Summary
Denne artikkelen presenterer en hurtig og enkel metode for administrering av bleomycin direkte inn i luftrøret mus via intubering. Viktige fordeler med denne metoden er at det er svært reproduserbar, lett å mestre, og krever ikke spesialutstyr eller lange utvinning ganger.
Introduction
Til tross for noen anatomiske og fysiologiske forskjeller, 1 murine modeller fortsette å være uvurderlig for modellering av menneskets biologi og sykdom patogenese. 2 Fra en reindrift synspunkt, mus er lette å håndtere, har en lav avl tid, en akselerert levetid, og er relativt billige til hus. Med utviklingen av ulike genetiske stammer og strategier (f.eks., Betinget knock-outs, reporter mus, avstamning-sporing tilnærminger, etc.), samt det brede utvalget av tilgjengelige reagenser (f.eks., Antistoffer, rekombinante proteiner, hemmere, etc.), har mus blitt en viktig modell virveldyr organisme å avdekke menneskelige Homeostase og sykdomsprosesser. 3
Mus har vært spesielt verdifullt for å studere lungesykdom, inkludert akutt lungeskade (ALI) og lungefibrose. 4 ALI hos mennesker kan være forårsaket av traumer, skade eller sepsis og er preget av epitel ogendothelial lekkasje (ie., ødem), betennelse, og begynnende fibrose. I mange pasienter, ALI utvikler seg til sin alvorlige form, akutt lungesviktsyndrom (ARDS), som ofte resulterer i fibrose og død på grunn av respirasjonssvikt. 5,6 Lunge fibrose er en progressiv, dødelig patologi preget av det overskytende deponering av ekstracellulære matrise , spesielt type i kollagen, noe som fører til nedsatt lungefunksjon. 7,8 Administrering av bleomycin (BLM) er den mest brukte og best karakteriserte modell for å indusere ALI og fibrose i forsøksdyr. 9 Selv om BLM-induserte lungefibrose hos gnagere gjør ikke rekapitulere fullt menneskelige fibrotiske fenotyper, 10 musestudier med denne modellen har ført til oppdagelsen av mange viktige faktorer som påvirker utbruddet og progresjon av sykdommen. 11
Mens den eksakte mekanisme (r) bak BLM-indusert fibrogenese er ukjente, den initierende skadeantas å oppstå fra kontakt-avhengig DNA trådbrudd i epitelceller lining gjennomfører luftveiene og alveolene, og i særdeleshet, type 1 pneumocytes. 12 Behovet for direkte kontakt mellom BLM og lunge epitel fremhever viktigheten av en robust levering rute , og disse bekymringene er også relevante for et bredt spekter av behandlinger rettet mot de fjerne luftveiene, inkludert rekombinante proteiner, antistoffer, siRNA, virus, bakterier, partikler, og mer. Orofaryngeal aspirasjon (OPA) har blitt mye brukt for dette formål 13, men et større en brist av OPA er at noen del av den leverte middel kan svelges i den gastrointestinale kanal, og dermed føre til unøyaktigheter i den administrerte dose. En annen mye brukt metode er transtracheal drypping, som innebærer trakeostomi under kraftig bedøvelse for å eksponere trakea og drypping av et middel direkte inn i luftveiene. 14 er imidlertid ikke bare kan slikeen prosedyre være uønsket på grunn av sin invasivity, men det er også tidkrevende, krever en god del trening, og fører til en potent skade på luftveiene. 15,16 Flere protokoller har blitt utviklet som involverer direkte administrasjon av midler inn i luftrøret uten behov for kirurgisk inngrep, 16,17,18,19,20 men disse metodene innebærer lengre utvinning ganger forårsaket av kraftige bedøvelsesmidler, bruk av kostbart utstyr (ie., otoskop / laryngoskop, kommersielt tilgjengelige prosedyre boards, fiberoptisk ledninger, etc.), et overskudd av manipulasjon i munnhulen, og usikkerhet med hensyn til doseringen.
Dette dokumentet beskriver en forholdsvis enkel metode for administrering via intubering som gjør at en forsker på en rask, billig, pålitelig og innpode et reagens til murine lungen med begrenset risiko for gjenværende skade på omgivende vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Institutional Animal Care og bruk komiteer (IACUC) ved University of Washington og Cedars-Sinai Medical Center har godkjent dyret nødvendige arbeidet for disse studiene.
1. Forberedelse
- Steriliser både den butte enden tang og depressor via autoklav.
- Ved hjelp av en biologisk sikkerhetskabinett, utarbeide en arbeids lager av BLM i PBS fra frysetørket pulver. Sonikere oppløsningen i 10 min ved 35 kHz for å sikre enda blanding.
Merk: Et totalt volum på mellom 30 og 45 ul anbefales for å hindre pipettering variant av den lave enden, og kvelning med større volumer. - Forbered et rent arbeidsområde som omfatter ca 1 m 2 for selve inngrepet, samt utpekte steder for bur både før og etter inngrepet.
- Feste bunnen av prosedyren brettet til benken umiddelbart foran forskeren ved legging 2 eller 3 strimler av laboratorie bånd tvers over fundamentet og underlYing benk. Se figur 1 for nærmere spesifikasjoner om å opprette et styre.
- Knyt en enkelt lengde på størrelse 4,0 sutur tråden mellom de to posisjoneringsskruer i prosedyren styret.
- Generer et provisorisk spirometer ved å fjerne og kaste stemplet fra tre 1 ml sprøyter, og avsetning av 60 ul av PBS inn i toppen av hvert fat for å danne en lufttett forsegling. Fest hub av kateteret løst til en av sprøytene og legg den til side av brettet.
- Sug 300 mL av luft i en 1 ml sprøyte og sett den til side av brettet.
- Skjær et ytterligere stykke tape ca. 6 inches i lengde og plass til den ene side. Dette vil bli brukt til å sikre dyret til styret i trinn 2.4.
- Sett opp en isofluran kammer. Fest O 2, isofluran, og vakuum til de riktige portene på både eksponering kammeret og klar vakuum. Alternativt administrere bedøvelse i en isofluran-kompatibel biologisksikkerhetskabinett.
2. Intubasjon
- Anesthetize mus med isofluran i kammeret før den mister bevisstheten og respirasjon bremser til en passende pris. En typisk eksponering omfatter 4% isofluran og 2% O 2 for 3-4 min, og den ideelle utfallet er 2 til 2,5 min for sedasjon. Dette tilsvarer en respirasjonsfrekvens av en pust hvert 2. sek.
- Mens du venter på sedasjon å sette inn, aspirer mellom 30 og 45 mL av BLM inn i en pipette og sted til side.
- Når du er klar, suspendere bedøvet musen ved sin øvre fortenner fra tråden festet til posisjoneringsskruer i prosedyren plattformen. Sørg for at dyrets ryggen ligger flatt mot plattformen overflaten.
- Være forsiktig med å begrense ventilasjon, plasserer et stykke tape løst over nedre (hale) del av brysthulen, like over membranen. Plassering bør være stramt nok til å opprettholde riktig justering under procedure, men ikke så stramt at det begrenser åndedrett.
- Slå på belysnings til mellom 80% og 100% intensitet og orientere svanehalsen, slik at det er 1 til 2 cm fra overflaten av huden, i nærheten av solar plexus. Periodisk kontrollere spissen av den svanehals for varme for å sikre at den ikke skade musen.
- Stående bak plattformen, bruker sterilt, butt ende tang for å finne tungen. Å være forsiktig for å unngå de nedre fortennene, forsiktig grep og trekke tungen ut av munnhulen.
- Ved hjelp av de resterende hånd, setter depressor og bruke den til å flate ut tungen mot gulvet i munnhulen. Slipp pinsett, men la depressor på plass for de neste to trinnene.
- Orientere lys, slik at luftrøret er synlig ved å lede den svanehalsen proksimalt fra nivået av solar plexus inntil den når nivået av mainstem bronkiene.
Merk: Luftrøret kan enkelt skilles ved påvirkning av respirasjon, WHIch bevirker det utsendte lys til å svinge i intensitet. Når riktig plassert, vil denne strukturen være merkbar i aksialplanet som en sentralt beliggende tapp av lys med minimal omgivende lys i munnhulen selv. - Vinkel sprøyten, slik at den følger den naturlige bane av luftrøret, og senke kateterspissen 22-G, med den vedlagte sprøyte som inneholder dråpe, rett inn i hulrommet. PBS boble vil begynne å stige og falle med hvert åndedrag etter vellykket emisjon.
Merk: Denne handlingen kan bli forsinket med flere sekunder som et resultat av dyp sedasjon. - Mate kateter i ytterligere 5 mm. Fjern tunge.
- Skift sprøyten til motsatt side, og ta tak i navet, fjern sprøyten forsiktig.
- Innskudd mellom 30 og 45 ul av BLM inn i sentrum av det indre av katetermuffen, feste den andre sprøyten og dispenser 300 ul av luft inn i navet.
- Sett på andresprøyte med den første inneholdende boble av PBS. Boblen vil fortsette å stige og falle hvis prosedyren er vellykket.
3. Post-prosessuell Care
- Fjern kateteret og tape, og plassere dyret i et tørt varmt sted til det gjenvinner bevisstheten - vanligvis innen et par minutter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Intubert mus ble overvåket daglig for vekttap og nød, og ofret 4, 10 eller 17 dager senere via intraperitoneal injeksjon av 2,5% 2,2,2- tribromoethanol. Bronchoalveolar kylling (BAL) ble samlet i tre vasker av PBS som beskrevet andre steder 21 og høyre lunge ble fiksert i 10% formalin, parafin innebygd, og farget med Masson er Trichrome ved University of Washington Histologi og Imaging Core 22.
I tråd med etablerte data, BLM-behandlede mus erfaren topp vekttap mellom dag 7 og 10 etter eksponering 23 (figur 2A). I tillegg er forhøyede nivåer av IgM i BAL fra avlivet BLM-behandlede mus viste en signifikant tidsavhengig økning i lunge permeabilitet, en indikasjon på epitel og / eller endothelial barriere dysfunksjon (figur 2B).
= "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> ble målt ved hjelp av Masson er Trichrome flekken The fibrogenic respons - et veletablert markør for total kollagen innhold 24. Høyre lungene var farget, og gjennomsnittlig samlet areal på Trichrome flekker per høyre lunge delen ble kvantifisert (figur 3A). Representative avsnittene viser den resulterende behandling avhengige fortykkelse av lunge interstitium og øker i fibrotiske lesjoner (Figur 3B).
Figur 1. Generelle parametere for å produsere en fungerende prosedyre bord. Lengdene som presenteres indikerer den omtrentlige dimensjoner som er nødvendig for å skape en fungerende prosedyre apparat. I disse eksperimentene, ble standard aluminiumsplate skjæres til riktige dimensjoner, og deretter forsterket med et "T" braketten.ftp_upload / 53771 / 53771fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Vekttap og barriere dysfunksjon etter administrasjon av bleomycin. Mus ble administrert 2,0 U / kg BLM eller et like stort volum av PBS. (A) vekttap uttrykt som prosent av dag 0 vekt (BLM: n = 21; PBS: 5). (B) Mus ble ofret på 4 eller 10 dager etter eksponering, og IgM protein i BAL fra høstet lungene ble målt via ELISA. (PBS: n = 5; dag 4: n = 3; dag 10: n = 5). Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM. * P <0,05 sammenlignet med PBS kontroll. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Lunge fibrose etter administrasjon av bleomycin. (A) Total kollagen, kvantifisert som total ganger endring Masson er Trichrome flekker fra WT kontroller. (B) Representative bilder av Trichrome farget lunge seksjoner tatt på 5x forstørrelse. PBS kontrollen består av dyrene tatt mellom 5 og 14 dager efter behandling PBS (PBS: n = 5; dag 10: n = 5; dag 17: n = 3). Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM. * P <0,05 sammenlignet med PBS kontroll. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I tilfeller hvor aerosolisering er upraktisk på grunn av begrenset reagens tilgjengelighet, sikkerhet, eller kostnadene, er direkte tracheal administrering en overlegen metode for levering av eksogene midler i lungene 16 transtracheal drypping har blitt mye brukt for å oppnå dette.; imidlertid, som med alle kirurgiske inngrep, bærer også med seg muligheten for komplikasjoner forårsaket av fremgangsmåten i seg selv, og ikke nødvendigvis det middel som skal innpodet. 13 Av disse grunner er det blitt stadig mer vanlig å administrere et stoff direkte inn i luftrøret via intubering 16,17,18,19,20. Men disse fremgangsmåter også lider av begrensninger, blant annet utvidede utvinning ganger på grunn av bruk av kraftige sedativa som ketamin / xylazin, usikkerhet angående plassering av kateteret (f.eks., Inn i spiserøret og ikke trakea), unødvendig manipulering av vev i munnhulen, og kostnadene forbundetmed å kjøpe spesialiserte instrumenter som otoscopes / laryngoskoper.
Når etablert, tilnærmingen beskrevet her gir flere meningsfulle fordeler fremfor andre intubasjon protokoller. For én ting, bruk av isofluran gir en reduksjon i den totale tiden brukt per mus. Dette er hovedsakelig på grunn av den reduserte tiden som trengs for dyr å gjenvinne bevissthet etter isofluran sedasjon i forhold til kontrollerte stoffer som ketamin (ca 5 min versus noen ganger større enn 3 timer). 14 I tillegg sikrer provisorisk spirometeret tilliten til suksess ved at forskeren å visualisere den oscillerende boblen PBS, noe som indikerer korrekt plassering av den administrerte substans både før og etter instillasjon. Til slutt, ved å benytte en ekstern lyskilde istedenfor en klumpete otoskop eller laryngoskop og guide wire, er forskeren i stand til å redusere mengden av utstyr i sine hender, samtidig forbedre deres syn of munnhulen og reduserer sjansene for å skade det myke vevet rundt luftrøret.
Spesifikke bekymringer knyttet til denne protokollen er få, men alvorlig. For eksempel, mens bruk av isofluran reduserer den tid forbundet med induksjon og utvinning fra sedasjon, krever det også strenge observasjon av dyrets tilstand sedasjon. Unnlatelse av å fjerne dyret fra isofluran kammeret på en riktig måte kan det føre til dødsfall, spesielt hos dyr allerede utvinne fra en tidligere intervensjon. Omvendt kan utilstrekkelig isofluran dosering og lengre saksbehandlingstider resulterer i dyre gjenvinne bevissthet under selve inngrepet, som også kan føre til skade. Derfor er det viktig for både sikkerheten av dyret og integriteten av eksperimentet at dyret føres tilbake til isofluran kammeret ved første tegn av bevissthet. Siden dette kan være vanlig når lære denne metoden, er det anbefalt at det ierfarne forskere bekrefte vellykket forvaltning av hvert dyr før bedøvelse neste. I tillegg kan forskere har problemer også velge å utvide isofluran eksponering for å øke den tilgjengelige prosess tid, forutsatt at de nøye overvåke dyrenes for moribundity.
En annen bekymring med denne metoden er at for skader forbundet med håndtering. Dette er spesielt sannsynlig i løpet av tre trinn: når du fjerner tungen fra munnen, når du setter inn kateteret, og da løsner sprøytene fra navet etter behandling. Kateteret plassering er langt den mest farlige av disse trinnene. Viktigere, bør kateteret ikke inn i munnhulen før visningen av luftrøret er ideell. Dersom luftrøret ikke kan bringes inn i synsfeltet gjennom manipulering av enten lyskilden eller depressor, bør forskeren frigjøre tungen og gjøre et nytt forsøk prosedyren. Manipulering av det myke vevet rundt luftrøret ier ikke nødvendig eller anbefalt. Men når kateteret er plassert riktig, omsorg bør også tas for å holde navet fra marsj for langt inn i luftrøret og perforering hoved-stammen bronkiene. Dette kan vanligvis unngås ved å sikre at kateteret er kun løst festet til sprøyteløpet, og ved avstiving den hånd som inneholder kateteret mot prosessuelle brettet slik at den forblir statisk. Disse nyansene, sammen med behovet for aktualitet og presisjon, markere betydningen av forberedelse og praksis i å perfeksjonere denne prosedyren. Likevel, med trening bør det være mulig for en nybegynner forsker for å behandle 20 eller flere dyr i løpet av en time, og for erfarne forskere å fullføre dobbelt så mange eller flere.
Konsistensen formidles ved direkte trakeal deponering har gjort det til en foretrukne administrasjons de siste årene. Faktisk har lignende metoder som allerede er blitt rapportert for et mangfold av uensartet kompisrial på denne måten 19,25. I samsvar med disse protokollene, levering av bleomycin på den måte som er beskrevet her resulterte i en potent fibrotisk reaksjon i begge lungene, og i alle fliker, noe som tyder på et tilsvarende nivå av dybde og ensartethet i fordelingen. Basert på dette, er det sannsynlig at denne protokollen gir sammenlignbare eksperimentelle fordeler for en rekke andre materialer som er avhengige av kontakt å megle deres effekter (f.eks., Legemidler, antistoffer, bakterielle midler, og in vivo protein modifikasjons systemer som lentiviral vektorer) , og at, som bleomycin, ville det tillate slike forsøk å også bli gjennomført med selvtillit, litt regning, og minimal postoperativ behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne takker Brian Johnson av histologi og Imaging Core ved University of Washington for å få hjelp med Trichrome farging og analyse. Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd HL098067 og HL089455.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bleomycin For Injection, 30 units/vial | APP Pharmaceuticals, LLC | 103720 | For best results, BLM should be suspended in PBS, aliquoted, and stored as single use lyophilzed aliquots |
| Blunt End Forceps | |||
| Tongue Depressor (i.e. bent Valleylab Blade Electrode, 2.4") | Covidien | E1551G | Before use, create a 45 degree bend 1.5 cm from the blade tip. A suitable depressor can also be created from any metal implement of similar dimensions. |
| Exel Safelet Catheter 22G X 1" | Exel International | 26746 | |
| 1 ml Slip-tip Disposable Tuberculin Syringe (200/sp, 1600/ca) | BD | 309659 | |
| 0.2 ml Pipettor and Filter Tips | |||
| Fiber-Lite Illuminator. Model 181-1: Model 180 mated with Standard Dual Gooseneck illuminator | Dolan Jenner Industries, Inc. | 181-1 | Lower output LED illuminators are not recommended as they fail to suficiently illuminate the trachea. |
| Intubation Board | See Diagram 1. | ||
| Colored Label Tape: 0.5 in. Wide | Fisherbrand | 15-901-15A | |
| Oxygen | |||
| Phosphate-Buffered Saline, 1X | Corning | 21-040-CV | Product should be sterile |
| Non-Sterile Silk Black Braided Suture Spool, 91.4 m, Size 4-0 | Harvard Apparatus | 517698 | |
| Table Top Anesthesia Machine Isoflurane | Highland Medical Equipment | http://www.highlandmedical.net/ | |
| Slide Top Induction Mouse Isoflurane Chamber | MIP / Anesthesia Technologies | AS-01-0530-SM | |
| FORANE (isoflurane, USP) Liquid For Inhalation 100 mL | Baxter | 1001936040 | |
| Nanozoomer Digital Pathology system | Hamamatsu | ||
| IgM ELISA Quantification Kit | Bethyl Laboratories | E90-101 |
References
- Hyde, D. M., Hamid, Q., Irvin, C. G. Anatomy, pathology, and physiology of the tracheobronchial tree: emphasis on the distal airways. J Allergy Clin Immunol. 124, S72-S77 (2009).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nat Cell Biol. 9, 993-999 (2007).
- Peters, L. L., et al. The mouse as a model for human biology: a resource guide for complex trait analysis. Nat Rev Genet. 8, 58-69 (2007).
- Baron, R. M., Choi, A. J., Owen, C. A., Choi, A. M. Genetically manipulated mouse models of lung disease: potential and pitfalls. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, 485-497 (2012).
- Sharma, S. Acute respiratory distress syndrome. BMJ Clin Evid. 2010, (2010).
- Saguil, A., Fargo, M. Acute respiratory distress syndrome: diagnosis and management. Am Fam Physician. 85, 352-358 (2012).
- Wilson, M. S., Wynn, T. A. Pulmonary fibrosis: pathogenesis, etiology and regulation. Mucosal Immunol. 2, 103-121 (2009).
- Wuyts, W. A., et al. The pathogenesis of pulmonary fibrosis: a moving target. Eur Respir J. 41, 1207-1218 (2013).
- Mouratis, M. A., Aidinis, V. Modeling pulmonary fibrosis with bleomycin. Curr Opin Pulm Med. 17, 355-361 (2011).
- Moeller, A., Ask, K., Warburton, D., Gauldie, J., Kolb, M. The bleomycin animal model: a useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis? Int J Biochem Cell Biol. 40, 362-382 (2008).
- Myllärniemi, M., Kaarteenaho, R. Pharmacological treatment of idiopathic pulmonary fibrosis - preclinical and clinical studies of pirfenidone, nintedanib, and N-acetylcysteine. European Clinical Respiratory Journal. 2, (2015).
- Reinert, T., Baldotto, C. S. dR., Nunes, F. A. P., Scheliga, A. A. dS. Bleomycin-Induced Lung Injury. Journal of Cancer Research. 2013, 1-9 (2013).
- Lakatos, H. F., et al. Oropharyngeal aspiration of a silica suspension produces a superior model of silicosis in the mouse when compared to intratracheal instillation. Exp Lung Res. 32, 181-199 (2006).
- Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. J Vis Exp. , (2010).
- Osier, M., Oberdorster, G. Intratracheal inhalation vs intratracheal instillation: differences in particle effects. Fundam Appl Toxicol. 40, 220-227 (1997).
- Driscoll, K. E., et al. Intratracheal instillation as an exposure technique for the evaluation of respiratory tract toxicity: Uses and Limitations. Toxicol Sci. 55, 24-35 (2000).
- MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. J Appl Physiol (1985). 106, 984-987 (1985).
- Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Lab Anim. 41, 128-135 (2007).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. J Vis Exp. , e50601 (2013).
- Starcher, B., WIlliams, I. A method for intratracheal instillation of endotoxin into the lungs of mice. Lab Anim. 23, 234-240 (1989).
- Daubeuf, F., Frossard, N. Performing bronchoalveolar lavage in the mouse. Curr Protoc Mouse Biol. 2, 167-175 (2012).
- Li, Y., et al. Severe lung fibrosis requires an invasive fibroblast phenotype regulated by hyaluronan and CD44. J Exp Med. 208, 1459-1471 (2011).
- Grazioli, S., et al. CYR61 (CCN1) overexpression induces lung injury in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 308, L759-L765 (2015).
- Redente, E. F., et al. Tumor necrosis factor-alpha accelerates the resolution of established pulmonary fibrosis in mice by targeting profibrotic lung macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol. 50, 825-837 (2014).
- Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. J Vis Exp. , e52261 (2014).
