Entwicklung Methode Regie in Published: April 1, 2016 doi: 10.3791/53761

DOI

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Javier Viña-Gonzalez¹, David Gonzalez-Perez¹, Miguel Alcalde¹

¹Department of Biocatalysis, Institute of Catalysis, CSIC

Abstract

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae bietet viele attraktive Vorteile , wenn Enzyme für biotechnologische Anwendungen entwerfen, ein Prozess, der Konstruktion, Klonierung und Expression von mutanten Bibliotheken, die mit Hochfrequenz - homologe DNA - Rekombination in vivo beinhaltet. Hier stellen wir ein Protokoll zu erstellen und Bildschirmmutantenbibliotheken in Hefe am Beispiel eines Pilz Aryl-Alkohol-Oxidase (AAO) seine Gesamtaktivität zu verbessern. Zwei Proteinsegmente wurden einer fokussierten gerichteten Evolution durch zufällige Mutagenese und in - vivo - DNA - Rekombination. Auskragungen von ~ 50 bp jedes Segment flankieren, erlaubt die korrekte Zusammenbau der AAO-Fusionsgens in linearisierter Vektor zu einem vollen autonom replizierenden Plasmid führt. Mutant Bibliotheken angereichert mit funktionellen AAO - Varianten wurden in S. gescreent cerevisiae Überstand mit einem empfindlichen Assay mit hohem Durchsatz auf die Fenton - Reaktion basiert. Der allgemeine Prozess derBibliothekskonstruktion in S. cerevisiae beschrieben hier leicht zu entwickeln viele andere eukaryotischen Genen angewandt werden, die Vermeidung zusätzliche PCR - Reaktionen, in vitro - DNA - Rekombination und Ligatur Schritte.

Introduction

Regie molekulare Evolution ist eine robuste, schnelle und zuverlässige Methode zu entwerfen Enzyme ^{1, 2.} Durch iterative Runden zufällige Mutation, Rekombination und Screening, verbesserte Versionen von Enzymen erzeugt werden können , die auf neue Substrate wirken, in neuartigen Reaktionen, in nicht-natürliche Umgebungen oder sogar um die Zelle zu unterstützen neue metabolische Ziele ^3-5 zu erreichen. Unter den Wirten in der gerichteten Evolution verwendet, um die Hefe Saccharomyces cerevisiae Brau bietet ein Repertoire an Lösungen für die funktionelle Expression von komplexen eukaryotischen Proteine ​​, die ^6,7 in den prokaryotischen sonst nicht verfügbar sind.

Verwendet erschöpfend in der Biologie Studien Zelle dieses kleine eukaryotischen Modell hat viele Vorteile in Bezug auf die post-translationale Modifikationen, die einfache Handhabung und Transformationseffizienz, von denen alle wichtigen Merkmale sind Enzyme zu konstruieren , durch gerichtete Evolution ^8. Darüber hinaus ist die Hochfrequenzvon homologen DNA - Rekombination in S. cerevisiae gekoppelt seiner effizienten proof-Lesevorrichtung eröffnet eine breite Palette von Möglichkeiten für die Bibliothekserstellung und Genanordnung in vivo, um die Entwicklung der verschiedenen Systeme von einzelnen Enzymen zur komplexen künstlichen Wege ^9-12 fördern. Unser Labor hat die letzten zehn Jahre verbrachte Tools und Strategien für die molekulare Evolution verschiedener Ligninasen in Hefe (Oxidoreduktasen beteiligt in den Abbau von Lignin während der natürlichen Holzzersetzung) ^13-14 entwerfen. In dieser Mitteilung stellen wir ein detailliertes Protokoll und Bildschirm Mutantenbibliotheken in S. vorzubereiten cerevisiae für ein Modell flavooxidase, Aryl-Alkohol - Oxidase (AAO ¹⁵⁾ -, die leicht auf viele andere Enzyme , übersetzt werden können. Das Protokoll beinhaltet eine fokussierte gerichtete Evolution - Methode (MORPHING: mutagene Organized Rekombinationsprozeß durch homologe in vivo - Gruppierung) von der Hefezelle Gerät ¹⁶ unterstützt wird , einda sehr empfindlich Screening - Test auf der Grundlage der Fenton - Reaktion , um AAO - Aktivität nachzuweisen in der Kulturbrühe sezerniert ^17.

Protocol

1. Mutant Library Construction

1. Wählen Sie die Regionen unterworfen werden mit Hilfe von Computer - Algorithmen auf MORPHING basierend auf den verfügbaren Kristallstruktur oder Homologie - Modelle ^18.
   1. Dabei zielen zwei Regionen AAO aus Pleurotus für zufällige Mutagenese und Rekombination (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), während Amplifizieren der Rest des Gens (844 bp) von High-Fidelity - PCR (Abbildung 1).
      Hinweis: Mehrere Segmente können durch MORPHING in einem unabhängigen oder kombinierten Weise ¹⁶ untersucht werden.
2. Amplify die Zielgebiete durch mutagene PCR. Erstellen Sie überlappende Bereiche zwischen den Segmenten (~ 50 bp jeweils) durch Überlagerung PCR-Reaktionen der definierten Regionen.
   1. Vorbereitung mutagene PCR gezielte Segmente in einem Endvolumen von 50 ul, enthaltend DNA-Templat (0,92 ng / ul), 90 nM Oligo Sinn (RMLn für Segment MI und AAO-BP für das Segment M-II), 90 nM antisense Primer (AAO-92C für Segment MI und RmlC für das Segment M-II), 0,3 mM dNTPs (0,075 mM each), 3% (v / v) Dimethylsulfoxid (DMSO), 1,5 mM MgCl _2, 0,05 mM MnCl ₂ und 0,05 U / & mgr; l Taq DNA - Polymerase. Primer - Sequenzen sind in 1 beschrieben.
   2. Verwenden Sie das folgende PCR-Programm: 95 ° C für 2 Minuten (1 Zyklus); 95 ° C für 45 sec, 50 ° C für 45 sec, 74 ° C für 45 sec (28 Zyklen); und 74 ° C für 10 min (1 Zyklus).
3. Amplify die nicht mutagen Regionen mit ultra-High-Fidelity-Polymerase und umfassen die entsprechenden Bereiche der mutagenen Segmente überlappende und / oder linearisierte Vektor Auskragungen.
   1. Bereiten Reaktionsgemische in einem Endvolumen von 50 & mgr; l, enthaltend: DNA-Matrize (0,2 ng / & mgr; l), 250 nM Oligo Sinne HFF, 250 nM Oligo Antisense- HFR, 0,8 mM dNTPs (jeweils 0,2 mM), 3% (v / v) Dimethylsulfoxid (DMSO) und 0,02 U / & mgr; l iProof DNA - Polymerase. Die Primer-Sequenzen sind in <strong> 1.
   2. Verwenden Sie das folgende PCR-Programm: 98 ° C für 30 Sekunden (1 Zyklus); 98 ° C für 10 sec, 55 ° C für 25 sec, 72 ° C für 45 sec (28 Zyklen); und 72 ° C für 10 min (1 Zyklus).
      Hinweis: Bei Bedingungen , die in 1.2 und 1.3 Überlappungen von 43 bp (Plasmid-M1 - Region); 46 bp (M1-Region-HF-Bereich); 47 bp (HF-Bereich M2 region) und 61 bp (M2 regions Plasmid) sind so ausgelegt , (1) in vivo Spleißen in Hefe zu begünstigen.
   3. Man reinige das alle PCR-Fragmente (mutagene und nicht-mutagene) mit einem handelsüblichen Kit Gel Extraction dem Protokoll des Herstellers entsprechend.
4. Linearisieren des Vektors, so daß Bereiche von etwa 50 bp flankiert werden erstellt, die zu den 5'- und 3'-Enden des Zielgens homolog sind.
   1. Bereiten Sie eine Linearisierungsreaktionsmischung , die 2 ug DNA, 7,5 U Bam HALLO, 7,5 U XhoI, 20 & mgr; g BSA und 2 ul Puffer Bam HALLO 10x in einem Endvolumen von 20 ul.
   2. Inkubieren der Reaktionsmischung bei 37 ° C für 2 h und 40 min. Danach fahren Sie für 20 min bei 80 ° C mit Inaktivierung.
5. Reinige den linearisierten Vektor durch Agarose - Gel Extraction Kontamination mit dem Rest zirkuläre Plasmid (Figur 2) zu vermeiden.
   1. Laden die Verdauung Reaktionsmischung in den Mega-Well einer semi-präparativen niedrigem Schmelzpunkt Agarosegel (0,75%, w: v) sowie ein Aliquot (5 ul) der Reaktionsmischung in dem benachbarten auch als Reporter.
   2. Run DNA-Elektrophorese (5 V / cm zwischen den Elektroden, 4 ᵒC) und trennen Sie die Agarose-Gel auf die Mega-gut entspricht, und speichern Sie sie bei 4 ᵒC in 1x TAE.
   3. Stain die Spur mit dem Molekulargewicht Leiter und dem Reporter. Visualisieren Sie die Bänder unter UV-Licht. Nick die Position, wo die linearisierte Vektor Plätze.
      Hinweis: Da die Qualität des gereinigten linearisierten Vektor a Criti istcal Faktor für eine erfolgreiche Rekombination und Montage in Hefe, Gel-Färbung für semi-präparative DNA-Elektrophorese zu vermeiden. Die Verwendung von Farbstoffen und UV - Belichtung für Gel Extraktion kann die Stabilität des DNA - Vektors beeinflussen, Beeinträchtigung der in vivo - Rekombination Effizienz. Als Alternative zu toxischen EtBr Farbstoffe, Gel Red und SYBR-Farbstoffe werden für Gel-Färbung verwendet.
   4. In Abwesenheit von UV-Licht, identifizieren die linearisierte Vektor im Fragment mega-gut die Führung der Kerben in der gefärbten Reporter Spur mit, so dass es isoliert werden kann.
   5. Extrahieren der linearisierte Vektor aus Agarose und reinige sie mit einem handelsüblichen Gel Extraction-Kit nach Herstellerprotokoll.
      Hinweis: Verwenden Sie High-Kopie episomalen Shuttle - Vektoren mit Antibiotika und Auxotrophie - Marker: In diesem Beispiel wird die Uracil unabhängig und Ampicillinresistenz pJRoC30 Vektor unter der Kontrolle des Hefe - GAL1 - Promotor eingesetzt.
6. Bereiten Sie eine äquimolare mixture der PCR-Fragmente und mit dem linearisierten Vektor mischen zu einem 2: 1-Verhältnis, mit nicht weniger als 100 ng linearisierter Plasmid (Test unterschiedliche Verhältnisse von äquimolaren Bibliothek / offener Vektor gute Transformation Ausbeuten zu erzielen).
   1. Messen der Extinktion der PCR-Fragmente und linearisierten Vektor bei 260 nm und 280 nm, ihre Konzentration und Reinheit zu bestimmen.
7. Trans Hefe kompetente Zellen mit dem DNA - Gemisch eine kommerzielle Hefe Transformation Kit (siehe Tabelle für die Versorgung) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   1. Hier verwenden eine Protease - defizienten und URA3 ^- abhängig S. cerevisiae - Stamm, BJ5465. Transformation der Zellen mit dem parentalen Vektor zirkularisierten als interner Standard bei Screening (siehe unten). Darüber hinaus überprüfen Sie den Hintergrund durch das linearisierte Vektor in Abwesenheit von PCR-Fragmenten verwandeln.
      Hinweis: Bei der anfänglichen niedrigen Sekretionsmengen Erkennung verwenden S.cerevisiae - Protease - defiziente Stämme wie BJ5465 die Anhäufung von aktiven Protein in den Kulturüberständen zu fördern. Wenn das Zielenzym Hyperglykosylierung läuft, die Verwendung von Glykosylierungs-defizienten Stämmen (beispielsweise die Δ kre2 nur des Anbringens kleineren Mannose Oligomeren kann) kann eine geeignete Wahl sein.
8. Platte die transformierten Zellen auf SC Drop-out-Platten und sie für drei Tage bei 30 ° C inkubiert. Teller (auf SC Drop-out - Platten , ergänzt mit Uracil) URA3 ^- S. cerevisiae - Zellen , die das Plasmid als negative Kontrolle für das Screening fehlt (siehe unten).

2. Hochdurchsatz-Screening-Assay (Abbildung 3)

1. Füllen eine geeignete Anzahl von sterilen 96-Well-Platten (23 Platten mit einer Bibliothek von 2.000 Klonen zu analysieren) mit 50 & mgr; l Minimalmedium pro Vertiefung mit Hilfe eines Pipettierroboters.
2. Wählen Sie einzelne Kolonien aus dem SC-Drop-out-Platten und sie auf den 96-Well-Platten.
   1. In jeder Platte Spaltennummer 6 mit dem Elterntyp als interner Standard inokulieren und gut mit URA3 H1 ^- S. cerevisiae - Zellen (in SC - Medium mit Uracil ergänzt) ohne Plasmid als negative Kontrolle.
      Hinweis: Nun H1 gefüllt ist speziell mit Drop-out mit Uracil Medien. Eine leere gut haltigen Medien ohne Zellen können auch als zusätzliche Sterilitätskontrolle hergestellt werden.
3. Decken Sie die Platten mit ihren Deckeln und wickeln Sie sie in Parafilm. Inkubieren Platten für 48 Stunden bei 30 ° C, 225 rpm und 80% relativer Luftfeuchtigkeit in einem feuchten shaker.
4. Entfernen Sie die Parafilm, fügen Sie 160 ul Expressionsmedium zu jeder Vertiefung mit Hilfe des Pipettierroboter, wieder verschließen die Platten und inkubieren sie für weitere 24 Stunden.
   Hinweis: Minimal Medium und Expressionsmedium hergestellt werden , wie an anderer Stelle ¹⁹ berichtet. Sekretionsniveaus variieren kann auf dem Gen untersucht und dementsprechend abhängig, ter Inkubationszeiten jeweils optimiert werden müssen das Zellwachstum in allen Vertiefungen zu synchronisieren.
5. Zentrifuge die Platten (Masterplatten) bei 2.800 x g für 10 min bei 4 ° C.
6. Transfer 20 ul des Überstandes aus den Vertiefungen in der Master-Platte an der Replik Platte ein Liquid-Handling Roboter-Multistation verwendet wird.
   Hinweis: Um begünstigen Enzym - Sekretion ist es ratsam, das native Signalpeptid des Zielproteins durch Signalpeptide häufig für die heterologe Expression in Hefe verwendet zu ersetzen (zB die α - Faktor Präpro-Führer, der Führer der K ₁ Killer - Toxin von S. cerevisiae oder auch chimäre Versionen der beiden Peptide ^13). Alternativ kann das native Signalpeptid ausschließlich für die Sekretion in Hefe entwickelt werden.
7. Geben Sie 20 & mgr; l von 2 mM p -methoxybenzylalcohol in 100 mM Natriumphosphatpuffer pH 6.0 mit Hilfe der Pipettierroboter. Rühren Sie die Platten kurz mit einem 96-wirll Tellermischer und brüten sie für 30 min bei RT.
8. Mit dem Pipettierroboter, fügen Sie 160 ul des FOX - Reagens zu jeder Replik Platte und rühren Sie kurz mit dem Mischer (Endkonzentration von FOX Mischung in den Brunnen: 100 & mgr; M Xylenolorangelösung, 250 & mgr; M Fe (NH _{4) 2} (SO _{4) 2} und 25 mM H ₂ SO _4).
   1. Fügen mehrere Zusatzstoffe der Reagenz Empfindlichkeit zu erhöhen, wie organische Cosolventien (DMSO, Ethanol, Methanol) oder Sorbitol ^17. Hier verstärken die Reaktion von Sorbitol zu einer Endkonzentration von 100 mM Zugabe (Abbildung 4).
9. Lesen Sie die Platten (End-Point - Modus, t ₀₎ bei 560 nm auf einem Plattenleser.
10. Die Inkubation bei RT , bis die Farbe wieder die Absorption entwickelt und messen (t _1).
    1. Berechnen Sie die relative Aktivität aus der Differenz zwischen dem ABS-Wert nach der Inkubation und der anfänglichen Messung normiert auf die parental Typ für jede Platte (At ₁ - t _0).
11. Betreff die besten Mutante Treffer zu zwei aufeinander folgenden Wieder Screenings Fehlalarme auszuschließen.
    Hinweis: In der Regel wieder Screenings Plasmidisolation von Hefe, Amplifikation und Reinigung in Escherichia coli umfassen, gefolgt von Transformation frische Hefe - Zellen mit dem Plasmid ^19. Jeder ausgewählte Klon wird in pentaplicate erneut kontrolliert.

Representative Results

AAO von P. eryngii ist eine extrazelluläre flavooxidase die Pilz-Peroxidasen mit H ₂ O ₂ liefert Lignin zu starten angreifen. Zwei Segmente der AAO wurden fokussierte gerichtete Evolution unterworfen , indem MORPHING, um ihre Aktivität und ihre Expression zu verstärken in S. cerevisiae ^19. Unabhängig von den ausländischen von S. beherbergte Enzyme cerevisiae, die kritischste Problem , wenn Mutantenbibliotheken in Hefe Konstruktion der Konstruktion von spezifischen überlappenden Regionen bezieht sich auf das Spleißen zwischen Fragmenten und deren Klonierung in den linearisierten Vektor zu begünstigen. In dem aktuellen Beispiel wird für jede PCR - Reaktion wurden alle Fragmente hatten Auskragungen von etwa 50 bp in vivo Spleißen in Hefe zu fördern. Die Anzahl der Rekombinationsereignisse abhängig ist von der Anzahl der Segmente mit dem linearisierten Vektor (dh zwei Crossover - Ereignisse zwischen dem nahm montiert und geklont werdendrei PCR Segmente -die zwei mutagenen Segmente der nicht-mutagenisierten segment- plus zwei zusätzliche Übergänge mit dem linearisierten Vektor flankieren; Abbildung 1). Nach unserer Erfahrung, überlappende Sequenzen, die länger als 50 bp, die Wahrscheinlichkeit von internen Rekombination verringern, während sie keine Transformationseffizienz zu verbessern.

Mutations Lasten wurden durch Abtasten Mutantenbibliotheken mit unterschiedlichen Landschaften angepasst, um die Anzahl der Klone mit <10% des Elternenzymaktivität zu berechnen und sie weiter Überprüfung durch Sequenzierung einer Stichprobe von aktiven und nicht aktiven Varianten (5A). Für die Bestimmung des Koeffizienten der Varianz S. cerevisiae - Zellen wurden mit dem parentalen AAO und plattiert auf SC-Dropout - Platten transformiert. Einzelne Kolonien wurden in einer 96-Well-Platte und die Aktivität der Klone wurde ausgewertet aus frischen Präparationen gepickt und inokuliert. mutagene Probe2 (Taq / MnCl ₂ 0,05 mM) wurde als Ausgangspunkt für Bibliothekskonstruktion und Screening ausgewählt.

Da die biologische Aktivität von AAO das Medium H ₂ O ₂ -Konzentration in der Reaktion erhöht, suchten wir nach einer empfindlichen und genauen Assay geringfügige Änderungen in H ₂ O ₂ zu quantifizieren. FOX ist ein chemisches Verfahren auf der Grundlage der Fenton - Reaktion ^20, wobei die Oxidation durch H ₂ O ₂ treibt die Reaktion von Fe ³⁺ mit Xylenolorangelösung ein blau-lila - Komplex (o -cresolsulfone-phthalein 3 zu bilden ', 3' '- Bis (methylimino) diacetat ε ₅₆₀ = 1,5 × 10 ⁴ M ^-1 cm ^-1). Der Eisenoxidationsschritt wurde amplifiziert Sorbit durch Zugabe der Empfindlichkeit des Assays zu verbessern, um die Ausbreitung von Radikalen mit einer scheinbaren Erhöhung ε ₅₆₀ = 2,25 x 10 ⁵ M ^-1 cm ^-1 (FiAbbildung 4).

Die Nachweisgrenze dieses Tests (im um - Bereich) durch die Blank - Bestimmungsverfahren in einer 96-Well - Platte mit den Standards in dreifacher Ausführung (0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3 und 4 uM H berechnet ₂ O ₂ ) und mehrere Überstände von S. Verwendung cerevisiae fehlt das URA3 ^- Plasmid (5B). Der Assay war linear in Gegenwart von Sorbit (bis zu 8 & mgr; M H ₂ O _2), und obwohl die Linearität in Abwesenheit dieses Zuckers mehr persistent war (zumindest bis zu 30 & mgr; M H ₂ O ₂₎ die Reaktion schwächer (beispielsweise bei 6 & mgr; M H ₂ O _2, eine 4-fache Verstärkung wurde in Gegenwart von Sorbit -deep purpur von einer Extinktion von 0,24 in ihrer Abwesenheit erhalten -dunkel orange- (5B)). Die Beziehung zwischen Abs und der AAO-Konzentration wurde mit steigenden Mengen von e ausgewertetnzyme (von Hefeüberstände) und eine lineare Reaktion beobachtet wurde; R ² = 0,997 (5C).

Es ist bemerkenswert, dass die FOX-Signal für mehrere Stunden ohne sichtbare Störung durch die verschiedenen Elemente in der Kulturbrühe stabil war. Die geschätzte Empfindlichkeit von FOX betrug ~ 0,4 & mgr; M H ₂ O ₂ durch die AAO im Überstand produzierten in Gegenwart von Sorbit und ~ 2 & mgr; M in seiner Abwesenheit.

Eine Mutantenbibliothek von 2.000 Klonen wurde mit diesem Assay konstruiert und gescreent. Mehrere AAO - Mutanten wurden mit deutlich verbesserte Sekretion und Aktivität gegen p - Methoxybenzyl Alkohol (5D) ¹⁹ identifiziert.

Abbildung 1.. MORPHING Protokoll für AAO Entwicklung Zwei verschiedene Regionen von AAO wurden für statistische Mutagenese und Rekombination gezielt: M1 (blau, 590 bp), die das Signalpeptid (SP) umfasst; M2 (gelb, 528 bp). Der HF-Bereich (grau, 844 bp) wurde mit High-Fidelity-Polymerasen amplifiziert. Mutagene Regionen wurden in der Kristallstruktur von AAO (PDB ID: 3FIM) abgebildet. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figure 2. Herstellung von PCR - Produkte und der linearisierte Vektor (A) Analytical Agarosegel (1% w: v). , Die einen Molekulargewichtsmarker (1 kb - Leiter) in den Bahnen 1 und 7; die Bam HALLO und XhoI linearisierte Vektor, Spur 2; PCR-Segment M1, Spur 3; PCR-Segment M2, Spur 4; PCR-Segment HF, Spur 5; die in vivo zusammengesetzt Vektor mit NheI linearisiert I (enthaltend das vollständige AAO - Gen mit Regionen MI, HF und M-II), Spur 6 (B) Vektorlinearisierung, Bahnen 1 und 6 molekulare Standards, 1 Kb Leiter; Plasmid Miniprep, Spur 2; Plasmid linearisiert mit NheI, Spur 3; Plasmid linearisiert mit Bam HALLO und Xho I, Bahn 4; linearisierte Plasmid durch Gel - Extraktion und Reinigung nach der Verdauung, Spur 5 (C) Protokoll für die Plasmid - Reinigung erhalten. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. Hochdurchsatz - Screening - Protokoll. Überblick über den Prozess. Bitte klicken Sie hier einen größeren vers zu sehenIon dieser Figur.

Abbildung 4. Die FOX - Methode. Weißfäulepilze greifen die Zellwand aus Holz durch eine Fenton - Reaktion , die Hydroxyl - Radikal OH ^• erzeugt. Die FOX Verfahren koppelt diese Reaktion Xylenolorangelösung (XO), und die Absorption des XO-Fe ³⁺ Komplexes wird bei 560 nm gemessen. Eisenoxidation durch Zugabe von Sorbit zu Reagenzmischung verstärkt wird. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5. mutagene Landschaften für Bibliotheken unter Verwendung verschiedener fehleranfällige PCR - Bedingungen und Validierung des Screening - Assays MORPHING. (A ng>) MORPHING Landschaften. Feste horizontale Linie zeigt die Aktivität des Elterntyp in dem Test, während die gestrichelten Linien die Variationskoeffizient des Assays anzeigen. Die Prozentangaben geben die Anzahl der Klone mit weniger als 10% des parentalen Enzymaktivität. Die Aktivitäten sind in absteigender Reihenfolge aufgetragen. (B) Die Grenze FOX Erkennung ausgewertet wurde mit Konzentrationen von H ₂ O ₂ in Gegenwart (schwarze Kreise) und Abwesenheit (weiße Quadrate) von Sorbit zu erhöhen. (C) lineare Korrelation zwischen AAO - Konzentration (Transüberstand) und Abs _560nm. Jeder Punkt entspricht dem Mittelwert von 8 Experimenten und enthält die Standardabweichung. (D) Mutant Bibliothekslandschaft. Die ausgewählten Varianten (beschatteten Platz) wurden als anderswo ¹⁹ berichtet gescreent. Durchgezogene Linie zeigt die Aktivität von AAO Elterntyp.> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

In diesem Artikel haben wir die meisten der Tipps und Tricks beschäftigt in unserem Labor zu konstruieren Enzyme durch gerichtete Evolution in S. zusammengefasst cerevisiae (unter Verwendung AAO als Beispiel) , so dass sie für die Verwendung mit vielen anderen eukaryotischen Enzymsysteme durch einfaches Folgenden werden die allgemeinen hier beschriebenen Ansatz angepasst werden kann.

In Bezug auf die Bibliothek Schöpfung ist MORPHING eine schnelle Ein-Topf - Verfahren einzuführen und zufällige Mutationen in kleinen Protein erstreckt sich rekombinieren , während die restlichen Bereiche des Proteins unverändert ¹⁶ zu verlassen. Bibliotheken mit mehreren Mutations Lasten können leicht in vivo hergestellt und rekombiniert werden, zusammen mit dem linearisierten Plasmids, eine vollständige autonom replizierenden Vektor zu erzeugen. Es ist wichtig , daß überlappende Sequenzen jede Dehnung flankieren die Fragmente des vollständigen Gens zu ermöglichen , durch in vivo - Rekombination wieder aufgebaut zu werden, vermeidet zusätzliche PCR - Reaktionen und in vitro - Ligation Schritten. In diesem protocol, die Häufigkeit der Überkreuzungsereignisse zwischen PCR-Fragmente können durch eine Verringerung der Größe der überlappenden Bereiche erhöht werden, obwohl dies die Transformationseffizienz beeinträchtigen kann. Unabhängig von den DNA - Polymerasen verwendet für mutagene PCR, die Mutations Lasten können durch vorheriges Konstruktion und Analyse von kleinen Mutantenbibliothek Landschaften (5A) eingestellt werden. Wenn das GeneMorph II Kit verwendet wird, ist es immer noch ratsam , diesen Ansatz zu folgen , da in vivo DNA - Rekombination insbesondere die Mutations - Lasten geschätzt vom Hersteller ändern können. Allgemein ausgedrückt in mutant Landschaften, die 35 - 50% der gesamten Klone gescreent haben weniger als 10% der Elternaktivität eignen sich für die gerichtete Evolution Kampagnen, obwohl diese Zahl in Abhängigkeit des Zielproteins und seine Aktivität variiert. Typischerweise sind die Analyse von Mutanten-Bibliotheken Landschaften weiter durch DNA-Sequenzierung einer Stichprobe von Mutanten verifiziert. In dem aktuellen Beispiel die TaqDNA-Polymerase wurde aufgrund seiner hohen Fehlerrate verwendet, die der fehlenden 3'→ 5'proof Lese Exonukleaseaktivität verbunden ist. Die Mutations - Lasten in Taq - Bibliotheken wurden durch die Zugabe von verschiedenen Konzentrationen von MnCl ₂ modifiziert, aber die Verwendung von unsymmetrischen dNTPs und / oder der Reduktion in Genmatrize Konzentrationen sind ebenfalls geeignete Optionen. Inherent Einschränkungen von MORPHING aus der Anzahl der Segmente kommen rekombiniert werden. Nach unserer Erfahrung können bis zu vier Proteinbausteine ​​(fünf Kreuzungsereignisse die Rekombination Bereiche mit dem linearisierten Vektor gezählt) mit guten Ausbeuten Transformation (~ 10 ⁵ Klone pro Transformationsreaktion) gespleißt werden. Dieses Verfahren kann leicht durchgeführt mehrere orts Sättigungsmutagenese modifiziert werden (zB mit NDT degenerierten Primern oder für 22 einzigartige Codons zu schaffen Entartung) mehrere Positionen gleichzeitig zu erkunden , während signifikant die Screening - Bemühungen ^21,22 reduziert.

"blind" Screening - Protokoll für AAO ist extrem empfindlich und zuverlässig (basierend auf dem direkten Nachweis von H ₂ O ₂ unabhängig von dem Substrat durch das Enzym verwendet), was einen komplementären Assay zu anderen gut indirekten etabliert Protokolle Peroxide zu erkennen (meist Kopplung Peroxidasen mit kolorimetrischen Substraten). Tatsächlich wurde die FOX - Test routinemäßig eingesetzten H ₂ O ₂ in biologischen Flüssigkeiten zu messen, und es kann nun leicht in Protokolle übersetzt werden AAO und andere H ₂ O ₂ produzieren Enzyme zu entwickeln (zB Glucose - Oxidasen, Cellobiose Dehydrogenasen, Glyoxal Oxidasen, Methanol-Oxidasen), insbesondere für Aktivitäten auf nicht-natürliche Substrate, wo Antworten sonst schwer zu erkennen sind.

S. cerevisiae ist der am besten geeignete Wirt für die gerichtete Evolution von eukaryotischen Genen , da es eine hohe Transformationseffizienz bietet (bis zu 1 x 10⁶ Transformanten / ug DNA), führt es komplexe post-translationale Prozessierung und Modifikationen (einschließlich N- und C-terminale Prozessierung und Glykosylierung) und exportiert Fremdproteine ​​in die Kulturbrühe über einen Sekretionsweg. Darüber hinaus sind gut etablierte Molekularbiologie Werkzeuge zur Verfügung, mit dieser Hefe zu arbeiten, einschließlich uni- oder bidirektionalen episomale (nicht integrativ) Shuttle-Vektoren unter der Kontrolle von Promotoren unterschiedlicher Stärke. Nicht zuletzt hat die hohe Frequenz der homologen DNA - Rekombination eine Reihe von Methoden erlaubt DNA Vielfalt zu erhalten , werden entwickelt , die derzeit verwendet werden einzelne Proteine ​​zu entwickeln, sowie komplexere Enzymwege ^{8, 12, 13, 23.} die in - vivo - Lücke Reparatur und der Beweis-Lesegerät dieser Hefe kann auch Chimären verwendet werden , zu erstellen , wenn verschiedene Gene rekombiniert (mit ca.. 60% der DNA - Sequenzidentität), sowie beste Nachwuchs / Mutationen von einem directe zu mischend Evolution Kampagne oder zusammen zu bringen , in vitro und in vivo - Rekombination Methoden in einer Runde der Evolution, wodurch Mutantenbibliotheken in Bezug auf die Faltbarkeit und Funktion zu bereichern.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Culture media
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A0166	CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto Agar	Difco	214010
Cloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378	CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G0750	CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Sigma-Aldrich	83400	CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51
Peptone	Difco	211677
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662	CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
Uracil	Sigma Aldrich	U1128
Yeast Extract	Difco	212750
Yeast Nitrogen Base without Amino Acids	Difco	291940
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil	Sigma-Aldrich	Y1501
Name	Company	Catalog Number	Comments
2. PCR Reactions
dNTP Mix	Agilent genomics	200415-51	25 mM each
iProof High-Fidelity DNA polymerase	Bio-rad	172-5301
Manganese(II) chloride tetrahydrate	Sigma-Aldrich	M8054	CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91
Taq DNA Polymerase	Sigma-Aldrich	D4545	For error prone PCR
Name	Company	Catalog Number	Comments
3. Plasmid linearization
BamHI restriction enzyme	New England Biolabs	R0136S
Bovine Serum Albumin	New England Biolabs	B9001S
XhoI restriction enzyme	New England Biolabs	R0146S
Not I restriction enzyme	New England Biolabs	R0189S
Gel Red	Biotium	41003	For staining DNA
Name	Company	Catalog Number	Comments
4. FOX assays
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	F3754	CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14
Anysil Alcohol	Sigma Aldrich	W209902	CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876	CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17
Hydrogen peroxide 30%	Merck Millipore	1072090250	FOX standard curve
Xylenol Orange disodium salt	Sigma-Aldrich	52097	CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62
Name	Company	Catalog Number	Comments
5. Agarose gel stuff
Agarose	Norgen	28035	CAS Nº 9012-36-6
Gel Red	Biotium	41003	DNA analysis dye
GeneRuler 1kb Ladder	Thermo Scientific	SM0311	DNA M.W. standard
Loading Dye 6x	Thermo Scientific	R0611
Low-melting temperature agarose	Bio-rad	161-3112	CAS Nº 39346-81-1
Name	Company	Catalog Number	Comments
6. Kits and cells
S. cerevisiae strain BJ5465	LGC Promochem	ATTC 208289	Protease deficient strain with genotype: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Blue competent cells	Agilent genomics	200150	For plasmid purification and amplification
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740,609,250	DNA gel extraction
NucleoSpin Plasmid Kit	Macherey-Nagel	740,588,250	Column miniprep Kit
Yeast Transformation Kit	Sigma-Aldrich	YEAST1-1KT	Included DNA carrier (Salmon testes)
Zymoprep yeast plasmid miniprep I	Zymo research	D2001	Plasmid extraction from yeast
Name	Company	Catalog Number	Comments
7. Plates
96-well plates	Greiner Bio-One	655101	Clear, non-sterile, polystyrene (for activity measurements)
96-well plates	Greiner Bio-One	655161	Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)
96-well plate lid	Greiner Bio-One	656171	Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)