Summary
Dit werk beschrijft een in vitro differentiatie protocol bij gepigmenteerde, volwassen melanocyten uit menselijke pluripotente stamcellen te produceren via een neurale en melanoblast tussenstap met behulp van een feeder-vrij, 25 dagen protocol.
Introduction
Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) bieden een platform om de normale differentiatie na te bootsen in een schaalbare manier voor de ziekte modelleren, drug discovery, en cel vervangende therapieën 1-6. Van bijzonder belang, hPSCs openstellen van mogelijkheden voor het bestuderen van moeilijk te isoleren of zeldzame / transient types cel waar de patiënt monsters zijn schaars. Bovendien, geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) onderzoekers in staat om ontwikkeling en ziekte modelleren studeren in een patiënt specifieke manier om unieke mechanismen 1,2,7-11 ontrafelen. De eerder gepubliceerde protocol voor differentiatie van melanocyten uit hPSCs is maximaal 6 weken differentiaties en omvat het kweken van cellen met geconditioneerd medium van L- Wnt3a 12 cellen. Het protocol voor het eerst gepresenteerd door Mica et al., En hier beschreven produceert gepigmenteerde cellen in drie weken en verwijdert de dubbelzinnigheid en inconsistenties in verband met geconditioneerd medium.
melanocyten are afgeleid van de neurale kam, een trekkende populatie cellen uniek vertebraten. De neurale gedefinieerd tijdens gastrulatie en vertegenwoordigt een populatie cellen aan de rand van de neurale plaat, grenzend tussen de neurale en niet-neurale ectoderm. Tijdens neurulatie, het zenuwweefsel evolueert van een neurale plaat neurale plooien, die convergeren in de dorsale middellijn waardoor de neurale buis 13,14 vormen.
De neurale cellen die voortkomen uit de dakplaat van de neurale buis, tegenover de notochord en een epitheliale naar mesenchymale transitie ondergaan vóór de migratie weg om tot een diverse bevolking van gedifferentieerde cellen te geven. Het lot van de kam cellen op een deel van de anatomische locatie van de dakplaat langs de lichaamsas van het embryo. Neurale cel derivaten omvatten lineages kenmerkend zowel mesoderm (gladde spiercellen, osteoblasten, adipocyten, chondrocyten) en ectoderm (melanocyten, Schwann cells, neuronen) 14. Neurale stamcellen reguleert de transcriptiefactor SOX10 en kan worden geïsoleerd door fluorescentie-geactiveerde celsortering met antilichamen tegen p75 en HNK1.
De neurale cellen gedoemd om te worden melanocyten passeren een melanoblast podium en upregulate KIT en MITF (-microphthalmia geassocieerde transcriptiefactor) 6,21 MITF is een meester regulator van melanocyten ontwikkeling en is een transcriptiefactor die verantwoordelijk is voor het besturen van een groot deel van melanocyten ontwikkeling 22- 24. Menselijke melanoblasten migreren naar de basale laag van de epidermis wanneer zij ofwel in het haar of uitstulping omgeven door keratinocyten in de epidermis (pigmentatie vormende eenheden) fungeren als voorlopers van de rijpe, gepigmenteerde melanocyten bevinden. De differentiatie en rijping van melanoblasten in gepigmenteerde melanocyten gebeurt gelijktijdig met de kolonisatie van de haarbol en expressie van het melanine traject (TYRP1, TYR, en OCA2PMEL) 25,26.
Het isoleren van menselijke melanocyten en melanoblasten van patiënten is duur, moeilijk en het beperken in kwantiteit. Dit protocol stelt onderzoekers in staat om hPSCs (geïnduceerd of embryonale) in de melanocyten of melanocyt voorlopers differentiëren in een goed gedefinieerde, snelle, reproduceerbare, schaalbare en goedkope methode zonder celsortering. Het protocol werd vroeger gebruikt om de ziekte-specifieke afwijkingen identificeren wanneer differentiëren iPSCs van patiënten met pigmentatie stoornissen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LET OP: De melanocyten protocol hier beschreven werd voor het eerst gedemonstreerd door Mica et al.
1. Voorbereiding van Cultuur Medium, Coated Schotels en onderhoud van hPSCs
- mediumbereiding
Opmerking: Bewaar alle bij 4 ° C in het donker gedurende maximaal 2 weken. Filter alle medium voor sterilisatie.- Bereid DMEM / 10% FBS. Meng 885 ml DMEM, 100 ml FBS, 10 ml Pen / Strep en 5 ml L-glutamine. Filter voor sterilisatie.
- Bereid hESC-medium. Meng 800 ml DMEM / F12, 200 ml KSR, 5 ml L-Glutamine, 10 ml MEM minimale essentiële aminozuren oplossing, 1 ml β-mercaptoethanol en 5 ml Pen / Strep. Na affiltreren voeg 10 ng / ml FGF-2.
- Bereid KSR-differentiatie medium: Meng 820 ml Knockout DMEM, 150 ml KSR, 10 ml L-glutamine, 10 ml Pen / Strep, 10 ml MEM minimum essentiële aminozuren oplossing en 1 ml β-Mercaptoethanol. Filter voor sterilisatie.
- Bereid N2-differentiatiemedium. Los op 12 g DMEM / F12 poeder in 980 ml dH 2 O. Voeg 1,55 g glucose, 2 g natriumbicarbonaat en 100 mg apo humaan transferrine. Meng 2 ml dH 2 O met 25 mg humane insuline en 40 pi 1 N NaOH; eenmaal opgelost, voeg het mengsel aan het medium. Voeg 100 ul putrescine dihydrochloride, 60 pl seleniet, 100 ul progesteron. Breng het uiteindelijke volume tot 1 l met dH 2 O voor filtering.
- Bereid Volledige melanocyten medium. Combineer 50% Neurobasal medium, 30% Lage glucose DMEM, en 20% MCDB201. Om deze add: 0,8% ITS +, 250 nM L-glutamine, 100 uM ascorbinezuur (L-AA), 50 ng / ml Cholera toxine, 50 ng / ml SCF, 0,05 uM dexamethason, 100 nM EDN3, 4 ng / ml FGF2 . Steriel filter voeg dan de resterende reagentia: 2% B27 supplement, 25 ng / ml BMP4, 3 urn CHIR99021, 500 uM cAMP.
- Coating van Cultuur Gerechten
- Verricht coaten met behulp van gelatine-achtige eiwit zoals Matrigel. Bij de opening, hoeveelheid en vries Matrigel tot 1 ml delen om herhaalde vries dooi c voorkomenycles. Dooi en opnieuw op te schorten een 1 ml bevroren monster met 19 ml DMEM / F12. Plaat 5 ml op een 10 cm schaal. Incubeer de gerechten gedurende 1 uur bij KT. Zuig het gelatineuze eiwit direct voor het uitplaten van de cellen en wassen met DMEM / F12.
- Verricht coating met behulp van Poly-L ornithin hydrobromide / muis laminine-I / fibronectine (PO / Lam / FN). Coat schotel met PBS dat 15 ug / ml Poly-L ornithin hydrobromide. Incubeer O / N bij 37 ° C in een bevochtigde incubator. Verstuif de oplossing en wassen van de platen met PBS driemaal eerder coaten met PBS dat 1 ug / ml muizen-laminine I en 2 ug / ml fibronectine. Incubeer de gerechten O / N bij 37 ° C in een bevochtigde incubator.
- Voorafgaand aan plating cellen, zuigen de oplossing en laat de platen drogen zonder deksel in de weefselkweek kap. Laat de platen drogen gedurende ongeveer 10-15 min.
Opmerking: De gerechten zijn droog en klaar voor mobiele plating wanneer kristalstructuren verschijnen op het oppervlak op het oog. de plates kan met PBS dat LAM / FN in de incubator gedurende twee weken, zolang de vloeistof verdampt niet bewaard. De platen kunnen gedroogd bij kamertemperatuur gedurende enkele uren bewaard.
- Voorafgaand aan plating cellen, zuigen de oplossing en laat de platen drogen zonder deksel in de weefselkweek kap. Laat de platen drogen gedurende ongeveer 10-15 min.
- Onderhoud van hPSCs
Opmerking: hPSCs worden gehandhaafd op 0,1% gelatine en mitotisch geïnactiveerde muis embryonale fibroblasten (MEF) in hESC-medium. De cellen dienen om de 6-8 dagen verdeeld.- Coat een 10 cm schaal met 0,1% gelatine in PBS bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Ontdooi bevroren MEFs snel in een 37 ° C waterbad.
- Zuig het gelatine en het bord van de cellen. MEFs plaat bij een dichtheid van ~ 50.000 cellen / cm2 in DMEM / 10% FBS. Incubeer bij 37 ° MEF CO / N voorafgaand aan het toevoegen hPSCs.
- Zuig het DMEM / 10% FBS uit de voorbereide MEF plaat, wassen plaat met PBS en voeg 10 ml hESC-medium met hPSCs. Passage de hPSCs in een verhouding van 1: 5/10 afhankelijk dichtheid voorafgaand aan passage.
Opmerking: Als de hPSCs worden ontdooid of gepasseerd als enkele cellen, supcomplement met 10 uM Y-27632 dihydrochloride (Rocki) tot de eerste passage. - Voeden cellen dagelijks met verse 10 ml hESC-medium.
- Voorafgaand aan het starten van een differentiatie verwijder pluripotente kolonies die verschijnen om gedifferentieerde cellen, onregelmatige randen, of transparante centra 28 bevatten. Mechanisch los en zuig het onregelmatige kolonies met een pipet onder een laminaire stroming kap met een dissectie microscoop.
2. Plating van hPSCs voor differentiatie
Opmerking: Differentiatie zijn beschreven voor de 10 cm schalen.
- Bereid 10 cm Matrigel gerechten voordat de differentiatie zoals beschreven in stap 1.3.1.
- Wanneer plating hPSCs een differentiatie beginnen met een plaat van hPSCs een dichtheid klaar voor passage (~ 80% confluent) zuig het hESC-medium, wassen met PBS en voeg 3 ml 0,05% trypsine-EDTA op de cellen.
- Schud de schotel horizontally voor 2 minuten onder te visualiseren onder de microscoop tot MEF tillen als enkele cellen. De HPSC kolonies moet vast blijven zitten als kolonies.
- Zuig het trypsine na de MEF hebben opgeheven, maar voordat de hPSCs kolonies los te maken.
- Voeg 10 ml van hESC-medium dat 10 uM Y-27632 dihydrochloride op de plaat en maak de cellen door pipetteren op en neer over de koloniën.
- Zuig het Matrigel oplossing uit de 10 cm schotel bereid in stap 2.1 en wassen met DMEM / F12 om klonten te verwijderen. Plate de hPSCs bij een 1: 2 verhouding op de Matrigel plaat. Voeg hESC-medium dat 10 uM Y-27632 dihydrochloride tot 10ml. Incubeer bij 37 ° CO / N.
Opmerking: Deze laag moet leiden tot ongeveer 100.000 cellen / cm2.
3. Inductie van neurale differentiatie
Opmerking: Het onderscheid moet worden gestart (dag 0) als de hPSCs zijn 80% confluent. De cellen kunnen dagelijks worden gevoed met hESC-mediummet 10 pM Y-dihydrochloride 27.632 tot begin de differentiatie.
- Op dag 0 en dag 1, voeden de cellen met 10 ml KSR differentiatie medium bevattende 100 nM en 10 uM LDN193189 SB431542.
- Op dag 2, voeden de cellen met 10 ml KSR differentiatie medium bevattende 100 nM LDN193189, 10 pM SB431542 en 3 uM CHIR99021.
- Op dag 3, voeden de cellen met 10 ml KSR differentiatie medium dat 10 uM SB431542 en 3 uM CHIR99021.
- Op dag 4 en 5 voer de cellen met 15 ml 75% KSR-differentiatiemedium en 25% N2-differentiatie medium dat 3 uM CHIR99021.
Let op: Wees niet gealarmeerd om een grote hoeveelheid van celdood te zien in termen van zwevende cellen. Dit is normaal en te verwachten. - Op dagen 6 en 7 voer de cellen met 15 ml 50% KSR-differentiatiemedium en 50% N2-differentiatiemedium beide met 3 uM CHIR99021, 25 ng / ml BMP4 en 100 nM EDN3.
- Op dagen 89 en voer de cellen met 20 ml 25% KSR-differentiatiemedium en 75% N2-differentiatiemedium beide met 3 uM CHIR99021, 25 ng / ml BMP4 en 100 nM EDN3.
- Op dagen 9 en 10 voor te bereiden PO / Lam / FN gerechten zoals aangegeven in 1.2.2 voor re-plating van de cellen op dag 11.
- Op dag 10 voer cellen met 20 ml N2-differentiatie medium dat 3 uM CHIR99021, 25 ng / ml BMP4 en 100 nM EDN3.
4. replating in Droplets voor NC Specification
- Op dag 11 aspireren Lam / FN van de voorbereide PO / LAM / FN borden en droog volledig.
- Verwijder medium uit de Dag 11 cellen, wassen met PBS en voeg 4 ml cel onthechting oplossing zoals Accutase per 10 cm schotel. Incubeer gedurende 25 minuten bij 37 ° C.
- Voeg 5 ml Volledige Melanocyte medium om de schotel en resuspendeer de cellen door handmatig en neer te pipetteren met een 10 ml pipet totdat alle cellen van de plaat zijn opgeheven. Breng de suspensie aan een 15 ml buis.
- Spin decellen die voor 5 min bij 200 xg en resuspendeer de cellen bij 2 x 10 6 cellen per ml in volledig medium melanocyten. Tel de cellen met behulp van de trypan blauw exclusie op een hemocytometer of gelijkwaardige techniek.
- Plaat 10 pl druppels dicht bij elkaar (zonder aan te raken) op de gedroogde PO / Lam / FN 10 cm schalen. Als de plaat voldoende is gedroogd, moet de druppels goed gedefinieerde randen en niet lopen.
Opmerking: Dit creëert een hoge dichtheid omgevingskwaliteit cellen, wat belangrijk is wanneer de cellen opnieuw platen, met behoud van ruimte in de schotel voor uitbreiding. - Laat de druppels bij kamertemperatuur staan gedurende 10-20 minuten om cellen te hechten, dan langzaam (niet de gehechte cellen verstoren) voeg 10 ml van volledige Melanocyte medium. Verplaats schotel naar de incubator.
5. Uitbreiding Melanocyt Progenitors
- Blijven voeden met Full Melanocyt medium elke 2 tot 3 dagen.
Opmerking: pigmentatie moet beginnen zichtbaar w te zijnedurende clusters van cellen door het einde van de eerste week en wordt duidelijk door de tweede week. Bekijk de plaat op een witte achtergrond, zoals een vel papier om deze vroege kleine, donkere clusters onderscheiden. Cellen zullen geleidelijk gepigmenteerde loop van de tijd, totdat de hele plaat gelijkmatig gepigmenteerde (zie figuur 2B). - Passage cellen eenmaal per week in een verhouding van ~ 1: 6 (plateren zoals druppels niet langer noodzakelijk in dit stadium). Gebruik Accutase om cellen te scheiden en tweemaal wassen met gewoon Neurobasal medium vooraleer opnieuw plating in Full Melanocyt medium. Handhaaf cellen op PO / LAM / FN platen.
Let op: We hebben gemerkt dat de Full Melanocyt medium is het meest geschikt voor het behoud en de uitbreiding van hESC en iPSC-afgeleide melanocyten. Echter kunnen cellen kort gekweekt in commercieel verkrijgbaar M254 medium maar de vereenvoudigde media verhoogt het risico van afsterven en tillen van de plaat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol verschaft een werkwijze voor het afleiden volledig gepigmenteerde volwassen melanocyten uit hPSCs in een in vitro voedingsvrije, kostenefficiënt en reproduceerbare wijze. In tegenstelling tot de eerder vastgestelde Fang et al. Protocol HPSC-afgeleide melanocyten, heeft de geschetste protocol niet geconditioneerd medium vereist en vermindert de vereiste tijd. Fang et al. Protocol gebruikt geconditioneerd medium van een Wnt3a-producerende cellijn van muis en nam tot 6 weken pigmentstoringen 6,12 visualiseren. Om vertekening van de neurale stamcellen naar een melanocyten lot (melanoblasten), verwijderen we de BMP en TGF-remmers (respectievelijk LDN en SB) na een vroege puls en vervolgens exogene BMP4 en EDN3 introduceren signalering op dag zes behoud Wnt activering (CHIR) 6. De resulterende melanoblasten kan worden gekarakteriseerd door expressie van KIT en MITF, en het onderhoud van SOX10 exprsessieschijven 6. Expressie van SOX10 kunnen worden gevisualiseerd in de gebieden in de cultuur schotel die ribbels op dag 11 cultuur (Figuur 1B - C) te vormen.
Na melanoblast inductie worden de cellen gepasseerd op PO / LAM / FN borden en gevoed met Full Melanocyt medium. Dit is een zeer rijk medium dat het extra voordeel van selectiviteit voor de melanocyt bevolking, waardoor de noodzaak voor een fluorescent geactiveerde celsortering 6 heeft. Tijdens melanocyt rijping, de cel reguleert de melanine synthese genen TYR en TYRP1 behoud vele melanoblast genen, waaronder TYRP2. Day25 stamcellen afgeleid melanocyten vlek op passende wijze voor de productie van melanine eiwitten TYRP1 en TYRP2 (figuur 2). Dit protocol is robuust en is gebruikt bij de H9 hESC lijn en tussen verschillende iPSC lijnen. Recentelijk werd dit protocol gebruikt om natuurgetrouwe weergave van de ul trastructural kenmerken van pigmentatie aandoeningen met behulp van patiënt-specifieke iPSC lijnen 6.
Figuur 1. Kritische stappen in de hESC-afgeleide melanocyt differentiatie protocol. (A) De differentiatie protocol regeling. KSR: KSR-differentiatie medium, N2: N2-differentiatie medium, LDN: LDN193189, SB: SB431542, CHIR: CHIR99021, BMP4: Bone morfogenetische eiwit 4, EDN3: endotheline-3, Rocki: Y-27632 dihydrochloride B - C. Toont GFP fluorescentie (C) beeld van differentiatie helderveld (B) en op dag 11 voorafgaand aan het opnieuw platen met behulp van een transgene pSOX10: GFP hESC lijn. De donkere randen zichtbaar in de helderveld beelden verrijkt zijn SOX10 + cellen die tot melanoblasten en uiteindelijk melanocyten geven. uploaden / 53806 / 53806fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. melanocyten en tussenstappen. (A) De gepigmenteerde Dag 25 cellen (rechts) kan gemakkelijk worden gevisualiseerd en onderscheiden van dag 11-cellen (links) bij gepelleteerd. (B) Op dag 20 van het protocol van de cultuur zowel ongepigmenteerde, rijpen melanocyten en volgroeid, gepigmenteerde melanocyten zal bevatten. (C - D) De melanocyten kan worden gevisualiseerd onder felle veld en zowel de rijping en volledig gepigmenteerde melanocyten vlek voor de melanoblast / melanocyten marker TYRP2. (E - F) Alleen de gepigmenteerde melanocyten vlek voor de late stadium melanocyten marker TYRP1.krijgen = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voor de succesvolle differentiatie van melanocyten uit hPSCs de volgende suggesties in overweging moeten worden genomen. Allereerst is het noodzakelijk om onder steriele kweekomstandigheden te allen tijde. Daarnaast is aangevangen met pluripotente volledig ongedifferentieerde hPSCs; indien de startpopulatie gedifferentieerde cellen bevat zal de opbrengst steeds dalen als de verontreinigingen niet kunnen worden gericht op melanocyten en kunnen verder verstoren de juiste differentiërende cellen.
Om ervoor te zorgen de cellen blijven pluripotente zorg te houden aan de gevestigde regels voor stamceltransplantatie onderhoud; voeden en passage regelmatig en bruidegom de culturen gedifferentieerde cellen te verwijderen voordat passage. Bij passage op gelatineachtige eiwitten differentiatie is het belangrijk dat de Schotel bekleed voorkomen cellen uit tillen tijdens de differentiatie.
De melanoblast verschillenentiation moet worden gestart rond de 80% celdichtheid; te hoge dichtheden zal leiden tot meer celdood terwijl een te lage dichtheden negatief differentiatie zal beïnvloeden. Bij passage, moeten de cellen tweemaal gewassen worden naar een cel detachement oplossing te verwijderen voordat plating. Overleving op dag 11 te maximaliseren is het van belang om de passage van de cellen in hoge dichtheid, goed gespreid druppels die onaangetast 20 min zijn, zodat de cellen cluster en hechten.
Dit protocol is effectief in het genereren van een groot aantal melanocyten, en zal waardevol zijn bij het bestuderen van menselijke patiënt monsters van beperkte hoeveelheid. Zoals de PVC-afgeleide melanocyt bevolking en selectief expandeerbaar de melanocyt populatie kan worden vermenigvuldigd tot zeer grote aantallen cellen zelfs wanneer de differentiatie opbrengsten laag aantal of percentage melanocyten. Initiëren van het protocol met iPSCs opent de mogelijkheid voor het bestuderen van de ontwikkeling van ziekten en patiënt-specifieke monsters. Eén limitation van dit protocol is het feit dat de melanocyten worden verkregen als monocultuur niet alle celtypen aanwezig dat de normale niche in vivo te vormen. Verder is het protocol vereist expertise in HPSC cultuur en differentiatie technieken. Echter, met de recente ontwikkelingen op het gebied van het produceren van iPSC hPSCs steeds beheersbaar geworden en methoden voor het kweken van hPSCs zijn routine geworden. Tot op heden heeft het protocol is gebruikt in ons lab om melanocyten uit de H9 hES lijn, evenals uit 14 iPS lijnen gegenereerd uit 5 verschillende donoren te produceren.
Mica et al. Gebruikten dit protocol met succes voor de afleiding van melanocyten uit menselijke hESC en iPSCs 6. Het papier aangetoond dat iPSCs afkomstig van patiënten met defecten pigmentatie kan worden onderscheiden in melanocyten en het protocol getrouw geproduceerde melanosomen van de fenotypische grootte en de hoeveelheid geassocieerd met de ziekte.
de work geïllustreerd één van de vele mogelijke toepassingen voor het protocol met het gebruik van iPSC-afgeleide melanocyten voor het bestuderen van ziektemechanismen en introduceerde de mogelijkheid tot opschaling van de productie voor drug discovery 6,29. Belangrijk is dat de krant toonde de robuustheid en reproduceerbaarheid van het protocol bij melanocyten te produceren uit een grote verzameling van genetisch onderscheiden iPSC lijnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicterende belangen te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een beurs voor melanoom onderzoekers van de Joanna M. Nicolay Foundation en door de National Institutes of Health onder Ruth L. Kirschstein National Research Service Award F31. Dit werk werd verder ondersteund door middel van subsidies uit NYSTEM en de Tri-institutionele stamcel-initiatief (Starr Foundation).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| apo human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Ascorbic Acid (L-AA) | Sigma | A4034 | 100 mM |
| B27 (B27 Supplement) | Invitrogen | 17504044 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | 10 mg/ml |
| BMP4 | R&D Systems | 314-bp | |
| CHIR99021 | Tocris-R&D Systems | 4423 | 6 mM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | 50 mg/ml |
| cAMP (cyclicAMP) | Sigma | D0627 | 100 mM |
| Dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | 50 μM |
| DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco-Life Technologies | 11985-092 | |
| DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Life Technologies | 1133--032 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| EDN3 (Endothelin-3, human) | American Peptide Company | 88-5-10B | 100 μM |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | 200 μg/ml |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | 0.1% in PBS | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Human insulin | Sigma | I2643 | |
| ITS+ Universal Culture Supplement Premix | BD Biosciences | 354352 | |
| KSR (Knockout Serum Replacement) | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | 100 mM |
| Low glucose DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | Dissolve 1:20 in DMEM/F12 |
| MCDB201 Medium | Sigma | M6770 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-080 | |
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-8105M | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | 1 mg/ml |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/ml |
| Poly-L Omithin hydrobromide | Sigma | P3655 | 15 mg/ml |
| Progesterone | Sigma | P8783 | 0.032 g in 100 ml 100% ethanol |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| FGF2 (Recombinant human FGF basic) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | 10 mg/ml |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1814 | 10 mM |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| SCF (Stem Cell Factor, recombinant Human) | Peprotech Inc. | 300-07 | 50 μg/ml |
| TYRP1 (G-17) Antibody | Santa Cruz | 10443 | 1:200 |
| TYRP2 Antibody | Abcam | 74073 | 1:200 |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | 10 mM |
References
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
- Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat methods. 7, 25-27 (2010).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ health persp. 120, 1116-1122 (2012).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell rep. 3, 1140-1152 (2013).
- Mariani, J., et al. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162, 375-390 (2015).
- Doulatov, S., et al. Modeling Diamond Blackfan Anemia in Vivo Using Human Induced Pluripotent Stem Cells. Blood. 124, (2014).
- Cherry, A. B. C., Daley, G. Q. Reprogrammed Cells for Disease Modeling and Regenerative Medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
- Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. Embo J. 33, 409-417 (2014).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494, 105-110 (2013).
- Fang, D., et al. Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells. Stem cells. 24, 1668-1677 (2006).
- Huang, X., Saint-Jeannet, J. P. Induction of the neural crest and the opportunities of life on the edge. Dev biol. 275, 1-11 (2004).
- White, R. M., Zon, L. I. Melanocytes in development, regeneration, and cancer. Cell stem cell. 3, 242-252 (2008).
- Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell. 96, 737-749 (1999).
- Elworthy, S., Pinto, J. P., Pettifer, A., Cancela, M. L., Kelsh, R. N. Phox2b function in the enteric nervous system is conserved in zebrafish and is sox10-dependent. Mech develop. 122, 659-669 (2005).
- Harris, M. L., Baxter, L. L., Loftus, S. K., Pavan, W. J. Sox proteins in melanocyte development and melanoma. Pigm cell melanoma r. 23, 496-513 (2010).
- Herbarth, B., et al. Mutation of the Sry-related Sox10 gene in Dominant megacolon, a mouse model for human Hirschsprung disease. PNAS. 95, 5161-5165 (1998).
- Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nat genetics. 18, 60-64 (1998).
- Dupin, E., Glavieux, C., Vaigot, P., Le Douarin, N. M. Endothelin 3 induces the reversion of melanocytes to glia through a neural crest-derived glial-melanocytic progenitor. PNAS. 97, 7882-7887 (2000).
- Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate. Development. 126, 3757-3767 (1999).
- Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF. Development. 127, 5379-5389 (2000).
- Levy, C., Khaled, M., Fisher, D. E. MITF: master regulator of melanocyte development and melanoma oncogene. Trends mol med. 12, 406-414 (2006).
- Phung, B., Sun, J., Schepsky, A., Steingrimsson, E., Ronnstrand, L. C-KIT signaling depends on microphthalmia-associated transcription factor for effects on cell proliferation. PloS one. 6, e24064 (2011).
- Grichnik, J. M., et al. KIT expression reveals a population of precursor melanocytes in human skin. J invest dermatol. 106, 967-971 (1996).
- Li, L., et al. Human dermal stem cells differentiate into functional epidermal melanocytes. J cell sci. 123, 853-860 (2010).
- Nishimura, E. K., et al. Dominant role of the niche in melanocyte stem-cell fate determination. Nature. 416, 854-860 (2002).
- Zur Nieden, N. I. Embryonic stem cell therapy for osteo-degenerative diseases : methods and protocols. , Humana Press. (2011).
- Lee, J. H., et al. high-content screening for novel pigmentation regulators using a keratinocyte/melanocyte co-culture system. Exp dermatol. 23, 125-129 (2014).
