Summary
Este artigo apresenta um método rápido e simples para a administração de bleomicina diretamente na traquéia do mouse através de intubação. As principais vantagens deste método é que ele é altamente reprodutível, fácil de dominar, e não requer equipamento especializado ou tempos de recuperação longos.
Introduction
Apesar de algumas diferenças anatômicas e fisiológicas, 1 modelos murino continuam a ser de valor inestimável para a modelagem de biologia humana e patogênese da doença. 2 Do ponto de vista pecuária, os ratos são fáceis de manusear, tem um tempo de reprodução baixa, um tempo de vida acelerado, e são relativamente baratos para abrigar. Com o desenvolvimento de diversas estirpes genéticas e estratégias (por ex., Condicionais knock-outs, ratinhos repórter, abordagens de rastreio de linhagem, etc.), bem como a grande variedade de reagentes disponíveis (por exemplo., Anticorpos, proteínas recombinantes, inibidores, etc.), os ratos se tornaram um organismo essencial modelo de vertebrados para descobrir processos de homeostase e de doenças humanas 3.
Os ratos têm sido especialmente valiosa para estudar as condições pulmonares, incluindo lesão pulmonar aguda (LPA) e fibrose pulmonar. 4 LPA em seres humanos pode ser causado por trauma, lesão, ou septicemia e é caracterizada por células epiteliais evazamento endotelial (isto é., edema), inflamação e fibrose nascente. Em muitos pacientes, ALI progride para sua forma grave, síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA), que muitas vezes resulta em fibrose e morte por insuficiência respiratória. 5,6 fibrose pulmonar é uma patologia progressiva, fatal caracterizada pela deposição excessiva de matriz extracelular , digite mais notavelmente I colágeno, levando a função pulmonar prejudicada. 7,8 a administração de bleomicina (BLM) é o modelo mais amplamente utilizado e melhor caracterizado para induzir ALI e fibrose em animais experimentais. 9 Apesar de fibrose pulmonar BLM-induzida em roedores faz não recapitular plenamente os fenótipos fibróticas humanos, 10 estudos com ratos com este modelo levaram à descoberta de muitos fatores importantes que influenciam o aparecimento e progressão da doença 11.
Enquanto o mecanismo exacto (s) por detrás fibrogénese induzida por BLM são desconhecidas, a lesão iniciarPensa-se que surgir a partir de rupturas dos filamentos de DNA dependente de contacto nas células epiteliais que revestem as vias aéreas condutoras e alvéolos e, em particular, tipo 1 pneumócitos. 12 A necessidade de contacto directo entre BLM eo epitélio pulmonar destaca a importância de uma rota de entrega robusta , e estas preocupações são também pertinentes para uma vasta gama de tratamentos direccionado para as vias respiratórias distais, incluindo proteínas recombinantes, anticorpos, siRNA, vírus, bactérias, partículas, e mais. Aspiração orofaríngea (OPA) tem sido amplamente utilizado para este fim 13, mas um grande inconveniente de uma OPA é que alguma porção do agente fornecido pode ser engolida para o tracto gastrointestinal, conduzindo assim a imprecisão na dose administrada. Outra abordagem amplamente utilizada é a instilação transtraqueal, que envolve traqueostomia sob anestesia forte para expor a traqueia e a instilação de um agente directamente no tracto respiratório. 14 No entanto, tal não só podeum procedimento ser indesejável devido ao seu invasividade, mas também consome tempo, exige um pouco de formação, e provoca uma lesão potente ao tracto respiratório têm sido desenvolvidos. 15,16 Vários protocolos que envolvem a administração directa de agentes para o traqueia, sem a necessidade de intervenção cirúrgica, 16,17,18,19,20 tempos de recuperação, mas estes métodos envolvem estendidos causada pelos anestésicos potentes, o uso de equipamento caro (isto é., otoscope / laringoscopio, disponíveis comercialmente placas de procedimento, de fibra óptica fios, etc.), um excesso de manipulação na cavidade oral, e a incerteza sobre a dosagem.
Este artigo descreve um método relativamente fácil de administração por entubação que permite que um investigador de forma rápida, barata, e infundir de forma fiável um reagente para o pulmão de murino com o risco reduzido de danos residuais para os tecidos circundantes.
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Protocol
Os Comitês Institucionais de Animais Cuidado e Uso (IACUC) da Universidade de Washington e Cedars-Sinai Medical Center aprovaram o animal de trabalho necessário para estes estudos.
1. Preparação
- Esterilizar ambas as pinças de extremidade embotada e o autoclave através de depressor.
- Usando uma câmara de segurança biológica, prepare um estoque de trabalho de BLM em PBS a partir do pó liofilizado. Sonicar a solução durante 10 min a 35 kHz a assegurar uma mistura uniforme.
Nota: Um volume total de entre 30 e 45 uL é recomendado para evitar a variação de pipetagem na extremidade baixa, e asfixia com volumes maiores. - Prepare um espaço de trabalho limpo, que inclui cerca de 1 m 2 para o procedimento em si, bem como locais designados para gaiolas antes e após o procedimento.
- Fixar a placa de base do procedimento para o banco imediatamente em frente do investigador por a disposição de 2 ou 3 tiras de fita laboratório através da base e Sublinharying banco. Veja a Figura 1 para mais especificações sobre a criação de um conselho.
- Amarre um único comprimento de tamanho 4.0 fio de sutura entre os dois parafusos de posicionamento da placa de procedimento.
- Gerar um espirómetro improvisada, removendo e rejeitando o êmbolo a partir de três seringas de 1 ml, e depositar 60 ul de PBS para o topo de cada barril, para formar uma vedação hermética. Fixar o cubo do cateter livremente para uma das seringas e colocá-lo para um lado do tabuleiro.
- Aspirar 300 ul de ar para uma seringa de 1 mL e colocá-lo para um lado do tabuleiro.
- Cortar uma peça adicional de fita de aproximadamente 6 polegadas de comprimento e lugar para um lado. Isso será usado para prender o animal para o conselho na etapa 2.4.
- Configurar uma câmara de isoflurano. Fixe O 2, isoflurano, e de vácuo para as portas apropriadas, tanto a câmara de exposição e o vácuo de apuramento. Em alternativa, administrar um anestésico de isoflurano-compatível biológicagabinete de segurança.
2. intubação
- Anestesiar o rato com isoflurano na câmara até que ela perde a consciência e respiração retarda a uma taxa adequada. Uma exposição típico inclui 4% de isoflurano e 2% de O 2 durante 3 a 4 minutos, e o resultado ideal é de 2 a 2,5 min da sedação. Isto corresponde a uma taxa de respiração de uma respiração cada 2 segundos.
- Enquanto espera para a sedação para, em conjunto, aspirado entre 30 e 45 l de BLM em uma pipeta e lugar para um lado.
- Quando estiver pronto, suspender o mouse sedado por seus incisivos superiores do fio ligado aos parafusos de posicionamento da plataforma procedimento. Certifique-se de que o dorso do animal fica plana contra a superfície da plataforma.
- Tendo o cuidado de não restringir a ventilação, colocar um pedaço de fita livremente entre a parte inferior (caudal) da porção interior da cavidade torácica, logo acima do diafragma. A colocação deve ser apertado o suficiente para manter o alinhamento adequado durante o procedure, mas não tão apertado que restringe a respiração.
- Ligue o iluminador para entre 80% e 100% de intensidade e orientar o pescoço de ganso de modo que é de 1 a 2 cm da superfície da pele, próximo do plexo solar. Verificar periodicamente a ponta do pescoço de ganso de calor para garantir que ele não ferir o rato.
- De pé por trás da plataforma, use as estéreis, pinças fim brusco para localizar a língua. Ser cuidadoso para evitar os incisivos inferiores, suavemente aderência e desenhar a lingueta para fora da cavidade oral.
- Usando a mão restante, insira o depressor e usá-lo para achatar a língua contra o assoalho da cavidade oral. Solte a pinça, mas deixe o depressor no lugar para as próximas duas etapas.
- Orientar a luz de modo que a traqueia é visível, orientando o pescoço de ganso proximalmente a partir do nível do plexo solar até atingir o nível dos brônquios mainstem.
Nota: A traqueia pode ser facilmente distinguidos pela acção da respiração, WHICH faz com que a luz emitida a flutuar em intensidade. Quando correctamente posicionada, esta estrutura será visível no plano axial de um pino localizado centralmente de luz com luz ambiente mínima na própria cavidade oral. - Ângulo da seringa para que ele segue o caminho natural da traqueia, e abaixe a ponta do cateter 22-G, com a seringa anexo contendo a gota, em linha reta para o lúmen. A bolha PBS começará a subir e descer com cada respiração em cima colocação bem sucedida.
Nota: Esta acção pode ser retardado por vários segundos, como resultado da sedação profunda. - Alimentar o cateter em um adicional de 5 mm. Retire a espátula.
- Deslocar a seringa ao lado oposto, e agarrando o hub, remova cuidadosamente a seringa.
- Depósito entre 30 e 45 ul de BLM no centro do interior do cubo de cateter, anexar a segunda seringa e dispensar 300 ul de ar para dentro do cubo.
- Substitua o segundoSeringa com o primeiro contendo a bolha de PBS. A bolha vai continuar a subir e descer se o procedimento foi realizado com sucesso.
Cuidado 3. pós-procedimento
- Retirar o cateter e fita, e colocar o animal em um lugar quente e seco até que ele recupera a consciência - geralmente dentro de um par de minutos.
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Representative Results
Ratos entubados foram monitorados diariamente para perda de peso e angústia, e sacrificados 4, 10 ou 17 dias depois através de injecção intraperitoneal de 2,5% 2,2,2 tribromoethanol. Lavado broncoalveolar (LBA) foi coletado em três lavagens de PBS como descrito em outra parte 21 , e o pulmão direito foi fixado em 10% de formalina, embebidos em parafina, e coradas com tricrómio de Masson pela Universidade de Washington Histologia e imagem de núcleo 22.
De acordo com dados estabelecidos, os ratos tratados com BLM experimentaram perda de peso de pico entre os dias 7 e 10 pós exposição 23 (Figura 2A). Além disso, níveis elevados de IgM em BAL de murganhos tratados com BLM sacrificaram demonstraram um aumento significativo, dependente do tempo na permeabilidade do pulmão, indicativo de células epiteliais e / ou disfunção da barreira endotelial (Figura 2B).
= "jove_content" fo: manter-together.within-page = "1"> A resposta fibrogênica foi medido utilizando o tricrômico de Masson - um marcador bem estabelecido de conteúdo total de colágeno 24. Pulmões direito foram coradas, e a média da área total de secção tricromo por pulmão direito foi quantificada (Figura 3A). As secções representativas mostrar o espessamento dependente do tratamento resultante do interstício pulmonar e aumento de lesões fibróticas (Figura 3B).
Figura 1. Os parâmetros gerais para a produção de uma placa de processo de trabalho. Os comprimentos apresentados indicam as dimensões aproximadas necessárias para a criação de um aparelho de procedimento de trabalho. Nestas experiências, o metal em chapa de alumínio padrão foi cortado com as dimensões adequadas, em seguida, reforçado com um suporte de "T".ftp_upload / 53771 / 53771fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. perda de peso e disfunção da barreira após a administração de bleomicina. Os ratinhos foram administrados 2,0 U / kg de BLM ou um volume igual de PBS. Perda (A) Peso expresso em percentagem de peso dia 0 (BLM: n = 21; PBS: 5). (B) Os ratinhos foram sacrificados aos 4 ou 10 dias pós-exposição, e proteína IgM no BAL de pulmão colhidas foi medida através de ELISA. (PBS: n = 5; 4 dias: n = 3; 10 dias: n = 5). Os dados são apresentados como média ± SEM. * P <0,05 em relação ao controle PBS. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. A fibrose pulmonar após a administração de bleomicina. (A) colágeno total, quantificado como coloração tricromo mudança total dobra de Masson dos controles WT. (B) Imagens representativas de tricrômicos secções de pulmão coradas tiradas com 5x de ampliação. controlo PBS consiste de animais capturados entre 5 e 14 dias de tratamento pós-PBS (PBS: n = 5; 10 dias: n = 5; 17 dias: n = 3). Os dados são apresentados como média ± SEM. * P <0,05 em relação ao controle PBS. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nos casos em que aerossolização é impraticável devido à disponibilidade limitada de reagentes, de segurança, ou de custos, a administração traqueal directa é um método superior para a entrega de agentes exógenos aos pulmões 16 transtraqueal instilação tem sido amplamente utilizada para realizar isto.; No entanto, como acontece com qualquer intervenção cirúrgica, ele também carrega consigo o potencial de complicações causadas pelo procedimento em si, e não necessariamente o agente a ser instilado. 13 Por estas razões, tornou-se cada vez mais comum para administrar uma substância directamente na traqueia através de intubação 16,17,18,19,20. No entanto, estes métodos também sofrem de limitações, incluindo longos períodos de recuperação, devido ao uso de sedativos poderosos como cetamina / xilazina, a incerteza sobre a colocação do cateter (ie., Para o esôfago e não da traqueia), manipulação desnecessária dos tecidos a cavidade oral, e o custo associadocom a compra de instrumentos especializados, tais como otoscopes / laringoscópios.
Uma vez estabelecida, a abordagem descrita aqui oferece vários benefícios significativos em relação a outros protocolos de intubação. Por um lado, o uso de isoflurano permite uma redução no tempo total dispendido por ratinho. Isto é principalmente devido à redução do tempo necessário para os animais a recuperar a consciência após sedação isoflurano em comparação com substâncias controladas como cetamina (cerca de 5 minutos versus vezes maior do que 3 horas). 14 Além disso, o espirómetro improvisada assegura confiança de sucesso, permitindo que o pesquisador visualizar a bolha PBS oscilante, o que indica a colocação correcta da substância administrada, tanto antes como após a instilação. Finalmente, através da utilização de uma fonte de luz externa em vez de um otoscópio volumosos ou fio de laringoscópio e guia, o pesquisador é capaz de reduzir a quantidade de equipamentos em suas mãos, melhorando simultaneamente a sua visão of a cavidade oral e reduzir as suas possibilidades de danificar os tecidos moles circundantes da traqueia.
preocupações específicas relacionadas com este protocolo são poucos, mas grave. Por exemplo, enquanto o uso de isoflurano reduz o tempo associado com a indução de sedação e de recuperação, é também requer uma observação rigorosa do estado de sedação do animal. A não remoção do animal a partir da câmara de isoflurano em tempo hábil pode resultar em morte, especialmente em animais já a recuperar de uma intervenção anterior. Por outro lado, insuficiente dosagem isoflurano e os tempos processuais estendida pode resultar em que o animal recuperar a consciência durante o próprio processo, que também pode resultar em lesões. Portanto, é imperativo que a segurança tanto do animal e a integridade da experiência que o animal ser devolvido para a câmara de isoflurano ao primeiro sinal de consciência. Uma vez que esta pode ser comum ao aprender este método, é recomendado que eminvestigadores experientes confirmar administração bem sucedida de cada animal antes de anestesiar o próximo. Além disso, os pesquisadores têm dificuldade também pode optar por estender a exposição isoflurano para aumentar o tempo processual disponível, desde que acompanhar de perto os animais em estado moribundo.
Uma preocupação adicional do presente método é a dos danos associados com a manipulação. Isto é especialmente provável durante três etapas: durante a remoção da lingueta da boca, ao inserir o cateter, e quando desalojar as seringas a partir do cubo após o tratamento. A colocação do cateter é, de longe, o mais perigoso destes passos. Importantemente, o cateter não deve entrar na cavidade oral, até que o ponto de vista da traqueia é ideal. Se a traquéia não pode ser posta em vista através da manipulação de qualquer fonte de luz ou o depressor, o pesquisador deve liberar a língua e tente novamente o procedimento. Manipulação dos tecidos moles em torno do i traqueiaNão é necessário nem recomendado. No entanto, uma vez que o cateter foi colocado corretamente, os cuidados devem também ser tomadas para manter o hub de avançar muito para dentro da traqueia e dos brônquios perfurante-haste principal. Isto pode geralmente ser evitada garantindo que o cateter é apenas vagamente ligado ao cilindro da seringa, e por órtese o lado que contém o cateter contra o bordo processual forma a que permaneça estático. Essas nuances, juntamente com a necessidade de rapidez e precisão, destacar a importância da preparação e prática para aperfeiçoar este procedimento. No entanto, com a formação que deve ser possível para um pesquisador iniciante para tratar 20 ou mais animais ao longo de uma hora, e para investigadores experientes para completar o dobro ou mais.
A consistência transmitida por deposição directa traqueal tornou uma via preferida de administração, nos últimos anos. Na verdade, já métodos semelhantes têm sido relatados para uma multiplicidade de companheiro dísparriais desta forma 19,25. Consistente com estes protocolos, administração de bleomicina na maneira descrita aqui resultou numa resposta fibrótica potente em ambos os pulmões, e em todos os lóbulos, sugerindo um nível semelhante de profundidade e uniformidade na distribuição. Com base nisto, é provável que este protocolo proporciona vantagens experimentais comparáveis para uma gama de outros materiais que dependem de contacto para mediar os seus efeitos (por exemplo., Produtos farmacêuticos, anticorpos, agentes bacterianos, e em sistemas de modificação de proteínas in vivo, tais como vectores lentivirais) , e que, como bleomicina, seria permitir que tais experimentos para também ser conduzido com confiança, pouca despesa e cuidados pós-operatórios mínima.
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Acknowledgments
Os autores agradecem Brian Johnson da Histologia e imagem Núcleo da Universidade de Washington para obter ajuda com a coloração tricromo e análise. Este trabalho foi financiado pelo NIH concede HL098067 e HL089455.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bleomycin For Injection, 30 units/vial | APP Pharmaceuticals, LLC | 103720 | For best results, BLM should be suspended in PBS, aliquoted, and stored as single use lyophilzed aliquots |
| Blunt End Forceps | |||
| Tongue Depressor (i.e. bent Valleylab Blade Electrode, 2.4") | Covidien | E1551G | Before use, create a 45 degree bend 1.5 cm from the blade tip. A suitable depressor can also be created from any metal implement of similar dimensions. |
| Exel Safelet Catheter 22G X 1" | Exel International | 26746 | |
| 1 ml Slip-tip Disposable Tuberculin Syringe (200/sp, 1600/ca) | BD | 309659 | |
| 0.2 ml Pipettor and Filter Tips | |||
| Fiber-Lite Illuminator. Model 181-1: Model 180 mated with Standard Dual Gooseneck illuminator | Dolan Jenner Industries, Inc. | 181-1 | Lower output LED illuminators are not recommended as they fail to suficiently illuminate the trachea. |
| Intubation Board | See Diagram 1. | ||
| Colored Label Tape: 0.5 in. Wide | Fisherbrand | 15-901-15A | |
| Oxygen | |||
| Phosphate-Buffered Saline, 1X | Corning | 21-040-CV | Product should be sterile |
| Non-Sterile Silk Black Braided Suture Spool, 91.4 m, Size 4-0 | Harvard Apparatus | 517698 | |
| Table Top Anesthesia Machine Isoflurane | Highland Medical Equipment | http://www.highlandmedical.net/ | |
| Slide Top Induction Mouse Isoflurane Chamber | MIP / Anesthesia Technologies | AS-01-0530-SM | |
| FORANE (isoflurane, USP) Liquid For Inhalation 100 mL | Baxter | 1001936040 | |
| Nanozoomer Digital Pathology system | Hamamatsu | ||
| IgM ELISA Quantification Kit | Bethyl Laboratories | E90-101 |
References
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