Summary
이 문서에서는 삽관을 통해 마우스 기관에 직접 블레오 마이신 관리를위한 신속하고 간단한 방법을 제공합니다. 이러한 방법의 주요 장점은 마스터 높은 재현성 쉽고, 특수 장비 나 긴 회복 시간을 요구하지 않는다는 점이다.
Introduction
일부 해부학 적 생리 학적 차이에도 불구하고, 1 뮤린 모델 사육 관점에서 인간 생물학 및 질환 발병. 2 모델링 헤아릴 수, 마우스, 취급하기 쉬운 낮은 사육 시간 가속 수명을 가지며, 상대적으로 저렴 계속 집입니다. 다양한 유전자 변형 전략 (예., 조건부 녹아웃 리포터 마우스 계통 추적 방법 등)뿐만 아니라, 가능한 시약의 다양한 (예., 항체, 재조합 단백질 억제제의 개발과 함께, 등), 마우스는 인간의 질병 및 항상성 과정을 밝히기 위해서 필수적인 모델 척추 생물되었다. (3)
마우스는 인간의 4 ALI는 외상, 부상 또는 패혈증으로 인해 발생할 수 있습니다. 급성 폐 손상 (ALI) 및 폐 섬유증을 포함한 폐 조건을 공부에 특히 유용되었습니다 상피을 특징으로하고내피 누출 (예., 부종), 염증 및 초기 섬유화. 많은 환자에서 ALI 종종 인한 호흡 부전으로 사망 섬유증 결과의 중증 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)으로 진행한다. 5,6- 폐 섬유증은 세포 외 기질의 과잉 증착 특징 진보적 인 심각한 병리학 , 특히. 나는 장애인 폐 기능을 선도, 콜라겐 블레오 마이신 (BLM)의 7,8 관리를 입력 한 실험 동물에 ALI 및 섬유화를 유도하기 위해 가장 널리 사용되는 최고의 특성화 된 모델입니다. (9) 설치류에 폐 섬유증을 BLM 유발하지만 않습니다 완전히 인간의 섬유 성 표현형은,이 모델 (10) 마우스 연구는 발병과 질병의 진행에 영향을 미치는 여러 중요한 요인의 발견을 주도 요점을 되풀이하지. (11)
BLM 유도 섬유화 뒤에 정확한 메커니즘 (들)를 알 수 있지만, 개시 부상전도기도 및 폐포, 특히 제 1 형 pneumocytes 라이닝 상피 세포의 접촉에 의존하는 DNA 가닥 나누기에서 발생하는 것으로 생각된다. (12) BLM과 폐 상피 세포 사이의 직접 접촉에 대한 필요성은 강력한 전달 경로의 중요성을 강조 그리고 이러한 우려는 재조합 단백질, 항체, siRNA를, 바이러스, 박테리아, 미립자 등을 포함한 말초기도를 대상으로 치료의 넓은 범위에 밀접한 있습니다. 인두 흡인 (OPA)는 이러한 목적 13 널리 사용되었지만, OPA의 주요 단점은 전달 제의 일부가되어 투여 용량으로 부정확 선도 위장관으로 삼킬 수 있다는 것이다. 널리 사용되는 또 다른 방법은 직접 호흡기에 제의 기관지 점적 및 노출 강한 마취 기관 절개술을 포함 transtracheal 점안이다. (14) 그러나, 그러한 수도절차 인해 invasivity에 바람직하지 않을 수 있지만, 또한, 시간 소모적 인 훈련 공정한 비트가 필요하며으로 제제의 직접 투여를 포함한다. 15,16 여러 프로토콜들이 개발되었다 호흡기 잠재적 손상을 일으키는 수술 개입 없이도기도가 16,17,18,19,20 그러나 이러한 방법은 확장 된 것을 포함 복구 시간 강력한 마취제로 인한 고가 장비의 사용 (예., 이경 / 후두경 시판 절차 보드, 광섬유 투여 량에 관한 와이어 등), 구강 조작 과량 불확실성.
이 논문은 연구자가 신속, 저렴하고 안정적으로 주변 조직에 잔류 손상의 제한으로 위험 쥐의 폐에 시약을 주입 할 수 있습니다 삽관을 통한 행정의 비교적 쉬운 방법을 설명합니다.
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Protocol
미국과 삼목 시나이 의료 센터의 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)는 이러한 연구에 필요한 동물 작업을 승인했다.
1. 준비
- 무딘 엔드 집게와 억압자를 통해 오토 클레이브를 모두 소독.
- 생물 안전 캐비닛을 사용하여 동결 건조 분말 PBS에서 BLM의 작업 주식을 준비합니다. 혼합조차 보장 35 kHz에서 10 분 동안 초음파 처리 용액.
참고 : μL (30) 사이에 45의 총 부피는 큰 볼륨과 피펫의 로우 엔드에 변화하고, 질식을 방지하는 것이 좋습니다. - 약 1 절차 자체에 대한 평방 미터뿐만 아니라 전 시술 후 모두 케이지에 대한 지정된 위치를 포함하는 깨끗한 작업 공간을 준비합니다.
- 베이스와 underl를 통해 실험실 테이프의 2 또는 3 스트립을 마련하여 즉시 연구원 앞의 벤치에 프로 시저 보드의 기본 수정벤치 잉. 보드를 만드는 방법에 대한 자세한 사양은 그림 1을 참조하십시오.
- 절차 기판의 두 개의 위치 사이의 나사 크기 4.0 봉합 실의 단일 길이 넥타이.
- 제거하고 1 ㎖의 세 주사기에서 플런저를 폐기하고, 기밀 밀봉을 형성하여 배럴의 상부에 PBS 60 μL를 증착함으로써 임시 폐활량계를 생성한다. 느슨하게 주사기 중 하나에 카테터의 허브를 안전하고 보드의 한쪽에 놓습니다.
- 1 ML의 주사기에 공기의 흡인 300 μL와 보드의 한쪽에 놓습니다.
- 한쪽으로 테이프 길이와 장소에 약 6 인치의 추가 조각을 잘라. 이 단계 2.4 보드 동물을 보호하는 데 사용된다.
- 이소 플루 란 실을 설정합니다. 노출 챔버와 통관 진공 모두에서 해당 포트에 O (2), 이소 플루 란, 진공을 연결합니다. 또는에서 마취를 관리 이소 플루 란 호환 생물학적안전 캐비닛.
2. 삽관
- 이 의식을 잃고 호흡이 적절한 속도로 감속 할 때까지 실에서 이소 플루 란과 마우스를 마취. 전형적인 노출 3-4 분 동안 4 % 이소 플루 란 2 % O 2를 포함하고, 최적의 결과는 마취 2-2.5 분이다. 이 한 숨을 2 초마다의 호흡 속도에 해당한다.
- 한쪽으로 피펫과 장소에 BLM 30, 45 μl의 사이에 설정하는 진정 작용, 흡인 기다리는 동안.
- 준비가되면, 절차 플랫폼의 위치에 장착 나사 스레드에서 상부 앞니에 의해 마우스를 진정 중단. 동물의 배부 플랫폼 표면에 평평하게 놓여 있는지 확인합니다.
- 환기를 제한하지 않도록주의이기 때문에, 그냥 진동판 위에 느슨하게 흉강의 하단 (꼬리) 부분에서 테이프의 조각을 놓습니다. 위치는 PROC 동안 적절한 정렬을 유지하기 위해 꽉 충분해야한다edure하지만 호흡을 제한 너무 꽉 없습니다.
- 80 % 내지 100 %의 강도로 조명을 켜고 명치 부근의 피부 표면 1~2cm,되도록 거위의 방향. 주기적으로 마우스를 손상하지 않도록 열을 위해 거위의 끝을 확인합니다.
- 플랫폼 뒤에 서, 혀의 위치를 살균, 무딘 엔드 집게를 사용합니다. 아래 앞니, 부드럽게 그립을 방지하고 구강 밖으로 혀를 그릴 조심.
- 나머지 손을 사용하여, 억압 물을 넣고 구강의 바닥에 평평하게 혀를 사용. 집게를 해제하지만 다음 두 단계를위한 장소에 억압자 둡니다.
- 기관지 그것이 mainstem 기관지의 수준에 도달 할 때까지 명치의 레벨로부터 근위 거위 안내하여 볼 수 있도록 빛의 방향.
주 : 기관지 용이 호흡 작용에 의해 구별 될 수 있으며, WHI채널은 강도가 변동하는 방출되는 빛을 발생합니다. 정확하게 위치 할 때,이 구조는 구강 자체 최소한의 주변 조명과 빛의 중앙에 위치한 핀과 같은 축 평면에서 식별 할 수 있습니다. - 각도가 직선 루멘, 액 적을 함유 연결된 주사기, 기관의 천연 경로를 따르며, 22-G 카테터 팁을 낮추도록 주사기. PBS 거품이 상승하고 성공적인 위치에 따라 각각의 호흡과 가을에 시작됩니다.
참고 :이 작업은 깊은 진정 작용의 결과로 몇 초 정도 지연 될 수 있습니다. - 추가 5mm에서 카테터 피드. 혀를 제거 억압자.
- 부드럽게 주사기를 제거, 반대 손으로 주사기를 이동하고, 허브를 파지.
- 카테터 허브의 내부의 중심으로 BLM 30 45 μL 사이 금고는 제 2 주사기를 연결하고 허브에 공기의 300 μL 분주.
- 두 번째 교체제 PBS의 기포를 함유하는 주사기. 거품 상승과 절차가 성공적으로 수행 된 경우 떨어질 것입니다.
3. 후 절차 케어
- 카테터 및 테이프를 제거하고 의식을 회복 할 때까지 건조 따뜻한 장소에서 동물을 배치 - 일반적으로 몇 분 내에.
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Representative Results
삽관 마우스는 체중 감소와 고통에 대해 매일 모니터링, 2.5 % 2,2,2- tribromoethanol의 복강 내 주사를 통해 4, 10 또는 제 17 일 후에 희생되었다. 기관지 폐포 세척액 (BAL)는 PBS 세 세척에 수집 된 21 곳 바와 같이 , 오른쪽 폐는 10 % 포르말린에 고정 된 파라핀, 워싱턴 조직학 및 이미징 코어 (22)의 대학에 의해 메이슨의 트리 크롬 염색 하였다.
구축 된 데이터에 아울러, BLM 처리 마우스 일 7 및 10 노광 후 23 (도 2a) 사이의 최대 체중 감소를 경험 하였다. 또한, 희생 BLM - 처리 된 마우스로부터 BAL에서의 IgM의 상승 된 수준은 상당한 시간 - 의존적 증가를 보여 폐 투과성 상피 및 / 또는 내피 기능 장애 배리어 (도 2B)를 나타내는.
= FO "jove_content"유지 - together.within 페이지 = "1"> 메이슨의 트리 크롬 염색하여 측정 하였다 폐의 섬유 응답 - 총 콜라겐 함량 (24)의 잘 확립 된 마커를. 오른쪽 폐는 염색, 오른쪽 폐 섹션 당 트리 크롬 염색의 평균 총 면적은 (그림 3A)를 정량 하였다. 대표 섹션은 섬유 성 병변 (그림 3B)에서 폐 간질과 증가의 결과로 치료에 의존 농축을 보여줍니다.
작업 절차 보드를 생산하는 그림 1. 일반 매개 변수. 제시 길이는 작업 절차 장치를 만드는 데 필요한 대략적인 크기를 나타냅니다. 이 실험에서, 표준 알루미늄 판금 후 적절한 사이즈로 절단 한 "T"로 보강 브라켓.ftp_upload / 53771 / 53771fig1large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 체중 감소 및 장벽 기능 장애 블레오 마이신의 투여. 마우스는 BLM 또는 PBS의 같은 부피의 2.0 U / kg을 투여 하였다. (A) 중량 손실은 0 일째 체중의 백분율로 표시 (BLM : N = 21; PBS : 5). (B) 마우스를 4 십일 노광 후 희생시키고, 수확 한 폐의 BAL에서의 IgM의 단백질을 ELISA로 측정 하였다. (PBS : N = 5; 4 일 : N = 3; 10 일 : N = 5). 데이터는 SEM ± 평균으로 표시하고 있습니다. * P <0.05 PBS 제어에 비교했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
블레오 마이신의 투여 그림 3. 폐 섬유증. WT 컨트롤에서 총 배 변경 메이슨의 트리 크롬 염색으로 정량화 (A) 총 콜라겐. (B) 5 배 배율에서 찍은 트리 크롬 스테인드 폐 부분의 대표 이미지. PBS 컨트롤은 5 14 일 사이 후 PBS 처리 촬영 동물 구성 (PBS를 : N = 5; 10 일 : N = 5; 일 17 : N = 3). 데이터는 SEM ± 평균으로 표시하고 있습니다. * P <0.05 PBS 제어에 비교했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
에어로졸 인해 제한 시약 가용성, 안전성, 또는 비용이 비현실적 경우에, 직접 기관 행정부는 폐에 외인성 에이전트의 전달을위한 우수한 방법이다 16 Transtracheal의 점안이 광범위하게이 작업을 수행하는 데 사용되었습니다.; 그러나, 모든 외과 적 개입, 그것은 또한 그것 절차 자체에 의한 합병증의 가능성을 수행하고, 반드시 제가 주입된다. (13) 이러한 이유로, 삽관 16,17,18,19,20 통해기도에 직접 약물을 투여하는 점차 일반화되고있다. 그러나, 이러한 방법은 확장 복구 케타민 / 자일 라진 같은 강력한 진정제의 사용으로 인해 시간, 불확실성 카테터의 위치에 대한 (즉., 식도로가 아닌 기관)에서 조직의 불필요한 조작을 포함, 제한 고통 구강 및 관련 비용이러한 검 이경 / 후두경 같은 전문 장비를 구입와.
설립되면, 여기에 설명 된 방법은 다른 삽관 프로토콜을 통해 몇 가지 의미있는 혜택을 제공한다. 우선, 이소 플루 란의 사용은 마우스 당 소요 된 총 시간의 감소를 허용한다. 이 케타민 등 규제 물질에 비해 이소 플루 란 진정 다음 의식을 회복 동물에 필요한 감소 된 시간에 주로 기인한다. (14) 또한 (때로는 더 시간 3 이상 대 약 5 분), 임시 변통 폐활량계는 연구원을 허용함으로써 성공의 신뢰를 보장 전 점안 후 모두 투여 물질의 정확한 위치를 나타내는 진동 PBS 거품을 시각화합니다. 마지막 대신 부피는 otoscope 또는 후두경의 가이드 와이어의 외부 광원을 이용하여, 연구자는 동시에 자신의 뷰 O를 향상시키면서, 손 장비의 양을 줄일 수있다구강 F 및 기관지 주변 연조직 손상들의 가능성을 감소시킨다.
이 프로토콜과 관련된 특정 문제 몇하지만 심각합니다. 이소 플루 란의 사용은 마취로부터 유도 및 복구와 연관된 시간을 단축하면서, 예를 들어, 또한 동물의 마취 상태의 정밀한 관찰이 필요하다. 적시에 이소 플루 란 챔버에서 동물을 제거하지 않으면, 특히 동물들이 이미 이전의 개입 복구에, 사망을 초래할 수 있습니다. 반대로, 불충분 한 이소 플루 란 용량 및 확장 절차 시간도 부상을 초래할 수있는 절차 자체 동안 의식을 회복 동물이 발생할 수 있습니다. 따라서, 동물의 안전과 동물 의식의 첫 징후에 이소 플루 란 실로 돌아 실험 무결성 모두 필수적이다. 이 방법을 배울 때이 공통 될 수 있기 때문에, 그것은에서하는 것이 좋습니다경험이 풍부한 연구자들은 다음을 마취하기 전에 각 동물의 성공적인 관리를 확인합니다. 또한, 난이도를 갖는 연구자들은 또한 밀접 사망 분석을 위해 동물을 모니터가 제공 가능한 절차 시간을 증가 이소 플루 노출 확장하도록 선택할 수있다.
이 방법의 또 다른 관심사는 취급과 관련된 손상이다. 이 세 단계 중 특히 가능성이 높습니다 : 카테터를 삽입 할 때, 입에서 혀를 제거 할 때, 치료 다음 허브에서 주사기를 빠지 때. 카테터의 위치는 지금까지 다음 단계의 가장 위험합니다. 기관의 전망이 적합 할 때까지 중요한 카테터는 구강를 입력하지 않아야합니다. 기관이 광원 또는 억압 물 중의 조작을 통해 볼 반입 할 수없는 경우, 연구자는 텅을 해제하는 절차를 다시 시도한다. 기관의 난을 둘러싸는 연조직의 조작필요하거나 권장 아니다. 카테터가 제대로 배치 된 후 그러나 치료는 너무 멀리 기관으로 발전하고 주 줄기 기관지를 관통에서 허브를 유지하기 위해주의해야한다. 이것은 일반적으로, 그것이 고정 유지되도록 절차 기판에 대해 카테터를 포함하는 손을 보강하여 카테터 느슨하게 주사기 배럴에 부착하도록함으로써 회피 할 수있다. 이러한 뉘앙스 함께 적시성과 정확성에 대한 필요성과 함께,이 절차를 완성에서 준비와 연습의 중요성을 강조 표시합니다. 초보자 연구자가 시간에 걸쳐 20 이상 동물을 치료하기위한, 경험이 풍부한 연구자 두 배 이상을 완료 할 그럼에도 훈련하는 것이 가능해야한다.
직접적인 기관 증착에 의해 부여 된 일관성은 최근의 바람직한 투여 경로했다. 사실, 유사한 방법이 이미 다른 메이트 다수보고되고이 방법 19,25에 리알. 이러한 프로토콜과 일치, 여기에 설명 된 방식으로 블레오 마이신의 전달은 모두 폐에 강력한 섬유 성 응답 결과, 모든 로브에 분포 깊이와 균일 비슷한 수준을 제안. 이것을 기초로하여,이 프로토콜 (예컨대 렌티 바이러스 벡터로 생체 내 단백질 개질 시스템의 예. 공업, 항체, 세균 제, 등) 그 영향을 중재 접촉에 의존하는 다른 물질의 범위를 비교 실험적인 장점을 제공하는 가능성 및 블레오 마이신처럼, 그러한 실험도 신뢰, 작은 비용, 최소한의 수술 후주의 수행 할 수 있도록 것이라고.
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Acknowledgments
저자는 트리 크롬 염색 및 분석에 대한 도움말은 워싱턴 대학의 조직학의 브라이언 존슨과 이미징 코어 감사합니다. 이 작품은 NIH 보조금 HL098067 및 HL089455에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bleomycin For Injection, 30 units/vial | APP Pharmaceuticals, LLC | 103720 | For best results, BLM should be suspended in PBS, aliquoted, and stored as single use lyophilzed aliquots |
| Blunt End Forceps | |||
| Tongue Depressor (i.e. bent Valleylab Blade Electrode, 2.4") | Covidien | E1551G | Before use, create a 45 degree bend 1.5 cm from the blade tip. A suitable depressor can also be created from any metal implement of similar dimensions. |
| Exel Safelet Catheter 22G X 1" | Exel International | 26746 | |
| 1 ml Slip-tip Disposable Tuberculin Syringe (200/sp, 1600/ca) | BD | 309659 | |
| 0.2 ml Pipettor and Filter Tips | |||
| Fiber-Lite Illuminator. Model 181-1: Model 180 mated with Standard Dual Gooseneck illuminator | Dolan Jenner Industries, Inc. | 181-1 | Lower output LED illuminators are not recommended as they fail to suficiently illuminate the trachea. |
| Intubation Board | See Diagram 1. | ||
| Colored Label Tape: 0.5 in. Wide | Fisherbrand | 15-901-15A | |
| Oxygen | |||
| Phosphate-Buffered Saline, 1X | Corning | 21-040-CV | Product should be sterile |
| Non-Sterile Silk Black Braided Suture Spool, 91.4 m, Size 4-0 | Harvard Apparatus | 517698 | |
| Table Top Anesthesia Machine Isoflurane | Highland Medical Equipment | http://www.highlandmedical.net/ | |
| Slide Top Induction Mouse Isoflurane Chamber | MIP / Anesthesia Technologies | AS-01-0530-SM | |
| FORANE (isoflurane, USP) Liquid For Inhalation 100 mL | Baxter | 1001936040 | |
| Nanozoomer Digital Pathology system | Hamamatsu | ||
| IgM ELISA Quantification Kit | Bethyl Laboratories | E90-101 |
References
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