Summary
Denne artikel præsenterer en hurtig og enkel metode til administration af bleomycin direkte i musen luftrøret via intubation. Vigtige fordele ved denne metode er, at det er meget reproducerbar, let at mestre, og kræver ikke specielt udstyr eller langvarige opsving gange.
Introduction
Til trods for nogle anatomiske og fysiologiske forskelle, 1 murine modeller fortsat være uvurderlig for modellering human biologi og sygdom patogenese. 2 Fra en dyrehold synspunkt, mus er lette at håndtere, har en lav avl tid, en accelereret levetid, og er relativt billige til hus. Med udviklingen af forskellige genetiske stammer og strategier (f.eks., Betingede knock-outs, reporter mus, slægt-tracing metoder, etc.), samt den brede vifte af tilgængelige reagenser (f.eks., Antistoffer, rekombinante proteiner, inhibitorer, etc.), er mus blevet en afgørende model hvirveldyr organisme at afdække menneskelige homeostase og sygdomsprocesser. 3
Mus har været særligt værdifulde til undersøgelse pulmonale tilstande, herunder akut lungeskade (ALI) og lungefibrose. 4 ALI hos mennesker kan være forårsaget af trauma, skade, eller sepsis og er kendetegnet ved epitel- ogendotel lækage (dvs.., ødem), inflammation og spirende fibrose. Hos mange patienter ALI udvikler sig til dens alvorlige form, akut lungesvigt (ARDS), hvilket ofte resulterer i fibrose og død på grund af respiratorisk svigt. 5,6 Pulmonal fibrose er en progressiv, dødelig patologi karakteriseret ved overskydende aflejring af ekstracellulær matrix , især kollagen type l, hvilket fører til nedsat lungefunktion. 7,8 Administration af bleomycin (BLM) er den mest udbredte og bedst karakteriserede model til induktion ALI og fibrose hos forsøgsdyr. 9 Selv BLM-induceret lungefibrose hos gnavere gør ikke rekapitulere fuldt humane fibrotiske fænotyper, har 10 musestudier med denne model førte til opdagelsen af mange vigtige faktorer, der påvirker debut og progression af sygdommen. 11
Mens den nøjagtige mekanisme (r) bag BLM-induceret fibrogenese er ukendte, den initierende skademenes at stamme fra kontakt-afhængige DNA strengbrud i epitelceller, der beklæder ledende luftveje og alveoler og navnlig, type 1 pneumocytter. 12. Behovet for direkte kontakt mellem BLM og pulmonal epitel understreger betydningen af en solid levering rute , og disse bekymringer er også relevant for en bred vifte af behandlinger målrettet til de distale luftveje, herunder rekombinante proteiner, antistoffer, siRNA, virus, bakterier, partikler og mere. Oropharyngeal aspiration (OPA) har været meget anvendt til dette formål 13, men en større en mangel ved OPA er, at en vis del af den leverede middel kan sluges i mavetarmkanalen, hvilket fører til unøjagtighed i den administrerede dosis. En anden almindeligt anvendt fremgangsmåde er transtracheal instillation, som involverer trakeostomi under stærk bedøvelse for at eksponere luftrøret og inddrypning af et middel direkte ind i luftvejene. 14 imidlertid ikke alene kan disseen procedure være uønsket på grund af sin invasivitet, men det er også tidskrævende, kræver en retfærdig bit af uddannelse, og forårsager en potent skade luftvejene er blevet udviklet. 15,16 Flere protokoller, der involverer den direkte administration af midler til trachea uden behov for kirurgisk intervention, 16,17,18,19,20 men disse fremgangsmåder involverer forlænget genstartstider forårsaget af kraftige anæstetika, brug af dyrt udstyr (dvs.., otoskop / laryngoskop, kommercielt tilgængelige procedure boards, fiberoptisk ledninger, etc.), et overskud af manipulation i mundhulen, og usikkerhed med hensyn til dosering.
Dette papir beskriver en forholdsvis let metode til indgivelse via intubation, der tillader en forsker for hurtigt, billigt og pålideligt bibringe et reagens i den murine lunge med begrænset risiko for resterende skader på det omgivende væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Institutional Animal Care og Brug udvalg (IACUC) ved University of Washington og Cedars-Sinai Medical Center har godkendt dyret arbejde er nødvendigt for disse undersøgelser.
1. Fremstilling
- Sterilisere både de stumpe ende pincet og den depressor via autoklaven.
- Ved hjælp af en biologisk sikkerhedsskab, forberede en arbejdsgruppe bestand af BLM i PBS fra det frysetørrede pulver. Sonikeres opløsningen i 10 minutter ved 35 kHz for at sikre ensartet blanding.
Bemærk: et samlet volumen på mellem 30 og 45 pi anbefales at forhindre pipettering variation i den lave ende, og kvælning med større volumener. - Forbered en ren arbejdsplads, der omfatter ca. 1 m 2 for selve proceduren, samt udpegede lokaliteter til bure både før og efter proceduren.
- Fastgør bunden af proceduren bord til bænken umiddelbart foran forskeren ved at lægge 2 eller 3 strimler af laboratorium tape hen over bunden og underlying bænk. Se figur 1 for yderligere specifikationer om at skabe et bræt.
- Bind en enkelt længde på størrelse 4,0 sutur tråd mellem de to positionering skruer af proceduren bord.
- Generere en improviseret spirometer ved at fjerne og kassere stemplet fra tre 1 ml sprøjter og deponere 60 pi PBS i toppen af hver tønde for at danne en lufttæt forsegling. Fastgør hub af kateteret løst til en af sprøjterne og stil den til side af brættet.
- Aspirér 300 pi af luft i en 1 ml sprøjte og stil den til side af brættet.
- Skær en yderligere stykke tape ca. 6 inches i længden og sted til den ene side. Dette vil blive brugt til at sikre dyret til bestyrelsen i trin 2.4.
- Opret en isofluran kammer. Vedhæft O 2, isofluran, og vakuum til de korrekte porte på både testkamre samt clearance vakuum. Alternativt administrere bedøvelsesmiddel i en isofluran-kompatibelt biologisksikkerhed kabinet.
2. intubering
- Bedøver musen med isofluran i kammeret, indtil den mister bevidstheden og respiration bremser til en passende hastighed. En typisk eksponering omfatter 4% isofluran og 2% O2 i 3 til 4 min, og det ideelle resultat er 2 til 2,5 min på sedation. Det svarer til en respiration på 1 åndedrag hver 2 sek.
- Mens vi venter på sedation at sætte i, aspirat mellem 30 og 45 pi BLM i en pipette og sted til den ene side.
- Når du er klar, suspendere bedøvet musen ved dens øverste fortænder fra tråden knyttet til positionering skruer af proceduren platformen. Sørg for, at dyrets dorsum ligger fladt mod platformen overflade.
- At være omhyggelig med ikke at begrænse ventilationen, placere et stykke tape løst på tværs af lavere (caudale) del af brysthulen, lige over mellemgulvet. Placering bør være stram nok til at opretholde en ordentlig tilpasning under procedure, men ikke så stram, at det begrænser åndedræt.
- Tænd for lampen til at mellem 80% og 100% intensitet og orientere svanehalsen, så den er 1 til 2 cm fra overfladen af huden, nær solar plexus. Regelmæssigt kontrollere spidsen af svanehalsen for varme for at sikre, at den ikke skade musen.
- Stående bag platformen, bruge sterile, stumpe ende pincet til at lokalisere tungen. At være omhyggelig med at undgå de nederste fortænder, blidt greb og trække tungen ud af mundhulen.
- Brug den resterende hånd stikkes depressor og bruge den til at flade tungen mod gulvet i mundhulen. Slip pincet, men lad depressor på plads for de næste to trin.
- Orientere lyset, således at luftrøret er synlig ved at føre svanehalsen proksimalt fra niveauet for solar plexus indtil den når niveauet af hovedstammebronkie bronkier.
Bemærk: Luftrøret er nemt at skelne ved indvirkning af respiration, whilm forårsager det udsendte lys til at svinge i intensitet. Når korrekt placeret, vil denne struktur være mærkbare i aksiale plan som en centralt placeret tap af lys med minimal omgivende lys i selve mundhulen. - Vinkel sprøjten, så den følger den naturlige vej luftrøret, og sænk 22-G kateterspidsen, med vedlagte sprøjte indeholdende dråben, lige ind i lumen. PBS boble vil begynde at stige og falde med hvert åndedrag efter en vellykket placering.
Bemærk: Denne handling kan blive forsinket af flere sekunder som følge af dyb sedation. - Feed kateteret i yderligere 5 mm. Fjern tungen depressor.
- Skift sprøjten til den modsatte side, og gribende navet, forsigtigt fjerne sprøjten.
- Deposit mellem 30 og 45 pi BLM ind i midten af det indre af kateternavet, vedhæfte den anden sprøjte og dispensere 300 pi luft ind i navet.
- Erstat den andensprøjte med det første indeholder den boble af PBS. Boblen vil fortsætte med at stige og falde, hvis proceduren er udført med succes.
3. Post-proceduremæssige Care
- Fjern kateteret og tape, og placer dyret på et tørt varmt sted, indtil det kommer til bevidsthed - typisk inden for et par minutter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Intuberet mus blev overvåget dagligt for vægttab og nød, og ofret 4, 10 eller 17 dage senere via intraperitoneal injektion af 2,5% 2,2,2 tribromethanol. Bronkoalveolær lavage (BAL) blev indsamlet i tre vaske PBS som beskrevet andetsteds 21 og højre lunge blev fikseret i 10% formalin, paraffin indlejret og farvet med Massons Trichrome af University of Washington Histologi og Imaging Core 22.
I overensstemmelse med etablerede data, BLM-behandlede mus oplevede peak vægttab mellem dag 7 og 10 efter eksponering 23 (figur 2A). Desuden forhøjede niveauer af IgM i BAL fra ofret BLM-behandlede mus viste en signifikant, tidsafhængig stigning i lunge permeabilitet, indikerer epitel- og / eller endotel-barriere-dysfunktion (Figur 2B).
= "jove_content" fo: holde-together.within-side = "1"> fibrogene respons blev målt ved hjælp af Masson trichrom plet - en veletableret markør af det samlede indhold kollagen 24. Højre lunger blev farvet, og den gennemsnitlige samlede areal af trichromfarvning pr højre lunge sektion blev kvantificeret (figur 3A). Repræsentative snit viser den resulterende behandling-afhængige fortykkelse af pulmonal interstitium og stigninger i fibrøse læsioner (figur 3B).
Figur 1. Generelle parametre til fremstilling af en arbejdsgang bord. Længderne præsenterede angiver de omtrentlige dimensioner er nødvendige for at skabe en arbejdsgang apparat. I disse eksperimenter blev standard aluminium metalplader skåret til de rette dimensioner, derefter forstærket med et "T" beslag.ftp_upload / 53.771 / 53771fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Vægttab og barriere dysfunktion efter administration af bleomycin. Mus blev indgivet 2,0 E / kg BLM eller et tilsvarende volumen PBS. (A) Vægttab udtrykt som procentdel af dag 0 vægt (BLM: n = 21; PBS: 5). (B) Mus blev aflivet efter 4 eller 10 dage efter eksponering, og IgM-protein i BAL fra høstede lunger blev målt via ELISA. (PBS: n = 5; dag 4: n = 3; dag 10: n = 5). Data er præsenteret som gennemsnit ± SEM. * P <0,05 sammenlignet med PBS-kontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Lungefibrose efter administration af bleomycin. (A) Samlet kollagen, kvantificeret som total gange ændring Massons trichromfarvning fra WT kontroller. (B) Repræsentative billeder af trichrome farvede lunge sektioner taget på 5x forstørrelse. PBS-kontrol består af dyr, der mellem 5 og 14 dage efter PBS-behandling (PBS: n = 5; dag 10: n = 5; dag 17: n = 3). Data er præsenteret som gennemsnit ± SEM. * P <0,05 sammenlignet med PBS-kontrol. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I tilfælde, hvor aerosolisering er upraktisk på grund af begrænset reagens tilgængelighed, sikkerhed eller pris, direkte tracheal administration er en overlegen metode til afgivelse af eksogene midler ind i lungerne 16 transtracheal instillation har været meget anvendt til at opnå dette.; Men som med alle kirurgiske indgreb, det indebærer også en risiko for komplikationer som følge af selve proceduren, og ikke nødvendigvis det middel, der indpodet. 13 Af disse grunde er det blevet mere almindeligt at indgive et stof direkte i trachea via intubation 16,17,18,19,20. Men disse metoder lider også af begrænsninger, herunder udvidede inddrivelse gange på grund af brugen af kraftige beroligende midler som ketamin / xylazin, usikkerhed om placering af kateteret (dvs.., Ind i spiserøret og ikke luftrøret), unødig manipulation af væv i mundhulen, og omkostningerne forbundetmed køb specialiserede instrumenter såsom otoscopes / laryngoskoper.
Når de er etableret, den her skitserede fremgangsmåde giver flere meningsfulde fordele frem for andre intubation protokoller. For det første er anvendelsen af isofluran giver mulighed for en reduktion i den samlede tid brugt per mus. Dette skyldes primært den reducerede tid, der kræves for dyr at komme til bevidsthed efter isofluran sedation sammenlignet med kontrollerede stoffer som ketamin (ca. 5 min versus undertiden større end 3 timer). 14 Derudover improviseret spirometer sikrer tillid succes ved at lade forskeren at visualisere den oscillerende PBS boble, som angiver korrekt placering af den administrerede substans både før og efter inddrypning. Endelig ved at anvende en ekstern lyskilde i stedet for en voluminøs otoskop eller laryngoskop og ledetråden, forskeren er i stand til at reducere mængden af udstyr i deres hænder, og samtidig forbedre deres opfattelse of mundhulen og reducere deres chancer for at beskadige de bløde væv omkring luftrøret.
Specifikke bekymringer forbundet med denne protokol er få, men alvorlige. For eksempel, mens anvendelse af isofluran reducerer tidsforbrug i forbindelse med induktion og nyttiggørelse fra sedation, det kræver også streng observation af dyrets sedation tilstand. Hvis du ikke fjerner dyret fra isofluran kammer i tide kan resultere i dødsfald, især i dyr, der allerede genoprettelse fra en tidligere indgriben. Omvendt kan utilstrækkelig isofluran dosering og udvidede proceduremæssige gange resultere i dyret genvundet bevidstheden under selve proceduren, som også kan resultere i skader. Derfor er det vigtigt for både sikkerheden af dyret og integriteten af forsøget, at dyret returneres til isofluran kammer ved det første tegn på bevidsthed. Da dette kan være fælles, når lære denne metode anbefales det, at ierfarne forskere bekræfter vellykket administration af hvert dyr, før bedøve den næste. Desuden kan forskerne har problemer også vælge at forlænge isofluran eksponering for at øge den tilgængelige proceduremæssige tid, forudsat at de nøje overvåge de dyr, hendøen.
Et yderligere problem ved denne fremgangsmåde er, at skader i forbindelse med håndtering. Dette er især sandsynligt i tre trin: ved afmontering af tungen fra munden, ved indføring af kateteret, og når løsne sprøjterne fra navet efter behandling. Kateteret placering er langt den mest farlige af disse trin. Vigtigt er, bør kateteret ikke trænge ind i mundhulen indtil visningen af luftrøret er ideel. Hvis luftrøret ikke kan bringes til syne gennem manipulation af enten lyskilden eller depressor, bør forskeren frigive tungen og forsøge at foretage proceduren. Manipulation af det bløde væv omkring luftrøret ier ikke nødvendigt eller anbefalet. Men når kateteret er korrekt placeret, bør også være omhyggelig med at holde navet fra fremrykkende for langt ind i luftrøret og perforering main-stammen bronkier. Dette kan normalt undgås ved at sikre, at kateteret er kun løst fæstnet til sprøjtecylinderen, og ved afstivning hånden indeholdende katetret mod den proceduremæssige bræt, så det forbliver statisk. Disse nuancer, sammen med behovet for aktualitet og præcision, fremhæve betydningen af forberedelse og praksis i perfektionere denne procedure. Ikke desto mindre, med træning bør det være muligt for en nybegynder forsker til at behandle 20 eller flere dyr i løbet af en time, og for erfarne forskere til at fuldføre dobbelt så mange eller flere.
Konsistensen bibringes ved direkte tracheal aflejring har gjort det en foretrukken administrationsvej i de seneste år. Faktisk er allerede blevet rapporteret lignende metoder til en lang række uensartede matematerialer på denne måde 19,25. I overensstemmelse med sådanne protokoller, levering af bleomycin på den måde her skitserede resulterede i et potent fibrotisk respons i begge lunger, og i alle lapper, antyder en tilsvarende grad af dybde og ensartethed i fordelingen. Baseret på dette, er det sandsynligt, at denne protokol giver sammenlignelige eksperimentelle fordele for en række andre materialer, der er afhængige af kontakt til at mediere deres virkninger (f.eks., Lægemidler, antistoffer, bakterielle midler, og in vivo proteinmodifikation systemer såsom lentivirale vektorer) , og at de ligesom bleomycin, ville det give sådanne eksperimenter også gennemføres med tillid, lidt regning, og minimal postoperativ pleje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne takker Brian Johnson i Histologi og Imaging Core ved University of Washington efter hjælp til trichromfarvning og analyse. Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud HL098067 og HL089455.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bleomycin For Injection, 30 units/vial | APP Pharmaceuticals, LLC | 103720 | For best results, BLM should be suspended in PBS, aliquoted, and stored as single use lyophilzed aliquots |
| Blunt End Forceps | |||
| Tongue Depressor (i.e. bent Valleylab Blade Electrode, 2.4") | Covidien | E1551G | Before use, create a 45 degree bend 1.5 cm from the blade tip. A suitable depressor can also be created from any metal implement of similar dimensions. |
| Exel Safelet Catheter 22G X 1" | Exel International | 26746 | |
| 1 ml Slip-tip Disposable Tuberculin Syringe (200/sp, 1600/ca) | BD | 309659 | |
| 0.2 ml Pipettor and Filter Tips | |||
| Fiber-Lite Illuminator. Model 181-1: Model 180 mated with Standard Dual Gooseneck illuminator | Dolan Jenner Industries, Inc. | 181-1 | Lower output LED illuminators are not recommended as they fail to suficiently illuminate the trachea. |
| Intubation Board | See Diagram 1. | ||
| Colored Label Tape: 0.5 in. Wide | Fisherbrand | 15-901-15A | |
| Oxygen | |||
| Phosphate-Buffered Saline, 1X | Corning | 21-040-CV | Product should be sterile |
| Non-Sterile Silk Black Braided Suture Spool, 91.4 m, Size 4-0 | Harvard Apparatus | 517698 | |
| Table Top Anesthesia Machine Isoflurane | Highland Medical Equipment | http://www.highlandmedical.net/ | |
| Slide Top Induction Mouse Isoflurane Chamber | MIP / Anesthesia Technologies | AS-01-0530-SM | |
| FORANE (isoflurane, USP) Liquid For Inhalation 100 mL | Baxter | 1001936040 | |
| Nanozoomer Digital Pathology system | Hamamatsu | ||
| IgM ELISA Quantification Kit | Bethyl Laboratories | E90-101 |
References
- Hyde, D. M., Hamid, Q., Irvin, C. G. Anatomy, pathology, and physiology of the tracheobronchial tree: emphasis on the distal airways. J Allergy Clin Immunol. 124, S72-S77 (2009).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nat Cell Biol. 9, 993-999 (2007).
- Peters, L. L., et al. The mouse as a model for human biology: a resource guide for complex trait analysis. Nat Rev Genet. 8, 58-69 (2007).
- Baron, R. M., Choi, A. J., Owen, C. A., Choi, A. M. Genetically manipulated mouse models of lung disease: potential and pitfalls. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, 485-497 (2012).
- Sharma, S.
- Saguil, A., Fargo, M. Acute respiratory distress syndrome: diagnosis and management. Am Fam Physician. 85, 352-358 (2012).
- Wilson, M. S., Wynn, T. A. Pulmonary fibrosis: pathogenesis, etiology and regulation. Mucosal Immunol. 2, 103-121 (2009).
- Wuyts, W. A., et al. The pathogenesis of pulmonary fibrosis: a moving target. Eur Respir J. 41, 1207-1218 (2013).
- Mouratis, M. A., Aidinis, V. Modeling pulmonary fibrosis with bleomycin. Curr Opin Pulm Med. 17, 355-361 (2011).
- Moeller, A., Ask, K., Warburton, D., Gauldie, J., Kolb, M. The bleomycin animal model: a useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis? Int J Biochem Cell Biol. 40, 362-382 (2008).
- Myllärniemi, M., Kaarteenaho, R. Pharmacological treatment of idiopathic pulmonary fibrosis - preclinical and clinical studies of pirfenidone, nintedanib, and N-acetylcysteine. European Clinical Respiratory Journal. 2, (2015).
- Reinert, T., Baldotto, C. S. dR., Nunes, F. A. P., Scheliga, A. A. dS.
- Lakatos, H. F., et al. Oropharyngeal aspiration of a silica suspension produces a superior model of silicosis in the mouse when compared to intratracheal instillation. Exp Lung Res. 32, 181-199 (2006).
- Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. J Vis Exp. , (2010).
- Osier, M., Oberdorster, G. Intratracheal inhalation vs intratracheal instillation: differences in particle effects. Fundam Appl Toxicol. 40, 220-227 (1997).
- Driscoll, K. E., et al. Intratracheal instillation as an exposure technique for the evaluation of respiratory tract toxicity: Uses and Limitations. Toxicol Sci. 55, 24-35 (2000).
- MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. J Appl Physiol (1985). 106, 984-987 (1985).
- Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Lab Anim. 41, 128-135 (2007).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. J Vis Exp. , e50601 (2013).
- Starcher, B., WIlliams, I. A method for intratracheal instillation of endotoxin into the lungs of mice. Lab Anim. 23, 234-240 (1989).
- Daubeuf, F., Frossard, N.
- Li, Y., et al. Severe lung fibrosis requires an invasive fibroblast phenotype regulated by hyaluronan and CD44. J Exp Med. 208, 1459-1471 (2011).
- Grazioli, S., et al. CYR61 (CCN1) overexpression induces lung injury in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 308, L759-L765 (2015).
- Redente, E. F., et al. Tumor necrosis factor-alpha accelerates the resolution of established pulmonary fibrosis in mice by targeting profibrotic lung macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol. 50, 825-837 (2014).
- Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. J Vis Exp. , e52261 (2014).
