Riktad evolution Method in Published: April 1, 2016 doi: 10.3791/53761

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Javier Viña-Gonzalez¹, David Gonzalez-Perez¹, Miguel Alcalde¹

¹Department of Biocatalysis, Institute of Catalysis, CSIC

Abstract

Riktad evolution i Saccharomyces cerevisiae erbjuder många attraktiva fördelar vid utformning av enzymer för biotekniska tillämpningar, en process som involverar konstruktionen, kloning och expression av mutantbibliotek, kopplad till hög frekvens homolog DNA-rekombination in vivo. Här presenterar vi ett protokoll för att skapa och bibliotek skärmen muterade i jäst baserat på exemplet med en svamp aryl-alkoholoxidas (AAO) för att förbättra sin totala verksamhet. Två proteinsegment utsattes för fokuserad riktad evolution genom slumpmässig mutagenes och in vivo DNA-rekombination. Överhäng av ~ 50 bp flankerande varje segment tillåts den korrekta återsammansättning av AAO-fusionsgenen i en linjäriserad vektor som ger upphov till en fullständig autonomt replikerande plasmid. Mutant bibliotek berikade med funktionella AAO varianter screenades i S. cerevisiae supernatanter med en känslig hög genomströmning analys baserad på Fenton reaktion. Den allmänna processen förbibliotekskonstruktion i S. cerevisiae beskrivs här kan tillämpas lätt att utvecklas många andra eukaryota gener, undvika extra PCR-reaktioner, in vitro-DNA-rekombination och ligering steg.

Introduction

Riktad molekylär evolution är en robust, snabb och tillförlitlig metod för att utforma enzymer ^{ett, två.} Genom upprepade omgångar av slumpmässig mutation, rekombination och screening, kan genereras förbättrade versioner av enzymer som verkar på nya underlag, i nya reaktioner i icke-naturliga miljöer, eller ens att hjälpa cellen att nå nya metabola mål ^3-5. Bland värdarna används i riktad evolution, erbjuder öljäst Saccharomyces cerevisiae en repertoar av lösningar för funktionellt uttryck av komplexa eukaryota proteiner som annars inte finns tillgängliga i prokaryota motparter ^6,7.

Används uttömmande i cellbiologiska studier, har denna lilla eukaryot modell många fördelar i form av post-translationella modifieringar, enkel manipulation och transformationseffektiviteten, som alla är viktiga egenskaper att konstruera enzymer genom riktad evolution ^8. Dessutom den höga frekvensenav homolog DNA-rekombination i S. cerevisiae kopplad till en effektiv apparat korrekturläsning öppnar ett brett utbud av möjligheter för biblioteks skapande och gensammansättning in vivo, främja utvecklingen av olika system från enstaka enzymer till komplexa artificiella vägar ^9-12. Vårt laboratorium har tillbringat det senaste decenniet utforma verktyg och strategier för molekylär evolution av olika ligninaser i jäst (oxidoreduktaser är involverade i nedbrytningen av lignin under trä sönderfall) ^13-14. I detta meddelande presenterar vi ett detaljerat protokoll för att förbereda och bibliotek skärmen muterade i S. cerevisiae för en modell flavooxidase, -aryl-alkoholoxidas (AAO ¹⁵⁾ -, som lätt kan översättas till många andra enzymer. Protokollet innebär en fokuserad-riktad evolution metoden (MORPHING: mutagen Organiserad Rekombination processen genom homolog in vivo gruppering) biträdd av jästcellen apparaten ^16, enda mycket känslig screeningsanalys baserad på Fenton-reaktion i syfte att detektera AAO aktiviteten utsöndras i odlingsbuljongen ^17.

Protocol

1. Mutant Library Construction

1. Välj vilka regioner som skall utsättas för MORPHING med hjälp av beräkningsalgoritmer baserat på de tillgängliga kristallstruktur eller homologimodeller ^18.
   1. Här riktar två regioner i AAO från kungsmussling för slumpmässig mutagenes och rekombination (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), medan förstärka resten av genen (844 bp) av hifi-PCR (figur 1).
      Obs: Flera segment kan studeras genom MORPHING i ett oberoende eller kombinerat sätt ^16.
2. Förstärk målområdena genom mutagen PCR. Skapa överlappande områden mellan segmenten (~ 50 bp vardera) genom att överlagra PCR-reaktioner av de definierade regionerna.
   1. Förbered mutagen PCR riktade segment i en slutlig volym av 50 pl innehållande DNA-mall (0,92 ng / l), 90 nM oligo känsla (RMLN för segment MI och AAO-BP för segmentet M-II), 90 nM antisense primer (AAO-92C för segmentet Ml och RMLC för segmentet M-II), 0,3 mM dNTP (0,075 mM vardera), 3% (volym / volym) dimetylsulfoxid (DMSO), 1,5 mM _MgCl2, 0,05 mM _MnCl2 och 0,05 U / ^ il Taq-DNA-polymeras. Primers sekvenser anges i detalj i figur 1.
   2. Använd följande PCR-program: 95 ° C under 2 minuter (1 cykel); 95 ° C under 45 sek, 50 ° C under 45 sek, 74 ° C under 45 sek (28 cykler); och 74 ° C under 10 min (1 cykel).
3. Förstärker de icke-mutagena regioner med extremt high fidelity-polymeras och inkluderar motsvarande områden som överlappar de mutagena segment och / eller ariserade vektorn överhäng.
   1. Förbered reaktionsblandningar i en slutlig volym av 50 ^ il innehållande: DNA mall (0,2 ng / | il), 250 nM oligo avkänning HFF, 250 nM oligo antisens HFR, 0,8 mM dNTP (0,2 mM vardera), 3% (volym / volym) dimetylsulfoxid (DMSO) och 0,02 U / | il iproof DNA-polymeras. Primers sekvenser beskrivs i <strong> Figur 1.
   2. Använda följande PCR-program: 98 ° C under 30 sek (1 cykel); 98 ° C under 10 sek, 55 ° C under 25 sek, 72 ° C under 45 sek (28 cykler); och 72 ° C under 10 min (1 cykel).
      Obs: Med förhållanden som beskrivs i 1.2 och 1.3 överlappning av 43 bp (plasmid-M1 region); 46 bp (M1 region-HF region); (Region HF region-M2) 47 bp och 61 bp (M2 regionen plasmid) är utformade (figur 1) för att gynna in vivo skarvning i jäst.
   3. Rena alla PCR-fragmenten (mutagena och icke-mutagena) med en kommersiell gelextraktionskit enligt tillverkarens protokoll.
4. Linjärisera vektorn så att flankerande regioner av ca 50 bp är skapade som är homologa med 5'- och 3'-ändarna av mål-genen.
   1. Förbered en arisereaktionsblandning innehållande 2 ug DNA, 7,5 U BamHI, 7,5 U Xhol, 20 mikrogram BSA och 2 pl buffert Bam HI 10x i en slutlig volym av 20 pl.
   2. Inkubera reaktionsblandningen vid 37 ° C under 2 h och 40 min. Efteråt fortsätter med inaktivering vid 80 ° C under 20 minuter.
5. Rena den lineariserade vektorn genom agarosgel-extraktion för att undvika kontaminering med den kvarvarande cirkulär plasmid (Figur 2).
   1. Ladda uppslutnings-reaktionsblandningen i mega-brunn av en semi-preparativ lågsmältande agarosgel (0,75%, vikt: volym) samt en alikvot (5 | il) av reaktionsblandningen i den intilliggande väl som reporter.
   2. Kör DNA elektrofores (5 V / cm mellan elektroderna, 4 ᵒC) och separera agarosgelen motsvarande mega väl och förvara den på fyra ᵒC i 1x TAE.
   3. Fläcka körfält med molekylvikten stege och reportern. Visualisera banden under UV-ljus. Nick läge där linjäriserade vektor platser.
      Notera: Eftersom kvaliteten på den renade lineariserad vektor är en critical faktor för framgångsrik rekombination och montering i jäst, undvika gel färgning för semipreparativ DNA elektrofores. Användningen av färgämnen och UV-exponering för gelextraktion kan påverka stabiliteten av den DNA-vektor, äventyra rekombination in vivo effektivitet. Som alternativ till giftiga EtBr färgämnen, är Gel Red och SYBR färgämnen som vanligen används för gel färgning.
   4. I avsaknad av UV-ljus, identifiera den linjäriserade vektor i mega väl fragment med hjälp av ledning av hack i den färgade reporter körfält så att den kan isoleras.
   5. Extrahera den lineariserade vektorn från agaros och rena det med en kommersiell gelextraktionskit enligt tillverkarens protokoll.
      Obs: Använd hög kopierings episomala skyttelvektorer med antibiotika och auxotrofi markörer: I det här exemplet använde vi den uracil oberoende och ampicillinresistens pJRoC30 vektor, under kontroll av jäst GAL 1 promotor.
6. Förbered en ekvimolär mixture av PCR-fragmenten och blanda det med den linjäriserade vektorn vid en 2: 1-förhållande, med inte mindre än 100 ng linjäriserad plasmid (testa olika förhållanden mellan ekvimolär bibliotek / öppen vektor för att uppnå goda omvandlings avkastning).
   1. Mät absorbansen av PCR-fragment och lineariserade vektorn vid 260 nm och 280 nm för att bestämma deras koncentration och renhet.
7. Transformera jäst kompetenta celler med DNA-blandningen med användning av ett kommersiellt jästtransformation kit (se tabell för leveranser) enligt tillverkarens instruktioner.
   1. Här använder ett proteas bristfällig och URA3 ^- beroende S. cerevisiae-stam, BJ5465. Transformera cellerna med den paren cirkulariserade vektorn som en inre standard under screening (se nedan). Dessutom, ta bakgrunden genom att omvandla den linjäriserade vektorn i frånvaro av PCR-fragment.
      Obs: Vid detektering initiala låga sekretionsnivåer, använder S.cerevisiae proteas brist stammar som BJ5465 att främja ackumulering av aktivt protein i odlingssupernatanterna. Om målenzymet genomgår hyperglykosylering, användningen av glykosylering fattiga stammar (t.ex. Δ Kre2 som bara kan fästa mindre mannos oligomerer) skulle kunna vara ett lämpligt alternativ.
8. Plate de transformerade cellerna på SC drop-out plattor och inkubera dem vid 30 ° C under tre dagar. Plate (på SC drop-out-plattor kompletterade med uracil) URA3 ^- S. cerevisiae-celler som saknar plasmiden som en negativ kontroll för screening (se nedan).

2. high-throughput screening analys (Figur 3)

1. Fyll ett lämpligt antal sterila 96-brunnsplattor (23 plattor för att analysera ett bibliotek med 2000 kloner) med 50 pl minimalmedium per brunn med hjälp av en pipetteringsrobot.
2. Plocka individuella kolonier från SC-släpp ut plattor och överföra dem till 96-brunnsplattor.
   1. I varje platta, inokulera kolumn nummer 6 med den parentala typen som en intern standard och väl H1 URA3 ^- S. cerevisiae-celler (i SC-medium kompletterat med uracil) utan någon plasmid som en negativ kontroll.
      Obs: Tja H1 fylls speciellt med drop-out media kompletterade med uracil. En tom brunn innehållande media utan celler kan också framställas som en extra sterilitet kontroll.
3. Täck plattorna med sina lock och slå in dem i Parafilm. Inkubera plattorna under 48 h vid 30 ° C, 225 rpm och 80% relativ fuktighet i en fuktig skakapparat.
4. Ta bort Parafilm, tillsätt 160 pl uttrycksmedium till varje brunn med hjälp av pipetteringsrobot, återför plattorna och inkubera dem under ytterligare 24 timmar.
   Obs: Minimal medium och uttrycksmediet beredd som rapporteras någon annanstans ^19. Sekretionsnivåer kan variera beroende på den gen som studeras och följaktligen than inkubationstider måste optimeras i varje enskilt fall för att synkronisera celltillväxt i alla brunnar.
5. Centrifugera plattorna (master plattor) vid 2800 x g under 10 min vid 4 ° C.
6. Transfer 20 ul av supernatanten från brunnarna i master plattan replik plattan med hjälp av en vätskehanterande robotMulti.
   Obs! För att gynna enzymsekre är det lämpligt att ersätta den nativa signalpeptiden av målproteinet av signalpeptider som vanligen används för heterologt uttryck i jäst (t.ex. den α faktor prepro-ledare, ledare för K _en Killer toxin från S. cerevisiae, eller till och med chimära versioner av båda peptiderna ^13). Alternativt kan den nativa signalpeptiden uteslutande utvecklats för sekretion i jäst.
7. Tillsätt 20 | il av 2 mM p -methoxybenzylalcohol i 100 mM natriumfosfatbuffert pH 6,0 med hjälp av pipetteringsrobot. Rör plattorna kort med en 96-vill plattblandare och inkubera dem i 30 min vid RT.
8. Med pipetteringsrobot, tillsätt 160 pl av FOX reagens i varje replik platta och rör om kortvarigt med biandaren (slutkoncentration av FOX blandningen i brunnen: 100 | iM xylenolorange, 250 ^ M Fe _{(NH4) 2} (SO _{4) 2} och 25 mM H ₂ SO _4).
   1. Tillsätt flera tillsatser till reagenset för att öka känsligheten, såsom organiska samlösningsmedel (DMSO, etanol, metanol) eller sorbitol ^17. Här, förstärka svaret genom att tillsätta sorbitol till en slutlig koncentration av 100 mm (figur 4).
9. Läs plattorna (slutpunktsläge, t ₀₎ vid 560 nm på en plattläsare.
10. Inkubera plattorna vid RT tills färg utvecklas och mäta absorptionen igen (t _1).
    1. Beräkna den relativa aktiviteten från skillnaden mellan Abs värde efter inkubation och den ursprungliga mätningen normaliseras mot parental typ för varje platta (At ₁ - t _0).
11. Utsätta bästa mutant träffar på två re-visningar i rad för att utesluta falska positiva.
    Obs: Normalt åter visningar inkluderar plasmid isolering från jäst, förstärkning och rening i Escherichia coli, följt av transformation av färska jästceller med plasmiden ^19. Varje vald klon återscreen i pentaplicate.

Representative Results

AAO från P. eryngii är ett extracellulärt flavooxidase som förser svamp peroxidaser med _{H2O 2} att börja attackera lignin. Två segment av AAO utsattes för fokuserad riktad evolution genom MORPHING i syfte att öka dess aktivitet och dess uttryck i S. cerevisiae ^19. Oberoende av de utländska enzymer hyste av S. cerevisiae, den mest kritiska frågan när man konstruerar muterade bibliotek i jäst avser konstruktion av specifika överlappande regioner för att gynna skarvning mellan fragment och deras kloning i den linjäriserade vektorn. I det aktuella exemplet, för varje PCR-reaktion, alla fragment hade överhäng om cirka 50 bp för att främja in vivo skarvning i jäst. Antalet rekombinationshändelser är beroende av antalet segment som skall monteras och klonas med den linjäriserade vektorn (dvs två crossover händelser ägde rum mellantre PCR segment -de två mutagena segment flankerande den icke-mutageniserade segment- plus ytterligare två överkorsningar med den linjäriserade vektorn, Figur 1). Enligt vår erfarenhet, överlappande sekvenser längre än 50 bp minska sannolikheten för inre rekombination när de inte förbättrar omvandlingseffektiviteten.

Mutations laster justerades genom provtagning muterade bibliotek med olika landskap, beräkning av antalet kloner med <10% av föräldraenzymaktivitet, och ytterligare kontrollera dem genom att sekvensera ett slumpmässigt urval av aktiva och icke-aktiva varianter (Figur 5A). För bestämningen av den variationskoefficient S. cerevisiae-celler transformerades med den parentala AAO och ströks ut på SC-drop out-plattor. Individuella kolonier plockades och inokulerades i en 96-brunnars-platta och aktiviteten för klonema utvärderades från färska beredningar. mutagen prov2 (Taq / _MnCl2 0,05 mM) valdes som startpunkt för konstruktion av bibliotek och screening.

Som den biologiska aktiviteten av AAO ökar _{H2O 2} koncentration i reaktionsmediet, sökte vi en känslig och exakt analys för att kvantifiera små förändringar i _{H2O 2.} FOX är en kemisk metod som grundar sig på Fenton reaktion ^20, varigenom oxidation av H ₂ O ₂ driver reaktionen av Fe ³⁺ med xylenolorange för att bilda en blå-lila-komplexet (o -cresolsulfone-phthalein 3 ', 3' '- bis (metylimino) diacetat ε ₅₆₀ = 1,5 x 10 ⁴ M ^-1 cm ^-1). Den ferro oxidationssteget amplifierades genom tillsats av sorbitol för att öka analysens känslighet, vilket ökar spridningen av radikaler med en skenbar ε ₅₆₀ = 2,25 x 10 ⁵ M ^-1 cm ^-1 (Figur 4).

Detektionsgränsen för denna analys (i ^ M-området) beräknades genom den Blank bestämningsmetod i ett 96-brunnsplatta med standarder i tre exemplar (0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3 och 4 ^ M _{H2O 2} ) och med användning av flera supernatanter från S. cerevisiae som saknar URA3 ^- plasmiden (figur 5B). Analysen var linjär i närvaro av sorbitol (upp till 8 iM av _{H2O 2),} och även om linjäritet var mer ihållande i avsaknad av detta socker (åtminstone upp till 30 iM av _{H2O 2)} svaret var svagare (t.ex., vid 6 | iM av _{H2O 2,} en 4-faldig förstärkning erhölls i närvaro av sorbitol -deep lila- från en absorbans av 0,24 i dess frånvaro -Dark orange (figur 5B)). Förhållandet mellan Abs och AAO koncentrationen utvärderades med ökande mängder av enzyme (från jästsupernatanter) och en linjär respons observerades; ^R2 = 0,997 (figur 5C).

Det är anmärkningsvärt att FOX signalen var stabil under flera timmar utan någon uppenbar inblandning av de olika elementen i odlingsbuljongen. Den beräknade känslighet FOX var ~ 0,4 | iM av _{H2O två} produceras av AAO i supernatanten i närvaro av sorbitol, och ~ 2 | iM i dess frånvaro.

Ett mutantbibliotek av 2.000 kloner konstruerades och screenades med denna analys. Flera AAO mutanter identifierades med särskilt förbättrad sekretion och aktivitet mot p-metoxibensyl alkohol (figur 5D) ^19.

Figur 1.. MORPHING protokoll för AAO Evolution Två olika regioner i AAO riktade för slumpmässig mutagenes och rekombination: M1 (blå, 590 bp) som innehåller signalpeptiden (SP); M2 (gul, 528 bp). HF-regionen (grå, 844 bp) amplifierades med hifi-polymeraser. Mutagena regioner kartlades i kristallstrukturen av AAO (PDB ID: 3FIM). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Framställning av PCR-produkter och den linjäriserade vektor (A) Analytisk agarosgel (1% vikt: volym). Som innehåller en molekylviktsmarkör (1 kb stege) i raderna 1 och 7; Bam Hl och Xho I linjäriserad vektor, bana 2; PCR-segmentet M1, spår 3; PCR-segmentet M2, spår 4; PCR-segmentet HF, bana 5; den i vivo återmonterade vektor linjäriserades med Nhel (som innehåller den fullständiga AAO-genen med regioner MI, HF och M-II), fält 6. (B) vektor linearisering, spår 1 och 6 molekylära standarder, 1 Kb stege; plasmid miniprep, spår 2; plasmid linjäriserades med Nhel, spår 3; plasmiden linjäriserades med BamHI och Xhol, spår 4; ariserade plasmiden erhålls genom gel extraktion och sanering efter matsmältning, spår 5. (C) Protokoll för plasmidrening. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. hög kapacitet Screening protokoll. Översikt över processen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4. FOX Method. White-rötsvampar angriper cellväggen av trä genom en Fenton reaktion som producerar hydroxylradikal OH ^•. FOX metoden par denna reaktion mot xylenolorange (XO), och absorbansen av XO-Fe ³⁺ komplex mäts vid 560 nm. Järn oxidation förstärks genom tillsats av sorbitol till reagensblandningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5. Mutagena landskap för MORPHING bibliotek Använda Olika felbenägen PCR förhållanden och validering av screeninganalys. (A ng>) Klassisk landskap. Fasta horisontella linjen visar aktiviteten hos den parentala typen i analysen medan de streckade linjerna anger variationskoefficient av analysen. Procentsiffran anger antalet kloner med mindre än 10% av föräldraenzymaktivitet. Verksamheten ritas i fallande ordning. (B) Den FOX detektionsgräns utvärderades med ökande koncentrationer av _{H2O 2} i närvaro (svarta cirklar) och frånvaro (vita kvadrater) sorbitol. (C) linjär korrelation mellan AAO koncentration (trans supernatanterna) och Abs _{560 nm.} Varje punkt motsvarar medelvärdet av 8 experiment och inkluderar standardavvikelse. (D) Mutant bibliotek landskap. De utvalda varianter (skuggad kvadrat) återscreenades såsom rapporterats på annat håll ^19. Heldragna linjen visar aktiviteten av AAO parentala typen.> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

I den här artikeln har vi sammanfattat de flesta av de tips och tricks som används i vårt laboratorium för att konstruera enzymer genom riktad evolution i S. cerevisiae (med AAO som ett exempel) så att de kan anpassas för användning med många andra eukaryota enzymsystem genom att helt enkelt följa den gemensamma metod som beskrivs här.

I termer av biblioteket skapande, är MORPHING ett snabbt en-pot metod för att införa och rekombinera slumpmässiga mutationer i små protein sträckor samtidigt som de återstående regioner av proteinet oförändrad ^16. Bibliotek med flera mutations laster kan lätt framställas och rekombineras in vivo, tillsammans med den linjäriserade plasmiden, för att generera ett fullständigt autonomt replikerande vektor. Det är kritiskt att överlappande sekvenser flankerar varje sträcka för att tillåta de fragment av den fullständiga genen för att sättas ihop genom rekombination in vivo, för att undvika extra PCR-reaktioner och ligering in vitro steg. I denna protocol, frekvensen av crossover händelser mellan PCR-fragment kan ökas genom att minska storleken på de överlappande regionerna, även om detta kan äventyra transformationseffektiviteten. Oberoende av de DNA-polymeraser som används för mutagen PCR, kan de mutations belastningar justeras med tidigare att konstruera och analysera små mutanta bibliotek landskap (figur 5A). Om GeneMorph II Kit används, är det fortfarande klokt att följa denna strategi, eftersom in vivo DNA-rekombination i synnerhet kan ändra mutations belastningar uppskattas av tillverkaren. I allmänna termer, mutanta landskap i vilken 35-50% av de totala screenade kloner har mindre än 10% av den parentala aktivitet är lämpliga för riktad evolution kampanjer, även om detta antal varierar i funktion av målproteinet och dess aktivitet. Typiskt är analysen av muterade bibliotek landskap ytterligare verifieras genom DNA-sekvensering av ett slumpmässigt urval av mutanter. I det aktuella exemplet, TaqDNA-polymeras användes på grund av dess höga felfrekvens, som är kopplad till avsaknaden av 3'→ 5'proof behandlingen exonukleasaktivitet. Mutations laster i Taq-bibliotek modifierades genom tillsats av olika koncentrationer av _MnCl2, men användningen av obalanserade dNTP och / eller minskningen av gense templatkoncentrationer är också lämpliga alternativ. Inneboende begränsningarna hos MORPHING kommer från antalet segment som skall rekombineras. Enligt vår erfarenhet, upp till fyra proteinblock (fem crossover händelser räknar rekombination områden med den linjäriserade vektorn) kan skarvas med god transformations avkastning (~ 10 ⁵ kloner per transformationsreaktionen). Denna metod kan lätt modifieras för att utföras flera platsmättnadsmutagenes (t.ex. användning av NDT degenererade primers eller skapa degenerering för 22 unika kodoner) för att undersöka flera positioner samtidigt samtidigt avsevärt minskar screeninginsatser ^21,22.

"blind" screening protokoll för AAO är extremt känslig och tillförlitlig (baserat på direkt detektion av H ₂ O _2, oberoende av vilket substrat som används av enzymet), vilket motsvarar en kompletterande analys till andra väletablerade indirekta protokoll för att upptäcka peroxider (mestadels kopplar peroxidaser med kolorimetriska substrat). I själva verket har den FOX-analysen rutinmässigt användes för att mäta _{H2O 2} i biologiska vätskor, och det kan nu lätt översättas till protokoll för att evolve AAO och varje annan _{H2O 2} producerande enzymer (t.ex., glukosoxidaser, cellobios dehydrogenaser, glyoxal oxidaser, metanol oxidaser), i synnerhet med avseende på aktivitet på icke-naturliga substrat där svaren i övrigt är svåra att upptäcka.

S. cerevisiae är den mest lämpliga värden för riktad evolution av eukaryota gener eftersom det ger hög transformationseffektivitet (upp till 1 x 10⁶ transformanter / pg DNA), utför den komplexa posttranslationell bearbetning och modifieringar (inkluderande N- och C-terminala bearbetning och glykosylering) och det exporterar främmande proteiner i odlingsbuljongen via en sekretorisk väg. Dessutom, väletablerade molekylärbiologiska verktyg finns tillgängliga för att arbeta med denna jäst, inklusive enkel- eller dubbelriktad episomala (icke-integrativ) skyttelvektorer under kontroll av promotorer med olika styrkor. Sist men inte minst, har sin höga frekvensen av homolog DNA-rekombination tillåts en rad metoder utvecklas för att erhålla DNA mångfald som för närvarande används för att utveckla enskilda proteiner, samt mer komplexa enzymvägar ^{8, 12, 13, 23.} in vivo-gapet reparation och korrekturläsningsanordningen enligt denna jäst kan också användas för att skapa chimärer när rekombination olika gener (med ca. 60% av DNA sekvensidentitet), liksom att blanda bästa avkommor / mutationer från en directed evolution kampanj, eller att samla in vitro och in vivo-rekombination metoder i en omgång av evolution, vilket berikar muterade bibliotek när det gäller vikbarhet och funktion.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Culture media
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A0166	CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto Agar	Difco	214010
Cloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378	CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G0750	CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16
D-(+)-Raffinose pentahydrate	Sigma-Aldrich	83400	CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51
Peptone	Difco	211677
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662	CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
Uracil	Sigma Aldrich	U1128
Yeast Extract	Difco	212750
Yeast Nitrogen Base without Amino Acids	Difco	291940
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil	Sigma-Aldrich	Y1501
Name	Company	Catalog Number	Comments
2. PCR Reactions
dNTP Mix	Agilent genomics	200415-51	25 mM each
iProof High-Fidelity DNA polymerase	Bio-rad	172-5301
Manganese(II) chloride tetrahydrate	Sigma-Aldrich	M8054	CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91
Taq DNA Polymerase	Sigma-Aldrich	D4545	For error prone PCR
Name	Company	Catalog Number	Comments
3. Plasmid linearization
BamHI restriction enzyme	New England Biolabs	R0136S
Bovine Serum Albumin	New England Biolabs	B9001S
XhoI restriction enzyme	New England Biolabs	R0146S
Not I restriction enzyme	New England Biolabs	R0189S
Gel Red	Biotium	41003	For staining DNA
Name	Company	Catalog Number	Comments
4. FOX assays
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	F3754	CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14
Anysil Alcohol	Sigma Aldrich	W209902	CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876	CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17
Hydrogen peroxide 30%	Merck Millipore	1072090250	FOX standard curve
Xylenol Orange disodium salt	Sigma-Aldrich	52097	CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62
Name	Company	Catalog Number	Comments
5. Agarose gel stuff
Agarose	Norgen	28035	CAS Nº 9012-36-6
Gel Red	Biotium	41003	DNA analysis dye
GeneRuler 1kb Ladder	Thermo Scientific	SM0311	DNA M.W. standard
Loading Dye 6x	Thermo Scientific	R0611
Low-melting temperature agarose	Bio-rad	161-3112	CAS Nº 39346-81-1
Name	Company	Catalog Number	Comments
6. Kits and cells
S. cerevisiae strain BJ5465	LGC Promochem	ATTC 208289	Protease deficient strain with genotype: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Blue competent cells	Agilent genomics	200150	For plasmid purification and amplification
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740,609,250	DNA gel extraction
NucleoSpin Plasmid Kit	Macherey-Nagel	740,588,250	Column miniprep Kit
Yeast Transformation Kit	Sigma-Aldrich	YEAST1-1KT	Included DNA carrier (Salmon testes)
Zymoprep yeast plasmid miniprep I	Zymo research	D2001	Plasmid extraction from yeast
Name	Company	Catalog Number	Comments
7. Plates
96-well plates	Greiner Bio-One	655101	Clear, non-sterile, polystyrene (for activity measurements)
96-well plates	Greiner Bio-One	655161	Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)
96-well plate lid	Greiner Bio-One	656171	Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)