Summary
Bu çalışma, bir nöral ile insan pluripotent kök hücreleri pigmentli olgun melanosit üretilmesi ve besleyici içermeyen, 25 günlük protokolünü kullanarak ara madde aşama melanoblast için bir in vitro farklılaşma protokolü tarif eder.
Introduction
Insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) hastalığı modelleme, ilaç tarama ve hücre replasman tedavileri 1-6 için ölçeklenebilir bir şekilde normal farklılaşma taklit etmek bir platform sağlar. Özellikle ilgi çekici, hPSCs izole etmek zor veya hasta numunelerinin kıt nadir / geçici hücre tipleri çalışmak için yollar açmak. Ayrıca, uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) benzersiz mekanizmaları 1,2,7-11 çözülmeye hasta belirli bir şekilde gelişmesini ve hastalık modelleme incelemek için araştırmacılar sağlar. HPSCs gelen melanosit farklılaşması için önce yayınlanan bir protokolün farklılaşmalar 6 haftaya kadar gerekmektedir ve L-Wnt3a hücreleri 12 kıvamlandırılmış ortamı ile kültür hücreleri içerir. Protokol ilk Mika ve arkadaşları tarafından sunulan. Ve tarif burada üç hafta içinde pigmentli hücreler üretir ve belirsizlik ve koşullandırılmış ortam ile ilişkili tutarsızlıkları ortadan kaldırır.
melanosit arnöral, omurgalılar özgü hücrelerin göç nüfusu türetilen e. nöral krest gastrulasyon sırasında tanımlanan ve nöral ve nöral olmayan ektoderm arasında sınırındaki nöral plaka kenarında hücre popülasyonu temsil etmektedir. Nörülasyon sırasında, sinir dokusu nöral tüp 13,14 sonuçlanan dorsal orta hat yakınsama sinir kıvrımlar oluşturmak için bir nöral plaka gelişir.
nöral krest hücreleri Notokordun karşısında, nöral tüpün çatı plakası ortaya ve farklılaşmış hücrelerin çeşitli bir nüfusa yol vermek için uzağa göç önce mezenkimal geçiş bir epitel uğrar. tepe hücreleri kaderi embriyo gövde ekseni boyunca tavan plakasının anatomik bölgeye kısmen tanımlanır. Nöral tepe hücresi türevleri, hem mezoderm karakteristik soy (düz kas hücreleri, osteoblastlar, adipositler, kondrositler) ve ektoderm hücrelerini içerir (melanosit Schwann Cıarşın, nöronlar) 14. Sinir tepe kök hücreler transkripsiyon faktörü SOX10 upregülasyon yapabileceğini ve p75 ve HNK1 antikorlar ile sıralama floresans ile aktive edilmiş hücre ile izole edilebilir.
Melanosit bir melanoblast aşamadan geçmesi ve 6,21 MITF melanosit gelişim ana düzenleyicisidir ve bir transkripsiyon faktörü melanosit gelişiminin çok kontrol sorumludur KIT ve MITF (mikroftalmi ilişkili transkripsiyon faktörü) upregüle olmaya mahkum nöral krest hücreleri 22- 24. İnsan Melanoblastlardan onlar saç şişkinliği veya Epidermisin keratinositlerin çevrili olgun, pigmentli melanosit için öncüleri olarak hizmet vermeye (pigmentasyon birimleri oluşturan) ya ikamet epidermisin bazal tabakasındaki göç. pigmentli melanosit içine Melanoblastlardan farklılaşması ve olgunlaşması saç ampul kolonizasyon ve ifade melanin üretimi yolunun (TYRP1, TYR, OKA2'den ve ile birlikte oluşurPMEL) 25,26.
Hastaların insan melanosit ve Melanoblastlardan Ayırma, pahalı zor ve miktar sınırlayıcı olduğunu. Bu protokol hücre sıralama olmadan iyi tanımlanmış, hızlı, tekrarlanabilir, ölçeklenebilir ve ucuz bir yöntem melanosit veya melanosit öncüleri içine hPSCs (isteğe bağlı veya embriyonik) ayırt etmek araştırmacılar sağlar. protokol pigmentasyon bozukluğu olan hastaların iPSCs ayırt zaman hastalığa özgü kusurları tespit etmek, daha önce kullanıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Burada özetlenen melanosit protokolü ilk Mika ve arkadaşları tarafından gösterilmiştir.
1. Kültür Orta hazırlanması, Kaplamalı Züccaciye ve hPSCs Bakım
- orta Hazırlık
Not: saklayın fazla 2 hafta boyunca karanlıkta 4 ° C'de tüm orta. Sterilizasyon için tüm orta Filtresi.- DMEM /% 10 FBS hazırlayın. 885 ml DMEM, 100 ml FBS, 10 mi Pen / Strep ve 5 ml L-glutamin karıştırın. Sterilizasyon Filtre.
- hESC orta hazırlayın. 800 mL DMEM / F12, 200 mi KSR, 5 ml L-glutamin, 10 mL MEM minimum temel amino asitler çözeltisi, β-merkaptoetanol 1 ml ve 5 ml pen / strep karıştırın. 10 ng / ml FGF-2 ilave süzüldükten sonra.
- KSR-farklılaştırma ortamı hazırlayın: 820 mi Nakavt DMEM, 150 mi KSR, 10 ml L-glutamin, 10 ml Pen / Strep, 10 mL MEM minimum temel amino asitler çözeltisi ve 1 mi β-merkaptoetanol karıştırın. Sterilizasyon Filtre.
- N2-farklılaşma ortamı hazırlayın. 12 g DMEM / F12 tozu i çözülürn 980 ml dH 2 O 1.55 g glikoz, 2 g sodyum bikarbonat ve 100 mg apo insan transferin ekleyin. 2 mi DH 2 O 25 mg insan insülininin ve 40 ul 1 N NaOH karıştırın; çözülmüş bir kez, orta karışımı ekleyin. 100 ul putresin dihidroklorür, 60 ul selenit, 100 ul progesteron ekleyin. Filtreleme önce dH 2 O ile 1 litreye son hacim kazandırın.
- Tam melanosit ortamı hazırlayın. % 50 Neurobasal orta,% 30 düşük glukoz DMEM ve% 20 MCDB201 birleştirin. Bu ekleme:% 0.8 ITS + 250 nM L-glutamin, 100 uM Askorbik Asit (L-AA), 50 ng / ml, kolera toksini, 50 ng / ml SCF, 0.05 uM Deksametason, 100 nM EDN3, 4 ng / ml FGF2 . % 2 B27 eki, 25 ng / ml BMP4, 3 uM CHIR99021, 500 uM cAMP: steril filtre sonra kalan reaktifleri ekleyin.
- Kültür Yemekleri Kaplama
- Böyle Matrigel olarak jelatinimsi proteini kullanarak kaplama yürütmek. 1 ml bölüme açılması, tablet ve dondurma Matrigel üzerine tekrarlanan donma çözülme c önlemek içinycles. Çözülme ve 19 ml DMEM / F12 ile 1 ml dondurulmuş kısım yeniden askıya. 10 cm'lik çanak üzerine plaka 5 ml. Oda sıcaklığında 1 saat süre ile bulaşıkları inkübe edin. hemen hücreleri kaplama önce jelatinimsi protein aspire ve DMEM / F12 ile yıkayın.
- Poli-L ornıtın hidrobromid / fare Laminin-I / fibronektin (PO / Lam / FN) kullanılarak kaplama yapınız. Içeren PBS ile kaplayın çanağı 15 ug / ml poli-L ornıtın hidrobromid. nemli bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C sıcaklıkta O / N inkübe edin. solüsyonu aspire ve PBS 1 ug / ml fare laminin I ve 2 ug / ml fibronektin içeren kaplamadan önce üç kez PBS ile plakaları yıkayın. nemli bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C 'de yemekler O / N inkübe edin.
- Önceki hücreleri kaplama için, çözüm aspire ve plakalar doku kültürü kaputu kapaksız iyice kurumasını bekleyin. Plakalar yaklaşık 10-15 dakika kurumasını bekleyin.
Not: kristal yapıları gözle yüzeyinde görünür olduğunda yemekleri kuru ve hücre kaplama için hazır. parseles PBS sürece sıvı buharlaşır yok gibi, iki hafta boyunca inkübatör LAM / FN içeren tutulabilir. Plakalar, birkaç saat boyunca oda sıcaklığında kurutuldu tutulabilir.
- Önceki hücreleri kaplama için, çözüm aspire ve plakalar doku kültürü kaputu kapaksız iyice kurumasını bekleyin. Plakalar yaklaşık 10-15 dakika kurumasını bekleyin.
- hPSCs bakımı
Not: hPSCs hESC ortamı içinde% 0.1 jelatin ve mitotik pasifleştirilmiş fare embriyonik fibroblastlar (MEF'ler) tutulur. Hücreler her 6-8 günde bölünmüş olmalıdır.- Kat 5 dakika boyunca oda sıcaklığında PBS içinde% 0.1 jelatin ile 10 cm'lik bir tabak.
- 37 ° C su banyosu içinde hızla dondurulmuş MEFS çözülme.
- jelatin aspire ve hücreleri plaka. DMEM /% 10 FBS içinde ~ 50,000 hücre / cm2 'lik bir yoğunlukta Plaka MEF'ler. önceki hPSCs ekleyerek 37 ° CO / N de MEFS kuluçkaya yatmaktadır.
- Hazırlanan MEF plakadan DMEM /% 10 FBS aspire PBS ile plaka yıkayın ve hPSCs 10 ml hESC orta ekleyin. Geçiş 1 'in bir oranda hPSCs: Ön pasaj için yoğunluğuna bağlı olarak 5/10.
Not: hPSCs çözülmüş ya da tek hücre olarak pasajlanmağa yapılıyorsa, destekilk geçiş kadar 10 uM Y-27632 dihidroklorid (Rocki) ile mana tamamlayıcı. - ml 10 taze hESC-orta günlük hücreleri besleyin.
- Bir farklılaşma farklılaşmış hücrelerin düzensiz sınırları, ya da şeffaf merkezleri 28 içeren görünen herhangi bir pluripotent koloniler kaldırmak başlamadan önce. Mekanik çıkarmak ve bir mikroskop ile bir laminer akış kaputu altında bir pipet ile düzensiz koloniler aspire.
Farklılaşma için hPSCs 2. Kaplama
Not: farklılaşma durumları 10 cm'lik kaplar için tarif edilmiştir.
- Adım 1.3.1 de açıklandığı gibi farklılaşma başlamadan önce 10 cm Matrigel yemekler hazırlamak.
- Bir farklılaşması için kaplama hPSCs geçişi için hazır bir yoğunlukta (~% 80 konfluent), hESC orta aspire PBS ile yıkayın ve hücrelere% 0.05 tripsin-EDTA 3 ml ekleyin de hPSCs bir plaka ile başladığınızda.
- Şiddetle çanak horizontall sallamakMEFS tek hücre olarak kaldırın kadar y 2 dakika süreyle mikroskop altında görüntülenmesi sırasında. hPSC kolonileri kolonilerin olarak ekli kalmalıdır.
- MEFS kaldırdı sonra Tripsin aspire ama hPSCs koloniler ayırmadan önce.
- Ekle plaka 10 uM Y-27632 dihidroklorür içeren hESC orta 10 ml ve koloniler üzerinde yukarı pipetleme ve aşağı hücreleri ayırmak.
- Adım 2.1 hazırlanan 10 cm çanak Matrigel çözüm aspire ve kümeleri kaldırmak için DMEM / F12 ile yıkayın. Matrigel plakasına 2: 1 oranında en hPSCs Plate. 10ml kadar 10 uM Y-27632 dihidroklorür içeren hESC orta ekleyin. 37 ° CO / N inkübe edin.
Not: Bu kaplama / cm2 yaklaşık 100,000 hücre sonuçlanmalıdır.
Sinir Farklılaşma 3. İndüksiyon
Not: hPSCs% 80 konfluent olduğunda, farklılaşma (gün 0) başlatılmalıdır. Hücreler HESC-ortamı ile günlük olarak beslenebilirfarklılaşma başlayan dek 10 uM Y-27632 dihidroklorür içeren.
- Gün 0 ve gün 1 üzerinde, 100 nM LDN193189 ve 10 uM SB431542 içeren KSR-farklılaştırma ortamının 10 ml hücreleri beslenir.
- 2. günde, 100 nM LDN193189, 10 uM SB431542, 3 uM CHIR99021 ihtiva KSR-farklılaştırma ortamının 10 ml hücreleri beslenir.
- 3. günde, 10 uM SB431542, 3 uM CHIR99021 ihtiva KSR-farklılaştırma ortamının 10 ml hücreleri beslenir.
- gün 4 ve 5, besleme 15% 75 KSR-farklılaştırma ortamının ml 3 uM CHIR99021 ihtiva eden% 25 N2 farklılaşma ortamı ile hücreler üzerinde.
Not: yüzen hücreleri açısından hücre ölümünün büyük miktarda görmek için paniğe etmeyin. Bu, normal ve beklenen bir şeydir. - gün 6 ve 7, besleme 15 ila 50%, KSR-farklılaştırma ortamının ml ve her ikisi de 3 uM CHIR99021, 25 ng / ml BMP4 ve 100 nM EDN3 ihtiva eden% 50 N2 farklılaşma ortamı ile hücreler üzerinde.
- günlerde 89 beslemesi 20% 25 KSR-farklılaştırma ortamının ml ve her ikisi de 3 uM CHIR99021, 25 ng / ml BMP4 ve 100 nM EDN3 ihtiva eden% 75 N2 farklılaşma ortamı ile hücreleri.
- 11. günde hücrelerin yeniden kaplama için 1.2.2 de belirtildiği gibi gün 9 ve 10 PO / Lam / FN yemekler hazırlamak.
- 3 uM CHIR99021, 25 ng / ml BMP4 ve 100 nM EDN3 içeren N2-farklılaştırma ortamının 20 ml gün 10 besleme hücreleri üzerinde.
NC Şartname damlacıklar 4. şarjı
- gün 11 soluklu Lam üzerinde / tamamen hazırlanmış PO / LAM / FN plakaları ve kuru FN.
- Gün 11 hücrelerinden orta çıkarın PBS ile yıkayın ve 10 cm çanak başına Accutase olarak 4 ml hücre dekolmanı çözüm ekleyin. 37 ° C'de 25 dakika süreyle inkübe edin.
- çanak Tam Melanosit orta 5 ml ekleyin ve tüm hücreleri plaka kaldırdı kadar bir 10 ml pipet ile elle yukarı pipetleme ve aşağı hücreleri tekrar süspansiyon. 15 ml'lik bir tüpe süspansiyon aktarın.
- SpinAşağı 200 x g'de 5 dakika boyunca hücre ve tam melanosit ortamı içinde ml başına 2 x 10 6 hücre tekrar süspansiyon hücreleri. Bir hemasitometre veya eşdeğer tekniğine tripan mavisi dışlama kullanarak hücreleri saymak.
- kurutulmuş PO / Lam / FN 10 cm yemekleri üzerine (onları dokunmadan) birbirlerine yakın plaka 10 ul damlacıkları. plaka yeterince kurutulmuş olmuşsa, damlacıklar iyi kenarları tanımlanmış ve çalıştırmak gerekirdi.
Not: Bu genişleme için çanak içinde oda korurken, hücrelerin şarjı zaman önemli olan hücreler, bir yüksek yoğunluklu yerel bir ortam oluşturur. - daha sonra yavaşça (ekli hücreleri bozmamaya) Tüm melanosit ortamı 10 ml damlacıklar hücre yapışmasına izin vermek için 10-20 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin. inkübatör çanak taşıyın.
5. Melanosit atalarıdır Genişleyen
- her 2 ila 3 gün tam Melanocyte ortamı ile beslemeye devam edin.
Not: Pigmentasyon w görünür olmasını başlamalıdırİlk hafta sonunda hücrelerin kümeleri ithin ve ikinci hafta çok netleşecektir. Bu tür erken küçük, karanlık kümeleri ayırt etmek bir kağıda gibi beyaz bir arka plan üzerinde plaka görüntüleyin. Tüm plaka (Şekil 2B bakınız) eşit pigmente kadar Hücreler, zamanla giderek daha pigmente olur. - ~ 1 oranında haftada bir Geçiş hücreleri: 6 (damlacıklar olarak kaplama, bu aşamada artık gerekli değildir). hücreleri ayırmak ve Tam melanosit ortam içinde yeniden kaplama önce, düz Neurobasal ortamı ile iki kez yıkanması Accutase kullanın. PO / LAM / FN plakalar üzerinde hücreleri korumak.
Not: Tam Melanosit orta korunması ve hESC ve iPSC türetilmiş melanositler genişletilmesi için en uygun olduğunu bulduk. Bununla birlikte, hücreler ticari olarak temin edilebilen M254 ortamı içinde kısa bir süre kültürlenebilir, ancak basitleştirilmiş ortam boyama ve plaka kaldırma hücre riskini arttırır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, bir in vitro besleyici içermeyen, düşük maliyetli, ve tekrarlanabilir bir şekilde hPSCs tamamen pigmentli olgun melanosit türetilmesi için bir yöntem temin etmektedir. HPSC türetilmiş melanosit için daha önce oluşturulan Fang ve diğerleri. Protokolünün aksine, ana hatları çizilen protokol, koşullu ortam gerektirir ve zaman gereksinimi azaltır etmez. Fang ve diğerleri. Protokol WNT3A üreten fare hücre hattı kıvamlandırılmış ortam kullanılabilir ve pigmentasyon 6,12 görselleştirmek için 6 hafta kadar sürmüştür. önyargı bir melanosit kader doğru nöral krest kök hücreler (Melanoblastlardan), biz (CHIR) erken darbe sonrasında BMP ve TGFβ inhibitörleri (sırasıyla LDN ve SB) kaldırmak ve daha sonra Wnt aktivasyonu korurken günde altı sinyalizasyon eksojen BMP4 ve EDN3 tanıtmak 6. Elde edilen Melanoblastlardan da SOX10 İfade bakımı gibi, kitin ve MITF sentezlenmesi ile karakterize edilebilirsalgılamanın 6. SOX10 İfade gün 11 kültür (- C Şekil 1B) tarafından sırtlar oluşturan kültür çanak alanlarda görülebilir.
melanoblast indüksiyon ardından, hücreler PO / LAM / FN plakaları üzerine geçişli ve Full Melanosit ortamı ile beslenen. Bu, melanosit nüfus için seçici olduğu 6 Sıralama flüoresan etkinleştirilmiş hücre ihtiyacını ortadan kaldırarak ek yararı vardır son derece zengin bir ortam. TYRP2 dahil melanoblast genlerin çoğu korurken melanosit olgunlaşması sırasında hücre melanin sentezi genler, Tyr ve TYRP1 artırdığım göstermektedir. Day25 kök hücre melanin üretimi proteinleri TYRP1 ve TYRP2 (Şekil 2) için uygun melanosit leke türetilmiştir. Bu protokol, sağlam ve H9 HESC hattı ile ve çeşitli iPSC hatları üzerinden kullanılmıştır. En son, bu protokol sadakatle ul üretmek için kullanıldı hastaya özgü iPSC hatları 6 kullanarak pigmentasyon hastalıkları trastructural özellikleri.
Şekil hESC elde edilen melanosit farklılaşma protokolü 1. Kritik adımlar. (A) farklılaşma protokol düzeni. KSR: KSR-farklılaşma ortamı, N2: N2-farklılaşma ortamı, LDN: LDN193189, SB: SB431542, CHIR: CHIR99021, BMP4: Kemik morfogenetik protein 4, EDN3: endotelin-3, Rocki: Y-27632 dihidroklorür B - C. GFP HESC grubu: önceden bir transgenik pSOX10 kullanılarak şarjı için gün 11 aydınlık (B) ve farklılaşma GFP floresans (C) bir görüntü gösterir. Aydınlık görüntü görünür koyu sırtlar Melanoblastlardan ve sonunda melanosit sebebiyet verecek SOX10 + hücreleri için zenginleştirilmiştir. / 53806 / 53806fig1large.jpg "target =" _ blank "upload> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Melanosit ve ara aşamaları. (A) 25 hücreleri (sağda) kolayca görülüp ve Gün ayırt edilebilir 11 hücreleri (solda) peletlenmiş pigmentli Günü. Kültür pigmentsiz, olgunlaşan melanosit ve tam olgun, pigmentli melanosit hem içerecektir protokol gün 20 ile (B). (C - D) melanositler parlak bir alan altında görüntülendi ve melanoblast / melanosit işaretleyici TYRP2 hem olgunlaşması ve tam pigmentli melanosit leke olabilir. (E - F) geç dönem melanosit işaretleyici TYRP1 için sadece pigmentli melanosit leke.= "_ Blank" olsun> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
hPSCs gelen melanosit başarılı farklılaşması için aşağıdaki önerileri dikkate alınmalıdır. İlk ve en önemlisi, her zaman steril kültür koşulları altında çalışmak için gereklidir. Buna ek olarak, pluripotent tam farklılaşmamış hPSCs ile başlamak için önemlidir; Başlangıç nüfus farklılaşmış hücreleri içeriyorsa verimi kaçınılmaz kirletici melanosit yönelik edilemez ve hatta daha düzgün ayırt hücreleri bozabilir olarak düşecek.
Hücreler pluripotent kök hücre bakım için köklü kurallara uymak için özen kalmasını sağlamak için; yem ve geçiş düzenli ve Pasajlanması önce farklılaşmış hücreleri çıkarmak için kültürler damat. farklılaşması için jelatinli protein üzerine pasaj zaman çanak düzgün farklılaşma sırasında kapalı kaldırma hücreleri önlemek için kaplı olması önemlidir.
Melanoblast farklılıkayırt edilmesi% 80 hücre yoğunluğu etrafında başlanmalıdır; çok düşük yoğunlukları olumsuz farklılaşma etkileyecektir ise çok yüksek yoğunlukları artan hücre ölümüne yol açacaktır. pasaj, hücreler kaplama önce herhangi bir hücre dekolmanı çözüm kaldırmak için iki kez yıkanmalıdır. 11. günde hayatta kalma en üst düzeye çıkarmak için, yüksek yoğunluklu, hücreler küme ve uygun şekilde, 20 dakika boyunca bakir iyi aralıklı damlacıklar halinde hücreler geçit için önemlidir.
Bu protokol, melanosit bir sayıda meydana getirmede etkili olduğunu ve sınırlı sayıda insan hasta numuneleri incelenirken değerli olacaktır. PSC-türevi melanosit popülasyon seçici ve genişletilebilir Dahası, melanosit popülasyon hücrelerinin çok sayıda katlanmış olabilir da farklılaşma verimleri düşük sayılar ya da melanosit yüzdeler halinde. iPSCs ile protokol başlatma gelişimsel hastalıkları ve hasta belirli örneklerin incelenmesi olasılığını açılır. Bir liBu protokolün mitation melanosit in vivo normal niş oluşturan mevcut tüm diğer hücre türleri olmadan monokültür olarak türetilmiştir gerçektir. Ayrıca protokol hPSC kültürü ve farklılaşma teknikleri uzmanlık gerektirir. Ancak, iPSC alan üreten hPSCs son gelişmeler ile giderek yönetilebilir hale gelmiştir ve kültürleme hPSCs yöntemleri rutin hale gelmiştir. Bugüne kadar, protokol 5 farklı vericiden elde edilen H9 embriyonik kök hattından melanositler, diğer yandan da 14 iPS çizgiler üretmek için laboratuarımızda kullanılmıştır.
Mika ve ark., Insan hESC ve iPSCs 6 melanosit türetilmesi için bu protokol başarıyla kullanılmaktadır. Kağıt pigmentasyon bozukluğu olan hastalardan alınan iPSCs melanosit ayırt edilebilir ve protokol sadakatle hastalıkla ilişkili fenotipik büyüklüğü ve miktar melanozomları yol açtığını göstermiştir.
wğ hastalık mekanizmaları çalışmak için iPSC türetilmiş melanosit kullanımı ile protokol birçok olası uygulamalardan biri resimli ve ilaç tarama 6,29 için üretim kadar ölçeklendirme olasılığını tanıttı. Önemli olarak, kağıt genetik olarak farklı hiPSC hatlarının büyük bir dizi melanosit üretilmesi için sağlamlık ve protokol tekrarlanabilirlik göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa etmek çatışan çıkarları yok yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Joanna M. Nicolay Vakfı melanom araştırmacılar için bir burs ile ve Ruth L. Kirschstein Ulusal Araştırma Hizmet Ödülü F31 altında Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma ayrıca NYSTEM ve Tri-kurumsal kök hücre girişimi (Starr Vakfı) hibe yoluyla destek verdi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| apo human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Ascorbic Acid (L-AA) | Sigma | A4034 | 100 mM |
| B27 (B27 Supplement) | Invitrogen | 17504044 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | 10 mg/ml |
| BMP4 | R&D Systems | 314-bp | |
| CHIR99021 | Tocris-R&D Systems | 4423 | 6 mM |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | 50 mg/ml |
| cAMP (cyclicAMP) | Sigma | D0627 | 100 mM |
| Dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | 50 μM |
| DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco-Life Technologies | 11985-092 | |
| DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Gibco-Life Technologies | 1133--032 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| EDN3 (Endothelin-3, human) | American Peptide Company | 88-5-10B | 100 μM |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | 200 μg/ml |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | 0.1% in PBS | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Human insulin | Sigma | I2643 | |
| ITS+ Universal Culture Supplement Premix | BD Biosciences | 354352 | |
| KSR (Knockout Serum Replacement) | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | 100 mM |
| Low glucose DMEM | Invitrogen | 11885-084 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | Dissolve 1:20 in DMEM/F12 |
| MCDB201 Medium | Sigma | M6770 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-080 | |
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-8105M | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | 1 mg/ml |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | 10,000 U/ml |
| Poly-L Omithin hydrobromide | Sigma | P3655 | 15 mg/ml |
| Progesterone | Sigma | P8783 | 0.032 g in 100 ml 100% ethanol |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| FGF2 (Recombinant human FGF basic) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | 10 mg/ml |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1814 | 10 mM |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| SCF (Stem Cell Factor, recombinant Human) | Peprotech Inc. | 300-07 | 50 μg/ml |
| TYRP1 (G-17) Antibody | Santa Cruz | 10443 | 1:200 |
| TYRP2 Antibody | Abcam | 74073 | 1:200 |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | 10 mM |
References
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
- Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat methods. 7, 25-27 (2010).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ health persp. 120, 1116-1122 (2012).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell rep. 3, 1140-1152 (2013).
- Mariani, J., et al. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162, 375-390 (2015).
- Doulatov, S., et al. Modeling Diamond Blackfan Anemia in Vivo Using Human Induced Pluripotent Stem Cells. Blood. 124, (2014).
- Cherry, A. B. C., Daley, G. Q. Reprogrammed Cells for Disease Modeling and Regenerative Medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
- Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. Embo J. 33, 409-417 (2014).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494, 105-110 (2013).
- Fang, D., et al. Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells. Stem cells. 24, 1668-1677 (2006).
- Huang, X., Saint-Jeannet, J. P. Induction of the neural crest and the opportunities of life on the edge. Dev biol. 275, 1-11 (2004).
- White, R. M., Zon, L. I. Melanocytes in development, regeneration, and cancer. Cell stem cell. 3, 242-252 (2008).
- Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell. 96, 737-749 (1999).
- Elworthy, S., Pinto, J. P., Pettifer, A., Cancela, M. L., Kelsh, R. N. Phox2b function in the enteric nervous system is conserved in zebrafish and is sox10-dependent. Mech develop. 122, 659-669 (2005).
- Harris, M. L., Baxter, L. L., Loftus, S. K., Pavan, W. J. Sox proteins in melanocyte development and melanoma. Pigm cell melanoma r. 23, 496-513 (2010).
- Herbarth, B., et al. Mutation of the Sry-related Sox10 gene in Dominant megacolon, a mouse model for human Hirschsprung disease. PNAS. 95, 5161-5165 (1998).
- Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nat genetics. 18, 60-64 (1998).
- Dupin, E., Glavieux, C., Vaigot, P., Le Douarin, N. M. Endothelin 3 induces the reversion of melanocytes to glia through a neural crest-derived glial-melanocytic progenitor. PNAS. 97, 7882-7887 (2000).
- Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate. Development. 126, 3757-3767 (1999).
- Hou, L., Panthier, J. J., Arnheiter, H. Signaling and transcriptional regulation in the neural crest-derived melanocyte lineage: interactions between KIT and MITF. Development. 127, 5379-5389 (2000).
- Levy, C., Khaled, M., Fisher, D. E. MITF: master regulator of melanocyte development and melanoma oncogene. Trends mol med. 12, 406-414 (2006).
- Phung, B., Sun, J., Schepsky, A., Steingrimsson, E., Ronnstrand, L. C-KIT signaling depends on microphthalmia-associated transcription factor for effects on cell proliferation. PloS one. 6, e24064 (2011).
- Grichnik, J. M., et al. KIT expression reveals a population of precursor melanocytes in human skin. J invest dermatol. 106, 967-971 (1996).
- Li, L., et al. Human dermal stem cells differentiate into functional epidermal melanocytes. J cell sci. 123, 853-860 (2010).
- Nishimura, E. K., et al. Dominant role of the niche in melanocyte stem-cell fate determination. Nature. 416, 854-860 (2002).
- Zur Nieden, N. I. Embryonic stem cell therapy for osteo-degenerative diseases : methods and protocols. , Humana Press. (2011).
- Lee, J. H., et al. high-content screening for novel pigmentation regulators using a keratinocyte/melanocyte co-culture system. Exp dermatol. 23, 125-129 (2014).
