Summary
Dette arbejde beskriver en in vitro differentiering protokol til at producere pigmenterede, modne melanocytter fra humane pluripotente stamceller via en neural crest og melanoblast mellemtrin ved hjælp af en feeder-fri, 25 dage protokol.
Introduction
Humane pluripotente stamceller (hPSCs) skabe en platform til at efterligne normal differentiering i en skalerbar mode for sygdom modellering, narkotika screening, og celle udskiftning behandlingsformer 1-6. Af særlig interesse, hPSCs åbner muligheder for at studere vanskeligt at isolere eller sjældne / forbigående celletyper hvor patientprøver er knappe. Endvidere inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) gøre det muligt for forskerne at studere udviklingen og sygdom modellering i en patient specifik måde at optrævle unikke mekanismer 1,2,7-11. Den tidligere offentliggjort protokol til differentiering af melanocytter fra hPSCs kræver op til 6 ugers opdelinger og involverer dyrkning af celler med konditioneret medium fra L-Wnt3a celler 12. Protokollen først præsenteret af Mica et al. Og beskrevet her producerer pigmenterede celler i tre uger, og fjerner den uklarhed og uoverensstemmelser i forbindelse med konditioneret medium.
melanocytter are afledt af crista neuralis, en vandrende population af celler unikke for hvirveldyr. Den neurale crest er defineret under gastrulation og repræsenterer en population af celler på kanten af det neurale plade, der grænser mellem neurale og ikke-neurale ektoderm. Under neurulation, nervevævet udvikler sig fra et neuralt plade til dannelse af neurale folder, der løber sammen i den dorsale midtlinje resulterer i neuralrøret 13,14.
Crista neuralis celler forlader toppladen af det neurale rør, overfor rygstrengen, og undergår en epitelial til mesenkymale overgang før strømme væk for at give anledning til en forskelligartet population af differentierede celler. Skæbner de kamceller er defineret delvist af den anatomiske placering af tagpladen langs legemet akse af embryonet. Neuralkam cellederivater omfatter slægter karakteristiske for både mesoderm (glatte muskelceller, osteoblaster, adipocytter, chondrocytter) og ektoderm celler (melanocytter, Schwann calen, neuroner) 14. Neurale crest stamceller opregulerer transskriptionsfaktoren SOX10 og kan isoleres ved fluorescensaktiveret cellesortering med antistoffer til p75 og HNK1.
De neurale kamceller skæbnesvangre at blive melanocytter passere gennem en melanoblast scene og opregulere KIT og MITF (mikroftalmia-associeret transkriptionsfaktor) 6,21 MITF er en master regulator af melanocyt udvikling og er en transkriptionsfaktor ansvarlig for kontrollen meget af melanocyt udvikling 22- 24. Humane melanoblasts migrere til det basale lag af epidermis, hvor de bor enten i håret bule eller omgivet af keratinocytter i epidermis (dannende pigmentering enheder) til at tjene som forløbere for de modne, pigmenterede melanocytter. Differentieringen og modning af melanoblasts i pigmenterede melanocytter sker samtidig med kolonisering af hår pære og udtryk for melanin produktionen vejen (TYRP1, TYR, OCA2 ogPmel) 25,26.
Isolering humane melanocytter og melanoblasts fra patienter er dyrt, vanskeligt og begrænsende mængde. Denne protokol giver forskerne til at differentiere hPSCs (induceret eller embryonale) i melanocytter eller melanocyt forstadier i et veldefineret, hurtig, reproducerbar, skalerbar og billig metode uden celle sortering. Protokollen blev brugt tidligere til at identificere sygdomsspecifikke defekter når differentiere iPSCs fra patienter med pigmentering lidelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: melanocyt proceduren skitseret her blev først påvist af Mica et al.
1. Forberedelse af Culture Medium, Coated Tallerkener og vedligeholdelse af hPSCs
- Medium Forberedelse
Bemærk: Opbevar alle ved 4 ° C i mørke i op til 2 uger. Filter alle medium for sterilisation.- Forbered DMEM / 10% FBS. Bland 885 ml DMEM, 100 ml FBS, 10 ml Pen / Strep og 5 ml L-glutamin. Filter til sterilisering.
- Forbered hESC-medium. Bland 800 ml DMEM / F12, 200 ml KSR, 5 ml L-glutamin, 10 ml MEM minimum essentielle aminosyrer opløsning, 1 ml p-mercaptoethanol og 5 ml Pen / Strep. Efter filtrering tilsættes 10 ng / ml FGF-2.
- Forbered KSR-differentiering medium: Bland 820 ml Knockout DMEM, 150 ml KSR, 10 ml L-glutamin, 10 ml Pen / Strep, 10 ml MEM minimum essentielle aminosyrer opløsning og 1 ml β-mercaptoethanol. Filter til sterilisering.
- Forbered N2-differentiering medium. Opløs 12 g DMEM / F12 pulver in 980 ml dH 2 O. Tilføj 1,55 g glucose, 2 g natriumbicarbonat og 100 mg apo humant transferrin. Bland 2 ml dH 2 O med 25 mg humant insulin og 40 pi 1 N NaOH; når opløst, tilsæt blandingen til mediet. Tilsæt 100 pi putrescin-dihydrochlorid, 60 pi selenit, 100 pi progesteron. Bring slutvolumenet til 1 liter med dH2O før filtrering.
- Forbered Fuld melanocyt medium. Kombiner 50% Neurobasal medium, 30% lav glukose DMEM, og 20% MCDB201. Til denne add: 0,8% ITS +, 250 nM L-glutamin, 100 uM ascorbinsyre (L-AA), 50 ng / ml koleratoksin, 50 ng / ml SCF, 0,05 uM dexamethason, 100 nM EDN3, 4 ng / ml FGF2 . Sterilfilter derefter tilføje de resterende reagenser: 2% B27 Supplement, 25 ng / ml BMP4, 3 pM CHIR99021, 500 uM cAMP.
- Overfladebehandling af petriskåle
- Udføre belægning hjælp geléagtige protein, såsom Matrigel. Efter åbning, portion og fryse Matrigel i 1 ml dele for at undgå gentagne fryse tø cycles. Tø og re-suspendere en 1 ml frossen portion med 19 ml DMEM / F12. Pladen 5 ml på en 10 cm skål. Inkubér skålene i 1 time ved stuetemperatur. Aspirere den gelatinøse protein umiddelbart før udpladning af cellerne og vask med DMEM / F12.
- Udføre belægning hjælp Poly-L ornithin hydrobromid / mus laminin-I / fibronektin (PO / Lam / FN). Coat skål med PBS indeholdende 15 ug / ml poly-L ornithin hydrobromid. Inkuber O / N ved 37 ° C i en fugtig inkubator. Aspirer opløsningen og vask pladerne med PBS tre gange, før overtrækning med PBS indeholdende 1 pg / ml muse laminin-I og 2 pg / ml fibronectin. Inkubér skålene O / N ved 37 ° C i en fugtig inkubator.
- Før udpladning celler, aspireres opløsningen og lad pladerne tørre grundigt uden låg i vævskultur hætte. Tillad pladerne tørre i ca. 10-15 min.
Bemærk: Skålene er tørre og klar til celleudpladning når krystalstrukturer vises på overfladen ved øjet. Den plates kan holdes med PBS indeholdende LAM / FN i inkubatoren i to uger, så længe væsken ikke fordamper. Pladerne kan holdes tørres ved stuetemperatur i et par timer.
- Før udpladning celler, aspireres opløsningen og lad pladerne tørre grundigt uden låg i vævskultur hætte. Tillad pladerne tørre i ca. 10-15 min.
- Vedligeholdelse af hPSCs
Bemærk: hPSCs opretholdes på 0,1% gelatine og mitotisk inaktiverede muse embryonale fibroblaster (MEF) i embryonale-medium. Cellerne bør opdeles hver 6-8 dage.- Coat en 10 cm skål med 0,1% gelatine i PBS ved stuetemperatur i 5 minutter.
- Optø frosne MEF'er hurtigt i en 37 ° C vandbad.
- Aspirere gelatinen og plade cellerne. Plade MEF'er ved en densitet på ~ 50.000 celler / cm2 i DMEM / 10% FBS. Inkuber MEF'er ved 37 ° CO / N før tilsætning hPSCs.
- Aspirer DMEM / 10% FBS fra den forberedte MEF plade, vask plade med PBS, og der tilsættes 10 ml embryonale-medium med hPSCs. Passage de hPSCs i forholdet 1: 5/10 afhængigt densitet før passage.
Bemærk: Hvis hPSCs bliver optøet eller passeres som enkelte celler, supplement med 10 pM Y-27632 dihydrochlorid (Rocki), indtil den første passage. - Feed celler dagligt med frisk 10 ml embryonale-medium.
- Forud for at starte en differentiering fjerne pluripotente kolonier, der synes at indeholde differentierede celler, uregelmæssige grænser, eller transparente centre 28. Mekanisk fordrive og suge de uregelmæssige kolonier med en pipette under en laminar flow hætte med et dissektionsmikroskop.
2. Plating af hPSCs for Differentiering
Note: Differentiering betingelser er beskrevet i 10 cm skåle.
- Forbered 10 cm Matrigel retter, før du starter differentiering som beskrevet i trin 1.3.1.
- Når plating hPSCs for en differentiering starter med en plade af hPSCs ved en densitet klar til passage (~ 80% konfluente) aspirere hESC-medium, vaskes med PBS, og der tilsættes 3 ml 0,05% trypsin-EDTA til cellerne.
- Rystes kraftigt fadet horizontally i 2 min, mens visualisere under mikroskopet indtil MEF'er løft som enkeltceller. De hPSC kolonier skal blive siddende som kolonier.
- Aspirer trypsin efter MEF har løftet, men før hPSCs kolonier frigøre.
- Der tilsættes 10 ml hESC-medium indeholdende 10 uM Y-27632 dihydrochlorid til pladen og frigøre cellerne ved pipettering op og ned over kolonierne.
- Aspirer Matrigel opløsningen fra 10 cm skål fremstillet i trin 2.1 og vask med DMEM / F12 for at fjerne klumper. Plate de hPSCs ved et 1: 2-forhold på Matrigel pladen. Tilføj hESC-medium indeholdende 10 uM Y-27632 dihydrochlorid op til 10 ml. Der inkuberes ved 37 ° CO / N.
Bemærk: Dette plating bør resultere i cirka 100.000 celler / cm2.
3. Induktion af Neural Differentiation
Bemærk: Differentieringen bør indledes (dag 0), når hPSCs er 80% sammenflydende. Cellerne kan fodres dagligt med embryonale-mediumindeholdende 10 uM Y-27632 dihydrochlorid indtil start differentieringen.
- På dag 0 og dag 1, fodre cellerne med 10 ml KSR-differentiering medium indeholdende 100 nM LDN193189 og 10 uM SB431542.
- På dag 2, fodre cellerne med 10 ml KSR-differentiering medium indeholdende 100 nM LDN193189, 10 uM SB431542 og 3 uM CHIR99021.
- På dag 3 fodre cellerne med 10 ml KSR-differentiering medium indeholdende 10 uM SB431542 og 3 uM CHIR99021.
- På dag 4 og 5 foder cellerne med 15 ml 75% KSR-differentiering medium og 25% N2-differentiering medium indeholdende 3 pM CHIR99021.
Bemærk: Må ikke være foruroliget at se en stor mængde af celledød i form af flydende celler. Dette er normalt og kan forventes. - På dag 6 og 7 foder cellerne med 15 ml 50% KSR-differentiering medium og 50% N2-differentiering medium begge indeholdende 3 pM CHIR99021, 25 ng / ml BMP4, og 100 nM EDN3.
- På dag 8og 9 foder cellerne med 20 ml 25% KSR-differentiering medium og 75% N2-differentiering medium begge indeholdende 3 pM CHIR99021, 25 ng / ml BMP4, og 100 nM EDN3.
- På dage 9 og 10 forberede PO / Lam / FN retter som angivet i 1.2.2 for re-plating af cellerne på dag 11.
- På dag 10 foder celler med 20 ml N2-differentiering medium indeholdende 3 pM CHIR99021, 25 ng / ml BMP4, og 100 nM EDN3.
4. -genudpladning Dråber for NC Specification
- På dag 11 aspirat Lam / FN fra de forberedte PO / LAM / FN plader og tørre helt.
- Fjern mediet fra Day 11 celler, vask med PBS, og der tilsættes 4 ml celle løsrivelse løsning som Accutase pr 10 cm skål. Inkuber i 25 min ved 37 ° C.
- Der tilsættes 5 ml Full Melanocyte medium i skålen og cellerne resuspenderes ved manuelt at pipettere op og ned med en 10 ml pipette, indtil alle celler er løftet fra pladen. Overfør suspensionen til et 15 ml rør.
- Spinceller ned i 5 minutter ved 200 xg og resuspender cellerne ved 2 x 10 6 celler pr ml i Full Melanocyte medium. Tæl celler under anvendelse af trypan-blå-udelukkelse på et hæmocytometer eller tilsvarende teknik.
- Pladen 10 pi dråber nær hinanden (uden dem røre) på de tørrede PO / Lam / FN 10 cm skåle. Hvis pladen er blevet tilstrækkeligt tørret, bør dråberne har veldefinerede kanter og ikke køre.
Bemærk: Dette skaber en høj densitet lokale miljø for cellerne, hvilket er vigtigt, når genudplade cellerne, og samtidig opretholde rum i skålen for ekspansion. - Tillad dråberne at henstå ved stuetemperatur i 10-20 minutter for at tillade celler at adhærere, derefter langsomt (ikke at forstyrre de vedhæftede celler) tilsættes 10 ml Full Melanocyte medium. Flyt parabol til inkubatoren.
5. Udvidelse melanocyt progenitorer
- Fortsæt fodring med Full Melanocyte medium hver 2 til 3 dage.
Bemærk: Pigmentering bør begynde at være synlige wnden klynger af celler ved udgangen af den første uge og blevet meget klart af den anden uge. Vis pladen over en hvid baggrund, såsom et ark papir til at skelne disse tidlige små, mørke klynger. Celler vil blive gradvist mere pigmenteret med tiden, indtil hele pladen er ensartet pigmenteret (se figur 2B). - Passage-celler en gang om ugen i et forhold på ~ 1: 6 (udpladning som dråber ikke længere er nødvendigt på dette trin). Brug Accutase at adskille celler og vask to gange med almindelig Neurobasal medium før genbrug plating i Full Melanocyte medium. Opretholde celler på PO / LAM / FN-plader.
Bemærk: Vi har fundet, at Full Melanocyte mediet er bedst egnet til at fastholde og udbygge embryonale og iPSC-afledte melanocytter. Imidlertid kan celler være kortvarigt dyrket i kommercielt tilgængeligt M254 medium, men den forenklede medier øger risikoen for celler dør og løft fra pladen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol giver en fremgangsmåde til afledning fuldt pigmenterede, modne melanocytter fra hPSCs i en in vitro feeder-fri, omkostningseffektiv, og reproducerbar måde. I modsætning til den tidligere fastsatte Fang et al. Protokol for hPSC-afledte melanocytter, er den skitserede protokol ikke kræver konditioneret medium og reducerer tidsforbrug. Fang et al. Protokol anvendt konditioneret medium fra en Wnt3a-producerende murin cellelinie og tog op til 6 uger at visualisere pigmentering 6,12. Til skævhed de neurale våbenskjold stamceller i retning af en melanocyt skæbne (melanoblasts), fjerner vi BMP og TGF-hæmmere (LDN og SB henholdsvis) efter en tidlig puls og efterfølgende introducere eksogene BMP4 og EDN3 signalering på dag seks og samtidig opretholde Wnt aktivering (CHIR) 6. De resulterende melanoblasts kan karakteriseres ved ekspression af KIT og MITF, samt vedligeholdelse af SOX10 expression 6. Ekspression af SOX10 kan visualiseres i områder i dyrkningsskålen der danner højderygge ved dag 11 kultur (figur 1B - C).
Efter melanoblast induktion cellerne passeres på PO / LAM / FN-plader og fodret med Full Melanocyte medium. Dette er en yderst rigt medium, der har den yderligere fordel af at være selektive for melanocyt befolkning, hvilket eliminerer behovet for noget fluorescerende cellesortering 6. Under melanocyt modning, cellen opregulerer melanin syntese-generne TYR og TYRP1 samtidig bevare mange af de melanoblast gener, herunder TYRP2. Day25 stamcelle afledt melanocytter pletten passende for melanin produktionen proteiner TYRP1 og TYRP2 (figur 2). Denne protokol er robust og har været anvendt med H9 embryonale linje og på tværs af flere IPSC linjer. Senest blev dette protokol, der bruges til at gengive den ul trastructural funktioner i pigmentering sygdomme ved hjælp af patientspecifikke IPSC linjer 6.
Figur 1. Kritiske trin i embryonale-afledte melanocyt differentiering protokol. (A) Differentieringen protokol ordningen. KSR: KSR-differentiering medium, N2: N2-differentiering medium, LDN: LDN193189, SB: SB431542, CHIR: CHIR99021, BMP4: knoglemorfogenetisk protein 4, EDN3: endothelin-3, Rocki: Y-27632 dihydrochlorid B - C. Viser lysfelt (B) og GFP-fluorescens (C) billede af differentiering på dag 11 før genudplade anvendelse af en transgen pSOX10: GFP hESC linje. De mørke kamme synlige i lysfelt billederne er beriget til SOX10 + celler, der vil give anledning til melanoblasts og i sidste ende melanocytter. upload / 53.806 / 53806fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Melanocyte og mellemstadier. (A) pigmenteret Dag 25 celler (til højre) kan nemt visualiseres og fornemme fra dag 11 celler (til venstre), når pelleteret. (B) Ved dag 20 af protokollen kulturen vil indeholde både upigmenterede, med udløb melanocytter og fuldt modne, pigmenterede melanocytter. (C - D) De melanocytter kan visualiseres under lyse felt og både modning og fuldt pigmenterede melanocytter pletten for melanoblast / melanocyt markør TYRP2. (E - F) Kun den pigmenterede melanocytter pletten for sent melanocyt markør TYRP1.få = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For en vellykket differentiering af melanocytter fra hPSCs bør tages hensyn til følgende forslag. Først og fremmest er det vigtigt at arbejde under sterile dyrkningsbetingelser på alle tidspunkter. Desuden er det vigtigt at starte med pluripotent, fuldt udifferentierede hPSCs; hvis startpopulationen indeholder differentierede celler udbyttet vil uvægerligt falde som forureningerne ikke kan rette sig mod melanocytter og kan endda yderligere forstyrre korrekt differentierende celler.
For at sikre at cellerne forbliver pluripotente sørge for at holde sig til de veletablerede regler for stamcelle vedligeholdelse foder og passage regelmæssigt og gommen kulturerne for at fjerne differentierede celler før passage. Når passage onto gelatinøse protein for differentiering er det vigtigt, at skålen er korrekt belagt for at forhindre celler i at løfte ud i løbet af differentiering.
Den Melanoblast adskillerrentiering bør indledes omkring 80% celledensitet; for høje tætheder vil føre til øget celledød mens for lave tætheder negativt vil påvirke differentiering. Når passage, skal cellerne vaskes to gange for at fjerne eventuelt Cellefrigørelse opløsning før udpladning. For at maksimere overlevelse på dag 11, er det vigtigt at passage af cellerne i høj massefylde, godt fordelte dråber, der er uberørt i 20 min, således at cellerne klynge og adhærere.
Denne protokol er effektiv til at generere et stort antal melanocytter, og vil være værdifulde, når studere humane patientprøver af begrænset mængde. Som PSC-afledte melanocyt befolkning er selektiv og udvides den melanocyt befolkning kan multipliceres til meget store antal celler, selv om differentiering udbytter lave tal eller procenter af melanocytter. Start af protokollen med iPSCs åbner mulighed for at studere udviklingsmæssige sygdomme og patientspecifikke prøver. én limitation af denne protokol er det faktum, at melanocytter er afledt som en monokultur, uden at alle andre celletyper tilstedeværende, der danner deres normale niche in vivo. Desuden protokollen kræver ekspertise i hPSC kultur og differentiering teknikker. Men med den seneste udvikling i IPSC felt producerer hPSCs er blevet stadig mere håndterbare og metoder til dyrkning hPSCs blevet rutine. Til dato har den protokol blevet udnyttet i vores laboratorium til fremstilling af melanocytter fra H9 hES linje, samt fra 14 iPS linjer genereret fra 5 forskellige donorer.
Mica et al. Brugt denne protokol med succes for afledningen af melanocytter fra menneskelige embryonale og iPSCs 6. Papiret viste, at iPSCs afledt fra patienter med pigmentering defekter kan opdeles i melanocytter og protokollen trofast producerede melanosomer af den fænotypiske størrelse og mængde forbundet med sygdommen.
work illustrerede en af mange mulige anvendelser for protokollen med brug af iPSC-afledte melanocytter for at studere sygdomsmekanismer og indført mulighed for opskalering af produktionen for narkotika screening 6,29. Vigtigt er det, at papiret viste robusthed og reproducerbarhed af protokollen til at producere melanocytter fra et stort sæt af genetisk forskellige hiPSC linjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen modstridende interesser til at videregive.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af et stipendium for melanom forskere fra Joanna M. Nicolay Foundation og National Institutes of Health i henhold Ruth L. Kirschstein National Research Service Award F31. Dette arbejde blev yderligere understøttet gennem tilskud fra NYSTEM og Tri-institutionelle stamcelle-initiativet (Starr Foundation).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| apo human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Ascorbic Acid (L-AA) | Sigma | A4034 | 100 mM |
| B27 (B27 Supplement) | Invitrogen | 17504044 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | 10 mg/ml |
| BMP4 | R&D Systems | 314-bp | |
| CHIR99021 | Tocris-R&D Systems | 4423 | 6 mM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | 50 mg/ml |
| cAMP (cyclicAMP) | Sigma | D0627 | 100 mM |
| Dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | 50 μM |
| DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco-Life Technologies | 11985-092 | |
| DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Life Technologies | 1133--032 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| EDN3 (Endothelin-3, human) | American Peptide Company | 88-5-10B | 100 μM |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | 200 μg/ml |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | 0.1% in PBS | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Human insulin | Sigma | I2643 | |
| ITS+ Universal Culture Supplement Premix | BD Biosciences | 354352 | |
| KSR (Knockout Serum Replacement) | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | 100 mM |
| Low glucose DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | Dissolve 1:20 in DMEM/F12 |
| MCDB201 Medium | Sigma | M6770 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-080 | |
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-8105M | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | 1 mg/ml |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/ml |
| Poly-L Omithin hydrobromide | Sigma | P3655 | 15 mg/ml |
| Progesterone | Sigma | P8783 | 0.032 g in 100 ml 100% ethanol |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| FGF2 (Recombinant human FGF basic) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | 10 mg/ml |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1814 | 10 mM |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| SCF (Stem Cell Factor, recombinant Human) | Peprotech Inc. | 300-07 | 50 μg/ml |
| TYRP1 (G-17) Antibody | Santa Cruz | 10443 | 1:200 |
| TYRP2 Antibody | Abcam | 74073 | 1:200 |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | 10 mM |
References
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
- Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat methods. 7, 25-27 (2010).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ health persp. 120, 1116-1122 (2012).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell rep. 3, 1140-1152 (2013).
- Mariani, J., et al. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162, 375-390 (2015).
- Doulatov, S., et al. Modeling Diamond Blackfan Anemia in Vivo Using Human Induced Pluripotent Stem Cells. Blood. 124, (2014).
- Cherry, A. B. C., Daley, G. Q. Reprogrammed Cells for Disease Modeling and Regenerative Medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
- Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. Embo J. 33, 409-417 (2014).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494, 105-110 (2013).
- Fang, D., et al. Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells. Stem cells. 24, 1668-1677 (2006).
- Huang, X., Saint-Jeannet, J. P. Induction of the neural crest and the opportunities of life on the edge. Dev biol. 275, 1-11 (2004).
- White, R. M., Zon, L. I. Melanocytes in development, regeneration, and cancer. Cell stem cell. 3, 242-252 (2008).
- Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell. 96, 737-749 (1999).
- Elworthy, S., Pinto, J. P., Pettifer, A., Cancela, M. L., Kelsh, R. N. Phox2b function in the enteric nervous system is conserved in zebrafish and is sox10-dependent. Mech develop. 122, 659-669 (2005).
- Harris, M. L., Baxter, L. L., Loftus, S. K., Pavan, W. J. Sox proteins in melanocyte development and melanoma. Pigm cell melanoma r. 23, 496-513 (2010).
- Herbarth, B., et al. Mutation of the Sry-related Sox10 gene in Dominant megacolon, a mouse model for human Hirschsprung disease. PNAS. 95, 5161-5165 (1998).
- Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nat genetics. 18, 60-64 (1998).
- Dupin, E., Glavieux, C., Vaigot, P., Le Douarin, N. M. Endothelin 3 induces the reversion of melanocytes to glia through a neural crest-derived glial-melanocytic progenitor. PNAS. 97, 7882-7887 (2000).
- Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate. Development. 126, 3757-3767 (1999).
- Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF. Development. 127, 5379-5389 (2000).
- Levy, C., Khaled, M., Fisher, D. E. MITF: master regulator of melanocyte development and melanoma oncogene. Trends mol med. 12, 406-414 (2006).
- Phung, B., Sun, J., Schepsky, A., Steingrimsson, E., Ronnstrand, L. C-KIT signaling depends on microphthalmia-associated transcription factor for effects on cell proliferation. PloS one. 6, e24064 (2011).
- Grichnik, J. M., et al. KIT expression reveals a population of precursor melanocytes in human skin. J invest dermatol. 106, 967-971 (1996).
- Li, L., et al. Human dermal stem cells differentiate into functional epidermal melanocytes. J cell sci. 123, 853-860 (2010).
- Nishimura, E. K., et al. Dominant role of the niche in melanocyte stem-cell fate determination. Nature. 416, 854-860 (2002).
- Zur Nieden, N. I. Embryonic stem cell therapy for osteo-degenerative diseases : methods and protocols. , Humana Press. (2011).
- Lee, J. H., et al. high-content screening for novel pigmentation regulators using a keratinocyte/melanocyte co-culture system. Exp dermatol. 23, 125-129 (2014).
