comments
3. Plasmid linearization
BamHI restriction enzyme New England Biolabs R0136S
Bovine Serum Albumin New England Biolabs B9001S
XhoI restriction enzyme New England Biolabs R0146S
Not I restriction enzyme New England Biolabs R0189S
Gel Red Biotium 41003 For staining DNA
Name Company Catalog Number Comments
4. FOX assays
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate Sigma-Aldrich F3754 CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14
Anysil Alcohol Sigma Aldrich W209902 CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16
D-Sorbitol Sigma-Aldrich S1876 CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17
Hydrogen peroxide 30% Merck Millipore 1072090250 FOX standard curve
Xylenol Orange disodium salt Sigma-Aldrich 52097 CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62
Name Company Catalog Number Comments
5. Agarose gel stuff
Agarose Norgen 28035 CAS Nº 9012-36-6
Gel Red Biotium 41003 DNA analysis dye
GeneRuler 1kb Ladder Thermo Scientific SM0311 DNA M.W. standard
Loading Dye 6x Thermo Scientific R0611
Low-melting temperature agarose Bio-rad 161-3112 CAS Nº 39346-81-1
Name Company Catalog Number Comments
6. Kits and cells
S. cerevisiae strain BJ5465 LGC Promochem ATTC 208289 Protease deficient strain with genotype: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Blue competent cells Agilent genomics 200150 For plasmid purification and amplification
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit Macherey-Nagel 740,609,250 DNA gel extraction
NucleoSpin Plasmid Kit Macherey-Nagel 740,588,250 Column miniprep Kit
Yeast Transformation Kit Sigma-Aldrich YEAST1-1KT Included DNA carrier (Salmon testes)
Zymoprep yeast plasmid miniprep I Zymo research D2001 Plasmid extraction from yeast
Name Company Catalog Number Comments
7. Plates
96-well plates Greiner Bio-One 655101 Clear, non-sterile, polystyrene (for activity measurements)
96-well plates Greiner Bio-One 655161 Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)
96-well plate lid Greiner Bio-One 656171 Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)

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References

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분자 생물학 문제 (110) 감독 진화, 높은 처리량 스크리닝
진화 방법에 감독<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비지에</em&gt; : 돌연변이 라이브러리 생성 및 검사
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Viña-Gonzalez, J., Gonzalez-Perez, D., Alcalde, M. Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening. J. Vis. Exp. (110), e53761, doi:10.3791/53761 (2016).

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