Summary
Dieser Artikel stellt eine schnelle und einfache Methode zur Bleomycin direkt in die Luftröhre Maus über Intubation verabreicht wird. Die wichtigsten Vorteile dieser Methode sind, dass sie in hohem Maße reproduzierbar, leicht zu beherrschen ist, und nicht spezialisierte Ausrüstung oder langwierige Wiederherstellungszeiten erfordern.
Introduction
Trotz einiger anatomischen und physiologischen Unterschiede, ein Mausmodell weiterhin für die Modellierung menschlichen Biologie und Pathogenese der Erkrankung. 2 von einer Haltung Standpunkt, Mäuse sind leicht zu handhaben, haben eine geringe Brutzeit, eine beschleunigte Lebensdauer und sind relativ preiswert von unschätzbarem Wert sein unterzubringen. Mit der Entwicklung der verschiedenen genetischen Stämme und Strategien (z. B. bedingte Knock-outs, Reporter Mäusen Abstammung-Tracing-Ansätze, etc.), sowie die große Auswahl an erhältlichen Reagenzien (z. B. Antikörper, rekombinante Proteine, Inhibitoren, etc.), Mäuse sind zu einem wesentlichen Modell wirbel~~POS=TRUNC-Organismus aufzudecken menschliche Homöostase und Krankheitsprozesse geworden. 3
Mäuse haben besonders wertvoll gewesen Lungenstudienbedingungen, einschließlich akutem Lungenversagen (ALI) und Lungenfibrose. 4 ALI beim Menschen können durch ein Trauma, Verletzungen hervorgerufen werden, oder Sepsis und wird von epithelialen gekennzeichnet undendothelialen Leck (dh., Ödem), Entzündung und werdende Fibrose. Bei vielen Patienten schreitet ALI seiner schweren Form, akutem Atemnotsyndrom (ARDS), die oft in Fibrose und Tod durch Atemstillstand führt. 5,6 Lungenfibrose eine progressive, fatale Pathologie ist durch das überschüssige Ablagerung von extrazellulärer Matrix gekennzeichnet geben, vor allem I-Kollagen, was zu einer Beeinträchtigung der Lungenfunktion. 7,8 Verabreichung von Bleomycin (BLM) ist die am weitesten verbreitete und am besten charakterisierte Modell zur Induktion ALI und Fibrose bei Versuchstieren. 9 Obwohl Lungenfibrose bei Nagetieren-BLM induziert tut rekapitulieren nicht vollständig die menschlichen fibrotische Phänotypen, 10 Maus-Studien mit diesem Modell zur Entdeckung von vielen wichtigen Faktoren geführt haben das Auftreten und Fortschreiten der Erkrankung zu beeinflussen. 11
Während der genaue Mechanismus (n) hinter BLM-induzierte Fibrogenese unbekannt sind, das auslösende Verletzungvermutlich aus Kontakt-abhängigen DNA-Strangbrüche in den Epithelzellen entstehen die leitenden Atemwege und Lungenbläschen auskleiden, und insbesondere, Typ-1-Pneumozyten. 12 Die Notwendigkeit für den direkten Kontakt zwischen BLM und die Lungen Epithel unterstreicht die Bedeutung eines robusten Lieferroute und diese Bedenken sind auch für eine breite Palette an Anwendungen auf die Atemwege distal ausgerichtet, einschließlich rekombinanter Proteine, Antikörper, siRNA, Viren, Bakterien, Teilchen und mehr relevant. Oropharyngealen Aspiration (OPA) wurde zu diesem Zweck 13, aber ein Haupt Ein Nachteil OPA ist, dass ein Teil der Mittel kann geliefert werden Verschlucken in den Magen-Darm-Trakt, was zu Ungenauigkeiten in der verabreichten Dosis eingesetzt. Eine andere verbreitete Ansatz ist transtracheal Einträufeln, die die Luftröhre und die Applikation von einem Agenten aufzudecken direkt in die Atemwege Tracheotomie unter starker Betäubung beinhaltet. 14 Aber nicht nur kann soeine Prozedur aufgrund seiner Invasivität unerwünscht sein, aber es ist auch zeitaufwendig und erfordert ein gutes Stück der Ausbildung, und verursacht eine starke Schädigung der Atemwege. 15,16 verschiedene Protokolle, die die direkte Verabreichung von Wirkstoffen in die entwickelt wurden, umfassen Luftröhre ohne die Notwendigkeit für einen chirurgischen Eingriff, 16,17,18,19,20 aber diese Verfahren erweitert Erholungszeiten von mächtigen Anästhetika verursacht beinhalten, die Verwendung von teuren Geräten (dh., Otoskop / Laryngoskop, im Handel erhältliche Verfahren Platten, Glasfaser Drähte, etc.), ein Überschuß der Manipulation in der Mundhöhle, und der Unsicherheit in Bezug auf die Dosierung.
Dieses Papier beschreibt eine relativ einfache Methode zur Verabreichung über Intubation, die ein Forscher, preiswert, schnell ermöglicht und zuverlässig ein Reagens in die Mäuselunge mit begrenztem Risiko von Rest Schäden an den umgebenden Gewebe vermitteln.
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Protocol
Die Institutional Animal Care und Verwenden Komitees (IACUC) an der University of Washington und Cedars-Sinai Medical Center haben das Tier Arbeit notwendig für diese Studien zugelassen.
1. Vorbereitung
- Sterilisieren sowohl dem stumpfen Ende einer Pinzette und den Niederhalter über Autoklaven.
- Mit einem biologischen Sicherheitsschrank, bereiten eine Arbeits Lager von BLM in PBS aus dem gefriergetrocknetes Pulver. Beschallen die Lösung für 10 min bei 35 kHz auch sicherzustellen Mischen.
Hinweis: Ein Gesamtvolumen von 30 bis 45 & mgr; l wird empfohlen Pipettieren Variation am unteren Ende zu verhindern, und Erstickung mit größeren Volumina. - Bereiten einer sauberen Arbeitsbereich, der sich etwa 1 m 2 für das Verfahren umfasst, sowie vorgesehenen Stellen für Käfige vor und nach dem Eingriff.
- Befestigen Sie die Basis des Verfahrens Bord der Bank unmittelbar vor dem Forscher durch Verlegung 2 oder 3 Streifen von Labor Band über der Basis und underlying Bank. Siehe Abbildung 1 für weitere Angaben auf ein Brett zu schaffen.
- Binden Sie eine Einzellänge von Größe 4,0 Faden zwischen den beiden Stellschrauben des Verfahrens Bord.
- Generieren Sie einen provisorischen Spirometer durch Entfernen und Verwerfen des Kolbens von drei 1 ml Spritzen und Ablegen 60 ul PBS in der Spitze jedes Fass eine luftdichte Abdichtung zu bilden. Sichern Sie die Nabe des Katheters lose an einer der Spritzen und legen Sie es auf der einen Seite der Platine.
- Saugen Sie 300 ul von Luft in einer 1-ml-Spritze und legen Sie es auf der einen Seite der Platine.
- Schneiden Sie ein zusätzliches Stück Band ca. 6 cm in der Länge und zur Seite legen. Diese werden verwendet, um das Tier zu dem Brett in Schritt 2.4 zu sichern.
- Stellen Sie eine Isofluran Kammer auf. Bringen O 2, Isofluran und Vakuum an die entsprechenden Anschlüsse sowohl auf der Belichtungskammer und der Frei Vakuum. Alternativ verwalten Betäubung in eine Isofluran-kompatibel biologischenSicherheitswerkbank.
2. Intubation
- Betäuben die Maus mit Isofluran in der Kammer, bis er das Bewusstsein verliert und die Atmung verlangsamt zu einer angemessenen Geschwindigkeit. Eine typische Belichtung enthält 4% Isofluran und 2% O 2 für 3 bis 4 min, und das ideale Ergebnis ist 2 bis 2,5 min der Sedierung. Dies entspricht einer Atemfrequenz von 1 Luft alle 2 sec.
- Während des Wartens auf Sedierung in zu setzen, aspirieren zwischen 30 und 45 & mgr; l der BLM in eine Pipette und zur Seite legen.
- Wenn Sie bereit sind, unterbrechen die sediert Maus mit seinem oberen Schneidezähne aus der zu den Stellschrauben des Verfahrens Plattform befestigt Faden. Stellen Sie sicher, dass das Tier die Rücken liegt flach auf der Plattformoberfläche.
- Man aufpassen, nicht Lüftung zu beschränken, legen Sie ein Stück Klebeband lose über die untere (kaudale) Teil der Brusthöhle, direkt über der Membran. Eine Platzierung sollte fest genug sein, die richtige Ausrichtung während der Prozedur zu haltenEDURE, aber nicht so eng, daß sie die Atmung einschränkt.
- Schalten Sie den Illuminator auf zwischen 80% und 100% Intensität und orientieren den Schwanenhals, so dass es 1 bis 2 cm von der Oberfläche der Haut ist in der Nähe des Sonnengeflecht. Überprüfen Sie regelmäßig die Spitze der Schwanenhals für Wärme, um sicherzustellen, dass es nicht die Maus nicht verletzen.
- Hinter der Plattform mit Hilfe der sterilen, stumpfen Ende Zange die Zunge zu lokalisieren. Wobei darauf geachtet, die unteren Schneidezähne, sanft Griff und ziehen die Zunge in der Mundhöhle zu vermeiden.
- Mit dem restlichen Hand, legen Sie die Niederhalter und es verwenden, um die Zunge gegen den Boden der Mundhöhle zu glätten. Lassen Sie die Zange, aber die Niederhalter an Ort und Stelle für die nächsten beiden Schritte lassen.
- Richten Sie das Licht, so dass die Luftröhre durch die Führung des Schwanenhals proximal von der Höhe des Solarplexus sichtbar ist, bis sie das Niveau des Hauptbronchus Bronchien erreicht.
Anmerkung: Die Luftröhre kann durch die Wirkung der Atmung leicht unterschieden werden, WHIch bewirkt, dass das emittierte Licht in Intensität schwankt. Wenn richtig positioniert, wird diese Struktur in der axialen Ebene als einer zentral angeordneten Stift von Licht mit minimaler Umgebungslicht in der Mundhöhle selbst erkennbar sein. - Winkeln Sie die Spritze so, dass sie den natürlichen Weg der Luftröhre folgt, und die 22-G Katheterspitze senken, mit dem angebrachten Spritze das Tröpfchen, gerade in das Lumen enthält. Die PBS-Blase beginnt mit jedem Atemzug bei erfolgreicher Platzierung zu steigen und fallen.
Hinweis: Diese Aktion kann durch mehrere Sekunden infolge der tiefen Sedierung verzögert werden. - Führen Sie den Katheter in einem zusätzlichen 5 mm. Entfernen Sie den Spatel.
- Schieben Sie die Spritze mit der anderen Hand, und Greifen der Nabe, sanft gegen die Spritze entfernen.
- Ablagerung zwischen 30 und 45 & mgr; l von BLM in der Mitte des Inneren des Katheteransatzes, der zweite Spritze befestigen und 300 & mgr; l von Luft in der Nabe verzichtet werden.
- Setzen Sie die zweiteSpritze mit dem zunächst die Blase PBS mit. Die Blase wird weiter steigen und fallen, wenn das Verfahren erfolgreich durchgeführt worden ist.
3. Post-Verfahrenspflege
- Entfernen Sie den Katheter und Band, und legen Sie das Tier in einem trockenen warmen Ort, bis er das Bewusstsein wiedererlangt - in der Regel innerhalb von ein paar Minuten.
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Representative Results
Intubierten Mäusen wurden täglich auf Gewichtsverlust und Not überwacht und getötet, 4, 10 oder 17 Tage später durch eine intraperitoneale Injektion von 2,5% 2,2,2-Tribromethanol. Bronchoalveoläre Lavage (BAL) wurde in drei Waschungen mit PBS gesammelt, wie an anderer Stelle beschrieben 21 und die rechte Lunge wurde in 10% Formalin, Paraffin eingebettet und gefärbt mit Masson Trichrom der von der University of Washington Histology and Imaging Kern 22 fixiert.
Im Einklang mit den festgelegten Daten,-BLM behandelten Mäusen Spitzengewichtsverlust zwischen den Tagen erfahren 7 und 10 nach der Belichtung 23 (2A). Darüber hinaus zeigte erhöhte Spiegel von IgM in BAL von geopfert BLM-behandelten Mäusen eine signifikante, zeitabhängige Zunahme in Lungen-Durchlässigkeit, was auf Epithel- und / oder Endothelzellen Barriere Dysfunktion (2B).
= "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> Die fibrogen Reaktion wurde mit Masson-Trichrom-Färbung gemessen - ein gut etabliertes Markierung des gesamten Kollagengehalt 24. Rechts Lungen wurden gefärbt, und die durchschnittliche Fläche von Trichromfärbung pro rechten Lunge Abschnitt wurde quantifiziert (3A). Repräsentative Abschnitte zeigen die resultierende Behandlung abhängige Verdickung der Lungeninterstitium und steigt bei fibrotischen Läsionen (3B).
Abbildung 1. Allgemeine Parameter für ein funktionierendes Verfahren Bord zu erzeugen. Die Längen dargestellt zeigen die ungefähren Abmessungen, die für eine funktionierende Verfahren Apparat zu schaffen. In diesen Experimenten wurde Standard-Aluminium-Blech an die richtigen Abmessungen geschnitten, dann mit einem "T" Klammer verstärkt.ftp_upload / 53771 / 53771fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Gewichtsverlust und Barrierefunktionsstörungen nach der Verabreichung von Bleomycin. Die Mäuse wurden 2,0 U / kg von BLM oder einem gleichen Volumen von PBS verabreicht. (A) Gewichtsverlust, ausgedrückt als Prozentsatz der Tag 0 Gewicht (BLM: n = 21; PBS: 5). (B) Die Mäuse wurden bei 4 oder 10 Tage nach der Exposition getötet und IgM-Protein in BAL von geerntet Lunge wurde mittels ELISA gemessen. (PBS: n = 5; Tag 4: n = 3; Tag 10: n = 5). Die Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. 0,05 * P <im Vergleich zu PBS-Kontrolle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Lungenfibrose nach der Verabreichung von Bleomycin. (A) Gesamt Kollagen, quantifiziert als Gesamt fache Änderung Masson Trichrom-Färbung von WT Kontrollen. (B) Repräsentative Bilder von dreifarbig gefärbten Lungenschnitten bei 5-facher Vergrößerung gemacht. PBS-Kontrolle besteht der Tiere zwischen 5 und 14 Tage nach der PBS-Behandlung (PBS: n = 5; Tag 10: n = 5; Tag 17: n = 3). Die Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. 0,05 * P <im Vergleich zu PBS-Kontrolle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
In Fällen, in denen Aerosolisierung aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit Reagenz unpraktisch ist, Sicherheit oder Kosten, ist direkte tracheale Verabreichung eine überlegene Methode zur Abgabe von exogenen Mitteln in die Lungen 16 Transtracheale Instillation diese weit verbreitet zu bewerkstelligen ist. Jedoch, wie bei allen chirurgischen Eingriff, es führt auch damit das Potential für durch das Verfahren verursachten Komplikationen selbst und nicht notwendigerweise das Mittel eingeflößt wurde. 13 Aus diesen Gründen wurde es zunehmend üblich, eine Substanz direkt in die Luftröhre über Intubation 16,17,18,19,20 zu verabreichen. Jedoch leiden diese Methoden auch von Einschränkungen, einschließlich verlängert Wiederherstellungszeiten durch den Einsatz von leistungsfähigen Beruhigungsmittel wie Ketamin / Xylazin, Unsicherheit in Bezug auf die Platzierung des Katheters (dh., In die Speiseröhre und nicht die Luftröhre), unnötige Manipulation von Geweben in die Mundhöhle, und die Kosten verbundenmit dem Kauf spezialisierte Instrumente wie Otoskopen / Laryngoskopen.
Einmal eingerichtet, skizziert der Ansatz hier bietet mehrere sinnvolle Vorteile gegenüber anderen Intubation Protokolle. Zum einen ermöglicht die Verwendung von Isofluran zu einer Verringerung der Gesamtzeit pro Maus aufgewendet. Dies ist auf die reduzierte Zeit in erster Linie ist für die Tiere benötigt Bewusstsein folgende Isofluran Sedierung wie Ketamin im Vergleich zu geregelten Stoffe zurückzugewinnen (ca. 5 min gegenüber manchmal mehr als 3 h). 14 Darüber hinaus gewährleistet die provisorischen Spirometer Vertrauen der Erfolg durch den Forscher ermöglichen die schwingende PBS Blase, die korrekte Platzierung der verabreichten Substanz anzeigt, sowohl vor als auch nach dem Eintropfen zu visualisieren. Schließlich wird durch eine externe Lichtquelle anstelle eines sperrigen Otoskop oder Kehlkopfspiegel und Führungsdraht verwendet wird, ist der Forscher der Lage, die Menge an Ausrüstung in ihren Händen zu reduzieren, während gleichzeitig ihre Sicht o Verbesserungf der Mundhöhle und reduziert ihre Chancen auf die Weichteile Beschädigung der Luftröhre umgibt.
Besondere Bedenken mit diesem Protokoll verbunden sind wenige, aber ernst. Zum Beispiel, während die Verwendung von Isofluran die Zeit mit Ein- und Ausleitung von Sedierung reduziert, es erfordert auch strenge Beobachtung der Sedierung Zustand des Tieres. Wird das Tier aus der Isofluran Kammer in einer angemessenen Art und Weise zu entfernen, kann zum Tod führen, vor allem bei Tieren bereits von einem vorherigen Eingriff erholen. Umgekehrt unzureichend Isofluran Dosierung und verlängert Verfahrenszeiten können in das Tier, ergeben Bewusstsein während des Verfahrens selbst zurückzugewinnen, die ebenfalls zu Verletzungen führen kann. Daher ist es zwingend erforderlich, sowohl für die Sicherheit des Tieres und der Integrität des Experiments, dass das Tier in die Kammer Isofluran bei den ersten Anzeichen von Bewusstsein zurückgeführt werden. Da dies gemeinsam sein kann, wenn diese Methode zu lernen, empfiehlt es sich, dass inerfahrene Forscher bestätigen erfolgreiche Verwaltung eines jeden Tieres, bevor der nächste Betäubung. Darüber hinaus wählen können die Forscher Schwierigkeiten haben auch die Isofluran-Exposition zu erweitern die verfügbare Verfahrenszeit zu erhöhen, sofern sie eng um die Tiere für einen Sterbe überwachen.
Eine weitere Sorge bei diesem Verfahren ist, daß bei Handhabung verbunden Beschädigungen. Dies ist besonders wahrscheinlich während drei Schritten: wenn die Zunge aus dem Mund zu entfernen, wenn der Katheter eingefügt, und wenn die Spritzen von der Nabe nach der Behandlung verdrängen. Die Katheterplatzierung ist bei weitem die meisten gefährlichen dieser Schritte. Wichtig ist, geben Sie die Katheter sollte nicht die Mundhöhle, bis der Blick auf die Luftröhre ist ideal. Wenn die Luftröhre nicht in Sicht durch Manipulation entweder der Lichtquelle oder der Niederhalter gebracht werden kann, sollte der Forscher die Zunge freizugeben, und das Verfahren erneut versuchen. Manipulation der Weichteile in die Luftröhre i umgebendenist nicht notwendig oder empfehlenswert. Allerdings, wenn der Katheter richtig platziert wurde, Pflege sollten auch die Nabe zu halten genommen werden zu weit in die Luftröhre aus fort und Perforieren der Hauptstamm Bronchien. Dies kann im Allgemeinen vermieden werden, indem sichergestellt wird, daß der Katheter nur lose an dem Spritzenzylinder befestigt ist, und durch die Hand Verspannen des Katheters gegen die Verfahrensplatte enthält, so daß es statisch bleibt. Diese Nuancen, zusammen mit dem Bedürfnis nach Aktualität und Präzision, unterstreichen die Bedeutung der Vorbereitung und Praxis in diesem Verfahren zu perfektionieren. Dennoch mit Ausbildung sollte es möglich sein, für einen Anfänger Forscher 20 zu behandeln oder mehrere Tiere im Laufe von einer Stunde, und für erfahrene Forscher doppelt so viele oder mehr abzuschließen.
Die Konsistenz durch direkte Luftröhrenablagerungs verliehen hat es eine bevorzugte Art der Verabreichung in den letzten Jahren. In der Tat haben ähnliche Verfahren bereits für eine Vielzahl von unterschiedlichen Kollegen berichtetRials auf diese Weise 19,25. In Übereinstimmung mit solchen Protokollen, Lieferung von Bleomycin in der beschriebenen Weise hier ergab sich eine starke fibrotische Reaktion in beiden Lungen, und in allen Lappen, ein ähnliches Niveau der Tiefe und Einheitlichkeit in Verteilung hindeutet. Auf dieser Grundlage ist es wahrscheinlich, dass dieses Protokoll vergleichbaren experimentellen Vorteile für eine Reihe anderer Materialien bereitstellt, die bei Kontakt angewiesen, um ihre Effekte zu vermitteln (z. B. Pharmazeutika, Antikörper, bakterielle Mittel, und in vivo Proteinmodifikation Systeme wie lentivirale Vektoren) und dass, wie Bleomycin, würde es solche Experimente erlauben, auch mit Vertrauen, wenig Aufwand und minimale post-operative Betreuung durchgeführt werden.
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Acknowledgments
Die Autoren danken Brian Johnson von der Histologie und Imaging-Core an der Universität von Washington für die Hilfe bei der Trichrom-Färbung und Analyse. Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse HL098067 und HL089455 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bleomycin For Injection, 30 units/vial | APP Pharmaceuticals, LLC | 103720 | For best results, BLM should be suspended in PBS, aliquoted, and stored as single use lyophilzed aliquots |
| Blunt End Forceps | |||
| Tongue Depressor (i.e. bent Valleylab Blade Electrode, 2.4") | Covidien | E1551G | Before use, create a 45 degree bend 1.5 cm from the blade tip. A suitable depressor can also be created from any metal implement of similar dimensions. |
| Exel Safelet Catheter 22G X 1" | Exel International | 26746 | |
| 1 ml Slip-tip Disposable Tuberculin Syringe (200/sp, 1600/ca) | BD | 309659 | |
| 0.2 ml Pipettor and Filter Tips | |||
| Fiber-Lite Illuminator. Model 181-1: Model 180 mated with Standard Dual Gooseneck illuminator | Dolan Jenner Industries, Inc. | 181-1 | Lower output LED illuminators are not recommended as they fail to suficiently illuminate the trachea. |
| Intubation Board | See Diagram 1. | ||
| Colored Label Tape: 0.5 in. Wide | Fisherbrand | 15-901-15A | |
| Oxygen | |||
| Phosphate-Buffered Saline, 1X | Corning | 21-040-CV | Product should be sterile |
| Non-Sterile Silk Black Braided Suture Spool, 91.4 m, Size 4-0 | Harvard Apparatus | 517698 | |
| Table Top Anesthesia Machine Isoflurane | Highland Medical Equipment | http://www.highlandmedical.net/ | |
| Slide Top Induction Mouse Isoflurane Chamber | MIP / Anesthesia Technologies | AS-01-0530-SM | |
| FORANE (isoflurane, USP) Liquid For Inhalation 100 mL | Baxter | 1001936040 | |
| Nanozoomer Digital Pathology system | Hamamatsu | ||
| IgM ELISA Quantification Kit | Bethyl Laboratories | E90-101 |
References
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