Summary
I denna artikel presenteras en snabb och enkel metod för att administrera bleomycin direkt i musen luftstrupen via intubation. Viktigaste fördelarna med denna metod är att det är mycket reproducerbar, lätt att bemästra, och inte kräver specialutrustning eller långa återhämtningstider.
Introduction
Trots vissa anatomiska och fysiologiska skillnader, 1 musmodeller fortsätter att vara ovärderlig för modellering humanbiologi och sjukdomar patogenes. 2 Ur djurhållning synpunkt möss är lätta att hantera, har en låg avel tid, en accelererad livslängd och är relativt billiga till huset. Med utvecklingen av olika genetiska stammar och strategier (t.ex.., Villkor knock-outs, reporter möss, härstamning-spårning metoder, etc.), samt det breda utbudet av tillgängliga reagens (eg., Antikroppar, rekombinanta proteiner, hämmare, etc.), har möss blivit en viktig modell ryggradsdjur organism att avslöja humana homeostas och sjukdomsprocesser. 3
Möss har varit särskilt värdefullt för att studera lungsjukdomar, inklusive akut lungskada (ALI) och lungfibros. 4 ALI hos människor kan orsakas av trauma, skada, eller sepsis och kännetecknas av epitelial ochendotel läcka (dvs., ödem), inflammation, och begynnande fibros. Hos många patienter fortskrider ALI till sin allvarligaste formen, akut andnödssyndrom (ARDS), vilket ofta resulterar i fibros och dödsfall till följd av andningssvikt. 5,6 Lungfibros är en progressiv, dödlig patologi kännetecknas av överskott avsättning av extracellulär matris , framför allt typ i-kollagen, vilket leder till försämrad lungfunktion. 7,8 Administration av bleomycin (BLM) är den mest använda och bäst karakteriserade modell för att inducera ALI och fibros hos försöksdjur. 9 Även BLM-inducerad lungfibros hos gnagare gör inte sammanfatta helt mänskliga fibrotiska fenotyper har 10 mus studier med denna modell har lett till upptäckten av många viktiga faktorer som påverkar uppkomsten och utvecklingen av sjukdomen. 11
Även om den exakta mekanismen (s) bakom BLM-inducerad fibrogenes är okända, det inledande skadatros härröra från kontakt beroende DNA-strängbrott i epitelceller som bekläder luftvägarna och alveoler och i synnerhet typ 1 pneumocyter. 12 Behovet av direktkontakt mellan BLM och lung epitel understryker vikten av en stabil leveransrutt , och dessa problem är också relevant för ett brett utbud av behandlingar riktade mot de distala luftvägarna, inklusive rekombinanta proteiner, antikroppar, siRNA, virus, bakterier, partiklar, och mycket mer. Orofaryngeal aspiration (OPA) har använts i stor utsträckning för detta ändamål 13, men en stor en brist i OPA är att någon del av den levererade medlet kan sväljas i mag-tarmkanalen, vilket därigenom leder till inexakthet i den administrerade dosen. En annan vanligt förekommande metod är transtrakeal instillation, vilket innebär trakeostomi under stark anestesi för att exponera luftstrupen och instillation av en agent direkt ner i luftvägarna. 14 Men inte bara kan en sådanett förfarande vara önskvärt på grund av dess invasivity, men det är också tidskrävande, kräver en hel del träning, och orsakar en potent skada luftvägarna. 15,16 Flera protokoll har utvecklats som involverar direkt tillförsel av medel till trakea utan behov av kirurgiskt ingrepp, 16,17,18,19,20 men dessa metoder innefattar förlängda återhämtningstider som orsakas av kraftiga anestetika, användning av dyr utrustning (dvs., otoskop / laryngoscopen, kommersiellt tillgängliga Förfarande brädor, fiberoptiska ledningar, etc.), ett överskott av manipulation i munhålan, och osäkerhet om doseringen.
Detta dokument beskriver en relativt enkel metod för administration via intubation som tillåter en forskare att snabbt, billigt och tillförlitligt ingjuta ett reagens i den murina lungan med begränsad risk för kvarvarande skador på omgivande vävnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Institutional Animal Care och användning kommittéer (IACUC) vid University of Washington och Cedars-Sinai Medical Center har godkänt djuret arbete som är nödvändigt för dessa studier.
1. Beredning
- Sterilisera både den trubbiga änden pincett och patel via autoklav.
- Med hjälp av ett biologiskt säkerhetsskåp, förbereda en fungerande lager av BLM i PBS från frystorkat pulver. Sonikera lösningen under 10 min vid 35 Khz för att säkerställa jämn blandning.
Obs: En total volym på mellan 30 och 45 l rekommenderas för att förhindra pipettering variant på den nedre delen, och kvävning med större volymer. - Förbered en ren arbetsyta som omfattar cirka 1 m 2 för själva förfarandet, liksom anvisade platser för burar både före och efter ingreppet.
- Fixa basen av förfarandet kortet till bänken omedelbart framför forskaren genom läggning 2 eller 3 remsor av laboratorietejp över basen och underlying bänk. Se figur 1 för ytterligare specifikationer om hur du skapar en styrelse.
- Knyt en enda längd av storlek 4,0 suturtråden mellan de två positioneringsskruvar av förfarandet kortet.
- Generera en provisorisk spirometern genom att ta bort och kasta kolven från tre 1 ml sprutor, och deponera 60 pl PBS till toppen av varje fat för att bilda en lufttät tätning. Fäst navet i katetern löst till en av sprutorna och placera det på ena sidan av kortet.
- Sug 300 pl av luft i en 1 ml spruta och placera den på ena sidan av kortet.
- Skär en ytterligare tejpbit ungefär sex inches i längd och lägg den åt sidan. Detta kommer att användas för att fästa djuret till styrelsen i steg 2,4.
- Inrätta en isofluran kammare. Fäst O2, isofluran, och vakuum till lämpliga portar på både exponeringskammare och avslutande vakuum. Alternativt, administrera bedövningsmedel i en isofluran-kompatibel biologiskasäkerhetsskåp.
2. Intubation
- Söva musen med isofluran i kammaren tills det förlorar medvetandet och andning saktar till en lämplig hastighet. En typisk exponering omfattar 4% isofluran och 2% O 2 för 3-4 minuter, och den ideala resultatet är 2-2,5 min av sedering. Detta motsvarar en andningsfrekvens av ett andetag var 2 sek.
- I väntan på sedering för att ställa in, aspirera mellan 30 och 45 pl BLM i en pipett och lägg den åt sidan.
- När du är klar avbryta sedated musen genom dess övre framtänder från tråden fäst vid positioneringsskruvar förfarande plattform. Se till att djurets dorsum ligger platt mot plattformsytan.
- Försiktigt så att inte begränsa ventilation, placera en bit tejp löst över den nedre (kaudala) delen av brösthålan, strax ovanför membranet. Placeringen bör vara tillräckligt stram för att bibehålla korrekt inriktning under procedure, men inte så hårt att det begränsar andning.
- Slå på belysningen för att mellan 80% och 100% intensitet och orientera svanhalsen så att det är en till två cm från ytan av huden, i närheten av solarplexus. Regelbundet kontrollera spetsen på svanhals för värme för att säkerställa att den inte skadar musen.
- Står bakom plattformen, använd sterila, trubbiga änden pincett för att lokalisera tungan. Var noga med att undvika de nedre framtänderna, försiktigt grepp och dra ut tungan i munhålan.
- Använd den återstående handen in patel och använda den för att platta till tungan mot golvet i munhålan. Släpp pincett, men lämna patel på plats för de kommande två steg.
- Orientera ljuset så att trakean är synlig genom att styra svanhalsen proximalt från nivån för den solarplexus tills den når nivån för mainstem bronkerna.
Notera: Luftstrupen kan lätt skiljas genom inverkan av andning, which orsakar det emitterade ljuset att fluktuera i intensitet. När den är korrekt placerad, kommer denna struktur att vara urskiljbar i den axiella plan som ett centralt beläget stift av ljus med minimal omgivande ljus i munhålan självt. - Vinkla sprutan så att den följer den naturliga vägen för luftstrupen, och sänka 22-G kateterspetsen, med bifogad spruta innehållande droppen, rakt in i lumen. PBS bubblan kommer att börja stiga och falla med varje andetag på lyckad placering.
Obs: Denna åtgärd kan fördröjas med flera sekunder till följd av djup sedering. - Mata katetern i en ytterligare 5 mm. Ta bort tungspatel.
- Flytta sprutan till den motsatta sidan, och gripande navet försiktigt bort sprutan.
- Insättning mellan 30 och 45 pl BLM i mitten av det inre av kateternavet, fästa den andra sprutan och fördela 300 l luft in i navet.
- Ersätta den andraSpruta med den första innehållande bubblan PBS. Bubblan kommer att fortsätta att stiga och falla om förfarandet har utförts framgångsrikt.
3. Post-procedur Care
- Ta bort katetern och tejp, och placera djuret i en torr varm plats tills den återfår medvetandet - typiskt inom ett par minuter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Intuberade möss övervakades dagligen för viktminskning och nöd, och avlivades 4, 10 eller 17 dagar senare via intraperitoneal injektion av 2,5% 2,2,2- tribromoethanol. Lungsköljning (BAL) samlades i tre tvättar av PBS som beskrivs på annat håll 21 och höger lunga fixerades i 10% formalin, paraffininbäddade och färgade med Massons Trichrome vid University of Washington histologi och Imaging Core 22.
I överensstämmelse med kända data, BLM-behandlade möss upplevde topp viktminskning mellan dagarna 7 och 10 efter exponering 23 (figur 2A). Dessutom, förhöjda nivåer av IgM i BAL från offrade BLM-behandlade möss visade en signifikant, tidsberoende ökning i lung permeabilitet, indikativ för epitel- och / eller endotelial barriär dysfunktion (Figur 2B).
= "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> Den fibrinogen svaret mättes med användning av Masson trikrom fläck - en väletablerad markör för total kollagenhalt 24. Höger lungor färgades, och den genomsnittliga totala arealen av trikromfläckning per höger lunga avsnitt kvantifierades (figur 3A). Representativa sektioner visar den resulterande behandlings beroende förtjockning av lung interstitium och ökar i fibrotiska lesioner (Figur 3B).
Figur 1. Allmänna parametrar för att producera ett arbetssätt kortet. Längderna presenteras visar de approximativa måtten som är nödvändiga för att skapa ett arbetssätt apparat. I dessa experiment, var standardaluminiumplåt kapas till rätt mått, sedan förstärkt med en "T" fäste.ftp_upload / 53.771 / 53771fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Viktminskning och barriärdysfunktion efter administrering av bleomycin. Mössen administrerades 2,0 U / kg av BLM eller en lika stor volym PBS. (A) Viktminskning uttrycktes som procent av dag 0 vikt (BLM: n = 21; PBS: 5). (B) Möss avlivades vid 4 eller 10 dagar efter exponering, och IgM-protein i BAL från skördade lungorna mättes via ELISA. (PBS: n = 5; dag 4: n = 3, dag 10: n = 5). Data presenteras som medelvärde ± SEM. * P <0,05 jämfört med PBS-kontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Lungfibros efter administrering av bleomycin. (A) Total kollagen, kvantifieras som total faldig förändring Massons trikromfläckning från WT kontroller. (B) Representativa bilder av trikrom färgade lungsektioner tagna vid 5x förstoring. PBS kontroll består av djur som tagits mellan 5 och 14 dagar efter PBS behandling (PBS: n = 5; dag 10: n = 5; dag 17: n = 3). Data presenteras som medelvärde ± SEM. * P <0,05 jämfört med PBS-kontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I fall där aerosolbildning är opraktisk på grund av begränsad reagens tillgänglighet, säkerhet, eller kostnad, är direkt trakeal administration en överlägsen metod för leverans av exogena medel i lungorna 16 transtrakeal instillation har använts i stor utsträckning för att åstadkomma detta. Men som med alla kirurgiska ingrepp, bär den också med sig risken för komplikationer orsakade av själva förfarandet, och inte nödvändigtvis det medel som ingjutit. 13 Av dessa skäl har det blivit allt vanligare att administrera ett ämne direkt in i luftstrupen via intubation 16,17,18,19,20. Men dessa metoder lider också av begränsningar, inklusive förlängda återhämtningstider på grund av användningen av kraftfulla lugnande medel som ketamin / xylazin, osäkerhet när det gäller placeringen av katetern (dvs., I matstrupen och inte luftstrupen), onödig manipulation av vävnader i munhålan, och kostnaden associeradmed inköp av specialiserade instrument såsom Otoskop / Laryngoskop.
När etablerade, den metod som beskrivs här ger flera betydelsefulla fördelar jämfört med andra intubation protokoll. För en sak, användning av isofluran möjliggör en minskning av den totala tidsåtgång per mus. Detta beror främst på den minskade tid som krävs för djuren att återfå medvetandet efter isofluran sedering jämfört med kontrollerade ämnen som ketamin (ca 5 min kontra ibland större än 3 timmar). 14 Dessutom provisoriska spirometer säkerställer förtroende för framgång genom att forskaren för att visualisera den oscillerande PBS bubblan, som indikerar korrekt placering av den administrerade substansen både före och efter instillation. Slutligen, genom användning av en extern ljuskälla istället för en skrymmande otoskop eller laryngoskop och styrtråd, är forskaren kunna minska mängden utrustning i sina händer, och samtidigt förbättra deras uppfattning of munhålan och minska deras chanser att skada de mjuka vävnaderna som omger luftstrupen.
Specifika problem i samband med detta protokoll är få, men allvarligt. Till exempel, medan användningen av isofluran minskar tid i samband med induktion och återhämtning från sedering, det kräver också noggrann observation av djurets sedering tillstånd. Underlåtenhet att ta bort djuret från isofluran kammare i tid kan leda till dödsfall, särskilt i djur som redan återhämta sig från en tidigare ingripande. Omvänt kan otillräcklig isofluran dosering och utökade procedur gånger resultat i djuret återfår medvetandet under själva förfarandet, vilket också kan leda till personskador. Därför är det absolut nödvändigt för både säkerheten hos djuret och integriteten av experimentet att djuret återföras till isofluran kammaren vid det första tecknet på medvetandet. Eftersom detta kan vara vanligt när man lär sig av denna metod är det rekommenderas att ierfarna forskare bekräftar framgångsrik administration av varje djur innan anesthetizing nästa. Dessutom kan forskare har svårt att också välja att förlänga isofluran exponering för att öka den tillgängliga processtiden, under förutsättning att de noga övervaka de djur för moribundity.
En ytterligare angelägenhet för denna metod är att av skador i samband med hantering. Detta är särskilt sannolikt under tre steg: när du tar bort tungan från munnen, när du sätter katetern, och när rubba sprutorna från navet efter behandling. Kateter placering är den i särklass mest farliga av dessa steg. Viktigt bör katetern inte komma in i munhålan tills vyn i luftstrupen är idealisk. Om luftstrupen inte kan bringas i utsikt genom manipulering av antingen ljuskällan eller patel, bör forskaren frigöra tungan och åter försöka förfarandet. Manipulering av de mjuka vävnaderna som omger luftstrupen iär inte nödvändigt eller rekommenderas. Men när katetern är korrekt placerad, omsorg bör också vidtas för att hålla navet från att avancera för långt in i luftstrupen och perforerar huvudstammen bronker. Detta kan i allmänhet undvikas genom att säkerställa att katetern är endast löst fäst vid sprutcylindern och genom stärkande handen innehåller katetern mot procedur styrelsen så att den är oförändrad. Dessa nyanser, tillsammans med behovet av aktualitet och precision, belysa vikten av förberedelser och praxis att finslipa den här proceduren. Men med utbildning bör det vara möjligt för en nybörjare forskare för att behandla 20 eller fler djur under loppet av en timme, och för erfarna forskare att slutföra dubbelt så många eller fler.
Konsistensen förmedlas genom direkt luftrör nedfallet har gjort det en föredragen administrerings under de senaste åren. I själva verket har liknande metoder som redan har rapporterats för en mängd disparata material på detta sätt 19,25. I överensstämmelse med sådana protokoll, leverans av bleomycin på det sätt som beskrivs här resulterade i en potent fibrotisk respons i båda lungorna, och i alla lober, vilket tyder på en liknande nivå av djup och enhetlighet i fördelningen. Baserat på detta, är det troligt att detta protokoll ger jämförbara experimentella fördelar för en rad andra material som är beroende av kontakt för att förmedla sina effekter (t.ex.., Läkemedel, antikroppar, bakteriella medel, och in vivo proteinmodifiering system som lentivirala vektorer) och att, precis som bleomycin, skulle det tillåta sådana experiment att även genomföras med förtroende, liten kostnad, och minimal postoperativ vård.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Författarna tackar Brian Johnson i histologi och Imaging Core vid University of Washington för att få hjälp med trikromfläckning och analys. Detta arbete stöddes av NIH bidrag HL098067 och HL089455.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bleomycin For Injection, 30 units/vial | APP Pharmaceuticals, LLC | 103720 | For best results, BLM should be suspended in PBS, aliquoted, and stored as single use lyophilzed aliquots |
| Blunt End Forceps | |||
| Tongue Depressor (i.e. bent Valleylab Blade Electrode, 2.4") | Covidien | E1551G | Before use, create a 45 degree bend 1.5 cm from the blade tip. A suitable depressor can also be created from any metal implement of similar dimensions. |
| Exel Safelet Catheter 22G X 1" | Exel International | 26746 | |
| 1 ml Slip-tip Disposable Tuberculin Syringe (200/sp, 1600/ca) | BD | 309659 | |
| 0.2 ml Pipettor and Filter Tips | |||
| Fiber-Lite Illuminator. Model 181-1: Model 180 mated with Standard Dual Gooseneck illuminator | Dolan Jenner Industries, Inc. | 181-1 | Lower output LED illuminators are not recommended as they fail to suficiently illuminate the trachea. |
| Intubation Board | See Diagram 1. | ||
| Colored Label Tape: 0.5 in. Wide | Fisherbrand | 15-901-15A | |
| Oxygen | |||
| Phosphate-Buffered Saline, 1X | Corning | 21-040-CV | Product should be sterile |
| Non-Sterile Silk Black Braided Suture Spool, 91.4 m, Size 4-0 | Harvard Apparatus | 517698 | |
| Table Top Anesthesia Machine Isoflurane | Highland Medical Equipment | http://www.highlandmedical.net/ | |
| Slide Top Induction Mouse Isoflurane Chamber | MIP / Anesthesia Technologies | AS-01-0530-SM | |
| FORANE (isoflurane, USP) Liquid For Inhalation 100 mL | Baxter | 1001936040 | |
| Nanozoomer Digital Pathology system | Hamamatsu | ||
| IgM ELISA Quantification Kit | Bethyl Laboratories | E90-101 |
References
- Hyde, D. M., Hamid, Q., Irvin, C. G. Anatomy, pathology, and physiology of the tracheobronchial tree: emphasis on the distal airways. J Allergy Clin Immunol. 124, S72-S77 (2009).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nat Cell Biol. 9, 993-999 (2007).
- Peters, L. L., et al. The mouse as a model for human biology: a resource guide for complex trait analysis. Nat Rev Genet. 8, 58-69 (2007).
- Baron, R. M., Choi, A. J., Owen, C. A., Choi, A. M. Genetically manipulated mouse models of lung disease: potential and pitfalls. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, 485-497 (2012).
- Sharma, S. Acute respiratory distress syndrome. BMJ Clin Evid. 2010, (2010).
- Saguil, A., Fargo, M. Acute respiratory distress syndrome: diagnosis and management. Am Fam Physician. 85, 352-358 (2012).
- Wilson, M. S., Wynn, T. A. Pulmonary fibrosis: pathogenesis, etiology and regulation. Mucosal Immunol. 2, 103-121 (2009).
- Wuyts, W. A., et al. The pathogenesis of pulmonary fibrosis: a moving target. Eur Respir J. 41, 1207-1218 (2013).
- Mouratis, M. A., Aidinis, V. Modeling pulmonary fibrosis with bleomycin. Curr Opin Pulm Med. 17, 355-361 (2011).
- Moeller, A., Ask, K., Warburton, D., Gauldie, J., Kolb, M. The bleomycin animal model: a useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis? Int J Biochem Cell Biol. 40, 362-382 (2008).
- Myllärniemi, M., Kaarteenaho, R. Pharmacological treatment of idiopathic pulmonary fibrosis - preclinical and clinical studies of pirfenidone, nintedanib, and N-acetylcysteine. European Clinical Respiratory Journal. 2, (2015).
- Reinert, T., Baldotto, C. S. dR., Nunes, F. A. P., Scheliga, A. A. dS. Bleomycin-Induced Lung Injury. Journal of Cancer Research. 2013, 1-9 (2013).
- Lakatos, H. F., et al. Oropharyngeal aspiration of a silica suspension produces a superior model of silicosis in the mouse when compared to intratracheal instillation. Exp Lung Res. 32, 181-199 (2006).
- Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. J Vis Exp. , (2010).
- Osier, M., Oberdorster, G. Intratracheal inhalation vs intratracheal instillation: differences in particle effects. Fundam Appl Toxicol. 40, 220-227 (1997).
- Driscoll, K. E., et al. Intratracheal instillation as an exposure technique for the evaluation of respiratory tract toxicity: Uses and Limitations. Toxicol Sci. 55, 24-35 (2000).
- MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. J Appl Physiol (1985). 106, 984-987 (1985).
- Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Lab Anim. 41, 128-135 (2007).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. J Vis Exp. , e50601 (2013).
- Starcher, B., WIlliams, I. A method for intratracheal instillation of endotoxin into the lungs of mice. Lab Anim. 23, 234-240 (1989).
- Daubeuf, F., Frossard, N. Performing bronchoalveolar lavage in the mouse. Curr Protoc Mouse Biol. 2, 167-175 (2012).
- Li, Y., et al. Severe lung fibrosis requires an invasive fibroblast phenotype regulated by hyaluronan and CD44. J Exp Med. 208, 1459-1471 (2011).
- Grazioli, S., et al. CYR61 (CCN1) overexpression induces lung injury in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 308, L759-L765 (2015).
- Redente, E. F., et al. Tumor necrosis factor-alpha accelerates the resolution of established pulmonary fibrosis in mice by targeting profibrotic lung macrophages. Am J Respir Cell Mol Biol. 50, 825-837 (2014).
- Lawrenz, M. B., Fodah, R. A., Gutierrez, M. G., Warawa, J. Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system. J Vis Exp. , e52261 (2014).
