Summary
Questo articolo presenta un metodo rapido e semplice per l'amministrazione bleomicina direttamente nella trachea del mouse tramite intubazione. I principali vantaggi di questo metodo sono che è altamente riproducibile, facile da padroneggiare, e non richiede attrezzature specializzate o tempi di recupero lunghi.
Introduction
Nonostante alcune differenze anatomiche e fisiologiche, 1 modelli murini continuano ad essere prezioso per la modellazione di biologia umana e patogenesi della malattia. 2 Dal punto di vista allevamento, i topi sono facili da gestire, hanno un basso tempo di allevamento, una durata di vita accelerato, e sono relativamente poco costoso a casa. Con lo sviluppo di diversi ceppi genetici e strategie (ad es., Condizionali knock-out, topi reporter, approcci lineage tracing, ecc), così come l'ampia gamma di reagenti disponibili (ad es., Anticorpi, proteine ricombinanti, inibitori, ecc), i topi sono diventati un elemento essenziale organismo modello vertebrato per scoprire i processi di omeostasi e malattie umane. 3
I topi sono stati particolarmente preziosi per lo studio le malattie polmonari, tra cui lesione acuta polmonare (ALI) e fibrosi polmonare. 4 ALI negli esseri umani può essere causata da traumi, lesioni, o sepsi ed è caratterizzata da epiteliale eperdita endoteliale (es., edema), l'infiammazione e la fibrosi nascente. In molti pazienti, ALI progredisce nella sua forma grave, sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS), che si traduce spesso in fibrosi e la morte a causa di insufficienza respiratoria. 5,6 fibrosi polmonare è una progressiva, una patologia fatale caratterizzata dall'eccesso deposizione di matrice extracellulare , in particolare collagene di tipo I, portando a deficit della funzionalità respiratoria. 7,8 somministrazione di bleomicina (BLM) è il modello più diffuso e meglio caratterizzato per indurre ALI e fibrosi negli animali da esperimento. 9 Sebbene BLM-indotta fibrosi polmonare nei roditori fa non ricapitolare completamente i fenotipi umani fibrotiche, 10 studi di topo con questo modello hanno portato alla scoperta di importanti fattori che influenzano l'insorgenza e la progressione della malattia. 11
Mentre l'esatto meccanismo (s) dietro fibrogenesi BLM-indotta sono sconosciuti, il danno avvioè pensato per sorgere dal contatto-dipendente rotture del DNA nelle cellule epiteliali che rivestono le vie aeree di conduzione e alveoli, in particolare, di tipo 1 pneumociti. 12 Il bisogno di contatto diretto tra BLM e l'epitelio polmonare mette in evidenza l'importanza di un robusto percorso di consegna , e queste preoccupazioni sono anche germano a una vasta gamma di trattamenti mirati per le vie aeree distali, tra cui proteine ricombinanti, anticorpi, siRNA, virus, batteri, particelle, e altro ancora. Aspirazione orofaringeo (OPA) è stato ampiamente utilizzato per questo scopo 13, ma un importante una lacuna di OPA è che una parte dell'agente erogata sia assorbito nel tratto gastrointestinale, determinando così imprecisione della dose somministrata. Un altro approccio ampiamente utilizzato è instillazione transtracheale, che coinvolge tracheostomia sotto forte anestesia per esporre la trachea e instillazione di un agente direttamente nelle vie respiratorie. 14 Tuttavia, non solo può taleuna procedura sia indesiderabile a causa della sua invasività, ma è anche in termini di tempo, richiede un bel po 'di allenamento, e provoca una lesione potente per le vie respiratorie sono stati sviluppati. 15,16 Diversi protocolli che coinvolgono l'amministrazione diretta di agenti in trachea senza la necessità di un intervento chirurgico, 16,17,18,19,20 tempi di recupero ma questi metodi comportano estesi causato da anestetici potenti, l'uso di attrezzature costose (es., otoscope / laringoscopio, disponibili in commercio tavole procedura, fibra ottica fili, ecc), un eccesso di manipolazione nella cavità orale, l'incertezza del dosaggio.
Questo documento descrive un metodo relativamente semplice di somministrazione tramite intubazione che permette un ricercatore modo rapido, economico e affidabile infondere un reagente nel polmone murino con limitato rischio di danno residuo ai tessuti circostanti.
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Protocol
L'animale cura e l'uso comitati istituzionali (IACUC) presso l'Università di Washington e Cedars-Sinai Medical Center hanno approvato il lavoro degli animali necessari per questi studi.
1. Preparazione
- Sterilizzare entrambe le pinze punta smussata e il divaricatore tramite autoclave.
- Usando una cappa di sicurezza biologica, preparare uno stock di lavoro di BLM in PBS dalla polvere liofilizzata. Sonicare la soluzione per 10 minuti a 35 Khz per assicurare una miscelazione uniforme.
Nota: Si raccomanda un volume totale di tra 30 e 45 ml per evitare variazioni pipettaggio sulla fascia bassa, e il soffocamento con volumi maggiori. - Preparare un lavoro pulito che comprende circa 1 m 2 per la procedura stessa, così come luoghi designati per gabbie sia prima che dopo la procedura.
- Fissare la base della tavola procedimento al banco immediatamente davanti ricercatore ponendo 2 o 3 strisce di nastro laboratorio attraverso la base e sottocaricoying panchina. Vedere la Figura 1 per ulteriori specifiche sulla creazione di un bordo.
- Legare una sola lunghezza di dimensioni 4,0 filo di sutura tra le due viti di posizionamento della scheda procedura.
- Generare uno spirometro improvvisato rimuovendo e scartando il pistone da tre 1 ml siringhe, e depositando 60 ml di PBS nella parte superiore di ciascun cilindro per formare una chiusura ermetica. Fissare il mozzo del catetere vagamente ad una delle siringhe e posizionarlo su un lato della tavola.
- Aspirare 300 ml di aria in una siringa da 1 ml e posizionarlo su un lato della tavola.
- Tagliare un pezzo aggiuntivo di nastro di circa 6 pollici di lunghezza e metterlo da parte. Questo verrà utilizzato per fissare l'animale alla scheda in fase 2.4.
- Impostare una camera isoflurano. Attaccare O 2, isoflurano, e vuoto per porte appropriate sia sulla camera di esposizione ed il vuoto gioco. In alternativa, somministrare anestetico in un isoflurano compatibile biologicocappa di sicurezza.
2. intubazione
- Anestetizzare il mouse con isoflurano nella camera fino a quando non perde conoscenza e la respirazione rallenta a un tasso adeguato. Un'esposizione tipico include 4% isoflurano e 2% O 2 da 3 a 4 min, e il risultato ideale è 2 a 2,5 min di sedazione. Ciò corrisponde ad un tasso di respirazione di 1 respiro ogni 2 secondi.
- In attesa che la sedazione per impostare in, aspirare tra 30 e 45 ml di BLM in una pipetta e metterlo da parte.
- Quando si è pronti, sospendere il mouse sedato dai suoi incisivi superiori dal filo attaccato alle viti di posizionamento della piattaforma procedura. Assicurarsi che dorso dell'animale in posizione piana rispetto alla superficie della piattaforma.
- Facendo attenzione a non limitare la ventilazione, posizionare un pezzo di nastro liberamente attraverso il (caudale) parte inferiore della cavità toracica, appena sopra il diaframma. Il posizionamento deve essere abbastanza stretto per mantenere il corretto allineamento durante il procedure, ma non così stretta che limita la respirazione.
- Accendere l'illuminatore tra l'80% e il 100% di intensità e orientare il collo d'oca in modo che sia da 1 a 2 cm dalla superficie della pelle, vicino al plesso solare. Controllare periodicamente la punta di un collo d'oca per il calore per garantire che essa non danneggia il mouse.
- In piedi dietro la piattaforma, utilizzare le sterili, pinze estremità smussata per individuare la lingua. Facendo attenzione ad evitare gli incisivi inferiori, delicatamente presa e disegnare la lingua fuori della cavità orale.
- Utilizzando la mano rimanente, inserire il divaricatore e utilizzarlo per appiattire la lingua contro il pavimento della cavità orale. Rilasciare le pinze, ma lasciare il divaricatore sul posto per i due passaggi successivi.
- Orientare la luce in modo che la trachea è visibile guidando il collo d'oca prossimalmente dal livello del plesso solare fino a raggiungere il livello dei bronchi mainstem.
Nota: La trachea può essere facilmente distinta dall'azione della respirazione, WHIch provoca la luce emessa fluttuare in intensità. Quando posizionato correttamente, questa struttura sarà distinguibile nel piano assiale di un perno centrale di luce con luce ambientale minimo nella cavità orale stessa. - Angle la siringa in modo che segua il percorso naturale della trachea, e abbassare la punta del catetere 22-G, con la siringa attaccata contenente la gocciolina, direttamente nel lume. La bolla PBS inizierà a salire e scendere ad ogni respiro sul posizionamento di successo.
Nota: Questa azione può essere ritardata di alcuni secondi a causa della sedazione profonda. - Nutrire il catetere in un ulteriore 5 mm. Rimuovere la abbassalingua.
- Spostare la siringa per la mano opposta, e impugnando il mozzo, rimuovere delicatamente la siringa.
- Deposito tra 30 e 45 ml di BLM nel centro dell'interno del mozzo del catetere, collegare la seconda siringa ed erogare 300 microlitri di aria nel mozzo.
- Sostituire il secondosiringa con il primo contenente la bolla di PBS. La bolla continuerà a salire e scendere se la procedura è stata eseguita con successo.
Cura 3. post-procedurale
- Rimuovere il catetere e il nastro, e mettere l'animale in un luogo caldo e asciutto fino a quando non riprende conoscenza - di solito entro un paio di minuti.
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Representative Results
Topi intubati sono stati monitorati giornalmente per la perdita di peso e di angoscia, e si sono sacrificati 4, 10 o 17 giorni dopo tramite iniezione intraperitoneale di 2,5% 2,2,2- tribromoethanol. Il lavaggio broncoalveolare (BAL) è stato raccolto in tre lavaggi di PBS come descritto altrove 21 , e il polmone destro è stato fissato in formalina 10%, inclusi in paraffina, e colorati con tricromica di Masson dalla University of Washington Istologia ed Imaging originale 22.
In linea con i dati consolidati, topi BLM-trattati hanno sperimentato la perdita di peso di picco tra i giorni 7 e 10 dopo l'esposizione 23 (Figura 2A). Inoltre, i livelli elevati di IgM nel BAL di topi BLM-trattati sacrificati dimostrato un aumento significativo, dipendente dal tempo in permeabilità polmonare, indicativa di epiteliale e / o disfunzione endoteliale barriera (Figura 2B).
= "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> La risposta è stata misurata utilizzando fibrogenica di Masson tricromica macchia - un indicatore consolidata del contenuto totale di collagene 24. Polmoni Destra erano macchiati, e la superficie totale media di colorazione tricromica per sezione polmone destro è stata quantificata (Figura 3A). Sezioni rappresentativi mostrano l'ispessimento trattamento-dipendente risultante dell'interstizio polmonare e aumenti nelle lesioni fibrotiche (Figura 3B).
Figura 1. Parametri generali per la produzione di una scheda di procedura di lavoro. Le lunghezze presentati indicano le dimensioni approssimative necessarie per la creazione di un apparato procedura di lavoro. In questi esperimenti, lamiera di alluminio standard è stato tagliato alle dimensioni appropriate, poi rinforzato con una staffa a "T".ftp_upload / 53771 / 53771fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Perdita di peso e disfunzione barriera dopo somministrazione di bleomicina. I topi sono stati somministrati 2,0 U / kg di BLM o un volume uguale di PBS. Perdita (A) Peso espresso come percentuale del giorno 0 peso (BLM: n = 21; PBS: 5). (B) topi sono stati sacrificati a 4 o 10 giorni post-esposizione, e IgM proteine nel BAL dai polmoni raccolte è stata misurata tramite ELISA. (PBS: n = 5; giorno 4: n = 3; giorno 10: n = 5). I dati sono presentati come media ± SEM. * P <0,05 rispetto al controllo PBS. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. La fibrosi polmonare dopo la somministrazione di bleomicina. (A) del collagene totale, quantificato come colorazione tricromica cambiamento totale piega di Masson dai controlli WT. (B) Immagini rappresentative della tricromica sezioni polmonari colorate prese a 5x ingrandimento. Controllo PBS consiste animali prese fra 5 e 14 giorni di trattamento post-PBS (PBS: n = 5; giorno 10: n = 5; giorno 17: n = 3). I dati sono presentati come media ± SEM. * P <0,05 rispetto al controllo PBS. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Nei casi in cui aerosol è impraticabile a causa della limitata disponibilità di reagente, la sicurezza, o il costo, amministrazione diretta tracheale è un metodo superiore per la consegna degli agenti esogeni nei polmoni 16 transtracheale instillazione è stato ampiamente utilizzato per raggiungere questo obiettivo.; Tuttavia, come con tutti gli interventi chirurgici, porta con sé anche il potenziale di complicazioni causate dalla procedura stessa, e non necessariamente l'agente essendo instillato. 13 Per queste ragioni, è diventato sempre più comune per somministrare una sostanza direttamente nella trachea mediante intubazione 16,17,18,19,20. Tuttavia, questi metodi soffrono anche di limitazioni, inclusi i tempi lunghi di recupero dovute all'uso di sedativi potenti come ketamina / xilazina, incertezza riguardo al posizionamento del catetere (es., Nell'esofago e non la trachea), manipolazione inutile di tessuti in la cavità orale, e il costo associatocon l'acquisto di strumenti specializzati come otoscopi / laringoscopi.
Una volta stabilito, l'approccio qui delineato offre diversi vantaggi significativi rispetto ad altri protocolli di intubazione. Per prima cosa, l'uso di isoflurano consente una riduzione del tempo totale speso per topo. Ciò è dovuto principalmente alla riduzione dei tempi necessari per gli animali a riprendere conoscenza dopo la sedazione isoflurano rispetto alle sostanze controllate come ketamina (circa 5 minuti rispetto a volte maggiore di 3 ore). 14 Inoltre, lo spirometro improvvisato assicura la fiducia di successo, consentendo al ricercatore per visualizzare la bolla oscillante PBS, che indica il corretto posizionamento della sostanza somministrata sia prima che dopo l'instillazione. Infine, utilizzando una sorgente di luce esterna anziché un otoscopio ingombranti o fili laringoscopio e guida, il ricercatore è in grado di ridurre la quantità di materiale nelle loro mani, migliorando contemporaneamente la loro vista of cavità orale e riducendo le probabilità di danneggiare i tessuti molli circostanti la trachea.
preoccupazioni specifici associati a questo protocollo sono pochi, ma grave. Per esempio, mentre l'uso di isoflurano riduce il tempo associato all'induzione e recupero dalla sedazione, richiede anche rigorosa osservazione dello stato sedazione dell'animale. La mancata rimozione degli animali dalla camera isoflurano in modo tempestivo può provocare la morte, soprattutto negli animali già riprendendo da un intervento precedente. Viceversa, insufficienti dosaggio isoflurano e tempi procedurali estese possono comportare l'animale ripreso conoscenza durante la procedura stessa, che può anche provocare lesioni. Pertanto, è imperativo sia per la sicurezza dell'animale e l'integrità dell'esperimento che l'animale essere restituito alla camera isoflurano al primo segno di coscienza. Dal momento che questo può essere comune quando imparare questo metodo, si raccomanda che inricercatori esperti confermano la somministrazione di successo di ogni animale prima di anestetizzare il prossimo. Inoltre, i ricercatori hanno difficoltà possono anche scegliere di estendere l'esposizione isoflurano per aumentare il tempo a disposizione procedurale, a condizione che seguire da vicino gli animali per agonia.
Un ulteriore problema di questo metodo è quello di danni associati alla manipolazione. Ciò è particolarmente probabile durante tre fasi: quando si estrae la lingua dalla bocca, quando si inserisce il catetere, e quando sloggiare le siringhe dal mozzo dopo il trattamento. Il posizionamento del catetere è di gran lunga il più pericoloso di questi passaggi. È importante sottolineare che il catetere non deve entrare nella cavità orale fino alla vista della trachea è ideale. Se la trachea non può essere portato in vista attraverso la manipolazione di una fonte di luce o il divaricatore, il ricercatore dovrebbe rilasciare la lingua e ritentare la procedura. La manipolazione dei tessuti molli circostanti l'i tracheas non necessaria o consigliata. Tuttavia, una volta che il catetere è stato posizionato correttamente, la cura dovrebbe anche essere presa per mantenere l'hub di avanzare troppo nella trachea e perforare il bronchi principali-staminali. Questo può essere generalmente evitata facendo in modo che il catetere è in stretta attaccato alla siringa, e da tiranti mano contenente il catetere contro la tavola procedurale modo che rimane statico. Queste sfumature, insieme alla necessità di tempestività e precisione, sottolineano l'importanza della preparazione e pratica nel perfezionare questa procedura. Tuttavia, con la formazione dovrebbe essere possibile per un ricercatore novizio trattare 20 o più animali nel corso di un'ora, e per ricercatori esperti per completare il doppio o più.
La consistenza impartita mediante deposizione tracheale diretta ha fatto un percorso di somministrazione preferito negli ultimi anni. In realtà, sono già stati descritti metodi simili per una moltitudine di compagno disparaterial in questo modo 19,25. Coerentemente con tali protocolli, consegna bleomicina nel modo descritto qui determinato una potente risposta fibrotica in entrambi i polmoni, e in tutti i lobi, suggerendo un livello simile di profondità e uniformità di distribuzione. Sulla base di questo, è probabile che questo protocollo fornisce vantaggi sperimentali paragonabili per una serie di altri materiali che si basano sul contatto per mediare gli effetti (ad es., Farmaceutici, anticorpi, agenti batterici, e in sistemi di modifica proteine vivo come vettori lentivirali) , e che, come la bleomicina, permetterebbe tali esperimenti da condurre anche con fiducia, poca spesa, e minimal cure post-operatorie.
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Acknowledgments
Gli autori ringraziano Brian Johnson del Istologia ed Imaging Nucleo presso l'Università di Washington per aiutare con la colorazione tricromica e l'analisi. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH sovvenzioni HL098067 e HL089455.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bleomycin For Injection, 30 units/vial | APP Pharmaceuticals, LLC | 103720 | For best results, BLM should be suspended in PBS, aliquoted, and stored as single use lyophilzed aliquots |
| Blunt End Forceps | |||
| Tongue Depressor (i.e. bent Valleylab Blade Electrode, 2.4") | Covidien | E1551G | Before use, create a 45 degree bend 1.5 cm from the blade tip. A suitable depressor can also be created from any metal implement of similar dimensions. |
| Exel Safelet Catheter 22G X 1" | Exel International | 26746 | |
| 1 ml Slip-tip Disposable Tuberculin Syringe (200/sp, 1600/ca) | BD | 309659 | |
| 0.2 ml Pipettor and Filter Tips | |||
| Fiber-Lite Illuminator. Model 181-1: Model 180 mated with Standard Dual Gooseneck illuminator | Dolan Jenner Industries, Inc. | 181-1 | Lower output LED illuminators are not recommended as they fail to suficiently illuminate the trachea. |
| Intubation Board | See Diagram 1. | ||
| Colored Label Tape: 0.5 in. Wide | Fisherbrand | 15-901-15A | |
| Oxygen | |||
| Phosphate-Buffered Saline, 1X | Corning | 21-040-CV | Product should be sterile |
| Non-Sterile Silk Black Braided Suture Spool, 91.4 m, Size 4-0 | Harvard Apparatus | 517698 | |
| Table Top Anesthesia Machine Isoflurane | Highland Medical Equipment | http://www.highlandmedical.net/ | |
| Slide Top Induction Mouse Isoflurane Chamber | MIP / Anesthesia Technologies | AS-01-0530-SM | |
| FORANE (isoflurane, USP) Liquid For Inhalation 100 mL | Baxter | 1001936040 | |
| Nanozoomer Digital Pathology system | Hamamatsu | ||
| IgM ELISA Quantification Kit | Bethyl Laboratories | E90-101 |
References
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