Summary
Cet article présente une méthode rapide et simple pour l'administration de la bléomycine directement dans la trachée de souris par intubation. Les principaux avantages de cette méthode est qu'il est hautement reproductible, facile à maîtriser, et ne nécessite pas d'équipement spécialisé ou de longs temps de récupération.
Introduction
En dépit de quelques différences anatomiques et physiologiques, 1 modèles murins continuent à être très précieux pour la modélisation de la biologie humaine et la pathogenèse de la maladie. 2 Du point de vue l'élevage, les souris sont faciles à manipuler, avoir un temps de reproduction faible, une durée de vie accélérée, et sont relativement peu coûteux à la maison. Avec le développement de souches diverses génétiques et stratégies (ex., Knock-out conditionnel, souris rapporteurs, les approches de la lignée de traçage, etc.), ainsi que la large gamme de réactifs disponibles (par ex., Des anticorps, des protéines recombinantes, des inhibiteurs, etc.), les souris sont devenues un organisme modèle vertébré essentiel pour découvrir les processus de l'homéostasie et les maladies humaines. 3
Les souris ont été particulièrement précieux pour l'étude des conditions pulmonaires, y compris les lésions aiguës du poumon (ALI) et la fibrose pulmonaire. 4 ALI chez l'homme peut être causée par un traumatisme, une blessure ou une septicémie et se caractérise par l'épithélium etfuite endothéliale (ie., oedème), l'inflammation et la fibrose naissante. Chez de nombreux patients, ALI progresse à sa forme sévère, syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA), ce qui se traduit souvent par la fibrose et de la mort par insuffisance respiratoire. 5,6 La fibrose pulmonaire est une pathologie évolutive fatale caractérisée par le dépôt excessif de matrice extracellulaire , notamment collagène de type I, qui conduit à la fonction pulmonaire. 7,8 administration de la bléomycine (BLM) est le modèle le plus largement utilisé et le meilleur caractérisé pour induire ALI et de la fibrose chez les animaux expérimentaux. 9 Bien que BLM-induit une fibrose pulmonaire chez les rongeurs ne récapituler pas pleinement les phénotypes fibrotiques humains, 10 des études de souris avec ce modèle ont conduit à la découverte de nombreux facteurs importants influant sur l'apparition et la progression de la maladie 11.
Bien que le mécanisme exact (s) derrière fibrogenèse induite BLM-ne sont pas connus, la blessure initiationon pense résultant d'un contact dépendant des brins d'ADN des pauses dans les cellules épithéliales qui tapissent les voies aériennes et les alvéoles, et en particulier, tapez 1 pneumocytes. 12 La nécessité d'un contact direct entre BLM et l'épithélium pulmonaire met en évidence l'importance d'un itinéraire de livraison robuste , et ces préoccupations sont également pertinentes pour un large éventail de traitements ciblés pour les voies aériennes distales, y compris les protéines recombinantes, les anticorps, siRNA, virus, bactéries, particules, et plus encore. Aspiration oropharyngée (OPA) a été largement utilisé à cette fin 13, mais un défaut majeur de l'OPA est qu'une partie de l'agent livré peut être avalé dans le tractus gastro-intestinal, ce qui conduit à l'imprécision de la dose administrée. Une autre approche est largement utilisé instillation transtracheale, ce qui implique une trachéotomie sous anesthésie forte pour exposer la trachée et l'instillation d'un agent directement dans les voies respiratoires. 14 Cependant, non seulement, de tellesune procédure pas souhaitable en raison de son invasivité, mais il est aussi prend du temps, nécessite un peu juste de la formation, et provoque une blessure puissant pour les voies respiratoires. 15,16 Plusieurs protocoles ont été élaborés qui impliquent l'administration directe des agents dans le trachée sans avoir besoin d'une intervention chirurgicale, 16,17,18,19,20 mais ces méthodes impliquent étendues temps de récupération causée par les anesthésiques puissants, l'utilisation d'un équipement coûteux (ie., otoscope / laryngoscope, disponibles dans le commerce planches de procédure, fibre optique fils, etc.), un excès de manipulation dans la cavité buccale, et l'incertitude en ce qui concerne le dosage.
Le présent document décrit une méthode relativement facile de l'administration par intubation qui permet à un chercheur rapidement, à moindre coût, et inculquer de manière fiable un réactif dans le poumon murin avec un risque limité de dommages résiduels aux tissus environnants.
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Protocol
Les soins et l'utilisation des comités institutionnels animaux (IACUC) à l'Université de Washington et de Cedars-Sinai Medical Center ont approuvé les travaux nécessaires à ces études animales.
1. Préparation
- Stériliser les deux pinces à extrémité franche et l'autoclave abaisse via.
- L'utilisation d'un poste de sécurité microbiologique, préparer un stock de travail de BLM dans PBS de la poudre lyophilisée. Sonication la solution pendant 10 min à 35 kHz pour assurer un mélange homogène.
Remarque: Un volume total compris entre 30 et 45 pi est recommandée pour éviter pipetage variation sur le bas de gamme, et la suffocation avec des volumes plus importants. - Préparer un espace de travail propre qui comprend environ 1 m 2 pour la procédure elle-même, ainsi que des endroits désignés pour les cages à la fois avant et après la procédure.
- Fixer la base de la procédure conseil sur le banc juste en face du chercheur en mettant 2 ou 3 bandes de ruban de laboratoire à travers la base et Ss-ying banc. Voir la figure 1 pour plus de spécifications sur la création d'un conseil.
- Attachez une seule longueur de taille 4.0 fil de suture entre les deux vis de la carte de la procédure de positionnement.
- Générer un spiromètre de fortune en enlevant et en écartant le piston de trois seringues de 1 ml, et le dépôt de 60 ul de PBS dans la partie supérieure de chaque cylindre pour former un joint étanche à l'air. Fixer le moyeu du cathéter de manière lâche l'une des seringues et le placer sur un côté de la planche.
- Aspirer 300 pi d'air dans une seringue de 1 ml et placez-le sur un côté de la planche.
- Couper une pièce supplémentaire de bande d'environ 6 pouces de longueur et la mettre de côté. Il sera utilisé pour fixer l'animal à la carte à l'étape 2.4.
- Mettre en place une chambre isoflurane. Fixez O 2, l'isoflurane et vide aux ports appropriés à la fois la chambre d'exposition et le vide de dégagement. Alternativement, d'administrer un anesthésique dans un isoflurane compatible biologiqueenceinte de sécurité.
2. intubation
- Anesthésier la souris avec de l'isoflurane dans la chambre jusqu'à ce qu'il perde conscience et la respiration ralentit à un taux approprié. Une exposition typique comprend 4% d'isoflurane et 2% d'O 2 pendant 3 à 4 min, et le résultat idéal est de 2 à 2,5 minutes de la sédation. Cela correspond à un taux de respiration 1 toutes les 2 s de respiration.
- En attendant que la sédation de mettre en, aspirer entre 30 et 45 pi de BLM dans une pipette et la mettre de côté.
- Lorsque vous êtes prêt, de suspendre la souris sous sédation par ses incisives supérieures du fil attaché aux vis de la plate-forme de la procédure de positionnement. Assurez-vous que le dos de l'animal repose à plat sur la surface de la plate-forme.
- En faisant attention de ne pas restreindre la ventilation, placez un morceau de ruban adhésif de manière lâche à travers le (caudale) partie inférieure de la cage thoracique, juste au-dessus du diaphragme. Le placement doit être assez serré pour maintenir un alignement correct au cours de la procedure, mais pas tellement serré qu'il restreint la respiration.
- Allumer le dispositif d'éclairage entre 80% et 100% d'intensité et d'orienter le col de cygne de sorte qu'il est de 1 à 2 cm de la surface de la peau, à proximité du plexus solaire. Vérifiez régulièrement la pointe du col de cygne pour la chaleur pour assurer qu'il ne nuit pas à la souris.
- Debout derrière la plate-forme, utilisez les, pince à extrémités franches stériles pour localiser la langue. En veillant à éviter les incisives inférieures, doucement adhérence et d'en tirer la langue hors de la cavité buccale.
- En utilisant la main restant, insérer le dépresseur et l'utiliser pour aplatir la langue contre le fond de la cavité buccale. Relâchez la pince, mais laisser le abaisse en place pour les deux étapes suivantes.
- Orienter la lumière de sorte que la trachée est visible par le col de cygne de guidage de manière proximale par rapport au niveau du plexus solaire jusqu'à ce qu'il atteigne le niveau des bronches de l'axe principal.
Remarque: La trachée peut être facilement distinguée par l'action de la respiration, WHIch provoque la lumière émise à fluctuer en intensité. Lorsqu'il est correctement positionné, cette structure sera discernable dans le plan axial une broche situé au centre de la lumière avec un minimum de lumière ambiante dans la cavité buccale elle-même. - Angle de la seringue afin qu'il suive le chemin naturel de la trachée, et abaisser l'extrémité du cathéter 22-G, avec la seringue attachée contenant la goutte, directement dans la lumière. La bulle PBS va commencer à monter et descendre à chaque respiration lors du placement réussi.
Remarque: Cette action peut être retardée de plusieurs secondes à la suite de la sédation profonde. - Nourrir le cathéter dans un supplément de 5 mm. Retirer l'abaisse-langue.
- Décaler la seringue à la main opposée, et saisir le moyeu, retirez délicatement la seringue.
- Dépôt entre 30 et 45 pi de BLM dans le centre de l'intérieur du moyeu de cathéter, fixer la deuxième seringue et dispense 300 pi de l'air dans le moyeu.
- Remplacer la deuxièmeseringue avec le premier contenant la bulle de PBS. La bulle va continuer à augmenter et à l'automne si la procédure a été effectuée avec succès.
Soins 3. postopératoire
- Retirer le cathéter et la bande, et placer l'animal dans un endroit chaud et sec jusqu'à ce qu'elle reprenne conscience - généralement au bout de quelques minutes.
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Representative Results
Souris intubés ont été suivis quotidiennement pour perdre du poids et de la détresse, et sacrifiés 4, 10 ou 17 jours plus tard par injection intrapéritonéale de 2,5% 2,2,2 tribromoéthanol. Lavage broncho-alvéolaire (BAL) a été recueilli en trois lavages de PBS comme décrit par ailleurs 21 et le poumon droit a été fixé à 10% de formol, inclus dans la paraffine et coloré avec du trichrome de Masson par l'Université de Washington histologie et Imaging Core 22.
En accord avec les données établies, les souris BLM-traités ont connu pic de perte de poids entre les jours 7 et 10 post-exposition 23 (Figure 2A). En outre, des niveaux élevés d'IgM dans le BAL de souris BLM-traités sacrifiés ont montré une augmentation significative, en fonction du temps la perméabilité du poumon, ce qui indique des cellules épithéliales et / ou la dysfonction endothéliale d'arrêt (figure 2B).
= "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> La réponse fibrogène été mesurée en utilisant trichrome de Masson - un marqueur bien établi de la teneur totale en collagène 24. Poumons droite étaient tachés, et la superficie totale moyenne de coloration au trichrome par section de poumon droit a été quantifiée (figure 3A). Des sections représentatives montrent l'épaississement de traitement dépendant résultant de l'interstitium pulmonaire et une augmentation des lésions de fibrose (figure 3B).
Figure 1. Paramètres généraux pour la production d'une procédure de travail à bord. Les longueurs présentées indiquent les dimensions approximatives nécessaires pour la création d'un appareil de travail de la procédure. Dans ces expériences, la norme tôle d'aluminium a été découpé aux dimensions appropriées, puis renforcé avec un support en "T".ftp_upload / 53771 / 53771fig1large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. perte de poids et le dysfonctionnement de la barrière après l'administration de la bléomycine. Les souris ont été administrés par 2,0 U / kg de BLM ou un volume égal de PBS. Perte (A) de poids exprimée en pourcentage de poids jour 0 (BLM: n = 21; PBS: 5). (B) Les souris ont été sacrifiées à 4 ou 10 jours après l'exposition, et des protéines IgM dans le BAL de poumons récoltées a été mesurée par ELISA. (PBS: n = 5; 4 jours: n = 3; jour 10: n = 5). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. * P <0,05 par rapport au témoin PBS. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. La fibrose pulmonaire après l'administration de la bléomycine. (A) de collagène total, quantifiés que trichrome coloration de totale pli changement Masson de contrôles WT. (B) des images représentatives de trichrome sections pulmonaires colorées prises au grossissement de 5x. contrôle PBS est constitué d'animaux prises entre 5 et 14 jours de traitement post-PBS (PBS: n = 5; jour 10: n = 5; jour 17: n = 3). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. * P <0,05 par rapport au témoin PBS. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Dans les cas où aérosol est impossible, en raison de la disponibilité limitée de réactifs, de la sécurité, ou le coût, l'administration de la trachée directe est une méthode supérieure pour l'administration d'agents exogènes dans les poumons 16 transtrachéale instillation a été largement utilisé à cette fin.; Cependant, comme pour toute intervention chirurgicale, il porte aussi en elle le risque de complications causées par la procédure elle-même, et pas nécessairement l'agent étant inculqué. 13 Pour ces raisons, il est devenu de plus en plus courant d'administrer une substance directement dans la trachée par intubation 16,17,18,19,20. Cependant, ces méthodes souffrent aussi de limitations, y compris des périodes prolongées de récupération en raison de l'utilisation de sédatifs puissants comme la kétamine / xylazine, l'incertitude concernant le placement du cathéter (ie., Dans l'œsophage et pas la trachée), la manipulation inutile des tissus la cavité buccale, et le coût associéà l'achat d'instruments spécialisés tels que otoscopes / laryngoscopes.
Une fois établie, l'approche décrite ici offre plusieurs avantages significatifs par rapport aux autres protocoles d'intubation. D'une part, l'utilisation de l'isoflurane permet une réduction de la durée totale dépensée par souris. Cela est principalement dû à la réduction du temps nécessaire pour les animaux reprendre conscience suite à la sédation isoflurane par rapport aux substances réglementées comme la kétamine (environ 5 min par rapport à parfois plus de 3 heures). 14 En outre, le spiromètre fortune assure la confiance de succès en permettant le chercheur de visualiser la bulle oscillante PBS, ce qui indique le positionnement correct de la substance administrée à la fois avant et après l'instillation. Enfin, en utilisant une source de lumière externe au lieu d'un otoscope volumineux ou laryngoscope et le fil de guidage, le chercheur est en mesure de réduire la quantité de matériel à la main, tout en améliorant leur point de vue of la cavité buccale et à réduire les risques d'endommager les tissus mous entourant la trachée.
préoccupations spécifiques liés à ce protocole sont rares, mais graves. Par exemple, tandis que l'utilisation de l'isoflurane réduit le temps associé à l'induction et la récupération de la sédation, il faut aussi l'observation rigoureuse de l'état de sédation de l'animal. Ne pas retirer l'animal de la chambre isoflurane en temps opportun peut entraîner la mort, surtout chez les animaux récupérer déjà d'une intervention précédente. A l'inverse, la posologie insuffisante et isoflurane fois procéduraux étendus peuvent entraîner chez l'animal repris conscience au cours de la procédure elle-même, qui peut également entraîner des blessures. Par conséquent, il est essentiel à la fois pour la sécurité de l'animal et l'intégrité de l'expérience que l'animal soit renvoyé à la chambre isoflurane dès les premiers signes de la conscience. Puisque cela peut être commun lors de l'apprentissage de cette méthode, il est recommandé que, danschercheurs expérimentés confirment administration réussie de chaque animal avant anesthésier la prochaine. En outre, les chercheurs ayant des difficultés peuvent également choisir de prolonger l'exposition isoflurane pour augmenter le temps de procédure disponibles, à condition qu'ils suivent de près les animaux pour les moribonds.
Un problème supplémentaire de ce procédé est que des dommages liés à la manipulation. Ceci est particulièrement vrai lors de trois étapes: lors du retrait de la languette de la bouche, lors de l'insertion du cathéter, et quand déloger les seringues du moyeu après le traitement. La pose du cathéter est de loin le plus dangereux de ces étapes. Fait important, le cathéter ne doit pas entrer dans la cavité orale jusqu'à ce que la vue de la trachée est idéal. Si la trachée ne peut pas être mis en vue par la manipulation soit la source de lumière ou l'abaisse, le chercheur doit libérer la langue et retenter la procédure. La manipulation des tissus mous qui entourent la trachée is pas nécessaire ou recommandé. Cependant, une fois le cathéter a été correctement placé, des précautions doivent également être prises pour empêcher le moyeu d'avancer trop loin dans la trachée et les bronches perforer la tige principale. Cela peut généralement être évitée en faisant en sorte que le cathéter est seulement faiblement attaché au corps de seringue, et par serrage de la main qui contient le cathéter contre le bord de la procédure de sorte qu'elle reste statique. Ces nuances, avec le besoin de rapidité et de précision, mettent en évidence l'importance de la préparation et de la pratique dans le perfectionnement de cette procédure. Néanmoins, avec la formation, il devrait être possible pour un chercheur novice à traiter 20 animaux ou plus au cours d'une heure, et pour les chercheurs expérimentés pour compléter deux fois plus nombreux ou plus.
La cohérence conférée par le dépôt de la trachée directe en a fait une voie d'administration préférée au cours des dernières années. En fait, des méthodes similaires ont déjà été rapportés pour une multitude de compagnon disparatesRials de cette façon 19,25. Conformément à ces protocoles, la livraison de la bléomycine de la manière décrite ici conduit à une réponse fibrotique puissant dans les deux poumons, et dans tous les lobes, ce qui suggère un niveau similaire de la profondeur et l'uniformité de la distribution. Sur cette base, il est probable que ce protocole offre des avantages expérimentales comparables pour une série d'autres matériaux qui dépendent de contact pour régler leurs effets (par exemple., Des produits pharmaceutiques, des anticorps, des agents bactériens, et dans les systèmes de modification des protéines in vivo tels que des vecteurs lentiviraux) , et que, comme la bléomycine, il permettrait à ces expériences pour être effectuées avec confiance, peu de frais, et les soins post-opératoires minimes.
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Acknowledgments
Les auteurs remercient Brian Johnson de l'histologie et Imaging Core à l'Université de Washington de l'aide pour la coloration et l'analyse trichrome. Ce travail a été soutenu par le NIH subventions HL098067 et HL089455.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bleomycin For Injection, 30 units/vial | APP Pharmaceuticals, LLC | 103720 | For best results, BLM should be suspended in PBS, aliquoted, and stored as single use lyophilzed aliquots |
| Blunt End Forceps | |||
| Tongue Depressor (i.e. bent Valleylab Blade Electrode, 2.4") | Covidien | E1551G | Before use, create a 45 degree bend 1.5 cm from the blade tip. A suitable depressor can also be created from any metal implement of similar dimensions. |
| Exel Safelet Catheter 22G X 1" | Exel International | 26746 | |
| 1 ml Slip-tip Disposable Tuberculin Syringe (200/sp, 1600/ca) | BD | 309659 | |
| 0.2 ml Pipettor and Filter Tips | |||
| Fiber-Lite Illuminator. Model 181-1: Model 180 mated with Standard Dual Gooseneck illuminator | Dolan Jenner Industries, Inc. | 181-1 | Lower output LED illuminators are not recommended as they fail to suficiently illuminate the trachea. |
| Intubation Board | See Diagram 1. | ||
| Colored Label Tape: 0.5 in. Wide | Fisherbrand | 15-901-15A | |
| Oxygen | |||
| Phosphate-Buffered Saline, 1X | Corning | 21-040-CV | Product should be sterile |
| Non-Sterile Silk Black Braided Suture Spool, 91.4 m, Size 4-0 | Harvard Apparatus | 517698 | |
| Table Top Anesthesia Machine Isoflurane | Highland Medical Equipment | http://www.highlandmedical.net/ | |
| Slide Top Induction Mouse Isoflurane Chamber | MIP / Anesthesia Technologies | AS-01-0530-SM | |
| FORANE (isoflurane, USP) Liquid For Inhalation 100 mL | Baxter | 1001936040 | |
| Nanozoomer Digital Pathology system | Hamamatsu | ||
| IgM ELISA Quantification Kit | Bethyl Laboratories | E90-101 |
References
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