Summary
En este artículo se presenta un método rápido y sencillo para la administración de bleomicina directamente en la tráquea ratón a través de la intubación. Las principales ventajas de este método son que es altamente reproducible, fácil de dominar, y no requiere equipo especializado ni largos tiempos de recuperación.
Introduction
A pesar de algunas diferencias anatómicas y fisiológicas, 1 modelos murinos continúan siendo de gran valor para el modelado de la biología humana y la patogénesis de la enfermedad. 2 Desde un punto de vista de la cría, los ratones son fáciles de manejar, tienen un tiempo de reproducción de baja, una esperanza de vida acelerada, y son relativamente baratos a casa. Con el desarrollo de diversas cepas genéticas y estrategias (por ejemplo., Knock-out condicionales, ratones reportero, enfoques de linaje de trazado, etc.), así como la amplia gama de reactivos disponibles (por ejemplo., Anticuerpos, proteínas recombinantes, inhibidores, etc.), los ratones se han convertido en un organismo modelo de vertebrados esencial para descubrir los procesos de homeostasis y enfermedades humanas. 3
Los ratones han sido especialmente valiosa para el estudio de enfermedades pulmonares, incluyendo lesión pulmonar aguda (ALI) y fibrosis pulmonar. 4 ALI en los seres humanos puede ser causado por trauma, lesión o sepsis y se caracteriza por epitelial yfuga endotelial (es decir., edema), la inflamación y la fibrosis incipiente. En muchos pacientes, ALI progresa a su forma severa, síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), que a menudo resulta en la fibrosis y la muerte por insuficiencia respiratoria. 5,6 La fibrosis pulmonar es una patología progresiva y fatal que se caracteriza por el exceso de deposición de la matriz extracelular , especialmente colágeno de tipo I, que lleva a la función pulmonar. 7,8 administración de bleomicina (BLM) es el modelo más ampliamente utilizado y mejor caracterizado para inducir ALI y fibrosis en animales de experimentación. 9 Aunque BLM inducida por la fibrosis pulmonar en roedores hace no recapitular completamente los fenotipos fibróticos humanos, 10 estudios con ratones con este modelo han llevado al descubrimiento de muchos factores importantes que influyen en la aparición y progresión de la enfermedad. 11
Aunque el mecanismo exacto (s) detrás de la fibrogénesis BLM inducida son desconocidos, la lesión iniciarse cree que surgen de la ruptura de cadenas de ADN dependientes del contacto en las células epiteliales que recubren las vías aéreas y los alvéolos, y, en particular, tipo 1 neumocitos. 12 La necesidad de un contacto directo entre la BLM y el epitelio pulmonar pone de relieve la importancia de una vía de administración robusta , y estas preocupaciones también son pertinentes para una amplia gama de tratamientos dirigidos a las vías respiratorias distales, incluyendo las proteínas recombinantes, anticuerpos, siRNA, virus, bacterias, partículas, y más. Aspiración orofaríngea (OPA) ha sido ampliamente utilizado para este fin 13, pero un importante una deficiencia de OPA es que alguna porción del agente suministrado puede ser tragado en el tracto gastrointestinal, lo que conduce a la imprecisión en la dosis administrada. Otro método ampliamente utilizado es la instilación transtraqueal, que implica la traqueostomía con anestesia fuerte como para exponer la tráquea y la instilación de un agente directamente en el tracto respiratorio. 14 Sin embargo, no sólo puede talesun procedimiento sea indeseable debido a su invasividad, pero también es mucho tiempo, requiere un poco de entrenamiento, y causa una lesión potente para el tracto respiratorio. 15,16 Varios protocolos se han desarrollado que implican la administración directa de los agentes en el tráquea sin la necesidad de intervención quirúrgica, 16,17,18,19,20 tiempos de recuperación pero estos métodos implican extendían causada por anestésicos potentes, el uso de equipo costoso (es decir., otoscopio / laringoscopio, tableros de procedimientos disponibles en el mercado, de fibra óptica cables, etc.), un exceso de manipulación en la cavidad oral, y la incertidumbre con respecto a la dosis.
Este documento describe un método relativamente fácil de administración a través de intubación que permite al investigador rápida, económica y fiable a infundir un reactivo en el pulmón murino con riesgo limitado de daño residual a los tejidos circundantes.
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Protocol
Los Comités Institucionales Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Washington y el Cedars-Sinai Medical Center han aprobado el trabajo con animales necesarios para estos estudios.
1. Preparación
- Esterilizar tanto las pinzas de extremos romos y el depresor través de autoclave.
- El uso de una cabina de seguridad biológica, preparar una solución de trabajo de la BLM en PBS a partir del polvo liofilizado. Sonicar la solución durante 10 min a 35 Khz para asegurar una mezcla uniforme.
Nota: Se recomienda un volumen total de entre 30 y 45 l para evitar la variación de pipeteado en el extremo inferior, y la asfixia con volúmenes más grandes. - Prepare un área de trabajo limpia que incluye aproximadamente 1 m 2 para el procedimiento en sí, así como los lugares designados para jaulas, tanto antes como después del procedimiento.
- Fijar la base de la junta procedimiento para el banco inmediatamente delante del investigador poniendo 2 o 3 tiras de cinta de laboratorio a través de la base y SUBCARying banco. Ver Figura 1 para más especificaciones sobre la creación de una tabla.
- Ate una sola longitud de tamaño de 4.0 hilo de sutura entre los dos tornillos de posicionamiento de la junta procedimiento.
- Generar un espirómetro improvisada eliminando y desechando el émbolo de tres jeringas de 1 ml, y el depósito de 60 l de PBS en la parte superior de cada barril para formar un sello hermético. Asegurar el centro del catéter vagamente a una de las jeringas y colocarlo a un lado de la junta.
- Aspirado de 300 l de aire en una jeringa de 1 ml y colocarlo a un lado de la junta.
- Cortar una pieza adicional de cinta de aproximadamente 6 pulgadas de largo y el lugar de uno de los lados. Esto se utiliza para asegurar el animal a la junta en el paso 2.4.
- Configurar una cámara de isoflurano. Adjuntar O2, isoflurano, y el vacío a los puertos apropiados tanto en la cámara de exposición y el vacío despacho. Alternativamente, administrar anestésico en un isoflurano-compatible biológicacabina de seguridad.
2. La intubación
- Anestesiar al ratón con isoflurano en la cámara hasta que se pierde la conciencia y la respiración se desacelera a un ritmo adecuado. Una exposición típica incluye 4% de isoflurano y 2% O 2 durante 3 a 4 minutos, y el resultado ideal es de 2 a 2,5 min de sedación. Esto corresponde a una tasa de respiración de 1 respiración cada 2 seg.
- A la espera de la sedación a instaurarse, aspirado de entre 30 y 45 l de BLM en una pipeta y el lugar de uno de los lados.
- Cuando esté listo, suspender el ratón sedado por sus incisivos superiores desde el hilo unido a los tornillos de posicionamiento de la plataforma procedimiento. Asegúrese de que el dorso del animal quede plana contra la superficie de la plataforma.
- Teniendo cuidado de no restringir la ventilación, coloque un trozo de cinta sin apretar a través de la parte inferior (caudal) de la cavidad torácica, justo por encima del diafragma. La colocación debe ser lo suficientemente apretado para mantener la alineación adecuada durante el procedure, pero no tan apretado que restringe la respiración.
- Encender el iluminador a entre 80% y 100% de intensidad y orientar el cuello de cisne de modo que es de 1 a 2 cm de la superficie de la piel, cerca del plexo solar. revisar periódicamente la punta del cuello de cisne para el calor para asegurarse de que no perjudique el ratón.
- De pie detrás de la plataforma, utilizar las pinzas de punta roma, estériles para localizar la lengua. Teniendo cuidado de evitar los incisivos inferiores, suavemente agarre y sacar la lengua fuera de la cavidad oral.
- Usando la mano restante, inserte el depresor y utilizarlo para aplanar la lengua contra el suelo de la cavidad oral. Liberar la pinza, pero deje el depresor en el lugar durante los siguientes dos pasos.
- Oriente la luz para que la tráquea es visible al guiar el cuello de cisne proximalmente desde el nivel del plexo solar hasta que alcanza el nivel de la bronquios principales.
Nota: La tráquea se puede distinguir fácilmente por la acción de la respiración, WHIch hace que la luz emitida a fluctuar en intensidad. Cuando está colocado correctamente, esta estructura será discernible en el plano axial como un pasador situado en el centro de la luz con la luz ambiental mínimo en la propia cavidad oral. - Ángulo de la jeringa para que siga el camino natural de la tráquea, y bajar la punta del catéter 22-G, con la jeringa unida que contiene la gota, directamente en el lumen. La burbuja PBS comenzará a subir y bajar con cada respiración sobre la colocacion exitosa.
Nota: Esta acción se puede retrasar por varios segundos, como resultado de la sedación profunda. - Alimentar el catéter en un 5 mm adicionales. Retire el depresor de lengua.
- Cambiar la jeringa con la mano opuesta, y agarrando el cubo, retire suavemente la jeringa.
- Fuerte entre 30 y 45 l de BLM en el centro del interior del cubo del catéter, coloque la segunda jeringa y dispensar 300 l de aire en el cubo.
- Vuelva a colocar la segundajeringa con la primera que contiene la burbuja de PBS. La burbuja seguirá subiendo y bajando si el procedimiento se ha realizado con éxito.
3. Cuidado post-procedimental
- Retirar el catéter y cinta, y colocar al animal en un lugar cálido y seco hasta que se recupere la conciencia - por lo general dentro de un par de minutos.
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Representative Results
Ratones intubados se controlaron diariamente para la pérdida de peso y la angustia, y se sacrificaron 4, 10 o 17 días más tarde a través de inyección intraperitoneal de 2,5% 2,2,2 tribromoetanol. Se recogió el lavado broncoalveolar (BAL) en tres lavados de PBS como se describe en otra parte 21 y el pulmón derecho se fijó en formalina al 10%, embebidos en parafina, y se tiñeron con tricrómico de Masson por la Universidad de Washington Histología y Imaging Core 22.
En consonancia con los datos establecidos, los ratones tratados con BLM experimentaron pérdida de peso máximo entre los días 7 y 10 después de la exposición 23 (Figura 2A). Además, los niveles elevados de IgM en BAL de ratones tratados con BLM sacrificados demostraron un aumento significativo, dependiente del tiempo en la permeabilidad de pulmón, indicativo de epiteliales y / o disfunción de la barrera endotelial (Figura 2B).
= "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> La respuesta fibrogénicos se midió utilizando tricrómico de Masson - un marcador bien establecido del contenido de colágeno total de 24. Pulmones derechos se tiñeron, y el área total medio de tricrómico de tinción por sección del pulmón derecho se cuantificó (Figura 3A). Secciones representativas muestran el engrosamiento tratamiento dependiente resultante del intersticio pulmonar y el aumento de lesiones fibróticas (Figura 3B).
Figura 1. Parámetros generales para producir un tablero de procedimiento de trabajo. Las longitudes presentados indican las dimensiones aproximadas necesarias para la creación de un aparato de procedimiento de trabajo. En estos experimentos, la hoja de aluminio de metal estándar fue cortado a las dimensiones adecuadas, a continuación, reforzada con un soporte de "T".ftp_upload / 53771 / 53771fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Peso pérdida y disfunción de la barrera después de la administración de bleomicina. Los ratones se administraron 2.0 U / kg de BLM o un volumen igual de PBS. Pérdida (A) Peso expresa como porcentaje de días 0 peso (BLM: n = 21; PBS: 5). (B) Los ratones fueron sacrificados a 4 o 10 días después de la exposición, y la proteína de IgM en el LBA de pulmones cosechadas se midió mediante ELISA. (PBS: n = 5; día 4: n = 3; día 10: n = 5). Los datos se presentan como media ± SEM. * P <0,05 en comparación con el control PBS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. La fibrosis pulmonar tras la administración de bleomicina. (A) de colágeno total, cuantificada en la tinción de tricrómico cambio total pliegue de Masson de los controles WT. (B) Imágenes representativas de tricrómico secciones de pulmón teñidas tomadas con un aumento de 5x. control de PBS se compone de animales capturados entre 5 y 14 días de tratamiento post-PBS (PBS: n = 5; día 10: n = 5; día 17: n = 3). Los datos se presentan como media ± SEM. * P <0,05 en comparación con el control PBS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En los casos en que la aerosolización es poco práctico debido a la limitada disponibilidad de reactivos, la seguridad, o el coste, la administración directa de la tráquea es un método superior para la administración de agentes exógenos en los pulmones 16 transtraqueal instilación ha sido ampliamente utilizado para lograr esto.; Sin embargo, como con cualquier intervención quirúrgica, sino que también lleva consigo la posibilidad de complicaciones causadas por el procedimiento en sí, y no necesariamente el agente que se inculca. 13 Por estas razones, se ha hecho cada vez más común para administrar una sustancia directamente en la tráquea a través de la intubación 16,17,18,19,20. Sin embargo, estos métodos también sufren de limitaciones, incluyendo los tiempos prolongados de recuperación debido al uso de sedantes potentes, como la ketamina / xilacina, la incertidumbre con respecto a la colocación del catéter (es decir., En el esófago y no la tráquea), la manipulación innecesaria de los tejidos en la cavidad oral, y el costo asociadocon la compra de instrumentos especializados, como los otoscopios / laringoscopios.
Una vez establecido, el enfoque descrito aquí ofrece varias ventajas significativas sobre otros protocolos de intubación. Por un lado, el uso de isoflurano permite una reducción en el tiempo total gastado por ratón. Esto se debe principalmente a la reducción del tiempo necesario para animales de recuperar la consciencia tras la sedación isoflurano en comparación con sustancias controladas como ketamina (aproximadamente 5 min frente a veces mayor que 3 hr). 14 Además, el espirómetro improvisada asegura confianza de éxito al permitir que el investigador para visualizar la burbuja oscilante PBS, lo que indica la colocación correcta de la sustancia administrada tanto antes como después de la instilación. Por último, mediante la utilización de una fuente de luz externa en lugar de un otoscopio voluminosos o alambre de laringoscopio y guía, el investigador es capaz de reducir la cantidad de equipos en sus manos, mejorando al mismo tiempo su punto de vista of la cavidad oral y la reducción de las posibilidades de dañar los tejidos blandos que rodean la tráquea.
Las preocupaciones específicas asociadas con este protocolo son pocos, pero grave. Por ejemplo, mientras que el uso de isoflurano reduce el tiempo asociado con la inducción y la recuperación de la sedación, sino que también requiere una observación rigurosa de estado de sedación del animal. Si no se retira el animal de la cámara de isoflurano en una manera oportuna puede resultar en la muerte, especialmente en animales ya recuperarse de una intervención anterior. Por el contrario, dosis insuficiente de isoflurano y tiempos de procedimiento prolongados pueden resultar en el animal de recuperar la conciencia durante el procedimiento en sí, que también puede provocar lesiones. Por lo tanto, es imperativo que tanto la seguridad del animal y la integridad del experimento que el animal se devuelve a la cámara de isoflurano a la primera señal de la conciencia. Ya que esto puede ser común en el aprendizaje de este método, se recomienda que eninvestigadores experimentados confirman la administración exitosa de cada animal antes de anestesiar a la siguiente. Además, los investigadores tienen dificultades también pueden optar por ampliar la exposición a isoflurano para aumentar el tiempo de procedimiento disponibles, siempre que vigilan de cerca los animales para moribundity.
Una preocupación adicional de este método es el de los daños asociados con el manejo. Esto es especialmente probable durante tres pasos: al quitar la lengua de la boca, cuando se inserta el catéter, y cuando desalojar las jeringas desde el cubo después del tratamiento. La colocación del catéter es de lejos el más peligroso de estos pasos. Es importante destacar que el catéter no debe entrar en la cavidad oral hasta que la vista de la tráquea es ideal. Si la tráquea no puede ser llevado a la vista a través de la manipulación de cualquiera de la fuente de luz o el depresor, el investigador debe liberar la lengua y volver a intentar el procedimiento. La manipulación de los tejidos blandos que rodean el i tráqueas no es necesario o recomendable. Sin embargo, una vez que el catéter ha sido colocado correctamente, se debe también tener cuidado para mantener el centro de avanzar demasiado en la tráquea y la perforación de la bronquios principales. En general, esto se puede evitar mediante asegurar que el catéter se conecta solamente libremente al cilindro de la jeringa, y por arriostramiento la mano que contiene el catéter contra el tablero de procedimiento de manera que permanece estática. Estos matices, junto con la necesidad de puntualidad y precisión, ponen de relieve la importancia de la preparación y la práctica en el perfeccionamiento de este procedimiento. Sin embargo, con el entrenamiento debería ser posible para un investigador novato para el tratamiento de 20 o más animales en el transcurso de una hora, y para los investigadores experimentados para completar el doble o más.
La consistencia impartida por deposición directa traqueal ha hecho una vía de administración preferida en los últimos años. De hecho, ya se ha informado de métodos similares para una multitud de compañero disparesRIALS de esta manera 19,25. De acuerdo con tales protocolos, la entrega de la bleomicina en la forma indicada aquí resultó en una respuesta fibrótica potente en ambos pulmones, y en todos los lóbulos, lo que sugiere un nivel similar de la profundidad y la uniformidad en la distribución. Basado en esto, es probable que este protocolo proporciona ventajas experimentales comparables para una gama de otros materiales que se basan en el contacto para mediar sus efectos (por ejemplo., Productos farmacéuticos, anticuerpos, agentes bacterianos, y los sistemas de modificación de proteínas in vivo, tales como vectores lentivirales) y que, como bleomicina, permitiría que tales experimentos que se llevaron a cabo también con confianza, poco gasto, y el cuidado postoperatorio mínimo.
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Acknowledgments
Los autores agradecen a Brian Johnson, de la Histología y Imaging Core de la Universidad de Washington en busca de ayuda con la tinción de tricrómico y análisis. Este trabajo fue apoyado por el NIH subvenciones y HL098067 HL089455.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bleomycin For Injection, 30 units/vial | APP Pharmaceuticals, LLC | 103720 | For best results, BLM should be suspended in PBS, aliquoted, and stored as single use lyophilzed aliquots |
| Blunt End Forceps | |||
| Tongue Depressor (i.e. bent Valleylab Blade Electrode, 2.4") | Covidien | E1551G | Before use, create a 45 degree bend 1.5 cm from the blade tip. A suitable depressor can also be created from any metal implement of similar dimensions. |
| Exel Safelet Catheter 22G X 1" | Exel International | 26746 | |
| 1 ml Slip-tip Disposable Tuberculin Syringe (200/sp, 1600/ca) | BD | 309659 | |
| 0.2 ml Pipettor and Filter Tips | |||
| Fiber-Lite Illuminator. Model 181-1: Model 180 mated with Standard Dual Gooseneck illuminator | Dolan Jenner Industries, Inc. | 181-1 | Lower output LED illuminators are not recommended as they fail to suficiently illuminate the trachea. |
| Intubation Board | See Diagram 1. | ||
| Colored Label Tape: 0.5 in. Wide | Fisherbrand | 15-901-15A | |
| Oxygen | |||
| Phosphate-Buffered Saline, 1X | Corning | 21-040-CV | Product should be sterile |
| Non-Sterile Silk Black Braided Suture Spool, 91.4 m, Size 4-0 | Harvard Apparatus | 517698 | |
| Table Top Anesthesia Machine Isoflurane | Highland Medical Equipment | http://www.highlandmedical.net/ | |
| Slide Top Induction Mouse Isoflurane Chamber | MIP / Anesthesia Technologies | AS-01-0530-SM | |
| FORANE (isoflurane, USP) Liquid For Inhalation 100 mL | Baxter | 1001936040 | |
| Nanozoomer Digital Pathology system | Hamamatsu | ||
| IgM ELISA Quantification Kit | Bethyl Laboratories | E90-101 |
References
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