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Immunology and Infection

हिल गतिशीलता के दृश्य और की भूमिका की विशेषता Published: April 8, 2016 doi: 10.3791/53816
Automatic Translation
1, 2
1Department of Plant Science, University of California, Davis, 2Agricultural Research Service, San Joaquin Valley Agricultural Sciences Center, United States Department of Agriculture

Summary

इस अध्ययन में, एक नैनो microfluidic प्रवाह कक्ष कल्पना करने के लिए और कार्यात्मक Xylella fastidiosa, एक जीवाणु कि चर्चा में पियर्स रोग का कारण बनता है के हिल गतिशीलता को चिह्नित कार्यरत था।

Abstract

Xylella fastidiosa एक ग्राम नकारात्मक गैर flagellated जीवाणु कि पौधों की आर्थिक रूप से महत्वपूर्ण रोगों के एक नंबर का कारण बनता है। हिल गतिशीलता एक्स प्रदान करता है fastidiosa लंबी दूरी की इंट्रा-संयंत्र आंदोलन और उपनिवेशवाद, के लिए एक साधन एक्स में pathogenicity की ओर योगदान fastidiosa। एक्स के हिल गतिशीलता fastidiosa द्वारा प्रकार चतुर्थ पिली चलाया जा रहा है। Xylella fastidiosa के प्रकार चतुर्थ पिली pilG, जनहित याचिका-सीपीएच operon एन्कोडिंग प्रोटीन में एक chemotaxis नियामक कि संकेत पारगमन मार्ग के साथ शामिल कर रहे हैं द्वारा विनियमित रहे हैं। एक्स के हिल गतिशीलता में pilG की भूमिका को स्पष्ट करने के लिए fastidiosa, एक pilG -deficient उत्परिवर्ती Xf ΔpilG और उसके पूरक तनाव मूल निवासी pilG युक्त XfΔpilG- सी विकसित किए गए। एक microfluidic एक समय चूक छवि रिकॉर्डिंग प्रणाली के साथ एकीकृत कक्षों XfΔp में हिल गतिशीलता निरीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया थाILG, XfΔpilG- सी और अपनी जंगली प्रकार के तनाव। इस रिकॉर्डिंग सिस्टम का उपयोग करना, यह एकत्रीकरण के लिए लंबी अवधि के स्थानिक और लौकिक टिप्पणियों, व्यक्तिगत कोशिकाओं और हिल गतिशीलता के माध्यम से बैक्टीरिया की आबादी के पलायन अनुमति देता है। एक्स fastidiosa जंगली प्रकार और पूरक XfΔpilG- सी तनाव ठेठ हिल गतिशीलता विशेषताओं सीधे microfluidic प्रवाह कक्षों में मनाया दिखाया है, जबकि उत्परिवर्ती XfΔpliG हिल कमी फेनोटाइप प्रदर्शन किया। यह अध्ययन दर्शाता है कि pilG एक्स के हिल गतिशीलता के लिए योगदान fastidiosa। microfluidic प्रवाह कक्ष हिल गतिशीलता के अवलोकन के लिए एक साधन के रूप में प्रयोग किया जाता है।

Introduction

Xylella fastidiosa एक ग्राम नकारात्मक गैर flagellated, रोगजनक जीवाणु कि चर्चा में पियर्स रोग (द्राक्षा एल) 1,2, 3 सहित आर्थिक रूप से महत्वपूर्ण फसल रोगों के एक नंबर का कारण बनता है। यह जीवाणु पानी का आयोजन जाइलम तक सीमित है वाहिकाओं। चर्चा के संक्रमण जाइलम वाहिकाओं और पानी तनाव में परिणाम और पोषक तत्वों की कमी 3 की रुकावट का कारण बनता है। सफल बसाना जीवाणु के संक्रमण की क्षमता की प्रारंभिक साइट से संयंत्र 3 के आराम करने के लिए स्थानांतरित करने के लिए पर निर्भर करता है। एक्सटेंशन, लगाव, और ध्रुवीय प्रकार चतुर्थ पिली 4 कि एक्स में बताया गया है की त्याग के माध्यम से गतिशीलता कशाभ स्वतंत्र बैक्टीरियल आंदोलन का एक साधन हिल जाता है fastidiosa 5,6,7।

हिल गतिशीलता लेजर चिमटी और परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) 8,9,10 द्वारा देखा गया है। इन तकनीकों का प्रयोग, टीwitching motilities द्वारा एन के प्रकार चतुर्थ Pilus उत्पन्न gonorrhoeae और पी aeruginosa FL uorescently लेबलिंग पिली और microscopically उनकी गतिविधियों पर कब्जा करने की विशेषता थे। हालांकि दोनों तरीकों अलग-अलग बैक्टीरिया के चिपकने वाला बल विस्तृत है, प्रक्रियाओं जटिल और समय लेने 9,10 कर रहे हैं। माइक्रो FL uidic कक्षों व्यक्ति की कोशिकाओं के लंबी दूरी के प्रवास के रूप में अच्छी तरह से बैक्टीरियल कोशिकाओं 5,6 के छोटे समुच्चय निरीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया। इन कक्षों एक थाली एक समय चूक छवि रिकॉर्डिंग सिस्टम 11,12,13,14 के साथ एकीकृत करने में एक microfabricated-नैनो चैनल के रूप में डिजाइन किए गए थे। माइक्रो uidic चैम्बर उपकरणों बैक्टीरिया के आंदोलन के व्यवहार और सेल सेल बातचीत के अध्ययन के लिए कई लाभ प्रदान करते FL: (i) यह कई चैनल क्षमताओं के साथ एक एकीकृत मंच प्रदान करता है; (Ii) यह गतियों और बैक्टीरिया की नैनो पैमाने पर सुविधाओं में एकल कक्षों के एकत्रित की जांच कर सकते हैं; (Iii) यह प्रत्यक्ष मीटर के लिए अनुमति देता हैबैक्टीरियल कोशिकाओं और समय चूक विश्लेषण के icroscopic छवि रिकॉर्डिंग, (iv) यह एक सूक्ष्म वातावरण में बैक्टीरिया की व्यक्तिगत और / या आबादी के लिए लंबी अवधि के स्थानिक और लौकिक टिप्पणियों प्रदान करता है; (V) एक चैनल में संस्कृति के माध्यम के प्रवाह की दर ठीक से नियंत्रित किया जा सकता है और संस्कृति के माध्यम से (vi) केवल एक बहुत छोटी मात्रा (1 मिलीलीटर) एक प्रयोग के लिए आवश्यक है।

हाल ही में, सूक्ष्म FL uidic FL ओउ प्रणाली विभिन्न microenvironments 14,15,16 के तहत बैक्टीरियल कोशिकाओं के व्यवहार की जांच करने के लिए नियुक्त किया गया है। चिपचिपाहट और ई की सतह लगाव कोलाई 15, एक्स fastidiosa 16, और Acidovorax citrulli 14 गिलास सतहों के लिए माइक्रो FL uidic कक्षों का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया। एकत्रीकरण और जैव फाई एल एम गठन के द्वारा Acidovorax citrulli के प्रकार चतुर्थ पिली मध्यस्थता 14 विश्लेषण किया गया। इसके अलावा, ए के प्रस्ताव citrulli के तहत फ्लोरिडा ओ सी मनायाonditions दिखा दिया है कि प्रकार चतुर्थ पिली उपनिवेशन में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं और ए के प्रसार एसएपी FL ओउ की शर्तों के तहत जाइलम वाहिकाओं में citrulli। Pseudomonas aeruginosa और एक्स के हिल motilities fastidiosa कोशिकाओं को सफलतापूर्वक एक microfabricated प्रवाह कक्ष 5,6,17 में एक द्रव वर्तमान के खिलाफ मनाया गया। प्रकार चतुर्थ Pilus कमी एक्स के pilB और pilQ म्यूटेंट fastidiosa गहराई से सूक्ष्म FL uidic उपकरणों 5,6,18 में फ्लोरिडा ओउ की शर्तों के तहत गतिशीलता हिल की गति में परिवर्तन पाया गया। बैक्टीरियल आसंजन और सूक्ष्म FL uidic उपकरणों में गतिशीलता पर किए गए अध्ययन से संकेत दिया कि सूक्ष्म FL uidic कक्षों इन विट्रो में हिल गतिशीलता और पिली की मध्यस्थता बैक्टीरिया के पलायन का विश्लेषण करने के लिए विशेष रूप से उपयुक्त हैं। इन परिणामों के हिल की मध्यस्थता प्रवास तंत्र है जो सेल सेल लगाव, एकत्रीकरण और उपनिवेशवाद के भीतर की सुविधा समझानेमेजबान, अंत में प्रणालीगत संक्रमण हो।

एक्स की जनहित याचिका-सीपीएच operon fastidiosa pilG, पिली, pilJ, गोली, chpB और chpC जो सांकेतिक शब्दों में संकेत पारगमन मार्ग 20 में शामिल है। transmembrane Chemoreceptors periplasmic डोमेन रासायनिक उत्तेजनाओं बाँध और उनके cytoplasmic भाग अंततः बैक्टीरियल हिल गतिशीलता को नियंत्रित करने में एक संकेत झरना को सक्रिय करें। एक्स की जनहित याचिका-सीपीएच operon में fastidiosa, एक phospho-शटल प्रोटीन PilG Chey करने के लिए एक सजात है। ई में कोलाई और पी aeruginosa, Chey chemotaxis प्रणाली है कि flagella मोटर प्रोटीन 19, 21 के साथ बातचीत में प्रतिक्रिया नियामक है। हालांकि एक्स में डाह की ओर जनहित याचिका-सीपीएच operon के योगदान fastidiosa हाल ही में 20 पर्यावरण संकेतों के जवाब में और एक्स की विनियमित / मोटर प्रकार चतुर्थ पिली को chemotaxis operon में pilG की भूमिका की जांच की गई, fastidiosa यूएनसी हैलेअर। एक्स के हिल गतिशीलता की गतिविधि में chemotaxis नियामक pilG की अंतर्दृष्टि को स्पष्ट करने के लिए fastidiosa, एक माइक्रो FL uidic चैम्बर एक्स के हिल गतिशीलता का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है fastidiosa। एक्स fastidiosa की pilG एक विलोपन उत्परिवर्ती Xf ΔpliG, पूरक तनाव XfΔpliG -सी और इन विट्रो में अपनी जंगली प्रकार के phenotypes की तुलना की विशेषता है। परिणाम एक्स के हिल गतिशीलता में pilG की भूमिका पर प्रकाश डाला fastidiosa।

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Protocol

1. बैक्टीरियल कॉलोनी के परिधीय फ्रिंज

  1. एक्स बढ़ो fastidiosa (Xf) Temecula जंगली प्रकार 22, pilG विलोपन उत्परिवर्ती Xf ΔpliG (पहले वर्णित विलोपन रणनीति 23 का उपयोग), और उसके पूरक XfΔpliG -सी PD2 मध्यम अगर प्लेट 25 में 28 डिग्री पर (पहले गुणसूत्र आधारित आनुवंशिक पूरक रणनीति 24 में वर्णित का उपयोग) 5-7 दिनों के लिए सी।
  2. 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस (249 ° एफ) में आटोक्लेव सिलोफ़न (1 एक्स 1 सेमी 2) पानी में। , सिलोफ़न में से एक टुकड़ा उठा एक खाली पेट्री डिश पर सिलोफ़न के एक कोने को छू द्वारा पानी के निकास, ध्यान से अगर सतह और शुष्क हवा के 15% से अधिक सिलोफ़न लेट गई।
  3. व्यक्तिगत एक्स उठाओ aseptically सिलोफ़न की एक निष्फल चादर अगर प्लेट में अगर सतह के 15% पर मढ़ा पर बाँझ गोल toothpicks और मौके कोशिकाओं के साथ fastidiosa कालोनियों। थाली सेते2-3 दिनों के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर एस।
  4. एक 2X उद्देश्य लेंस के साथ एक विदारक माइक्रोस्कोप और एक 10X नेत्र लेंस का उपयोग कर कालोनियों के किनारे आकृति विज्ञान की जांच करना। कालोनियों के आसपास परिधीय फ्रिंज तस्वीर।

2. माइक्रोस्कोपी और microfluidic प्रवाह कक्षों

  1. बनाना microfluidic तस्वीर-पत्थर के छापे से उन लोगों के लिए इसी तरह की प्रक्रियाओं का उपयोग उपकरणों पहले से 5,18 का वर्णन किया। मानक lithographic तरीकों का उपयोग कर 26 मास्टर सिलिकॉन वेफर पर कंप्यूटर की मदद से डिजाइन सॉफ्टवेयर के साथ चार समानांतर चैनलों डिजाइन।
  2. polydimethylsiloxane (PDMS) के साथ सिलिकॉन वेफर गुरु से microfluidic कक्षों बनाएँ। सिलिकॉन वेफर मास्टर से अधिक unpolymerized PDMS डालो और 1 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर इसे इलाज। वेफर मास्टर से PDMS प्रतिकृति छील और एक 22 मिमी x 40 एक गिलास coverslip का एक ही आकार के रूप में मिमी एक ब्लेड के साथ PDMS प्रतिकृति ट्रिम।
  3. PDMS प्रतिकृति, एक गिलास coverslip (22 x 40 मिमी 2), और एक microsc बेनकाब2 मिनट 27 के लिए 30 डब्ल्यू पर ope स्लाइड (51 x 76 मिमी 2) हवा प्लाज्मा। सैंडविच कांच coverslip और गिलास खुर्दबीन सूक्ष्म FL uidic कक्ष का निर्माण करने के लिए के बीच PDMS शरीर।
  4. नमूनों चैनल के प्रत्येक के अंत में PDMS माध्यम से एक छेद (5.5 मिमी व्यास) ड्रिल। 12-20 सेमी लंबे समय में सिलिकॉन रबर टयूबिंग कट। PDMS प्रतिकृति के चैनलों में से प्रत्येक को खोलने के अंत में सिलिकॉन रबर टयूबिंग के एक छोर (व्यास के बाहर 5.1 मिमी, 2.1 मिमी व्यास के अंदर, 0.8 मिमी दीवार) डालें, और 1 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर unpolymerized PDMS के साथ इसे सील।
  5. प्लास्टिक Luer कनेक्टर्स के कांटेदार अंत करने के लिए ट्यूबिंग का एक और अंत कनेक्ट। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लपेटें इकट्ठे microfluidic कक्षों और 20 मिनट के लिए उन्हें आटोक्लेव।
  6. एक्स के बैक्टीरिया की कोशिकाओं को ले लीजिए fastidiosa जंगली प्रकार, उत्परिवर्ती Xf ΔpliG, और स्क्रैप के माध्यम से पूरक XfΔpliG -सी, डिस्पोजेबल inoculating का उपयोग कर PD2 मध्यम प्लेटों से छोरों। सेल घनत्व को समायोजित करेंPD2 शोरबा में 600 एनएम पर 0.05 की एक ऑप्टिकल घनत्व के रूप में पहले 23 में वर्णित है। 1 मिलीलीटर Gastight सिरिंज में बैक्टीरिया कोशिका समाधान लीजिए।
  7. एक औंधा माइक्रोस्कोप के मंच पर microfluidic युक्ति माउंट। 5 मिलीलीटर Gastight PD2 शोरबा युक्त सिरिंज के लिए एक इनलेट ट्यूब कनेक्ट। सिरिंज पंप के साथ 5 मिलीलीटर सिरिंज Gastight फिट बैठते हैं।
  8. बर्बादी जलाशय में आउटलेट ट्यूब कनेक्ट। 0.2 μl मिनट का एक माध्यम के प्रवाह दर को बनाए रखने -1 30 मिनट प्रणाली को स्थिर करने के लिए।
  9. बैक्टीरिया कोशिका समाधान युक्त एक 1 मिलीलीटर Gastight सिरिंज के लिए पक्ष-इनलेट ट्यूबों कनेक्ट करें। रबर टयूबिंग के माध्यम से बैक्टीरिया कोशिका समाधान निकलवाने जब तक चैनल पर पहुंच गया है। आदेश कक्ष से छवि पर कब्जा करने से पहले अनबाउंड कोशिकाओं फ्लश करने में 0.2 μl मिनट का एक माध्यम के प्रवाह की दर -1 एक और 30 मिनट के लिए बनाए रखें।
  10. माइक्रोस्कोप प्रकाश को नियंत्रित करने के क्षेत्र से समायोजित हिस्सा तहत माइक्रोस्कोप शटर माउंट। शटर सह करने के लिए शटर कनेक्टntrol प्रणाली और कंप्यूटर के लिए शटर नियंत्रण प्रणाली से कनेक्ट।
  11. माइक्रोस्कोप के वीडियो बंदरगाह के लिए एक डिजिटल कैमरा माउंट और यह कंप्यूटर से कनेक्ट। समय चूक रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर चलाने, मेनू से "शटर" समारोह का चयन करें, और सॉफ्टवेयर में स्वचालित रूप से डिफ़ॉल्ट रूप में स्थापित शटर को पहचान सॉफ्टवेयर के साथ शटर के लिए कनेक्शन स्थापित करने के लिए।
  12. स्वचालित रूप से सॉफ्टवेयर में डिफ़ॉल्ट कब्जा डिवाइस के रूप में डिजिटल कैमरा और पहचान के लिए सॉफ्टवेयर के साथ डिजिटल कैमरा के साथ संवाद स्थापित करने के लिए समय चूक रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर के मेनू से "डिजिटल कैमरा" समारोह का चयन करें।
  13. 20X चरण विपरीत प्रकाशिकी का उपयोग चैनलों में से एक में बैक्टीरियल कोशिकाओं का पता लगाएँ, तो 40x उद्देश्य छवि पर कब्जा करने से पहले लेंस के लिए स्विच।
  14. समय चूक रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर चलाने, मेनू से तयशुदा मापदंडों का उपयोग कर खुर्दबीन से छवियों को प्राप्त करने के लिए "छवि अधिग्रहण" समारोह का चयन करें।अगला, "मोल समय चूक" समारोह खोलने के लिए और मानव संसाधन 6-24 एक्स के हिल गतिशीलता का पालन करने की जरूरत प्रयोग के आधार पर की अवधि के लिए 30 सेकंड 5,18,28 के लिए समय अंतराल सेट fastidiosa 5,18,28। क्लिक करें "ठीक है" समय चूक रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए। मेनू से "ढेर समारोह" पर क्लिक करें, "बचाने के लिए" के रूप में रिकॉर्डिंग खत्म करने के बाद कंप्यूटर पर गंतव्य फ़ोल्डर में छवियों को ढेर करने के लिए।
  15. कई चैनलों के लिए, समय चूक छवियों पहले चैनल से 6 घंटे के लिए हर 30 सेकंड पर कब्जा। लक्ष्य कोशिकाओं का पता लगाने के लिए अगले चैनल के लिए माइक्रोस्कोप के उद्देश्य लेंस ले जाएँ। जैसा कि ऊपर वर्णित चार चैनलों क्रमिक रूप से प्रत्येक में छवियों पर कब्जा करने के लिए अगर प्रयोग चार चैनलों का उपयोग करने के लिए स्थापित किया गया है समय चूक समारोह दोहराएँ। जब तक लगातार तीन दिनों के लिए समय चूक छवि पर कब्जा जारी रखें। सभी प्रयोगों कमरे के तापमान (23 ± 2 डिग्री सेल्सियस) पर आयोजित की गई।
  16. एक में समय चूक छवियों को संकलितवीडियो फ़ाइल समय चूक रिकॉर्डिंग इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर। भागो समय चूक रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर, मेनू से क्लिक करें "ढेर समारोह", और कंप्यूटर से खड़ी फाइलों को खोलने के लिए चुनें "खुला ढेर समारोह"।
  17. ढेर मॉड्यूल से "फिल्म बनाने के लिए" समारोह शुरू, सभी छवियों का चयन और "AVI" आउटपुट स्वरूप का चयन। कंप्यूटर पर गंतव्य फ़ोल्डर में वीडियो फाइल स्टोर करने के लिए "के रूप में सहेजें" क्लिक करें।
  18. कंप्यूटर पर गंतव्य फ़ोल्डर से संकलित फिल्मों का चयन करें और उन्हें खेलते हैं। फिर, उत्पन्न वीडियो फाइलों में बैक्टीरिया की कोशिकाओं की गतिशीलता हिल गतिविधि के परिणामस्वरूप दृश्य के माध्यम से एकल कक्षों की गतिशीलता का पालन।

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Representative Results

एक परिधीय कॉलोनी फ्रिंज प्रकार चतुर्थ Pilus की मध्यस्थता हिल गतिशीलता का संकेत की उपस्थिति, एक्स की कालोनियों में मनाया गया fastidiosa जंगली प्रकार और पूरक Xf ΔpliG -सी तनाव (चित्रा 1)। उत्परिवर्ती XfΔpliG, तथापि, कालोनियों की परिधि के चारों ओर एक फ्रिंज (चित्रा 1) का प्रदर्शन नहीं किया था। नैनो microfluidic प्रवाह कक्षों में बैक्टीरियल कोशिकाओं के समय चूक इमेजिंग से पता चला है कि हिल गतिशीलता दोनों जंगली प्रकार एक्स में मनाया गया fastidiosa और पूरक XfΔpliG -सी (पूरक V1, वी 3), जबकि XfΔpilG उत्परिवर्ती कोशिकाओं प्रयोग (पूरक V2) भर में गतिशीलता हिल प्रदर्शन नहीं किया था। उत्परिवर्ती XfΔpilG की कोशिकाओं PD2 शोरबा (पूरक V2) में अपेक्षाकृत छोटे ढीला समुच्चय का गठन किया। इसके विपरीत, एक्स की कोशिकाओं fastidiosa जंगली प्रकार और पूरक XfΔpilG- सी डी PD2 शोरबा में eveloped बड़ा समुच्चय (चित्रा 2, (पूरक V1, वी 3)।

आकृति 1
चित्रा 1:। एक्स के जीवाणु कॉलोनी के परिधीय फ्रिंज कालोनी मार्जिन विशेषताओं जंगली प्रकार, उत्परिवर्ती Xf ΔpilG, और पूरक XfΔpilG- सी से fastidiosa सिलोफ़न की एक निष्फल चादर के साथ कवर PD2 अगर पर हो। उत्परिवर्ती XfΔpilG के अपवाद के साथ, सभी कालोनियों एक परिधीय फ्रिंज का प्रदर्शन किया है, यह दर्शाता प्रकार चतुर्थ Pilus की मध्यस्थता हिल गतिशीलता। चित्र संस्कृति के माध्यम से विकास के 5 दिनों के बाद लिया गया। बढ़ाई बार, 0.5 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 2: एक्स की हिल गतिशीलता नैनो microfluidic प्रवाह कक्ष में fastidiosa कोशिकाओं। सभी परीक्षण तनाव कोशिकाओं की गतिशीलता हिल अवलोकन के 6 दिन के दौरान दर्ज किया गया था। आकलन के तीन स्वतंत्र वीडियो खंडों से आयोजित की गई। बढ़ाई बार, 20 माइक्रोन।
नोट: एक्स की हिल गतिशीलता fastidiosa कोशिकाओं विस्तार, लगाव, और ध्रुवीय प्रकार चतुर्थ पिली के त्याग के माध्यम से गिलास सतहों के पार एकल कक्ष आंदोलन की विशेषता है। एकल कोशिका एक microfabricated प्रवाह कक्ष में एक तरल पदार्थ वर्तमान के खिलाफ रियायत के प्रवास में मनाया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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पूरक चित्रा 1: एक चार चैनल microfluidic प्रवाह कक्ष। मीडिया और प्रत्येक के अंत में मीडिया बाहर कनेक्टर्स के साथ प्रत्येक चैनल। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक मूवी 1
पूरक मूवी 1: गतिशीलता हिल। (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)। एक microfluidic प्रवाह कक्ष में जंगली प्रकार के एक्स fastidiosa के हिल।

पूरक मूवी 2
पूरक मूवी 2: बिगड़ा Twitchinजी गतिशीलता। (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)। Xf उत्परिवर्ती की गतिशीलता। XfΔpilG amicrofluidic प्रवाह कक्ष में मनाया।

पूरक मूवी 3
पूरक मूवी 3: हिल गतिशीलता लौटी। (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें)। Xf पूरक तनाव की गतिशीलता हिल। XfΔpilG-सी एक microfluidic प्रवाह कक्ष में मनाया।

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Discussion

इस अध्ययन में, हम एक्स की गति व्यवहार की विशेषता fastidiosa PilG उत्परिवर्ती Xf ΔpilG और नए डिजाइन कई समानांतर-नैनो चैनल सूक्ष्म FL uidic कक्षों में उसके पूरक XfΔpilG- सी उपभेदों। नए डिजाइन सूक्ष्म FL uidic कक्षों केवल एक ही 50 माइक्रोन विस्तृत चैनल 18 के साथ पहले डिजाइन की तुलना में चौड़ाई में 100 माइक्रोन नैनो चैनल के साथ करने के लिए चार समानांतर कक्षों हो सकता है। में सुधार के लिए व्यापक नैनो चैनल मीडिया के बहने के साथ बैक्टीरियल कोशिकाओं की शुरूआत की सुविधा। इसके अलावा, इस microfluidics चैम्बर बनाने के लिए और इकट्ठा करने के लिए है 1) सरल; 2) अपेक्षाकृत सस्ती; और 3) प्रयोगात्मक आवश्यकताओं अलग-अलग करने के लिए आसानी से लागू हो। नतीजतन, इस कक्ष डिजाइन किस्मों के तहत बैक्टीरियल कोशिकाओं की गति की लंबी अवधि के अवलोकन प्रयोगात्मक microenvironment परमिट।

धाराओं throu की ओउ FL स्थिरजीएच सूक्ष्म FL uidic चैनल प्रयोगात्मक वातावरण की एक किस्म के तहत बैक्टीरियल कोशिकाओं की गतिशीलता के अवलोकन के लिए एक अक्षुण्ण बह-सूक्ष्म FL uidic microenvironment बनाने के लिए महत्वपूर्ण कदम है। माइक्रो FL uidic कक्षों की निस्तब्धता और मीडिया से पहले बैक्टीरियल कोशिकाओं की शुरुआत करने के साथ जोड़ने ट्यूबिंग भी कक्ष में प्रवाह को स्थिर करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। हालांकि, प्रवाह की उच्च गति के चैम्बर के पाठ्यक्रम में कोशिकाओं को बनाए रखने के बिना चैम्बर के बाहर बैक्टीरियल कोशिकाओं फ्लश होगा। मीडिया सूक्ष्म FL uidic चैनलों के माध्यम से बहने की उचित गति एक सिरिंज पंप का उपयोग कर समायोजित किया जाना चाहिए। इस अध्ययन में प्रयोगों के दौरान बहने सेट और मिनट -1 में कम से कम 30 मिनट के लिए चैनल में बैक्टीरियल कोशिकाओं को शुरू करने से पहले 0.2 करने के लिए 1 μl पर पंप द्वारा स्थिर हो गया था। एक बार कोशिकाओं सूक्ष्म FL uidic चैनलों में शुरू किए गए थे, मध्यम FL ओउ 0.2 μl मीटर की ऊंचाई पर बनाए रखा गया था-1 30 से 60 मिनट प्रणाली को स्थिर और nonattached कोशिकाओं को दूर करने के लिए। यह प्रवाह को स्थिर करने और व्यवस्था बैक्टीरियल कोशिकाओं की गति का निरीक्षण करने के लिए स्पष्ट पृष्ठभूमि रखने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। छवियाँ फर्म के चुनाव के लिए 0.2 μl मिनट -1 पर एक निरंतर प्रवाह की गति को बनाए रखने के लिए शुरू की कोशिकाओं की गतिशीलता हिल गतिविधि हर 30 सेकंड पर कब्जा कर लिया गया था। प्रयोगों कक्ष में बैक्टीरियल कोशिकाओं के संग्रह की आवश्यकता है, कोशिकाओं को धीरे-धीरे 0.2 110 μl मिनट -1 से मीडिया के फ्लोरिडा ओउ दरों में वृद्धि सिरिंज पंप की गति का समायोजन करके द्वारा बाहर निकाले जा सकते हैं।

माइक्रो FL uidic कक्षों में बैक्टीरिया कोशिका गतिविधियों 40X चरण विपरीत प्रकाशिकी और एक डिजिटल कैमरा है, जो इमेजिंग सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित किया गया था के साथ दर्ज की समय चूक छवियों का उपयोग उलटा माइक्रोस्कोप के माध्यम से मूल्यांकन किया गया। प्रवाह की गति और छवि को पकड़ने के लिए समय अंतराल के साथ experim के अनुसार समायोजित किया जा सकताअंदरूनी आवश्यकताओं। हालांकि, ज्यादातर मामलों में, गति के प्रवाह के लिए एक माध्यम के प्रवाह की दर 0.2 μl मिनट के लिए निर्धारित है -1 समय चूक छवियों Pilus की मध्यस्थता बैक्टीरियल कोशिकाओं के लिए हर 30 सेकंड में दर्ज की गई है। अन्य मामलों में, यदि मध्यम FL ओउ दर 0.1 μl मिनट तक बढ़ जाती है -1 प्रयोग के दौरान, बैक्टीरियल कोशिकाओं के व्यवहार पर कब्जा छवियों से हर 10 के लिए 15 सेकंड के हिसाब से दर्ज किया जाएगा। समय चूक छवियों 6-24 घंटे की अवधि के लिए हर 30 सेकंड ले लिया है और के रूप में प्रत्येक परीक्षण तनाव के लिए एक स्रोत के चित्र फ़ाइलें बच गए। वीडियो तो प्रत्येक तनाव है, जो उत्परिवर्ती और जंगली प्रकार के बीच motilities हिल में विपरीत phenotypes दिखाए से 6-8 मानव संसाधन से लिए गए चित्रों से पालन किया गया / उपभेदों (पूरक V1, V2, V3) के पूरक हैं।

macroscale समानांतर प्लेट FL ओउ कक्षों से ज्यादा नैनो सूक्ष्म FL uidic चैम्बर उपकरणों के महत्व गतियों के प्रत्यक्ष परीक्षा और गाना एकत्रित शामिलबैक्टीरिया की कोशिकाओं le। कम लागत वाली 5 और कम अभिकर्मक और नमूना मात्रा आवश्यकताओं के अलावा, माइक्रो FL uidic कक्षों के फायदे के जीवाणु संस्कृति और फ्लोरिडा यूआईडी FL ओउ दर पर सटीक नियंत्रण के लिए एक FL ओउ microenvironment के निर्माण में आसानी रहे हैं। कई समानांतर चैनलों एक ही प्रयोग सेटअप जो विश्लेषण के लिए संगत डेटा प्रदान करता है में अंतर जीवाणु उपभेदों के अवलोकन की अनुमति है। कशाभ स्वतंत्र ध्रुवीय पिली साथ बैक्टीरिया के हिल गतिशीलता इस नैनो सूक्ष्म FL uidic कक्ष में विश्लेषण के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है। हालांकि, इस माइक्रो FL uidic चैम्बर कशाभ निर्भर बैक्टीरियल आंदोलन है, जो में बैक्टीरिया के आंदोलन को आम तौर पर बहुत जल्दी है और यादृच्छिक दिशाओं प्रदर्शन के लिए कम उपयुक्त है। यह सीमा कभी कभी 1 घंटा analy करने के लिए हर 2 सेकंड के लिए 1 पर 0.05 μl मिनट के लिए मध्यम प्रवाह की दर का समायोजन -1 और समय चूक छवि पर कब्जा दर बदलने से समझौता किया जा सकता हैनैनो पैमाने पर वातावरण में कशाभ की मध्यस्थता बैक्टीरिया की गतियों ज़ी।

Microfluidic चैम्बर इसमें प्रयोग उपकरणों PilG इन विट्रो में गति व्यवहार के लिए जिम्मेदार के कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए प्रत्यक्ष दृश्य सबूत प्रदान करते हैं। साथ ही, इस अध्ययन में यह भी पता चलता है कि हिल गतिशीलता के माध्यम से सेल एकत्रीकरण के लिए सेल, biofilm गठन के लिए आवश्यक है और संकेत एक्स में pathogenicity fastidiosa। microfluidic उपकरणों द्वारा गतिशीलता हिल बैक्टीरिया का जीन दृश्य बैक्टीरिया में व्यवहार जो आसानी से अन्य परख तरीकों से मापा नहीं है से जुड़े समारोह का अध्ययन करने के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रदान करता है। यह दृष्टिकोण अन्य बैक्टीरियल सिस्टम को लागू किया जा सकता है। microfluidic चैम्बर उपकरणों सेल सेल संलग्नक, सेल एकत्रित, गति पैटर्न और biofilm गठन के साथ जुड़े बैक्टीरियल कोशिकाओं के शारीरिक व्यवहार निस्र्पक के लिए एक प्रवाह प्रणाली प्रदान करते हैं।

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Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।

Acknowledgments

इस अध्ययन में कृषि के संयुक्त राज्य अमेरिका विभाग, कृषि अनुसंधान सेवा द्वारा समर्थित किया गया। व्यापार के नाम या इस प्रकाशन में वाणिज्यिक उत्पादों में विशेष जानकारी प्रदान करने के उद्देश्य के लिए पूरी तरह उल्लेख कर रहे हैं और कृषि के संयुक्त राज्य अमेरिका विभाग द्वारा सिफारिश या बेचान संकेत नहीं करता। यूएसडीए एक समान अवसर प्रदाता और नियोक्ता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biology materials
X. fastidiosa (Xf) Temecula wild type Costa, H. S., et al., 2004 22
pilG deletion mutant XfΔpliG Shi, X. Y., et al., 2007 26
pilG complementary strain XfΔpliG-C  Davis, M. J., et al. 1998 23
Physical materials and equipment
Disposable inoculating loops VWR international, Radnor, PA #22-363-607 quantitative procedures such as bacterial collection
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Corporation #0002709226 Sylgard 184 silicone Elastomeric Kits
AmScope MD2000 digital camera AmScope, Irvine, CA SE305R-AZ-E Image, video recording and measurement 
Tubes line Edgewood, NY #T4300 Connected to the syringe and microfluidic chamber
Plastic luer connectors Edgewood, NY Connected to the syringe and microfluidic chamber
Syringe pumps Pico Plus, Harvard Apparatus, MA #702209 The flow rate can be adjusted while the pump is running.
Syringes Gastight, Hemilton Company, Reno, NV #1005 Provide the flowing broth
Inverted Olympus IMT-2 microscope Olympus IMT-2 FLuoro PHase Image observation and recording
SPOT-RT digital camera Diagnostic Instruments, Inc., MI RT230 Image, video recording and measurement
Microscope Shutter The UNIBLITZ, US #LS2T2 Control camera’s exposure time
Microscope Shutter Control system The UNIBLITZ, US VCM-D1 VCM-D1 Single Channel CE/UL/CSA Approved Shutter Driver
MetaMorph Image software Universal Imaging Corp., PA Real-time super-resolution image processing 

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 110, गतिशीलता चिकोटी प्रकार चतुर्थ Pilus, Microfluidic प्रवाह कक्ष
हिल गतिशीलता के दृश्य और की भूमिका की विशेषता<em&gt; PilG</emमें&gt;<em&gt; Xylella fastidiosa</em
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Shi, X., Lin, H. Visualization of… More

Shi, X., Lin, H. Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa. J. Vis. Exp. (110), e53816, doi:10.3791/53816 (2016).

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