Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Geregisseerd Evolution Method in Published: April 1, 2016 doi: 10.3791/53761
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biocatalysis, Institute of Catalysis, CSIC

Abstract

Evolutie in Saccharomyces cerevisiae biedt vele aantrekkelijke voordelen bij het ​​ontwerpen van enzymen voor biotechnologische toepassingen, een proces dat de constructie, klonering en expressie van mutante bibliotheken, gekoppeld met hoge frequentie homologe DNA recombinatie in vivo omvat. Hier presenteren we een protocol en het scherm mutante bibliotheken in gist hand van het voorbeeld van een schimmel aryl-alcohol oxidase (AAO) om haar totale activiteit verhogen creëren. Twee eiwitsegmenten werden onderworpen aan gerichte gerichte evolutie door willekeurige mutagenese en DNA in vivo recombinatie. Overhangen ~ 50 bp flankerend elk segment kon de juiste montage van de AAO-fusiegen in een gelineariseerde vector waardoor een volledig autonoom replicerend plasmide. Mutant bibliotheken verrijkt met functionele AAO varianten werden vertoond in S. cerevisiae supernatanten met een gevoelige high-throughput assay gebaseerd op de Fenton reactie. Het algemene proces vanbibliotheek bouw in S. cerevisiae beschreven kunnen gemakkelijk worden toegepast op vele andere eukaryote genen evolueren vermijden extra PCR reacties, in vitro DNA recombinatie en ligatiestappen.

Introduction

Gerichte moleculaire evolutie is een robuuste, snelle en betrouwbare methode om enzymen ontwerpen 1, 2. Door iteratieve ronden van willekeurige mutatie, recombinatie en screening, verbeterde versies van enzymen kan worden gegenereerd die inwerken op nieuwe substraten in nieuwe reacties, in niet-natuurlijke omgevingen of zelfs de cel te helpen nieuwe metabole doelen 3-5 bereiken. Onder de gastheren gebruikt in gerichte evolutie, van de brouwer gist Saccharomyces cerevisiae heeft een repertoire van oplossingen voor de functionele expressie van complexe eukaryote eiwitten die anders niet beschikbaar in prokaryotische tegenhangers 6,7 zijn.

Uitvoerig gebruikt in celbiologische Dit kleine eukaryotische model heeft vele voordelen in termen van posttranslationele modificaties, gemakkelijke manipulatie en transformatie-efficiëntie, die allemaal belangrijke eigenschappen om enzymen te construeren door gerichte evolutie 8. Bovendien is de hoogfrequentevan homologe DNA recombinatie in S. cerevisiae gekoppeld aan een efficiënte proof-leesapparaat opent een breed scala aan mogelijkheden voor de bibliotheek creatie en gen-assemblage in vivo, het bevorderen van de ontwikkeling van verschillende systemen van enkele enzymen om complexe kunstmatige paden 9-12. Ons laboratorium heeft de afgelopen tien jaar van het ontwerp gereedschappen en strategieën voor de moleculaire evolutie van verschillende ligninasen in gist (oxidoreductases betrokken bij de afbraak van lignine in het hout verval) 13-14. In deze mededeling, presenteren we een gedetailleerd protocol voor te bereiden en het scherm mutant bibliotheken in S. cerevisiae een model flavooxidase, -aryl-alcohol oxidase (AAO 15) -, welke gemakkelijk vertalen vele andere enzymen. Het protocol gaat om een gerichte-evolutie methode (MORPHING: Mutageen Organized Recombinatie Process door homologe in vivo Groepering) bijgestaan ​​door het gistcel apparaat 16, eenda zeer gevoelige screening assay gebaseerd op de Fenton reactie om AAO activiteit afgescheiden in het kweekmedium 17 te detecteren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Mutant Bibliotheek Construction

  1. Kies de regio's moeten worden onderworpen aan MORPHING met behulp van algoritmes op basis van de beschikbare kristalstructuur of homologie modellen 18.
    1. Hier targeten twee gebieden van AAO van Pleurotus voor willekeurige mutagenese en recombinatie (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), terwijl de rest amplificeren van het gen (844 bp) van high-fidelity PCR (figuur 1).
      Opmerking: Meerdere segmenten kunnen worden bestudeerd door MORPHING op een onafhankelijke of gecombineerde manier 16.
  2. Versterken de doelgebieden door mutagene PCR. Maak overlappende gebieden tussen segmenten (~ 50 bp elk) door superpositie van PCR-reacties van de gedefinieerde regio's.
    1. Bereid mutagene PCR gerichte segmenten in een eindvolume van 50 pl bevattende DNA matrijs (0,92 ng / ul), 90 nM oligo zin (RMLN voor segment MI en AAO-BP segment M-II), 90 nM eenntisense primer (AAO-92C voor segment MI en RMLC voor segment M-II), 0,3 mM dNTPs (0,075 mM elk), 3% (v / v) dimethylsulfoxide (DMSO), 1,5 mM MgCl2, 0,05 mM MnCl2 en 0,05 U / ul Taq DNA polymerase. Primers sequenties zijn beschreven in figuur 1.
    2. Gebruik de volgende PCR-programma: 95 ° C gedurende 2 min (1 cyclus); 95 ° C gedurende 45 seconden, 50 ° C gedurende 45 seconden, 74 ° C gedurende 45 seconden (28 cycli); en 74 ° C gedurende 10 min (1 cyclus).
  3. Versterken de niet-mutagene regio's met een ultra-high fidelity polymerase en omvatten de desbetreffende gebieden overlappen de mutagene segmenten en / of lineair vector overhangen.
    1. Bereid reactiemengsels in een eindvolume van 50 pl bevattende: DNA template (0,2 ng / ul), 250 nM oligo zin HFF, 250 nM oligo antisense HFR, 0,8 mM dNTPs (0,2 mM elk), 3% (v / v) dimethylsulfoxide (DMSO) en 0,02 U / pl iProof DNA polymerase. Primers sequenties worden beschreven in <strong> Figuur 1.
    2. Gebruik de volgende PCR-programma: 98 ° C gedurende 30 sec (1 cyclus); 98 ° C gedurende 10 sec, 55 ° C gedurende 25 sec, 72 ° C gedurende 45 seconden (28 cycli); en 72 ° C gedurende 10 min (1 cyclus).
      Opmerking: Met de in 1.2 beschreven omstandigheden en 1,3 overlappingen van 43 bp (regio plasmide-M1); 46 bp (M1 regio-HF regio); 47 bp (HF regio-M2 gebied) en 61 bp (M2 regio- plasmide) worden gemaakt (Figuur 1) begunstigen in vivo in gist splicing.
    3. Zuiveren de PCR-fragmenten (mutagene en niet-mutagene) met een commerciële gelextractiekit volgens het protocol van de fabrikant.
  4. Lineariseren de vector zodanig dat flankerende gebieden van ongeveer 50 bp worden gecreëerd die homoloog zijn aan de 5'- en 3'-uiteinden van het doelgen is.
    1. Bereid een linearisatie reactiemengsel dat 2 ug DNA, 7,5 U BamHI, 7,5 U XhoI, 20 ug BSA en 2 ui buffer Bam HI 10x in een eindvolume van 20 pl.
    2. Incubeer het reactiemengsel bij 37 ° C gedurende 2 uur en 40 minuten. Daarna verder met inactivatie bij 80 ° C gedurende 20 min.
  5. Zuiver het gelineariseerde vector door agarose gel extractie om besmetting met de resterende circulair plasmide (figuur 2) te voorkomen.
    1. Laad de digestie reactiemengsel in de mega-putje van een semi-preparatieve laag smeltpunt agarose gel (0,75%, w: v) en een monster (5 pl) van het reactiemengsel in de aangrenzende en een reporter.
    2. Run DNA elektroforese (5 V / cm tussen de elektroden, 4 ᵒC) en scheid de agarosegel die overeenkomt met de mega-goed en het op 4 ᵒC in 1x TAE.
    3. Vlekken op de baan met het molecuulgewicht ladder en de verslaggever. Visualiseer de banden onder UV-licht. Nick de positie waar de gelineariseerde vector plaatsen.
      Opmerking: Als de kwaliteit van het gezuiverde gelineariseerde vector een critical factor voor een succesvolle recombinatie en assemblage in gist, vermijd gel kleuring voor semi-voorbereidende DNA elektroforese. Het gebruik van kleurstoffen en UV-belichting voor gelextractie kan de stabiliteit van de DNA vector beïnvloeden compromitteren de in vivo recombinatie efficiëntie. Als alternatief voor EtBr giftige kleurstoffen worden Gel Red en SYBR kleurstoffen gebruikt voor gel kleuring.
    4. Bij afwezigheid van UV-licht, identificeren van de gelineariseerde vector in de mega-goed-fragment met behulp van de leiding van de inkepingen in het gebrandschilderde verslaggever rijbaan, zodat deze kunnen worden geïsoleerd.
    5. Extraheer de gelineariseerde vector uit agarose en zuiveren met een commerciële gelextractiekit volgens het protocol van de fabrikant.
      Noot: Gebruik high-episomale shuttlevectoren met antibiotica en auxotrofie markers: In dit voorbeeld gebruikt de uracil onafhankelijke en ampicillineresistentie pJRoC30 vector, onder controle van de gist GAL1 promoter.
  6. Bereid een equimolaire mixture van de PCR-fragmenten en meng dit met de gelineariseerde vector met een 2: 1 verhouding van niet minder dan 100 ng gelineariseerde plasmide (test verschillende verhoudingen van equimolaire bibliotheek / openen vector voor transformatie goede opbrengst te bereiken).
    1. Meet de absorptie van de PCR-fragmenten en de lineair gemaakte vector bij 260 nm en 280 nm voor de concentratie en zuiverheid te bepalen.
  7. Transformeren gist competente cellen met het DNA-mengsel met een commerciële gist transformatie kit (zie Tabel voor leveringen) volgens de instructies van de fabrikant.
    1. Hier, gebruik dan een protease deficiënt URA3 en - afhankelijk van S. cerevisiae stam, BJ5465. Transformeer de cellen met de parentale gecirculariseerde vector als interne standaard bij screening (zie hieronder). Bovendien, controleer dan de achtergrond door het transformeren van de gelineariseerde vector in de afwezigheid van PCR-fragmenten.
      Opmerking: In het geval van het detecteren van de eerste laag secretie niveaus, gebruiken S.cerevisiae protease deficiënte stammen BJ5465 zoals de accumulatie van actieve eiwitten in kweeksupernatanten bevorderen. Als het doel enzym ondergaat hyperglycosylering, het gebruik van glycosylering-deficiënte stammen (bijvoorbeeld Δ kre2 dat alleen kan hechten kleinere mannose oligomeren) kan een geschikte optie.
  8. Plaat de getransformeerde cellen op SC drop-out platen en incubeer ze op 30 ° C gedurende drie dagen. Plaat (op SC drop-out platen, aangevuld met uracil) URA3 - S. cerevisiae cellen zonder het plasmide als een negatieve controle voor screening (zie hieronder).

2. High-throughput screeningstest (figuur 3)

  1. Vul een passend aantal steriele 96-putjesplaten (23 platen een bibliotheek van 2000 klonen analyseren) met 50 ul minimaal medium per putje met behulp van een robot pipetteren.
  2. Pick individuele kolonies van de SC-uitval platen en overbrengen naar de 96-well platen.
    1. In elke plaat, te enten kolom nummer 6 met de ouderlijke soort als een interne standaard en goed H1 met URA3 - S. cerevisiae cellen (SC in medium aangevuld met uracil) zonder plasmide als een negatieve controle.
      Opmerking: Nou H1 is speciaal gevuld met drop-out media, aangevuld met uracil. Een blanco putje medium zonder cellen kunnen ook worden bereid als extra controle steriliteit.
  3. Bedek de platen met hun deksels en wikkel ze in Parafilm. Incubeer de platen gedurende 48 uur bij 30 ° C, 225 rpm en 80% relatieve vochtigheid in een vochtige shaker.
  4. Verwijder de Parafilm, voeg 160 pl expressie medium aan elk putje met behulp van de robot pipetteren, bedek de platen en incubeer ze nog eens 24 uur.
    Let op: minimaal medium en expressie medium worden bereid als elders 19 gerapporteerd. Uitscheidingsniveaus kan afhankelijk van het gen bestudeerde variëren en dienovereenkomstig tHij incubatietijden geoptimaliseerd moet worden telkens de celgroei synchroniseren alle putjes.
  5. Centrifugeer de platen (meesterplaten) bij 2800 x g gedurende 10 min bij 4 ° C.
  6. Overdracht 20 ul van de supernatant uit de putjes in de moederplaat de replica plaat met een vloeistofverwerking robot meerdere stations.
    Opmerking: Om enzym secretie bevorderen verdient het aanbeveling het natieve signaalpeptide van het doelwiteiwit te vervangen door signaalpeptiden gebruikt voor heterologe expressie in gist (bijvoorbeeld de α-factor prepro-leader, de leider van de K 1 killer toxine van S. cerevisiae, of chimère versies van beide peptiden 13). Als alternatief kan het natieve signaalpeptide uitsluitend ontwikkeld voor uitscheiding in gist.
  7. Voeg 20 ul van 2 mM p -methoxybenzylalcohol in 100 mM natriumfosfaatbuffer pH 6,0 met behulp van de robot pipetteren. Roer de platen kort met een 96-well plaat mixer en incubeer ze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
  8. Het pipetteren robot, voeg 160 ul van de FOX reagens aan elke replica plaat en roer kort met de mixer (eindconcentratie van FOX mengsel in de put: 100 uM xylenol oranje, 250 uM Fe (NH4) 2 (SO4) 2 en 25 mM H 2 SO 4).
    1. Voeg enkele additieven voor reagens gevoeligheid, zoals organische hulpoplosmiddelen (DMSO, ethanol, methanol) of sorbitol 17 verbeteren. Hier, versterken de reactie door toevoeging van sorbitol tot een uiteindelijke concentratie van 100 mM (Figuur 4).
  9. Lees de platen (end-point mode, t 0) bij 560 nm op een plaatlezer.
  10. Incubeer de platen bij RT tot de kleurontwikkeling en opnieuw meten van de absorptie (t 1).
    1. Bereken de relatieve activiteit van het verschil tussen de waarde na incubatie Abs en die van de eerste meting in dat van de parental soort voor elke plaat (At 1 - t 0).
  11. Betreft de beste mutant hits op twee opeenvolgende re-screenings uit te sluiten valse positieven.
    Opmerking: Meestal opnieuw screenings omvatten plasmide isolatie van gist, amplificatie en zuivering van Escherichia coli, gevolgd door transformatie van verse gistcellen met plasmide 19. Elke geselecteerde kloon wordt opnieuw gescreend pentaplicate.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

AAO van P. eryngii is een extracellulair flavooxidase dat schimmel peroxidasen voorziet van H 2 O 2 beginnen aanvallen lignine. Twee segmenten van AAO werden onderworpen aan gerichte evolutie van MORPHING om de activiteit en de expressie in S. verbeteren 19 cerevisiae. Ongeacht de buitenlandse enzymen koesterde door S. cerevisiae, de meest kritieke punt bij de bouw mutant bibliotheken in gist betreft de engineering van specifieke overlappende gebieden aan de splitsing tussen de fragmenten en hun klonen in de gelineariseerde vector te bevorderen. In het huidige voorbeeld, voor elke PCR reactie, die fragmenten hadden overhangen van ongeveer 50 bp te bevorderen in vivo in gist splicing. Het aantal recombinatiegebeurtenissen is afhankelijk van het aantal segmenten worden samengevoegd en gekloneerd met de gelineariseerde vector (dat wil zeggen, twee crossover gebeurtenissen plaats tussen dedrie PCR delen -de twee mutagene segmenten aan weerszijden van de niet-gemutageniseerde segment- plus twee extra crossovers met de gelineariseerde vector, figuur 1). Volgens onze ervaring, overlappende sequenties langer dan 50 bp verminderen de kans van interne recombinatie terwijl ze geen transformatie-efficiëntie verbeteren.

Mutationele ladingen werden aangepast door bemonstering mutante bibliotheken met verschillende landschappen, berekenen van het aantal klonen met <10% van de ouderlijke enzymactiviteit, en verder controlerend hen door sequentiebepaling een aselecte steekproef van actieve en niet-actieve varianten (Figuur 5A). Voor de bepaling van de variatiecoëfficiënt S. cerevisiae cellen werden getransformeerd met de parentale AAO en uitgeplaat op SC-platen uitval. Individuele kolonies werden opgepikt en geïnoculeerd in een 96 putjes plaat en de activiteit van de klonen werd geëvalueerd van verse preparaten. mutageen monster2 (Taq / MnCl2 0,05 mM) werd gekozen als het vertrekpunt voor de bibliotheek bouw en screening.

Aangezien de biologische activiteit van AAO verhoogt de H 2 O 2 concentratie in het reactiemedium, we gezocht naar een gevoelige en nauwkeurige test voor kleine veranderingen in H 2 O 2 kwantificeren. FOX is een chemische basis van de Fenton reactie 20, waarbij oxidatie door H 2 O 2 drijft de reactie van Fe3 + met xylenol oranje een blauwpaarse te vormen (o -cresolsulfone ftaleïnekleurstof-3 ', 3' '- bis (methylimino) diacetaat 560 ε = 1,5 x 10 4 M -1 cm -1). De ferro oxidatiestap werd geamplificeerd door toevoeging sorbitol de gevoeligheid van de assay verbeteren, verhogen de voortplanting van radicalen met een schijnbare ε 560 = 2,25 x 10 5 M -1 cm -1 (Figuur 4).

De detectiegrens van deze assay (in uM bereik) werd berekend door de lege bepalingsmethode in een 96-wells plaat met standaarden in drievoud (0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3 en 4 uM H 2 O 2 ) en met behulp van verschillende supernatanten S. cerevisiae ontbreekt het URA3 - plasmide (Figuur 5B). De test was lineair bij aanwezigheid van sorbitol (maximaal 8 uM H 2 O 2), en hoewel lineariteit langer voortduurde in afwezigheid van deze suiker (tenminste tot 30 uM H 2 O 2) de reactie was zwakker (bijvoorbeeld ten 6 uM H 2 O 2, een 4-voudige verbetering werd verkregen in aanwezigheid van sorbitol -deep paars- van een absorptie van 0,24 bij gebreke Dark oranje- (figuur 5B)). De relatie tussen Abs en de AAO concentratie werd geëvalueerd met toenemende hoeveelheden enzyme (uit gist supernatanten) en een lineaire respons werd waargenomen; R 2 = 0,997 (figuur 5C).

Het is opmerkelijk dat de FOX signaal was stabiel gedurende verscheidene uren zonder zichtbare inmenging van de verschillende elementen in de kweekbouillon. De geschatte gevoeligheid van FOX was ~ 0,4 uM H 2 O 2 door het AAO in de supernatant in aanwezigheid van sorbitol en ~ 2 pM in zijn afwezigheid.

Een mutant bibliotheek van 2000 klonen werd geconstrueerd en gescreend met deze test. Verschillende AAO mutanten werden geïdentificeerd met name verbeterde secretie en activiteit tegen p-methoxybenzyl alcohol (figuur 5D) 19.

Figuur 1
Figuur 1.. MORPHING Protocol voor AAO Evolution Twee verschillende regio's van AAO waren gericht voor willekeurige mutagenese en recombinatie: M1 (blauw, 590 bp) dat het signaal peptide (SP) omvat; M2 (geel, 528 bp). De HF regio (grijs, 844 bp) werd versterkt met high fidelity polymerase. Mutageen regio's werden in kaart gebracht in de kristalstructuur van AAO (VOB ID: 3FIM). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 2
Figuur 2. Bereiding van PCR-producten en de gelineariseerde vector (A) Analytische agarosegel (1% w: v). Met een molecuulgewicht merker (1 kb ladder) in lanen 1 en 7; de BamHI en Xhol lineair gemaakte vector, laan 2; PCR segment M1, laan 3; PCR segment M2, laan 4; PCR segment HF, laan 5; de in vivo weer in elkaar gezet vector gelineariseerd met NheI (met de volledige AAO-gen met de regio's MI, HF en M-II), laan 6. (B) Vector linearisatie, lanen 1 en 6 moleculaire normen, 1 Kb ladder; plasmide miniprep, laan 2; plasmide gelineariseerd met NheI, laan 3; plasmide gelineariseerd met BamHI en XhoI, laan 4; gelineariseerde plasmide verkregen door gel extractie en clean-up na de spijsvertering, lane 5. (C) Protocol voor plasmide zuivering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3. High-throughput screening protocol. Overzicht van het proces. Klik hier om een grotere vers bekijkenion van dit cijfer.

figuur 4
Figuur 4. De FOX-methode. Wit-rot schimmels aanval op de celwand van hout door middel van een Fenton reactie die hydroxylradicaal produceert OH •. De FOX methode koppels deze reactie aan xylenol oranje (XO), en de absorptie van de XO-Fe 3+ complex wordt gemeten bij 560 nm. Ferro oxidatie wordt versterkt door de toevoeging van sorbitol aan het reactiemengsel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5. Mutagene Landschappen voor MORPHING bibliotheken gebruik van verschillende foutgevoelige PCR Voorwaarden en Validatie van de screeningstest. (A ng>) Van kleur veranderende landschappen. Vaste horizontale lijn toont de activiteit van de oudertype in de test, terwijl de onderbroken lijnen geven de variatiecoëfficiënt van de test. De percentages geven het aantal klonen met minder dan 10% van de ouderlijke enzymactiviteit. De activiteiten worden uitgezet in aflopende volgorde. (B) De FOX detectiegrens werd geëvalueerd met toenemende concentraties H 2 O 2 met (zwarte cirkels) en afwezigheid (witte vierkantjes) sorbitol. (C) lineair verband tussen AAO concentratie (transformant supernatanten) en Abs 560nm. Elk punt correspondeert met het gemiddelde van experimenten 8 en omvat de standaarddeviatie. (D) Mutant bibliotheek landschap. De geselecteerde varianten (geschaduwd vierkant) werden opnieuw gescreend zoals elders 19 gerapporteerd. Ononderbroken lijn toont de activiteit van het AAO ouderlijk type.> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit artikel hebben we samengevat het grootste deel van de tips en trucs die werkzaam zijn in ons laboratorium om enzymen ingenieur door gerichte evolutie in S. cerevisiae (met AAO ter illustratie) zodat ze kunnen worden aangepast voor gebruik met vele andere eukaryote enzymsystemen door simpelweg na de gemeenschappelijke benadering beschreven.

Qua bibliotheek schepping MORPHING is een snel-pot methode te introduceren en recombineren willekeurige mutaties in kleine stukjes eiwit terwijl de overige gebieden van het eiwit ongewijzigd 16. Bibliotheken met verschillende mutationele lasten kunnen gemakkelijk worden bereid en gerecombineerd in vivo, met het gelineariseerde plasmide, een volledig autonoom replicerende vector te genereren. Het is essentieel dat overlappende sequenties flankeren elk rek zodat de fragmenten van het volledige gen dat opnieuw samengesteld behulp van in vivo recombinatie, vermijden extra PCR-reacties en in vitro ligatie stappen. In dit pROTOCOL, de frequentie crossover gebeurtenissen tussen PCR fragmenten kan worden verhoogd door de omvang van de overlappende gebieden, hoewel de transformatie-efficiëntie in gevaar brengt. Ongeacht het DNA polymerase gebruikt voor mutagene PCR, kan de mutatie-lasten worden ingesteld door eerder construeren en analyseren van kleine mutant bibliotheek landschappen (figuur 5A). Als de GeneMorph II Kit wordt gebruikt, is het raadzaam om deze weg verder omdat in vivo DNA-recombinatie name de mutatie belastingen geschat door de fabrikant kan wijzigen. In het algemeen mutant landschappen waarin 35-50% van de totale klonen gescreend minder dan 10% van de ouderlijke activiteit geschikt voor gerichte evolutie campagnes, hoewel dit aantal varieert in functie van het doeleiwit en zijn activiteit. Typisch worden de analyse van mutante bibliotheken landschappen verder geverifieerd door DNA sequentiebepaling van een steekproef van mutanten. In het huidige voorbeeld, het TaqDNA polymerase werd gebruikt vanwege zijn hoge foutenpercentage, dat verband houdt met het ontbreken van 3'→ 5'proof lezing exonuclease activiteit. De mutatie in Taq belastingen bibliotheken werden gemodificeerd door de toevoeging van verschillende concentraties van MnCl2, maar het gebruik van onevenwichtige dNTP's en / of de verlaging gen template concentraties ook geschikte opties. Inherente beperkingen van MORPHING afkomstig uit het aantal segmenten gerecombineerd worden. Volgens onze ervaring, maximaal vier eiwitblokken (vijf crossover recombinatie gebeurtenissen geldt de gebieden met de gelineariseerde vector) kunnen worden gesplitst met goede opbrengsten transformatie (~ 10 5 klonen per transformatiereactie). Deze methode kan eenvoudig worden aangepast om uitgevoerd multisite-verzadigingsmutagenese (bijvoorbeeld met behulp van gedegenereerde primers of NDT maken degeneratie van 22 unieke codons) in meerdere standen gelijktijdig staand terwijl significante reductie screening inspanningen 21,22.

"blind" screening protocol AAO is uiterst gevoelig en betrouwbaar (gebaseerd op de directe detectie van H 2 O 2 ongeacht het gebruikte substraat door het enzym), die een complementaire bepaling om andere gevestigde indirecte protocollen peroxiden (meestal koppelen peroxidasen met colorimetrische substraten) te detecteren. Inderdaad, de FOX assay routinematig gebruikt voor H meten 2 O 2 in biologische vloeistoffen, en kan nu gemakkelijk worden omgezet in protocollen AAO en andere H 2 O 2 producerende enzymen ontwikkelen (bijvoorbeeld glucose-oxidasen, cellobiose dehydrogenasen, glyoxal oxidasen, methanol oxidasen), met name op activiteit op niet-natuurlijke substraten waarbij reacties anderszins moeilijk te detecteren.

S. cerevisiae is de meest geschikte gastheer voor gerichte evolutie van eukaryote genen, omdat het biedt een hoge efficiëntie van de transformatie (maximaal 1 x 106 transformanten / ug DNA), voert complexe post-translationele verwerking en modificaties (waaronder N- en C-eindstandige verwerking en glycosylatie) en exporteren vreemde eiwitten in het kweekmedium via een secretieroute. Bovendien gevestigde moleculair biologische methoden zijn beschikbaar om met deze gist, zoals uni- of bidirectionele episomale (niet-integratieve) shuttlevectoren onder de controle van promoters van verschillende sterktes. Tenslotte heeft de hoge frequentie van homologe DNA recombinatie diverse methoden worden ontwikkeld om DNA diversiteit die momenteel worden gebruikt om afzonderlijke eiwitten, evenals complexere enzymstroom 8, 12, 13, 23 evolueren verkrijgen toegestaan. de in vivo spleet reparatie en het corrigerend inrichting van deze gist kan ook worden gebruikt om chimeren te maken wanneer recombineren verschillende genen (bij. ongeveer 60% van de DNA-sequentie identiteit), maar ook best nakomelingen / mutaties schudden van een Directed evolutie campagne of samen in vitro en in vivo recombinatie werkwijzen in een ronde tonen van evolutie, waarbij mutant bibliotheken te verrijken qua vouwbaarheid en functie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Culture media
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A0166 CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto Agar Difco 214010
Cloramphenicol Sigma-Aldrich C0378 CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-Galactose Sigma-Aldrich G0750 CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G5767 CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16
D-(+)-Raffinose pentahydrate Sigma-Aldrich 83400 CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51
Peptone Difco 211677
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P0662 CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
Uracil Sigma Aldrich U1128
Yeast Extract Difco 212750
Yeast Nitrogen Base without Amino Acids Difco 291940
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil Sigma-Aldrich Y1501
Name Company Catalog Number Comments
2. PCR Reactions
dNTP Mix Agilent genomics 200415-51 25 mM each
iProof High-Fidelity DNA polymerase Bio-rad 172-5301
Manganese(II) chloride tetrahydrate Sigma-Aldrich M8054 CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91
Taq DNA Polymerase Sigma-Aldrich D4545 For error prone PCR
Name Company Catalog Number Comments
3. Plasmid linearization
BamHI restriction enzyme New England Biolabs R0136S
Bovine Serum Albumin New England Biolabs B9001S
XhoI restriction enzyme New England Biolabs R0146S
Not I restriction enzyme New England Biolabs R0189S
Gel Red Biotium 41003 For staining DNA
Name Company Catalog Number Comments
4. FOX assays
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate Sigma-Aldrich F3754 CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14
Anysil Alcohol Sigma Aldrich W209902 CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16
D-Sorbitol Sigma-Aldrich S1876 CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17
Hydrogen peroxide 30% Merck Millipore 1072090250 FOX standard curve
Xylenol Orange disodium salt Sigma-Aldrich 52097 CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62
Name Company Catalog Number Comments
5. Agarose gel stuff
Agarose Norgen 28035 CAS Nº 9012-36-6
Gel Red Biotium 41003 DNA analysis dye
GeneRuler 1kb Ladder Thermo Scientific SM0311 DNA M.W. standard
Loading Dye 6x Thermo Scientific R0611
Low-melting temperature agarose Bio-rad 161-3112 CAS Nº 39346-81-1
Name Company Catalog Number Comments
6. Kits and cells
S. cerevisiae strain BJ5465 LGC Promochem ATTC 208289 Protease deficient strain with genotype: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Blue competent cells Agilent genomics 200150 For plasmid purification and amplification
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit Macherey-Nagel 740,609,250 DNA gel extraction
NucleoSpin Plasmid Kit Macherey-Nagel 740,588,250 Column miniprep Kit
Yeast Transformation Kit Sigma-Aldrich YEAST1-1KT Included DNA carrier (Salmon testes)
Zymoprep yeast plasmid miniprep I Zymo research D2001 Plasmid extraction from yeast
Name Company Catalog Number Comments
7. Plates
96-well plates Greiner Bio-One 655101 Clear, non-sterile, polystyrene (for activity measurements)
96-well plates Greiner Bio-One 655161 Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)
96-well plate lid Greiner Bio-One 656171 Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jäckel, C., Hilvert, D. Biocatalysts by evolution. Curr. Opin. Biotechnol. 21 (6), 753-759 (2010).
  2. Bornscheuer, U. T. Engineering the third wave of biocatalysis. Nature. 485 (7397), 185-194 (2012).
  3. Renata, H., Wang, Z. W., Arnold, F. H. Expanding the enzyme universe: accessing non-natural reactions by mechanism-guided directed evolution. Angew. Chem. Int. Ed. 54 (11), 3351-3367 (2015).
  4. Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. Directed evolution: past, present and future. AIChE J. 59 (5), 1432-1440 (2013).
  5. Abatemarco, J., Hill, A., Alper, H. S. Expanding the metabolic engineering toolbox with directed evolution. Biotechnol. J. 8 (12), 1397-1410 (2013).
  6. Pourmir, A., Johannes, T. W. Directed evolution: selection of the host organism. Comput Struct Biotechnol J. 2 (3), e201209012 (2012).
  7. Krivoruchko, A., Siewers, V., Nielsen, J. Opportunities for yeast metabolic engineering: lessons from synthetic biology. Biotechnol J. 6 (3), 262-276 (2011).
  8. Gonzalez-Perez, D., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. Saccharomyces cerevisiae in directed evolution: an efficient tool to improve enzymes. Bioeng Bugs. 3, 172-177 (2012).
  9. Alcalde, M. Mutagenesis protocols in Saccharomyces cerevisiae by In Vivo Overlap Extension. Methods Mol. Biol. 634, 3-14 (2010).
  10. Bulter, T., Alcalde, M. Preparing libraries in Saccharomyces cerevisiae. Methods. Mol. Biol. 231, 17-22 (2003).
  11. Ostrov, N., Wingler, L. M., Cornish, W. Gene assembly and combinatorial libraries in S. cerevisiae via reiterative recombination. Methods. Mol. Biol. 978, 187-203 (2013).
  12. Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways. Nucleic Acids Res. 37 (2), e16 (2009).
  13. Alcalde, M. Engineering the ligninolytic enzyme consortium. Trends Biotechnol. 33 (3), 155-162 (2015).
  14. Garcia-Ruiz, E. Directed evolution of ligninolytic oxidoreductases: from functional expression to stabilization and beyond. Cascade Biocatalysis: integrating stereoselective and environmentally friendly reactions. , Wiley-VCH. 1-22 (2014).
  15. Hernandez-Ortega, A., Ferreira, P., Martinez, A. T. Fungal aryl-alcohol oxidase: a peroxide-producing flavoenzyme involved in lignin degradation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (4), 1395-1410 (2012).
  16. Gonzalez-Perez, D., Molina-Espeja, P., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. Mutagenic organized recombination process by homologous in vivo grouping (MORPHING) for directed enzyme evolution. PLoS One. 9, e90919 (2014).
  17. Rhee, S. G., Chang, T., Jeong, W., Kang, D. Methods for Detection and Measurement of Hydrogen Peroxide Inside and Outside of Cells. Mol. Cells. 29 (6), 539-549 (2010).
  18. Sebestova, E., Bendl, J., Brezovsky, J., Damborsky, J. Computational tools for designing smart libraries. Methods. Mol. Biol. 1179, 291-314 (2014).
  19. Viña-Gonzalez, J., Gonzalez-Perez, D., Ferreira, P., Martinez, A. T., Alcalde, M. Focused directed evolution of aryl-alcohol oxidase in yeast using chimeric signal peptides. Appl. Environ. Microbiol. , (2015).
  20. Gay, C., Collins, J., Gebicki, J. M. Hydroperoxide Assay with the Ferric-Xylenol orange Complex. Anal. Biochem. 273 (2), 149-155 (1999).
  21. Reetz, M. T. Biocatalysis in organic chemistry and biotechnology: Past, present, and future. J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).
  22. Mate, D. M., Gonzalez-Perez, D., Mateljak, I., Gomez de Santos, P., Vicente, A. I., Alcalde, M. The pocket manual of directed evolution: Tips and tricks. Biotechnology of Microbial Enzymes: Production, Biocatalysis and Industrial Applications. , Elsevier. Forthcoming Forthcoming.
  23. Chao, R., Yuan, Y., Zhao, H. Recent advances in DNA assembly technologies. FEMS Yeast Res. 15, 1-9 (2015).

Tags

Molecular Biology Gerichte ontwikkeling, gericht-willekeurige mutagenese high-throughput screening
Geregisseerd Evolution Method in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Bibliotheek Creatie en Screening
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Viña-Gonzalez, J.,… More

Viña-Gonzalez, J., Gonzalez-Perez, D., Alcalde, M. Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening. J. Vis. Exp. (110), e53761, doi:10.3791/53761 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter