Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Regissert Evolution Metode i Published: April 1, 2016 doi: 10.3791/53761
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biocatalysis, Institute of Catalysis, CSIC

Abstract

Rettet evolution in Saccharomyces cerevisiae byr på mange attraktive fordeler ved utforming av enzymer for bioteknologiske anvendelser, er en prosess som involverer konstruksjon, kloning og ekspresjon av mutante biblioteker, koblet til høy frekvens homolog DNA-rekombinasjon in vivo. Her presenterer vi en protokoll for å skape og skjermen mutante bibliotekene i gjær basert på eksempel på en sopp aryl-alkoholoksidase (AAO) for å forbedre sin totale aktivitet. To proteinsegmenter ble utsatt for fokusert rettet evolusjon ved tilfeldig mutagenese og in vivo DNA-rekombinasjon. Overheng på ~ 50 bp som flankerer hvert segment tillates korrekt montering av AAO-fusjonsgenet i en linearisert vektor som gir opphav til et fullstendig autonomt replikerende plasmid. Mutant bibliotekene beriket med funksjonelle AAO varianter ble vist i S. cerevisiae-supernatanter med en følsom high-throughput-analyse basert på den Fenton reaksjonen. Den generelle fremgangsbibliotek bygging i S. cerevisiae er beskrevet her, lett kan anvendes for å utvikle mange andre eukaryote gener, unngår ekstra PCR-reaksjoner, in vitro-DNA-rekombinasjon og ligeringstrinn.

Introduction

Regissert molekylær evolusjon er en robust, rask og pålitelig metode for å designe enzymer 1, 2. Gjennom iterative runder med tilfeldig mutasjon, rekombinasjon og screening, forbedrede versjoner av enzymer kan genereres som virker på nye underlag, i nye reaksjoner, i ikke-naturlig miljøer, eller til å hjelpe til cellen for å oppnå nye mål metabolske 3-5. Blant vertene som brukes i rettet evolusjon, ølgjær Saccharomyces cerevisiae tilbyr et repertoar av løsninger for funksjonell uttrykk for komplekse eukaryote proteiner som ellers ikke er tilgjengelig i prokaryote kolleger 6,7.

Brukes uttømmende i cellebiologi studier, har dette liten eukaryote modellen mange fordeler i form av posttranslasjonelle modifikasjoner, enkel manipulasjon og transformasjon effektivitet, som alle er viktige egenskaper til ingeniør enzymer av rettet evolusjon 8. Videre er den høye frekvensenav homolog DNA rekombinasjon i S. cerevisiae koblet til sin effektive korrekturlesing apparat åpner en rekke muligheter for biblioteket etablering og genet montering in vivo, fremme utviklingen av ulike systemer fra enkelt enzymer til komplekse kunstige veier 9-12. Vårt laboratorium har brukt det siste tiåret utforme verktøy og strategier for molekylær evolusjon av ulike ligninases i gjær (oxidoreductases involvert i nedbrytning av lignin i løpet av tre forfall) 13-14. I denne kommunikasjonen, presenterer vi en detaljert protokoll for å forberede og skjermen mutante bibliotekene i S. cerevisiae for en modell flavooxidase, aryl-alkohol-oksydase (AAO 15) -, som lett kan oversettes til mange andre enzymer. Protokollen innebærer en fokusert styrt evolusjon metode (morphing: Mutagent Organized rekombinasjon Process ved homolog in vivo Gruppering) assistert av gjærcellen apparat 16, enda meget følsom screeningsanalyse basert på den Fenton reaksjonen for å detektere AAO aktivitet utskilt i kulturmediet 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Mutant Library Construction

  1. Velg regionene for å bli utsatt for morphing med hjelp av beregningsalgoritmer basert på de tilgjengelige krystallstruktur eller homologi modeller 18.
    1. Her, målrette to områder med AAO fra Pleurotus for tilfeldig mutagenese og rekombinasjon (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), mens forsterke resten av genet (844 bp) av Hi-Fi PCR (figur 1).
      Merk: Flere segmenter kan studeres ved morphing i en uavhengig eller kombinert måte 16.
  2. Forsterke de målrettede områder av mutagene PCR. Lag overlappende områder mellom segmentene (~ 50 bp hver) ved over PCR reaksjoner av de definerte regioner.
    1. Forbered mutagen PCR av målrettede segmenter i et sluttvolum på 50 pl inneholdende DNA-templat (0,92 ng / ul), 90 nM oligo forstand (RMLN for segment MI og AAO-BP for segmentet M-II), 90 nM etntisense primer (AAO-92C for segmentet MI og RMLC for segmentet M-II), 0,3 mM dNTP (0,075 mM hver), 3% (v / v) dimetylsulfoksyd (DMSO), 1,5 mM MgCl2, 0,05 mM MnCl2 og 0,05 U / pl Taq DNA-polymerase. Primere sekvenser er beskrevet i figur 1.
    2. Bruk følgende PCR-program: 95 ° C i 2 minutter (1 syklus); 95 ° C i 45 sek, 50 ° C i 45 sek, 74 ° C i 45 sekunder (28 sykluser); og 74 ° C i 10 minutter (1 syklus).
  3. Forsterke de ikke-mutagene regioner med ultra-high fidelity polymerase og inkludere de tilsvarende områdene overlapper de mutagene segmenter og / eller linearisert vektor overheng.
    1. Fremstille reaksjonsblandinger i et sluttvolum på 50 pl inneholdende: DNA-templat (0,2 ng / ul), 250 nM oligo forstand HFF, 250 nM oligonukleotid antisense HFR, 0,8 mM dNTP (0,2 mM hver), 3% (v / v) dimetylsulfoksyd (DMSO) og 0,02 U / ul iProof DNA-polymerase. Primere sekvenser er beskrevet i <strong> Figur 1.
    2. Bruk følgende PCR-program: 98 ° C i 30 sekunder (1 syklus); 98 ° C i 10 sek, 55 ° C i 25 sek, 72 ° C i 45 sekunder (28 sykluser); og 72 ° C i 10 minutter (1 syklus).
      Merk: Med vilkårene som er beskrevet i 1.2 og 1.3 omlegg på 43 bp (plasmid-M1 region); 46 bp (M1 region-HF region); 47 bp (HF region-M2 region) og 61 bp (M2 region plasmid) er utformet (figur 1) for å favorisere in vivo skjøting i gjær.
    3. Rens alle PCR-fragmenter (mutagene og ikke-mutagene) med en kommersiell gel utvinning kit i henhold til produsentens protokoll.
  4. Linearisere vektoren slik at flankerende regioner av omtrent 50 bp er skapt som er homologe til de 5'- og 3'-endene av målgenet.
    1. Forbered en linearreaksjonsblanding som inneholder 2 mikrogram DNA, 7,5 U Bam HI, 7,5 U Xho, 20 mikrogram BSA og 2 mL buffer Bam HI 10x i et endelig volum på 20 ul.
    2. Inkuber reaksjonsblandingen ved 37 ° C i 2 timer og 40 min. Deretter fortsetter med inaktivering ved 80 ° C i 20 min.
  5. Rens det lineariserte vektoren ved agarosegel-ekstraksjon for å unngå forurensning med den resterende sirkulære plasmidet (figur 2).
    1. Installering av nedbrytningsreaksjonen blandes inn i mega-brønn av en semi-preparativ med lavt smeltepunkt agarosegel (0,75%, w: v) i tillegg til en alikvot (5 ul) av reaksjonsblandingen i den tilstøtende vel som en reporter.
    2. Kjør DNA elektroforese (5 V / cm mellom elektrodene, 4 ᵒC) og skille agarosegel som tilsvarer den mega-godt og oppbevar den på 4 ᵒC i 1x TAE.
    3. Flekk kjørefelt med molekylvekten stigen og reporter. Visual bandene under UV-lys. Nick posisjonen hvor de lineariserte vektor steder.
      Merk: Når kvaliteten av det rensede lineariseres vektoren er et Critical faktor for vellykket rekombinasjon og montering i gjær, unngå gel farging for semipreparativ DNA elektroforese. Anvendelsen av fargestoffer og UV eksponering for gelen ekstraksjon kan påvirke stabiliteten av DNA-vektor, noe som påvirker in vivo rekombinasjon effektivitet. Som alternativ til giftige EtBr fargestoffer, er Gel Red og SYBR fargestoffer som vanligvis brukes til gel farging.
    4. I fravær av UV-lys, identifisere den lineariserte vektor i mega-vel-fragmentet ved hjelp veiledning av kutt i farget reporteren kjørefelt, slik at det kan isoleres.
    5. Ekstraher den lineariserte vektor fra agarose og rense det med en kommersiell gel ekstraksjon sett i overensstemmelse med fabrikantens protokoll.
      Merk: Bruk av høy-kopi episomal shuttle vektorer med antibiotika og auxotrofi markører: I dette eksempel anvendes det vi uracil uavhengig og ampicillin-resistens pJRoC30 vektor, under kontroll av gjær GAL1-promotoren.
  6. Forbered en ekvimolar mixture av PCR-fragmenter og blande det med det lineariserte vektoren ved et 2: 1 forhold, med ikke mindre enn 100 ng av linearisert plasmid (test forskjellige forhold mellom ekvimolar bibliotek / åpen vektor for å oppnå gode utbytter transformasjon).
    1. Mål absorbansen av PCR-fragmenter og lineariserte vektor ved 260 nm og 280 nm for å bestemme deres konsentrasjon og renhet.
  7. Transform gjær kompetente celler med DNA blanding ved hjelp av en kommersiell gjær transformasjon kit (se tabell for forsyninger) i henhold til produsentens instruksjoner.
    1. Her bruker en protease mangelfull og URA3 - avhengig S. cerevisiae stamme, BJ5465. Transformere celler med den parentale vektoren sirkularisert som en indre standard i løpet av screening (se nedenfor). I tillegg kontrollerer bakgrunnen ved å transformere det lineariserte vektoren i fravær av PCR-fragmenter.
      Merk: Ved å oppdage innledende lav sekresjon nivåer, bruke S.cerevisiae protease mangel stammer som BJ5465 å fremme akkumulering av aktive protein i kultursupernatanter. Dersom målenzymet gjennomgår hyperglycosylation, bruk av glykosylerings-manglende stammer (f.eks Δ kre2 det er bare i stand til å feste mindre mannose oligomerer) kan være et egnet alternativ.
  8. Plate de transformerte cellene på SC drop-out plater og inkuber dem ved 30 ° C i tre dager. Plate (på SC drop-out plater supplert med uracil) URA3 - S. cerevisiae-celler som mangler plasmidet som en negativ kontroll for filtrering (se nedenfor).

2. Høy throughput screening analysen (figur 3)

  1. Fylle et passende antall av sterile 96-brønners plater (23 plater for å analysere et bibliotek med 2000 kloner) med 50 ul minimalmedium per brønn med hjelp av en pipetteringsrobot.
  2. Plukk individuelle kolonier fra SC-slipp ut plater og overføre dem til 96-brønners plater.
    1. I hver plate, inokuler kolonne nummer 6 med den parentypen som en intern standard og vel H1 med URA3 - S. cerevisiae-celler (i SC-medium supplert med uracil) med ingen plasmid som en negativ kontroll.
      Merk: Vel H1 er fylt spesielt med drop-out media supplert med uracil. En tom brønn inneholdende medium uten celler kan også fremstilles som en ytterligere kontroll sterilitet.
  3. Dekk platene med sine lokk og pakk dem i Parafilm. Inkuber platene i 48 timer ved 30 ° C, 225 rpm og 80% relativ fuktighet i en fuktig shaker.
  4. Fjern det Parafilm, tilsett 160 ul av ekspresjons-medium til hver brønn med hjelp av den pipetteringsrobot, forsegle platene og inkuber dem i ytterligere 24 timer.
    Merk: Minimal medium og uttrykk medium blir fremstilt som rapportert andre steder 19. Sekresjon nivåer kan variere, avhengig av genet som studeres og deretter, than inkubasjonstider må optimaliseres i hvert enkelt tilfelle for å synkronisere cellevekst i alle brønnene.
  5. Sentrifuger platene (master-plater) ved 2800 x g i 10 min ved 4 ° C.
  6. Overføre 20 ul av supernatanten fra brønnene i masterplaten til replika platen ved hjelp av en væskehåndteringsrobotflerstasjons.
    Merk: For å favorisere enzym sekresjon det er tilrådelig å erstatte den opprinnelige signal peptid av målet protein signalpeptider som vanligvis brukes for heterologe uttrykk i gjær (f.eks α faktor prepro-leder, leder av K 1 Killer toksin fra S. cerevisiae, eller til og kimære versjoner av begge peptider 13). Alternativt kan den innfødte signal peptid utelukkende utviklet for sekresjon i gjær.
  7. Tilsett 20 ul 2 mM p -methoxybenzylalcohol i 100 mM natriumfosfatbuffer pH 6,0 med hjelp av pipetteringsrobot. Rør platene kort med en 96-vill plate-blander og inkubere dem i 30 minutter ved RT.
  8. Med pipetteringsrobot, tilsett 160 ul av FOX reagens til hver kopi plate og røre kort med blandebatteri (endelig konsentrasjon på FOX blandingen i tillegg: 100 mikrometer xylenol orange, 250 mikrometer Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 og 25 mM H 2 SO 4).
    1. Legg flere additiver til reagensen for å forbedre følsomheten, slik som organiske ko-løsningsmidler (DMSO, etanol, metanol) eller sorbitol 17. Her, forsterke responsen ved tilsetning av sorbitol til en endelig konsentrasjon på 100 mM (figur 4).
  9. Les plater (endepunkt modus, t 0) ved 560 nm på en plateleser.
  10. Inkuber platene ved romtemperatur inntil fargen utvikles og måle absorpsjonen igjen (t 1).
    1. Beregn den relative aktivitet av forskjellen mellom den Abs verdi etter inkubasjon, og at den første måleverdien normalisert til den parental type for hver plate (At en - t 0).
  11. Emne de beste mutant treff på to påfølgende re-screenings å utelukke falske positiver.
    Merk: Vanligvis re-screenings inkluderer plasmid isolert fra gjær, forsterkning og rensing i Escherichia coli, etterfulgt av transformasjon av fersk gjærceller med plasmidet 19. Hver valgt klone er re-screenet i pentaplicate.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

AAO fra P. eryngii er et ekstracellulært flavooxidase som leverer sopp peroxidases med H 2 O 2 for å starte angripe lignin. To segmenter av AAO ble utsatt for fokusert rettet evolusjon ved morphing for å øke dens aktivitet og dets ekspresjon i S. cerevisiae 19. Uavhengig av de utenlandske enzymer næret av S. cerevisiae, den mest kritiske spørsmålet når du bygger mutant bibliotekene i gjær gjelder prosjektering av konkrete overlappende regioner for å favorisere spleising mellom fragmenter og deres kloning inn i lineariserte vektoren. I dagens eksempel for hver PCR-reaksjon, alle fragmentene hadde overheng på omtrent 50 bp for å fremme in vivo skjøting på gjær. Antallet rekombinasjonshendelser er avhengig av antall segmenter som skal settes sammen og klonet med den lineariserte vektor (dvs. to kryssede hendelser som fant sted mellomtre PCR segmenter -the to mutagene segmenter flankerer den ikke-mutageniserte Segment- pluss to flere krysningspunkter med den lineariserte vektor, figur 1). Ifølge vår erfaring, overlappende sekvenser som er lengre enn 50 bp redusere sannsynligheten for intern rekombinasjon mens de ikke forbedre transformasjon effektivitet.

Mutasjons belastninger ble justert ved prøvetaking mutant bibliotek med forskjellige landskap, beregning av antall kloner med <10% av foreldreenzymaktivitet, og videre sjekke dem ved å sekvensere et tilfeldig utvalg av aktive og ikke-aktive varianter (figur 5A). For bestemmelse av koeffisienten av varians S. cerevisiae celler ble transformert med foreldre AAO og platet på SC-slipp ut plater. Individuelle kolonier ble plukket ut og inokulert i en 96-brønners plate og aktiviteten av klonene ble evaluert fra ferske preparater. mutagene prøve2 (Taq / MnCl2 0,05 mM) ble valgt som utgangspunkt for bibliotek konstruksjon og screening.

Som den biologiske aktivitet av AAO øker H 2 O 2-konsentrasjonen i reaksjonsmediet, søkte vi en følsom og nøyaktig analyse for å kvantifisere mindre endringer i H 2 O 2. FOX er en kjemisk metode basert på Fenton reaksjonen 20, hvorved oksydasjon av H 2 O 2 driver reaksjonen av Fe 3+ med xylenolorange for å danne en blå-purpur-kompleks (o -cresolsulfone-Phthalein 3 ', 3' '- bis (metylimino) diacetat ε 560 = 1,5 x 10 4 M -1 cm -1). Den jernholdige oksidasjonstrinnet ble amplifisert ved å tilsette sorbitol for å forbedre sensitiviteten av analysen, noe som øker forplantning av radikalene med en tilsynelatende ε 560 = 2,25 x 10 5 M -1 cm -1 (Fifigur 4).

Påvisningsgrensen for denne assay (i uM-området) ble beregnet ved den Blank bestemmelsesmetoden i en 96-brønns plate med standarder i triplikat (0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3 og 4 uM H to O to ) og ved hjelp av flere supernatanter fra S. cerevisiae mangler URA3 - plasmid (figur 5B). Analysen var lineær i nærvær av sorbitol (opp til 8 pM av H2O 2), og selv om linearitet var mer vedvarende i fravær av dette sukker (i det minste opp til 30 pM av H2O 2) og responsen var svakere (for eksempel, ved 6 pM av H2O 2, en 4-gangers forbedring ble oppnådd i nærvær av sorbitol-Deep purple- fra en absorbans på 0,24 i dets fravær -Mørk oransje- (figur 5B)). Forholdet mellom Abs og den AAO konsentrasjonen ble evaluert med økende mengder av enzyme (fra gjærsupernatanter) og en lineær respons ble observert; R 2 = 0,997 (figur 5C).

Det er bemerkelsesverdig at den FOX signalet var stabil i flere timer uten noen åpenbar innblanding av de forskjellige elementer i kulturmediet. Den estimerte følsomheten av FOX var ~ 0,4 pM av H2O 2 fremstilt ved AAO i supernatanten i nærvær av sorbitol, og ~ 2 uM i dens fravær.

En mutant bibliotek på 2000 kloner ble konstruert og screenet med denne analysen. Flere AAO mutanter ble identifisert med særlig forbedret sekresjon og aktivitet mot p-metoksybenzyl-alkohol (figur 5D) 19.

Figur 1
Figur 1.. Morphing Protokoll for AAO Evolution To ulike regioner av AAO var målrettet for tilfeldig mutagenese og rekombinasjon: M1 (blå, 590 bp) som inneholder signal peptid (SP); M2 (gul, 528 bp). HF-regionen (grå, 844 bp) ble forsterket med High Fidelity polymeraser. Mutagene regioner ble kartlagt i krystallstrukturen av AAO (PDB ID: 3FIM). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Fremstilling av PCR-produkter og det lineariserte vektor (A) Analytisk agarosegel (1% w: v). Inneholdende en molekylvekt markør (1 kb stige) i banene 1 og 7; Bam HI og Xho I linearisert vektor, spor 2; PCR-segmentet M1, kjørefelt 3; PCR-segmentet M2, kjørefelt 4; PCR-segmentet HF, kjørefelt 5; det i vIvo satt sammen vektor linearisert med Nhel (som inneholder full AAO genet med regioner MI, HF og M-II), lane 6. (B) Vector linea, baner 1 og 6 molekylære standarder, en Kb stige; plasmid miniprepp, kjørefelt 2; plasmid linearisert med Nhe I, kjørefelt 3; plasmidet linearisert med Bam HI og Xho I, felt 4; lineariserte plasmid oppnås ved gel utvinning og rydde opp etter fordøyelse, lane 5. (C) Protokoll for plasmid rensing. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Høy throughput screening protokoll. Oversikt over prosessen. Klikk her for å se et større version av denne figuren.

Figur 4
Figur 4. FOX Method. Hvitråtesopper angripe celleveggen av trevirke gjennom en Fenton reaksjon som produserer hydroksylradikalet OH •. Fox metoden par denne reaksjon for å xylenolorange (XO), og absorbansen til XO-Fe 3+ komplekset blir målt ved 560 nm. Ferrous oksidasjon forsterkes ved tilsetning av sorbitol til reagensblandingen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. mutagene Landskap for morphing biblioteker Bruke forskjellige feil utsatt PCR betingelser og Validering av Screening Assay. (A ng>) Morphing landskap. Fast horisontal linje viser aktiviteten av foreldretypen i analysen, mens de stiplede linjer angir koeffisienten for variansen av analysen. Prosentene angir antall kloner med mindre enn 10% av den parenenzymaktivitet. Aktiviteter er plottet i synkende rekkefølge. (B) Den FOX Deteksjonsgrensen ble evaluert med økende konsentrasjoner av H 2 O 2 i nærvær av (sorte sirkler) og fravær (hvite firkanter) av sorbitol. (C) Lineær sammenheng mellom AAO konsentrasjon (transform supernatanter) og Abs 560nm. Hvert punkt svarer til gjennomsnittet av 8 eksperimenter og innbefatter standardavviket. (D) Mutant biblioteklandskap. De utvalgte varianter (skygget kvadrat) ble screenet på nytt som rapportert andre steder 19. Heltrukne linjen viser aktiviteten av AAO foreldretype.> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne artikkelen har vi oppsummert det meste av tips og triks ansatt i vårt laboratorium til ingeniør enzymer ved rettet evolusjon i S. cerevisiae (ved hjelp av AAO som et eksempel), slik at de kan tilpasses for bruk sammen med mange andre eukaryote enzym-systemer ved å følge den vanlige metode som er beskrevet her.

I form av bibliotek skapelse, er morphing en rask one-pot metode for å innføre og rekombinerer tilfeldige mutasjoner i små protein strekninger samtidig la de resterende delene av proteinet uendret 16. Biblioteker med flere mutasjons belastninger lett kan fremstilles og rekombinert in vivo, i tillegg til det lineariserte plasmid, for å generere et fullstendig autonomt replikerende vektor. Det er viktig at overlappende sekvenser som flankerer hver strekning for å tillate fragmenter av hele genet som skal bli satt sammen ved in vivo-rekombinasjon, unngår ekstra PCR-reaksjoner og in vitro ligeringstrinn. I denne protocol, hyppigheten av crossover-hendelser mellom PCR-fragmenter kan økes ved å redusere størrelsen av de overlappende områder, selv om dette kan svekke transformasjonseffektivitet. Uavhengig av DNA-polymeraser som brukes for mutagene PCR, kan mutasjons belastninger reguleres ved på forhånd å konstruere og å analysere små mutant bibliotek natur (figur 5A). Hvis GeneMorph II Kit er brukt, er det likevel lurt å følge denne tilnærmingen siden in vivo DNA rekombinasjon kan særlig endre mutasjons laster anslått av produsenten. I generelle termer, mutante landskaper hvor 35 - 50% av de totale klonene screenet har mindre enn 10% av den paren aktivitet er egnet for rettet evolusjon kampanjer, selv om dette antallet varierer som funksjon av målproteinet, og dens aktivitet. Vanligvis er den analyse av mutante biblioteker landskaper ytterligere bekreftet ved DNA-sekvensering av et tilfeldig utvalg av mutanter. I det aktuelle eksempel TaqDNA-polymerase ble anvendt på grunn av sin høye feilraten, som er knyttet til den manglende 3'→ 5'proof-lesing eksonukleaseaktivitet. Mutasjons laster i Taq-bibliotekene ble modifisert ved tilsetning av forskjellige konsentrasjoner av MnCl2, men bruk av ubalanserte dNTP og / eller reduksjon i genet mal konsentrasjoner er også egnede alternativer. Iboende begrensninger morphing kommer fra antall segmenter som skal saman. Ifølge vår erfaring, opptil fire protein blokker (fem crossover hendelser telle rekombinasjon områder med lineariserte vektor) kan skjøtes med gode transformasjon gir (~ 10 5 kloner per transformasjon reaksjon). Denne metoden kan enkelt endres til utført flere site-metning mutagenese (for eksempel ved bruk av NDT degenererte primere eller opprette degenerering for 22 unike kodon) for å utforske flere stillinger samtidig samtidig redusere betydelig screening innsats 21,22.

"blind" screening-protokoll for AAO er ekstremt følsom og pålitelig (basert på den direkte påvisning av H to O to uavhengig av underlaget som brukes av enzymet), som representerer en komplementær analyse for å annen veletablert indirekte protokoller for å oppdage peroksider (for det meste kopling peroxidases med kolorimetriske substrater). Faktisk har FOX analysen er rutinemessig brukt for å måle H 2 O 2 i biologiske væsker, og det kan nå være lett oversatt til protokoller for å utvikle seg AAO og alle andre H 2 O 2 produserer enzymer (f.eks glukose oksidase, cellobiose dehydrogenase, glyoksal oksidase, metanol oksidase), spesielt for aktivitet på ikke-naturlige underlag der svarene er ellers vanskelig å oppdage.

S. cerevisiae er den mest dekkende verten for rettet utviklingen av eukaryote gener siden det gir høye transformasjon effektivitet (opp til 1 x 106 transformanter / ug DNA), utfører den komplekse post-translasjonell prosessering og modifikasjon (inkludert N- og C-terminal prosessering, og glykosylering) og det eksporterer fremmede proteiner inn i dyrkingsmediet via en sekretorisk vei. I tillegg veletablerte molekylærbiologi verktøy er tilgjengelig for å jobbe med dette gjær, inkludert uni- eller toveis episomal (ikke-integrerende) shuttle vektorer under kontroll av arrangører av forskjellige styrker. Sist, men ikke minst, har den høye frekvensen av homolog DNA rekombinasjon tillot en rekke metoder for å bli utviklet for å oppnå DNA mangfoldet som for tiden blir brukt for å utvikle enkle proteiner, samt mer komplekse enzymveiene 8, 12, 13, 23. in vivo gap reparasjon og korrekturlesing anordning av denne gjær kan også anvendes for å skape kimærer når rekombinere forskjellige gener (med ca. 60% av DNA-sekvensidentitet), i tillegg til å mikse beste avkom / mutasjoner fra en direkted evolusjon kampanje, eller å samle in vitro og in vivo rekombinasjon metoder i en runde av evolusjon, og dermed berikende mutant bibliotekene i form av mykhet og funksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Culture media
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A0166 CAS Nº 69-52-3 M.W. 371.39
Bacto Agar Difco 214010
Cloramphenicol Sigma-Aldrich C0378 CAS Nº 56-75-7 M.W. 323.13
D-(+)-Galactose Sigma-Aldrich G0750 CAS Nº 59-23-4 M.W. 180.16
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G5767 CAS Nº 50-99-7 M.W. 180.16
D-(+)-Raffinose pentahydrate Sigma-Aldrich 83400 CAS Nº 17629-30-0 M.W. 594.51
Peptone Difco 211677
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P0662 CAS Nº 7778-77-0 M.W. 136.09
Uracil Sigma Aldrich U1128
Yeast Extract Difco 212750
Yeast Nitrogen Base without Amino Acids Difco 291940
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil Sigma-Aldrich Y1501
Name Company Catalog Number Comments
2. PCR Reactions
dNTP Mix Agilent genomics 200415-51 25 mM each
iProof High-Fidelity DNA polymerase Bio-rad 172-5301
Manganese(II) chloride tetrahydrate Sigma-Aldrich M8054 CAS Nº 13446-34-9 M.W. 197.91
Taq DNA Polymerase Sigma-Aldrich D4545 For error prone PCR
Name Company Catalog Number Comments
3. Plasmid linearization
BamHI restriction enzyme New England Biolabs R0136S
Bovine Serum Albumin New England Biolabs B9001S
XhoI restriction enzyme New England Biolabs R0146S
Not I restriction enzyme New England Biolabs R0189S
Gel Red Biotium 41003 For staining DNA
Name Company Catalog Number Comments
4. FOX assays
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate Sigma-Aldrich F3754 CAS Nº 7783-85-9 M.W. 392.14
Anysil Alcohol Sigma Aldrich W209902 CAS Nº 105-13-5 M.W. 138.16
D-Sorbitol Sigma-Aldrich S1876 CAS Nº 50-70-4 M.W. 182.17
Hydrogen peroxide 30% Merck Millipore 1072090250 FOX standard curve
Xylenol Orange disodium salt Sigma-Aldrich 52097 CAS Nº 1611-35-4 M.W. 716.62
Name Company Catalog Number Comments
5. Agarose gel stuff
Agarose Norgen 28035 CAS Nº 9012-36-6
Gel Red Biotium 41003 DNA analysis dye
GeneRuler 1kb Ladder Thermo Scientific SM0311 DNA M.W. standard
Loading Dye 6x Thermo Scientific R0611
Low-melting temperature agarose Bio-rad 161-3112 CAS Nº 39346-81-1
Name Company Catalog Number Comments
6. Kits and cells
S. cerevisiae strain BJ5465 LGC Promochem ATTC 208289 Protease deficient strain with genotype: MATα ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL
E. coli XL2-Blue competent cells Agilent genomics 200150 For plasmid purification and amplification
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit Macherey-Nagel 740,609,250 DNA gel extraction
NucleoSpin Plasmid Kit Macherey-Nagel 740,588,250 Column miniprep Kit
Yeast Transformation Kit Sigma-Aldrich YEAST1-1KT Included DNA carrier (Salmon testes)
Zymoprep yeast plasmid miniprep I Zymo research D2001 Plasmid extraction from yeast
Name Company Catalog Number Comments
7. Plates
96-well plates Greiner Bio-One 655101 Clear, non-sterile, polystyrene (for activity measurements)
96-well plates Greiner Bio-One 655161 Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)
96-well plate lid Greiner Bio-One 656171 Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jäckel, C., Hilvert, D. Biocatalysts by evolution. Curr. Opin. Biotechnol. 21 (6), 753-759 (2010).
  2. Bornscheuer, U. T. Engineering the third wave of biocatalysis. Nature. 485 (7397), 185-194 (2012).
  3. Renata, H., Wang, Z. W., Arnold, F. H. Expanding the enzyme universe: accessing non-natural reactions by mechanism-guided directed evolution. Angew. Chem. Int. Ed. 54 (11), 3351-3367 (2015).
  4. Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. Directed evolution: past, present and future. AIChE J. 59 (5), 1432-1440 (2013).
  5. Abatemarco, J., Hill, A., Alper, H. S. Expanding the metabolic engineering toolbox with directed evolution. Biotechnol. J. 8 (12), 1397-1410 (2013).
  6. Pourmir, A., Johannes, T. W. Directed evolution: selection of the host organism. Comput Struct Biotechnol J. 2 (3), e201209012 (2012).
  7. Krivoruchko, A., Siewers, V., Nielsen, J. Opportunities for yeast metabolic engineering: lessons from synthetic biology. Biotechnol J. 6 (3), 262-276 (2011).
  8. Gonzalez-Perez, D., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. Saccharomyces cerevisiae in directed evolution: an efficient tool to improve enzymes. Bioeng Bugs. 3, 172-177 (2012).
  9. Alcalde, M. Mutagenesis protocols in Saccharomyces cerevisiae by In Vivo Overlap Extension. Methods Mol. Biol. 634, 3-14 (2010).
  10. Bulter, T., Alcalde, M. Preparing libraries in Saccharomyces cerevisiae. Methods. Mol. Biol. 231, 17-22 (2003).
  11. Ostrov, N., Wingler, L. M., Cornish, W. Gene assembly and combinatorial libraries in S. cerevisiae via reiterative recombination. Methods. Mol. Biol. 978, 187-203 (2013).
  12. Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways. Nucleic Acids Res. 37 (2), e16 (2009).
  13. Alcalde, M. Engineering the ligninolytic enzyme consortium. Trends Biotechnol. 33 (3), 155-162 (2015).
  14. Garcia-Ruiz, E. Directed evolution of ligninolytic oxidoreductases: from functional expression to stabilization and beyond. Cascade Biocatalysis: integrating stereoselective and environmentally friendly reactions. , Wiley-VCH. 1-22 (2014).
  15. Hernandez-Ortega, A., Ferreira, P., Martinez, A. T. Fungal aryl-alcohol oxidase: a peroxide-producing flavoenzyme involved in lignin degradation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (4), 1395-1410 (2012).
  16. Gonzalez-Perez, D., Molina-Espeja, P., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. Mutagenic organized recombination process by homologous in vivo grouping (MORPHING) for directed enzyme evolution. PLoS One. 9, e90919 (2014).
  17. Rhee, S. G., Chang, T., Jeong, W., Kang, D. Methods for Detection and Measurement of Hydrogen Peroxide Inside and Outside of Cells. Mol. Cells. 29 (6), 539-549 (2010).
  18. Sebestova, E., Bendl, J., Brezovsky, J., Damborsky, J. Computational tools for designing smart libraries. Methods. Mol. Biol. 1179, 291-314 (2014).
  19. Viña-Gonzalez, J., Gonzalez-Perez, D., Ferreira, P., Martinez, A. T., Alcalde, M. Focused directed evolution of aryl-alcohol oxidase in yeast using chimeric signal peptides. Appl. Environ. Microbiol. , (2015).
  20. Gay, C., Collins, J., Gebicki, J. M. Hydroperoxide Assay with the Ferric-Xylenol orange Complex. Anal. Biochem. 273 (2), 149-155 (1999).
  21. Reetz, M. T. Biocatalysis in organic chemistry and biotechnology: Past, present, and future. J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).
  22. Mate, D. M., Gonzalez-Perez, D., Mateljak, I., Gomez de Santos, P., Vicente, A. I., Alcalde, M. The pocket manual of directed evolution: Tips and tricks. Biotechnology of Microbial Enzymes: Production, Biocatalysis and Industrial Applications. , Elsevier. Forthcoming Forthcoming.
  23. Chao, R., Yuan, Y., Zhao, H. Recent advances in DNA assembly technologies. FEMS Yeast Res. 15, 1-9 (2015).

Tags

Molecular Biology regissert evolusjon, fokusert-tilfeldig mutagenese high-throughput screening
Regissert Evolution Metode i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Bibliotek Creation og resirkulering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Viña-Gonzalez, J.,… More

Viña-Gonzalez, J., Gonzalez-Perez, D., Alcalde, M. Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening. J. Vis. Exp. (110), e53761, doi:10.3791/53761 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter