Introduction
Glomerulusfiltrasjon (GFR) er den beste parameter for å vurdere den totale nyrefunksjonen. Gullstandarden for å bestemme GFR er avhengig av urin eller plasma-clearance av eksogene nyre markører, så som inulin 1. Men disse framgangsmåter er tidkrevende og komplisert, og krever innsamling av serielle blod og / eller urinprøver og bakre laboratorieanalyser for sin analyse. I tillegg er disse metodene er invasiv og stressende for dyrene, begrenser det antall ganger og frekvensen der målingene kan gjentas. En rekke alternative metoder er blitt utviklet for å forenkle de klassiske fremgangsmåtene for å bestemme GFR, men de er avhengige av urin og plasma prøvetaking 2-4 og / eller kreve dype anestesi 5,6, som er kjent for å påvirke nyre hemodynamikk og funksjon 7, 8. Sluttproduktene med metabolisme, slik som kreatinin, er også mye brukt til å estimere nyrefunksjon. Imidlertid er det kjent at accurACY av disse endogene markørene er ikke optimal, og dessuten for å analysere dem, urin eller blodprøvetaking er også uunnværlig.
Her beskriver vi en transkutan metode for å vurdere nyrefunksjonen hos bevisste dyr. Denne fremgangsmåte er enklere og raskere enn tradisjonelle metoder, så vel som bare minimalt invasiv. Med denne teknikken, ved hjelp av en miniatyrisert optisk enhet, og det eksogene renal markør fluoresceinisotiocyanat (FITC) -sinistrin, er det mulig å bestemme nyrefunksjon nesten i sanntid uten behov for plasma eller urin prøvetaking og uten kirurgisk kateterisering for substans administrering. På grunn av disse egenskaper, er fremgangsmåten egnet for å utføre sekvensielle målinger på det samme dyret.
FITC-sinistrin er en renal markør fritt filtrert ved glomerulus, uten tubulær reabsorpsjon eller sekresjon. Den optiske delen av miniatyriserte Enheten består av to lysdioder (LED), som opphisseden administrerte markør og en fotodiode for å detektere fluorescensen som avgis gjennom huden. De registrerte data blir lagret i det interne minnet er integrert i enheten, og de kan brukes til å generere den FITC-sinistrin elimineringskinetikk kurven. Power er levert av et lite oppladbart litiumbatteri. For mer detaljert informasjon om enheten og dens enkelte deler referere til Schreiber et al. 9. Anordningen er lett å montere på dyrekroppen ved hjelp av et dobbeltsidig klebemiddellapp som bærer et gjennomsiktig vindu for de optiske komponentene. Resultatene er lett tilgjengelig etter at registreringsperioden er over.
Med fremgangsmåten og protokollen gitt her, har vi introdusere en lovende teknologi som kan erstatte dagens gullstandarden for å bestemme GFR, ikke bare i forskning, men også i det kliniske feltet.
Protocol
Nødvendige eksperimenter for å utvikle protokollen ble utført i henhold til nasjonale bestemmelser, og ble godkjent av den lokale etiske Science Committee (Regierungspräsidium Karlsruhe).
1. Utarbeidelse av FITC-sinistrin Injection Solution
- Oppløs FITC-sinistrin i fysiologisk saltvann for å fremstille en stamoppløsning. Den anbefalte dose hos mus er 7,5 mg / 100 g kroppsvekt (BW), mens i rotter 5 mg / 100 g BW FITC-sinistrin er å foretrekke. For mus, fremstille en løsning av FITC-sinistrin stamløsning på 15 mg / ml, mens for rotter fremstille ved en konsentrasjon på 40 mg / ml.
Merk: FITC-sinistrin stamløsning kan fremstilles på forhånd og lagret ved -20 ° C beskyttet mot lys.
2. Animal Forberedelse
- Akklimatisere dyrene i minst en uke før de ble introdusert i noen forsøk.
- Bedøve dyret under anvendelse av 5% isofluran ved 5 l / min O to
- Bekreft at dyret er skikkelig bedøvet ved å observere sin pust, som blir tregere og dypere, og verifisere manglende respons med en mangel på en tå respons.
- Når dyret sover, redusere anestesi til 2,5% isofluran på 2 l / min O 2 levering hastighet og ta BW.
- Fjerne pelsen fra flanken av ryggen på dyret ved hjelp av en elektrisk barbermaskin. Barbere et område litt større enn det område som vil bli opptatt av den tosidige selvklebende lapp, som har dimensjoner på 3 cm x 6 cm.
- Deretter gjelder hårfjerning krem for en kort periode (2-3 min) for å fjerne gjenværende pels.
- Vask grundig området til kremen har blitt fullstendig fjernet, som kremen i seg selv kan være fluoriserende.
Merk: Unngå riper i huden på dyret som det kan produsere irritasjon / ødem. Hvis hårfrie området viser pigmentering i huden, barbere et større område til et ikke-pigmentert sted foroptiske delen av enheten er funnet. Det anbefales å barbere 24 timer i forveien for å minimere anestesi eksponering.
3. Enhets Forberedelse
- Plasser optisk innretning for å måle nedsatt funksjon på den ene siden av den tosidige selvklebende lapp, å posisjonere den optiske delen som ligger over det transparente vinduet (figur 1) som forlater den motsatte del med beskyttelsesfolien.
Merk: Når du arbeider med smågnagere, redusere størrelsen på lappen som vist i figur 2. - Fest et stykke av tosidige selvklebende lapp av samsvarende størrelse til batteriet som vist i Figur 3.
4. Festing av enheten på Animal
- Beregn passende volum av injeksjon, basert på dyrets kroppsvekt.
- Bedøve dyret med isofluran som tidligere indikert på seksjoner 2,1-2,3.
- Klipp et stykke av rørformet elastisk gasbind bandasje of ca 1 cm lengre enn bredden av den dobbeltsidige klebemiddellapp som skal brukes.
- Trekk strikken gasbind bandasje over hodet på dyret og sted på ryggen, slik at det barberte området avdekket.
Merk: Du kan også feste enheten ved hjelp av teip, men vær klar over utilbørlig press på enheten. - Koble batteriet til enheten ved å koble batterikontakten til den tilsvarende porten på enheten. Etter at fjerne beskyttelsesfolien fra den del av plasteret og montere batteri på den øvre overflaten av anordningen (figur 4A). Kontroller at batteriet er riktig plugget ved å sjekke at enheten begynner å blinke.
Merk: I rotter, kan batteriet også festes direkte på limet patch, ved siden av enheten (figur 4B). - Fjern beskyttelsesdekselet fra plasteret med driftsenheten og plasser det barberte området på baksiden av dyret holder dets kanter før det er riktig festet.
- Dekk til enheten med rørformet elastisk gasbind bandasje man følger den til limet overflaten av plasteret (figur 5).
- Riktig strekke rørformet bandasje på magen på dyret, slik at bena kan bevege seg fritt.
- For en bedre fiksering og beskyttelse av anordningen, anvende en strimmel av klebebånd etter at formen på enheten og som dekker ledningene på batteriet.
- Mål bakgrunn for 1-3 min, uten å legge press på enheten
5. FITC-sinistrin Administrasjon og målingsprosedyre
- Om nødvendig kan varme opp halen av dyret ved hjelp av varmt vann før injeksjon eller en temperatur-kontrollert varmeplate langs hele prosedyren.
- Injiser gjennom halevenen passende volum av FITC-sinistrin stamløsning. Volumet av injeksjons avhenger dyr BW og derfor må beregnes for hver enkelt ulemperidering den ønskede dose og konsentrasjon av stamløsningen, tidligere nevnte i avsnitt 1.1.
- Sørg for at all den FITC-sinistrin Oppløsningen gis intravenøst og ikke subkutant.
Merk: Alternativt kan FITC-sinistrin administreres ved hjelp av en pre-implantert venekateter gått ut på nakken hos gnagere eller via retro orbital injeksjon i mus. - Nøye, tilbake dyret til sitt hjem buret unngå sterke bevegelser og noe press på enheten, som det ville introdusere bevegelse gjenstander.
- Plasser hjem buret på et rolig sted for å unngå at dyret blir forstyrret.
- Utfør målingen i minst en time hvis arbeider med mus og 2 timer ved bruk av rotter. I løpet av denne perioden, vil den optiske enheten måle gjennom huden fluorescens slippes ut av FITC-sinistrin.
Merk: Under innspillingen perioden dyret må ligge alene. Videre vannforsyning, samt utragendestrukturer som tråd lokk, må fjernes for å unngå skade på den elektroniske enheten og bevegelse gjenstander på grunn av konsekvensene med gjenstander.
6. fjerning av enhet
- Når innspillingen er over, fjerner du enheten uten bedøvelse; imidlertid, hvis det er nødvendig, bedøve dyret raskt under 5% isofluran ved 5 l / min O to tilførselshastighet i løpet av 2 min.
- Nøye, trekke av teip først, deretter rørformet bandasje.
- Forsiktig løsne tosidige selvklebende lapp fra huden og gå tilbake dyret til sin normale hjem buret.
7. Les av data
- Koble batteriet fra enheten og fjerne limet patch.
Merk: Dataene lagres på enheten til en ny måling starter. Når et batteri er koblet de lagrede dataene overskrives med nye innspillinger. Derfor må du ikke koble til batteriet før du laster ned data fraenhet. Det er en 10 sek gyldighetsperiode beregnet for tilfeldige gjeninnkoblingsforsøk på batteriet. - Koble enheten til en PC via en micro USB-kabel og laste ned data ved hjelp av den medfølgende programvaren. Utgangen filen er en CSV-fil som kan åpnes og modifisert med et regnearkprogram.
- Åpne datafil med spesifikk programvare for den optiske enheten og generere eliminasjonskinetikk kurven ved hjelp av programvare protokoller.
- Analyser kurven ved å følge instruksjonene som følger med den optiske enheten. Kort tid, for evaluering av data, sette bakgrunnssignalet måles før FITC-sinistrin administrasjon og markerer starten på den eksponentielle utskillelse fase av markør, som vanligvis skjer 15 min og 45 min etter bolusinjeksjon i mus og rotter henholdsvis .
Merk: Programvaren vil automatisk vise FITC-sinistrin halveringstid (t 1/2) sammen med en R2 verdi, bestemmes av en 1-komparativetment modell. t 1/2 kan benyttes til å beregne GFR ved hjelp av en omregningsfaktor 9,10.
Representative Results
Oppsettet av transkutan måling er meget enkel og rask: anordningen er plassert på den dobbeltsidige klebemiddellapp (figur 1) og justeres i størrelse om nødvendig (figur 2), at batteriet er fremstilt (figur 3) og forbundet (figur 4).
Denne metoden for å vurdere nyrefunksjonen er allerede godkjent i forskjellige arter sammenlignet med den tradisjonelle tilnærmingen av plasmaclearance 9,11,12. Ved å følge protokollen utsettes her, Schreiber et al. demonstrerte gyldigheten av teknikken i forskjellige musemodeller, som viser sterkt sammenlignbare resultater blant transkutan måling og plasma-clearance for alle de gruppene som er undersøkt (tabell 1) 9. I dette arbeidet får t 1/2 ble omdannet til GFR ved hjelp av en mus bestemt semi-empirisk omdannelsefaktor.
Konsistensen av transkutan vurdering av nyrefunksjonen er også vist ved hjelp av ulike stammer av mus. Sekvensielle målinger i løpet av 3 dager i det samme dyr viste en koeffisient på variasjoner på 3,0 til 6,2% 13. I denne studien var det ingen konvertering til GFR men resultatene ble uttrykt og tolket direkte i form av t 1/2.
Muligheten for å ha resultatene nesten i sanntid er en av de store fordelene med denne metoden. Etter innspillingen periode, resultatene er umiddelbart tilgjengelig for analyse og den medfølgende programvaren viser utskillelsen kurven av FITC-sinistrin momentant (figur 6). Innenfor den samme programvare t 1/2 av FITC-sinistrin kan oppnås, noe som direkte kan benyttes som parameter for å vurdere nyrefunksjonen av konverteres i form av GFR. Figur 7 1/2 øker på grunn av den reduserte utskillelse av stoffet og utseendet av kurven endres. Vanligvis gjør den målte kurven ikke komme tilbake til bakgrunnsnivået, og gir en øket areal under kurven. I det samme dyr, kan målinger fra før til etter skade oppleve en økning i maksimal fluorescens intensitet på grunn av opphopning av markøren på grunn av sin reduserte utskillelse. I nærvær av nyresvikt, kan transkutant målt kurve av FITC-sinistrin viser en stabil tilstand på grunn av alvorlig svekket funksjon (figur 7B).
Bruken av miniatyriserte anordningen i flere stammer av gnagere med ulike helsetilstand har vist at denne teknikken er egnet og følsom nok til å detektere endringer due til renal sykdom og aldring. Tabell 2 viser et sammendrag av de murine modeller studert hittil med denne metoden.
Figur 1. Plassering av anordningen på den dobbeltsidige klebemiddellapp. Apparatet er montert på plasteret posisjoneringsklebe dens optiske del i det gjennomsiktige vinduet.
Figur 2. Tilpasning limet patch for små-sized gnagere. For bruk i små dyr er det anbefalt å redusere størrelsen på lappen. A: Bruk enheten som en guide for å kutte plasteret riktig. B: Når ønsket størrelse er oppnådd, idet anordningen kan anbringes på den klebrige overflate av plasteret. Please klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Utarbeidelse av batteriet. Slik fester batteriet til enheten, skjære et lite stykke av tosidige selvklebende lapp (A og B) og plassere den på overflaten av batteriet (C). Klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Tilkobling og plassering av batteriet under målingen. (A) I små gnagere som mus, på grunn av redusert plass, må batteriet plasseres på toppen av enheten. (B) I større dyr batteriet cen plasseres ved siden av enheten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Plassering av rørformet elastisk gasbind bandasje i en rotte. Den rørformet bandasje skal dekke tosidige selvklebende lapp uten å forstyrre den frie bevegelse av lemmer for komfort av dyret. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Representative bilde av en eliminering kurve av FITC-sinistrin. Det signal som genereres av FITC-sinistrin detekteres transcutomme samtidig og lagret i det interne minnet på enheten. Når de registrerte data blir lastet ned til en PC, genererer programvare en kurve tilsvarende den som presenteres i bildet. Y-aksen viser den registrerte fluorescens intensitet [AU], slippes ut av den injiserte FITC-sinistrin markør, mens X-aksen representerer varigheten av målingen i [min]. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Representative bilde av en eliminering kurve av FITC-sinistrin hos dyr med svekket nyrefunksjon. (A) FITC-sinistrin eliminering kurve i dyr med redusert nyrefunksjon viser typisk et øket areal under kurven, og manglende evne til å nå grunnlinjen innenfor normal måleperioden . (B) I sterkt svekket dyrene transkutant målt kurve kan vise en stabil tilstand som indikerer nyresvikt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1. Validering av transkutan måling ved å sammenligne med den tradisjonelle plasmaclearance. Den transkutan måling av nyrefunksjonen er validert i ulike musemodeller (sunn og ensidig nefrektomisert (unx) C57BL / 6-129 SV mus og musemodell for Nephronophthisis ( PCY)) sammenlignet med plasma-clearance. Verdier er gjennomsnitt ± SD. GFR, glomerulusfiltrasjon 9.
/53767/53767table2.jpg "/>
Tabell 2. Murine modeller studert ved hjelp av transkutan måling unx, ensidig nefrektomisert.; ACE, angiotensin-converting enzyme; T gumodwt / vekt, transgen uromodulin knockout, SD, Sprague Dawley rotte; PKD, polycystisk nyresykdom.
Discussion
Den nåværende papiret beskriver fremgangsmåten for å avgjøre nyrefunksjon hos bevisste gnagere ved hjelp av en miniatyrisert enheten og eksogene nedsatt markør FITC-sinistrin. Som nevnt tidligere, har denne fremgangsmåte flere fordeler sammenlignet med de tradisjonelle fremgangsmåtene klaring urin og plasma. En av dem er den uavhengighet fra blod og urinprøver som fører til store besparelser i form av forbruksvarer, tid og, selvfølgelig, dyr stress.
Som vist i tabell 2, den eksogene renal markør FITC-sinistrin og måling av dens elimineringskinetikken gjennom huden tillate virkningen av renale patologier på nyrefunksjonen som skal studeres 9,10,14-18. Serie innsamling av blodprøver som kreves for å vurdere plasma clearance eller biomarkører for nyresykdom er stressende for dyret, tungvint og tidkrevende for forskerne. Derfor har sekvensielle målinger innenfor samme dyr vært limset av velferden til dyr og metodiske grunner. Det viste seg i løpet-dyr reproduserbarhet av transkutan måling 13 gjør det en ideell metode for å påvise endringer i nyrefunksjonen på grunn av sykdomsprogresjon eller aldring. Av samme grunn kan det også være svært nyttig for å undersøke effektiviteten av terapeutiske tilnærminger.
To kritiske trinn for en vellykket bruk av denne teknologien er fiksering av den optiske enheten på dyret og korrekt administrasjon av markøren. Enheten må være riktig festet for å unngå bevegelse gjenstander. For dette formål forebygge festing og løsgjøring av den dobbeltsidige klebemiddellapp er viktig da det kan føre til tap av dets adhesive egenskaper og til slutt en upassende fiksering på dyret. Som nevnt i protokollen, immobilisering og beskyttelse av den optiske anordning ved å dekke den med klebetape er en effektiv metode for å sikre en adequate fiksering. Når du utfører FITC-sinistrin bolusinjeksjon er det avgjørende å administrere alt stoffet intravenøst og ikke subkutant. Utgivelsen av markøren i det subkutane vevet kan lett identifiseres av en gul ring sirkle halen på dyret produsert av FITC-sinistrin egen farge. En subkutan injeksjon manifesterer vanligvis som en flatere kurve og langvarig markør utskillelse tid. Den mulige begrensning av denne metode er mer relatert til den markør som brukes enn med teknologien per se. Når et ødem er til stede i huden av et dyr, ville transkutan vurdering av nyrefunksjonen anbefales ikke, da det er et ekstra rom som kan endre utskillelse dynamikken i FITC-sinistrin. På samme måte kan pigmentert hud begrense bruken av teknikken på grunn av den overlappende eksitasjon og emisjonsspektra av FITC-sinistrin og melanin. Men i dyr med pigment i huden i lapper, er problemet løst ved å plassere den optiskedel av enheten i en upigmentert område.
Det er mulig å modifisere forskjellige aspekter av transkutan vurderingen av nyrefunksjon, for å tilpasse fremgangsmåten til forskjellige dyrearter og / eller tilnærminger. For eksempel kan den anbefalte FITC-sinistrin dosering eller lengden av målingen justeres avhengig av målet av forsøket så vel som for forskjellige arter eller dyremodeller. Denne tilpasning av metoden har allerede blitt bekreftet av sin vellykkede anvendelse i ulike arter av gnagere og flere typer stammer med ulike helsemessige forhold. I tillegg har den transkutane vurderingen av nyrefunksjon, er nylig blitt godkjent i hunder og katter 12 med gode resultater. På grunn av de utvilsomme forskjellene mellom disse dyrene og gnagere, denne studien bestemmes riktig dose av FITC-sinistrin for begge, hunder og katter, og det utføres en mye lengre måle tid, 4 timer i stedet for 1 eller 2 timer brukd i gnagere.
Tatt sammen, til bruk av denne teknikken kan hjelpe oss å oppnå mer nøyaktig innsikt i nyre, inkludert en bedre forståelse av renal sykdomsprogresjon og effekten av terapi. Egenskapene til det transkutan vurderingen av nyrefunksjon plasserer den som en egnet teknikk som skal anvendes i humane og veterinære kliniske felt i fremtiden, og bør betraktes som en lovende teknologi for å erstatte den tradisjonelle tilnærminger.
Disclosures
NG har et patent på produksjonen av FITC-sinistrin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NIC-Kidney device | Mannheim Pharma & Diagnostics GmbH | Software, batteries and chargers are provided together with the device/s. Orderings should be done through info@mapdiagnostics.com | |
| FITC-sinistrin | Mannheim Pharma & Diagnostics GmbH | Orderings should be done through info@mapdiagnostics.com | |
| Double-sided adhesive patch | Mannheim Pharma & Diagnostics GmbH | Orderings should be done through info@mapdiagnostics.com | |
| Isis Rodent electric shaver | Braun Aesculap | GT420 | |
| Isoflurane | Abbott GmbH | PZN4831850 | |
| Leukosilk adhesive tape | BSN medical | 102200 | |
| Tubular elastic gauze bandage | MaiMed Medical GmbH | 73012 | There are different sizes available. Size 1 is recommended for mice. |
| Veet depilation cream | Reckitt Benckiser | PZN7768307 | Sensitive skin formulation is recommended as is more gentle with the skin of the animals |
| Micro USB cable | Samsung | APCBU10BBE | |
| Deltajonin Physiologic solution | AlleMan Pharma GmbH | 3366954 | Alternatively, it can be used saline or PBS |
References
- Stevens, L. A., Levey, A. S. Measured GFR as a confirmatory test for estimated GFR. J Am Soc Nephrol. 20, 2305-2313 (2009).
- Katayama, R., et al. Calculation of glomerular filtration rate in conscious rats by the use of a bolus injection of iodixanol and a single blood sample. J Pharmacol Toxicol Methods. 61, 59-64 (2010).
- Reinhardt, C. P., et al. Functional immunoassay technology (FIT), a new approach for measuring physiological functions: application of FIT to measure glomerular filtration rate (GFR). Am J Physiol Renal Physiol. 295, F1583-F1588 (2008).
- Rieg, T. A high-throughput method for measurement of glomerular filtration rate in conscious mice. J Vis Exp. , e50330 (2013).
- Yu, W., Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Rapid determination of renal filtration function using an optical ratiometric imaging approach. Am J Physiol Renal Physiol. 292, F1873-F1880 (2007).
- Wang, E., Sandoval, R. M., Campos, S. B., Molitoris, B. A. Rapid diagnosis and quantification of acute kidney injury using fluorescent ratio-metric determination of glomerular filtration rate in the rat. Am J Physiol Renal Physiol. 299, F1048-F1055 (2010).
- Colson, P., et al. Does choice of the anesthetic influence renal function during infrarenal aortic surgery? Anesth Analg. 74, 481-485 (1992).
- Fusellier, M., et al. Influence of three anesthetic protocols on glomerular filtration rate in dogs. Am J Vet Res. 68, 807-811 (2007).
- Schreiber, A., et al. Transcutaneous measurement of renal function in conscious mice. Am J Physiol Renal Physiol. 303, F783-F788 (2012).
- Schock-Kusch, D., et al. Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate using FITC-sinistrin in rats. Nephrol Dial Transplant. 24, 2997-3001 (2009).
- Schock-Kusch, D., et al. Transcutaneous assessment of renal function in conscious rats with a device for measuring FITC-sinistrin disappearance curves. Kidney Int. 79, 1254-1258 (2011).
- Steinbach, S., et al. A pilot study to assess the feasibility of transcutaneous glomerular filtration rate measurement using fluorescence-labelled sinistrin in dogs and cats. PLoS One. 9, e111734 (2014).
- Schock-Kusch, D., et al. Reliability of transcutaneous measurement of renal function in various strains of conscious mice. PLoS One. 8, e71519 (2013).
- Cowley, A. W. Jr, et al. Progression of glomerular filtration rate reduction determined in conscious Dahl salt-sensitive hypertensive rats. Hypertension. 62, 85-90 (2013).
- Giani, J. F., et al. Renal angiotensin-converting enzyme is essential for the hypertension induced by nitric oxide synthesis inhibition. J Am Soc Nephrol. 25, 2752-2763 (2014).
- Sadick, M., et al. Two non-invasive GFR-estimation methods in rat models of polycystic kidney disease: 3.0 Tesla dynamic contrast-enhanced MRI and optical imaging. Nephrol Dial Transplant. 26, 3101-3108 (2011).
- Trudu, M., et al. Common noncoding UMOD gene variants induce salt-sensitive hypertension and kidney damage by increasing uromodulin expression. Nat Med. 19, 1655-1660 (2013).
- Zollner, F. G., et al. Simultaneous measurement of kidney function by dynamic contrast enhanced MRI and FITC-sinistrin clearance in rats at 3 tesla: initial results. PLoS One. 8, e79992 (2013).
