Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.
De fleste undersøgelser af morfogenese stole på kvalitative beskrivelser af, hvordan anatomiske træk påvirkes af forstyrrelser af specifikke gener og genetiske pathways. Kvantitative beskrivelser er sjældent udført, selv om genetiske manipulationer producere en række fænotypiske effekter og observeres variationer selv blandt individer inden kontrolgrupper. Nye beviser for, at morfologi, størrelse og placering af organeller spiller en tidligere underappreciated, men grundlæggende rolle i celle funktion og overlevelse. Her giver vi trin-for-trin instruktioner til at udføre kvantitative analyser af fænotyper på Drosophila larvestadiet neuromuskulære junction (NMJ). Vi bruger flere pålidelige immunhistokemisk markører kombineret med bio-imaging teknikker og morfometriske analyser til at undersøge virkningerne af genetiske mutationer på specifikke cellulære processer. Især fokuserer vi på kvantitativ analyse af fænotyper påvirker morfologi, størrelse og placering af nuclei inden for de tværstribede muskler Drosophila larver. Den Drosophila larver NMJ er et værdifuldt eksperimentel model til at undersøge de molekylære mekanismer bag strukturen og funktionen af det neuromuskulære system, både i sundhed og sygdom. Dog kan de metoder, vi beskriver her udvides til andre systemer.
Qualitative analysis restricts the focus of most experimental studies to the examination of genetic manipulations leading to large phenotypic effects or to phenotypes that are not amenable to quantification, e.g., absence/presence. Quantification of phenotypes is not usually performed and variations present within members of a phenotypic group are not taken into consideration. Additionally, without mathematical descriptions of morphologies, it may be difficult to determine whether fine scale phenotypic changes are the result of genetically induced alterations or whether observed changes are simply due to random fluctuations.
We propose that for an accurate and unbiased analysis of phenotypic defects due to gene disruption, quantitative methodologies should accompany more traditional qualitative approaches. Quantitative evaluation of phenotypes is particularly beneficial for structures such as synapses that present a high degree of variability due to their intrinsic morphological and functional plasticity. We have selected examples of quantitative analyses applied to areas of investigation with which we are most familiar, namely the Drosophila larval neuromuscular junctions (NMJs). However, concepts and principles apply equally well to other experimental systems.
The larval NMJ is an excellent model system to study synaptic development and function because of the highly stereotyped nature of its structure. Each hemi-segment of the larval neuromuscular system contains 32 identifiable motor neurons forming synaptic contacts with their postsynaptic target muscle. Every hemi-segment also contains a fixed number of muscles visible as multinucleated fibers attached to the internal surface of the cuticle1. Another advantage of using the larval neuromuscular system is the power and versatility of Drosophila genetics that easily allows the generation of a number of mutant alleles and the possibility to modify gene expression in a time- and tissue-restricted manner. Finally, 75% of the human genes causing a disease have an evolutionarily conserved orthologue in Drosophila2. Indeed, entire genetic pathways are conserved between flies and humans. Because of this, the Drosophila larval neuromuscular system is a very popular experimental model to elucidate the molecular mechanisms underlying a number of human diseases including amyotrophic lateral sclerosis (ALS)1.
Here we show that the availability of several reliable immuno-histochemical markers, combined with bio-imaging techniques and accurate morphometric analyses can describe anatomical traits that are likely to play an important functional role3,4,5. Among the cellular processes that are amenable to quantitative analyses, we focus on changes in shape, size and position of intracellular structures such as the nuclei. All these are processes that we know very little about.
The challenge for molecular geneticists in the coming decades will be to extend our current knowledge by analyzing the effect of genetic mutations that produce very subtle phenotypic defects. Quantitative methodologies that allow researchers to meticulously explore the effects of genetic mutations can provide a more comprehensive understanding of how genotypes relate to phenotypes, especially for poorly understood cellular processes.
Før i tiden blev morfologiske variationer i og mellem forsøgsgrupper sjældent taget i betragtning. Imidlertid er anvendelsen af kvantitative metoder nu ved at blive normen i sammenlignende studier af morfologi og matematisk beskrivelse af anatomiske former beregnes. Brugen af kvantitative analyser at vurdere virkningerne af genetiske manipulationer om specifikke cellulære processer, holde løfte i at forbedre vores evne til at detektere morfologiske ændringer og forbedre nøjagtigheden, hvormed disse ændringer er beskrevet. Endvidere statistisk analyse af kvantitative data giver os mulighed for at vurdere, om observerede forskelle mellem fænotyper er betydelige.
I tværstribede muskler, kerner udviser en tydelig afrundet struktur og er jævnt fordelt langs muskelfiber. Selvom de molekylære mekanismer oprettelse og vedligeholdelse af størrelse, form og arkitektur kerner ikke er kendt, disse nukleare funktioner er sandsynligvis to spille en afgørende rolle i at kontrollere muskelfunktion. Faktisk er flere myopatier forårsaget af mutationer i gener, der regulerer morfologi og placering af kerner inden muskler. Den funktionelle betydning af form og fordeling af kerner i en celle er ikke begrænset til muskler. Viser voksende vidnesbyrd at nukleare mangler også er forbundet med neurodegenerative sygdomme, såsom Parkinsons sygdom 18,24. Derudover er vi begyndt at forstå, at morfologi, størrelse og intracellulær fordeling af andre organeller herunder endoplasmatiske reticulum og mitokondrierne kan have funktionelle konsekvenser. For eksempel er ændringer i mitokondrie morfologi forbundet med neurologiske lidelser, såsom opticusatrofi type 1 (OPA1) og Charcot-Marie-Tooth typen 2A neuropati 25.
For at hjælpe i processen med at belyse de molekylære mekanismer bag disse vigtige processer, foreslår vi at kombinere høj opløsning konfokaldata med imaging software og morfometriske analyser kvantitativt vurdere, hvor genetiske manipulationer kan påvirke form, størrelse og placering af kerner inden muskelfibre. Den styrke og alsidighed af Drosophila genetik sammen med den meget stereotype karakter af den neuromuskulære system i Drosophila larver gøre larvestadiet NMJ en eksperimentel model særlig egnet til denne type analyser. Ved de larval NMJs, kan udføres fænotypisk analyse på et enkelt synapse beslutning muliggør en nøjagtig morfometrisk analyse, hvor kan studeres en række NMJs inden for samme flue og endda den samme identificerbare NMJ kan sammenlignes mellem fluer af forskellige genotyper 3,4.
Fænotypisk karakterisering af nukleare position, form og størrelse på Drosophila larvestadiet NMJ starter ved at udføre immunfarvning af dissekerede NMJs med antistoffer, der fremhæver muskler og kerner inden muskler. I protokollen beskrevet i this papir, myonuclei blev farvet med polyklonale antistoffer mod lamin, en markør af kernemembranen, med en nuklear markør fremhæve de nukleare indvendige og med antistoffer specifikke for DVAP at farve hele musklen. De Lamin antistoffer anvendt i disse eksperimenter blev venligst leveret af Paul Fisher 19-22, men kan anvendes alternative anti-Lamin antistoffer. Derudover en række andre antistoffer specifikke for kernekappen er kommercielt tilgængelige. Endelig nukleare markører, såsom DAPI og propidiumiodid, er også tilgængelige, mens muskler kunne visualiseres ved farvning med anti-actin eller anti-tubulin-antistoffer. Hvis andre end dem, der anvendes i denne eksperimentelle procedure antistoffer anvendes, vil immunfarvning protokol kræver ekstra-trin, hvor fiksering betingelser og koncentrationer for de nye antistoffer vil skal optimeres. Et afgørende skridt i denne protokol, især når volumen renderinger skal analyseres, er the montering af prøverne på dias. I dette tilfælde er det vigtigt at medtage afstandsstykker mellem dias og dækglasset så, at enhederne ikke bliver klemt. Tre bånd af cellulose tape viklet rundt objektglasset på begge sider af dækglasset repræsenterer en nem måde at gøre afstandsstykker.
Mens ImageJ blev brugt til 2D-billeder, analyser meste af 3D multi-kanal billede præsenteres i dette papir, blev udført ved hjælp af Imaris på grund af sin interne tilgængelighed. Imidlertid kan enhver anden lignende kommerciel softwarepakke anvendes til disse applikationer.
Der er flere open source (f.eks ImageJ, CellProfiler, Vaa3D, Icy, KNIME og andre) og kommercielle software-platforme til rådighed for analysen af konfokale billeder. ImageJ 26, den gratis software fra NIH eller dens mere forbedret udgave, kendt som Fiji 27, har et stort antal af import filtre, makroer og plugins til rådighed for den verdensomspændende imaging kommunity. De fleste af disse plugins er fokuseret på at behandle oplysninger om en skive-by skive måde. Der er også plugins til rådighed for visualisering og analyse af multikanal 3D-billeder. Men de er ofte udviklet til en bestemt opgave, og brugere kan være nødvendigt at udvide eller tilpasse disse plugins til deres egne behov. På den anden side, kommercielle platforme målrette relativt uerfarne brugere og er ofte fokuseret på lethed at bruge, bred dækning af billedbehandling opgaver med utrolig hastighed.
Den eksperimentelle procedure sammen med den kvantitative fænotypisk analyse skitseret i denne protokol, kan hjælpe med at belyse de molekylære mekanismer, der styrer organel morfologi og deres fordeling i en celle. Men denne tilgang har den indlysende begrænsning analysere disse processer på et bestemt slutpunkt. Processen med at styre morfologi og fordeling af organeller sandsynligvis være meget dynamisk og varierer ikke kun mellem forskellige celle types men også inden for samme celle afhængigt af den udviklingsmæssige eller fysiologiske status. En videre gennemførelse af denne analyse vil være repræsenteret af tidsforskydningen imaging, der tillader ændringer i organel morfologi og position til at blive overvåget over tid.
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to Dr. Andrea Chai for her insightful comments on the manuscript. This work was supported by the Wellcome Trust (grant number: Pennetta8920) and by the Motor Neuron Disease Association (grant number: Pennetta6231).
Micro-Forceps 0.3×0.25 mm | Fine Science Tools | 11030-12 | |
Sylgard dissection plates | SIGMA-ALDRICH | 76103 | Mix the pre-weighed elastomer base with curing agent. Poor the mixture into a 5 cm Petri dish. Let cure it at 60ºC for at least 24 hours |
Stainless/Steel Minutien Pins 0.1 mm diameter | Fine Science Tools | 26002-10 | |
Microdissection scissors (ultra-fine) | Fine Science Tools | 15200-00 | |
1x PBS (Phosphate Buffered Saline). Composition: 3mM NaH2PO4, 7mM Na2HPO4, 130mM NaCl, pH 7 | NaH2PO4 (SIGMA-S8282), Na2HPO4 (SIGMA-S7907), NaCl (SIGMA-S7653) | ||
Bouin's Solution. Composition: Picric Acid, Formaldehyde, Acetic Acid (15:10:1) | Picric Acid (SIGMA 197378), Formaldehyde (F8775), Acetic Acid (SIGMA-1005706) | ||
1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton). 1xPBS +0.1% Triton | Triton-X100. SIGMA-T8787 | ||
Normal Goat Serum | SIGMA | G9023 | |
Guinea Pig anti-DVAP antibody | Provided by Dr. Giuseppa Pennetta (University of Edinburgh, UK). Use at !:200 dilution in 5% NGS | ||
Rabbit anti-HRP (Horseradish peroxidase) | Jackson ImmunoResearch | 123-065-021 | Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS |
Rabbit anti-Lamin antibody | Provided by Dr. Paul Fisher (State Univeristy of New York at Stony Brook). Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS | ||
TO-PRO-3 | Molecular Probes | T3605 | |
Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor488, conjugated | Jackson ImmunoResearch | bs-295G-A555-BSS | Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS |
Goat anti-guinea pig IgG antibody, Cy3, conjugated | Jackson ImmunoResearch | bs-0358G-Cy3-BSS | Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS |
Vectashield mounting medium for fluorescence | Vector laboratories | H-1000 |