Abstract
רוב המחקרים על morphogenesis להסתמך על תיאורים איכותיים על איך תכונות אנטומיות מושפעים השיבוש של גנים ספציפיים מסלולים גנטיים. תיאורים כמותיים לעתים רחוקות מבוצעים, למרות מניפולציות גנטיות מייצרות מגוון של תופעות פנוטיפי ווריאציות הם נצפו גם בקרב אנשים בתוך קבוצות ביקורת. מתעוררים הראיות עולה כי מורפולוגיה, גודל ומיקום של אברונים לשחק תפקיד מעריכים בעבר, זאת בסיסי בתפקוד הישרדות התא. כאן אנו מספקים צעד אחר צעד הוראות לביצוע ניתוחים כמותיים של פנוטיפים בצומת neuromuscular תסיסנית הזחל (NMJ). אנו משתמשים כמה סמנים חיסוניים histochemical אמינים בשילוב עם טכניקות ביו-הדמית morphometric מנתח לבחון את ההשפעות של מוטציות גנטיות על תהליכים תאיים ספציפיים. בפרט, אנו מתמקדים ניתוח כמותי של פנוטיפים המשפיעים מורפולוגיה, גודל ומיקום של nuclei בתוך השרירים המפוספסים של הזחלים תסיסנית. תסיסנית הזחל NMJ הוא מודל ניסיוני יקר כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס המבנה ואת התפקוד של מערכת עצבית-שרירית, הן בבריאות ובחולי. עם זאת, מתודולוגיות מתוארת כאן יכולה להתארך עד מערכות אחרות גם כן.
Protocol
1. הכנה ניסויית
הערה: וניתוחים ונהלים חיסוניים היסטוכימיה בסעיפים 2 ו -3 מבוצעים על פי אזכור 3-6, אבל עם שינויים.
- כן 1x פוספט שנאגר מלוח (PBS) ו PBS המכיל 0.1% Triton-X 100 (PBT). ולשמור אותם על הקרח.
- כן המקבע של Bouin (15 picric חומצה: 10 פורמלדהיד: 1 חומצה אצטית קרחונית). הפוך מגיב זה טרי.
- בחר נקי סיכות נירוסטה minutien ו מלקחיים בסדר.
- הכן צלחות לנתיחה המכיל דיסק Sylgard בצלחת 5 ס"מ פטרי.
2. Dissection של צד instar הזחל NMJs
- פיק נדודים הזחלים-instar השלישי מבקבוקון או בקבוק עם מברשת עדינה ומניחים אותם לתוך צלחת 2 ס"מ פטרי המכילה 4 ° C PBS לשטוף את האוכל שיורית משם.
- מניחים זחל אחד על גבי משטח sylgard של הצלחת לנתיחה לוודא שזה positioned עם הצד הגבי שלה עד כדי ששני צינורות לקנה הנשימה האורך גלויים על החלק העליון.
- שימוש במלקחיים כדי להחזיק את הסיכה, להצמיד הזחל בסופה הקדמית, ממש מתחת וו הפה. מתח את הזחל החוצה ככל האפשר ולהצמיד האחורי שלה בסופו למטה.
- הוסף מספיק מלוח PBS להגיע הקירות של ההצלחה לחלוטין לטבול את הזחל.
- חזור על התהליך מן הצעדים 2.1 כדי 2.3 זחלים אחרים של גנוטיפ הזהה. צלחת לנתיחה בצלחת אחת 5 ס"מ פטרי יכול להכיל בקלות עד 8 הזחלים.
- בעזרת מספריים מיקרו לנתיחה, להרים את לציפורן הגב מעט ולעשות חתך אופקי קטן בקצה האחורי ליד סיכה.
- הכנס מספריים לתוך החתך, לחתוך את הזחל כל הדרך עד הסוף הקדמי לאורך קו האמצע בין שני קטעי האורך של קנה הנשימה. ודא כי קיצוצי קו האמצע הם שטחיים מספיק רק לעבור דרך לציפורן וכדי למנוע חיתוך דרך השריריםבצד הגחון.
- בכל קצה, לחתוך שני חריצים משני השמאל וימין.
- פתח את הפילה על ידי נחת שתי סיכות משני צידי החתך הקדמי. חזור על אותו דבר עם הקצה האחורי. כאשר הנחת סיכות, לוודא להפיץ את הקיר הגוף בנפרד.
- יש לנקות את האיברים הפנימיים באמצעות מלקחיים מלוחים PBS. השארת מערכת העצבים המרכזית ללא פגע. בעדינות למתוח את הזחל עם סיכות בפינה עד שהוא נמתח לחלוטין אך לוודא כי השרירים הם לא נקרעו במהלך תהליך זה.
- חזור על אותו ההליך לנתיחה עבור הזחלים האחרים על אותה צלחת לנתיחה.
- לשטוף עם מי מלח שלוש פעמים PBS להסיר כל האיברים הפנימיים.
- החזר את PBS עם מקבע של Bouin ומשאירים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
- לשטוף מספר פעמים עם PBT.
- הסר את הסיכות בזהירות ולהעביר את כל ההכנות, אשר נמצאים כעת נוקשה למדי, לתוך צינור 1.5 מ"ל מיקרו צנטריפוגות עבור מכתים חיסונית.
3. חיסונית-histochemical הכתמה של תסיסנית NMJs עם נוגדנים ספציפיים עבור שרירים Myonuclei
- במהירות לשטוף את פילת הזחל ב PBT.
- חסום את ההכנות על ידי דוגרים עם 10% עז בסרום נורמלי (NGS) ב- PBT במשך שעה 2 תחת תסיסה מתמדת.
- דגירה קבוצה של NMJs גזור PBT המכיל 5% של NGS ו נוגדן אנטי-lamin ארנב (בריכוז של 1: 500) ועם נוגדן אנטי DVAP שרקן (בריכוז של 1: 500) עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר או 4 ºC לילה. הנוגדן אנטי DVAP מכתים את השרירים המפוספסים בעוד המכתים אנטי-lamin מזהה את קווי המתאר של myonuclei.
- שטפי פעם במהירות PBT להסיר את הנוגדנים עולים. לשטוף PBT במשך שעה 2 על ידי שינוי PBT חיץ כל 15 דקות.
- דגירה דגימות PBT המכיל NGS 5% ו נוגדנים משני שכותרתו פלורסנט בבית 1: 500 דילול עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר. אותו דגימות גלהיות נתון מכתים עם נוגדנים מרובים בו זמנית אם נוגדנים משני מצומדות עם chromophores שונים משמשים.
- הסר נוגדנים משני ולשטוף PBT במשך שעה 2 על ידי שינוי PBT חיץ כל 15 דקות.
- כדי להכתים את הפנים של myonuclei לשטוף את דגימות שלוש פעמים עם PBS והמשך כדלקמן:
- מוסיף את הסמן הגרעיני TO-PRO-3 בדילול של 1: 1,000 ב PBS ו דגירה במשך 20 דקות תחת תסיסה מתמדת. סמן זה משמש במחקר זה אבל כל סמן גרעיני זמין מסחרי אחר יכול לשמש היטב.
- שטפו במהירות שלוש פעמים PBS לפני הרכבה.
4. דוגמאות הרכבה בשקופיות
- בחר את דגימות עם מלקחיים מן 1.5 מ"ל צינור מיקרו צנטריפוגות ונשכב אותם בשקופית עיבוד.
- באמצעות מספריים מיקרו לנתיחה, לחתוך את הראש ואת הזנב של פילה להתעדכן המשטח הפנימי שלהם.
- כן הדואר הרכבת שקופיות על ידי לפף סביב שלוש רצועות של סרט תאי בכל צד של שקופית נקיה ממרחק של כ -1 סנטימטר אחד מהשני. לאחר coverslip ממוקם על גבי שתי רצועות, פער יופק כי ימנע משטחת של הדגימות. זה חיוני אם הדמיות נפח תלת ממדי של מבנים הם להיעשות.
- שים טיפה קטנה של כ -20 μl של הרכבה בינונית באמצע השקופית גובר בין רצועות קלטת תאית שלוש.
- אחרי מריחת ההרכבה בינונית עם מלקחיים נקיים, גרור את הזחלים הגזורים לשקופית ההרכבה לתוך ההרכבה הבינונית, תוך שמירה על למעלה המשטח הפנימי. נסה לעגן אותן בשורות של ארבעה או חמישה.
- בעדינות טיפה להחליק על גבי העטיפה של השקופית הרכבה ולוודא כי אין בועות אוויר נוצרות. חותם את השקופית עם לכה מסמר שקוף. תנו דגימות להתייבש במשך לפחות 10 דקות לפני הדמיה.
5. הגדרות Confocal הדמיה
הערה: תמונות שהוצגו במחקר זה נלקחים באמצעות יחידת confocal A1R Nikon משולבת על Ti: מיקרוסקופ E הפוכה. עם זאת, כל מיקרוסקופ confocal עם מינימום של 3 יחידות ליזר זמינות באזורי הגל של 488 ננומטר, 561 ננומטר 642 ננומטר ומערכת זיהוי 3 ערוץ מתאים למטרה זו.
- להדליק את הלייזרים, יחידת גלאי, נורה כספית, בקר במה, המיקרוסקופ לבין המחשב. הפעל את התוכנה מלאה לאבטח את השקף על בעל הבמה.
- כדי להפוך הדמיה מהר, בחר וסמן את כל האזורים של עניין (ROI) על מדגם באמצעות המטרה 20X.
- בזהירות להניף את המזנקים אל העדשה האובייקטיבית בהגדלת 60X גבוהה (60X תכנית Apo VC / NA 1.4 OIL).
- מניח טיפת שמן טבילה על העדשה האובייקטיבית ובחר אחד ROI מסומן מחלון סקירת XYZ במחשב.
- התחל הדמיה באמצעות ההגדרות האופטיות הבאות: בחר את מראה dichroic הראשון: 405/488/561/640. בחר 488 ננומטר לייזר עם מסנן פליטה 525/50 ננומטר בערוץ 1, 561 ננומטר לייזר עם מסנן פליטה 595/50 בערוץ 2 ו לייזר 642 ננומטר עם 650 ננומטר מסנן ארוך לעבור בערוץ 3.
- השתמש בהגדרות הסריקה הבאות לפני תחילת רכישת תמונה: בחר סורק Galvano; כיוון סריקה: דרך אחת; מהירות סריקה: 0.5 פריימים לשנייה.
- בחר הסדרה בערוץ להימנע לדמם דרך הערוץ.
- התאם את גודל פין חור היחידה אוורירית 1. סרוק ולהתאים את הרווח זיהוי כוח, לייזר ו לקזז כראוי עבור כל ערוץ, כדי למנוע הרוויה פיקסל ורמת רקע.
- רוכשת Z- ערימות באמצעות גודל voxel 0.2 x 0.2 x 0.5 מיקרומטר 3 עבור כל ROIs וההכנות השקופיות. אם התמונות יהיה נתון deconvolution מכן להגדיר את גודל voxel 0.06 x 0.06 x 0.15 מיקרומטר 3.
- שמור תמונות בפורמט פורמט או .ics קובץ .nd2.
חישוב 6. של המרחק בין גרעיני בתוך מפוספס60; שרירים על ידי השיטה של ניתוח השכן הקרוב ביותר
- לניתוח זה, להשתמש בתמונות confocal המוצגות שרירי גוף-קיר זחל מוכתמים נוגדני DVAP לדמיין את השרירים עם נוגדני lamin ועם סמן גרעיני כדי להדגיש את הגרעינים.
- כדי לאמוד את המרחק הקרוב בין הגרעינים, השתמש נקודות מדידה בתוך מודול MeasurementPro של תוכנת ניתוח התמונה (לדוגמה, Imaris). יישומי תוכנה דומים אחרים לניתוח תמונה יכולים לשמש לאותן מטרות.
- פתח את התמונות confocal. כדי ליזום, לחץ לחיצה כפולה על סמל התוכנה. גרור ושחרר את Z- מחסנית תמונות confocal לזירה.
- לחץ לחיצה כפולה על התמונות כדי לפתוח אותם אוטומטית צפו לעלות, מתחת לסמל סרגל כלי תפריט
. יש לעלות צפה שלושה פאנלים סביבת עבודה עיקריים: Area נוף, Object רשימה עצמים פינת מאפיינים. - צור t שניתנו נפחhree תמונת ערוץ על ידי לחיצה על סמל תפריט תצוגת 3D
. - הקש על סמל הנקודות להוסיף המדידה החדשה
מ ה אובייקטים של הסרגלים בצעו את אשף יצירה שמופיע בשטח מאפייני אובייקט. - מתוך אשף היצירה לבחור בכרטיסיית העריכה ראשונה ולאחר מכן בערוץ ספציפי. בחר באחת האפשרויות סמן גרעיני או בערוץ lamin כדי להדגיש את הגרעינים.
- הגדר את המצביע למצב בחר ידי לחיצה על הלשונית Esc במקלדת.
- התאם את גודל תיבת סמן 3D עם גלגל העכבר כדי לכלול גרעין נתון בתמונה. הוספת נקודת מדידה על ידי החזקת מקש SHIFT לחוץ ולחץ עכבר שמאלי על אותו הגרעין.
- מוסיפים את הנקודה השנייה על גרעין הסמוכים על אותו השריר על ידי חזרה על השלבים הקודמים. קו מצויר באופן אוטומטי בין שתי נקודות ואת המרחק הנמדד בין שני הגרעינים מוצגים. המרחק בין שני הגרעינים נרשם עכשיו כמשתנת סטטיסטיות אובייקט שטח נכסים תחת סטטיסטיקת כרטיסייה> מפורט> מרחק הנתונים.
- חזור על התהליך מן הצעדים 6.6 כדי 6.10 עבור כל הגרעינים סביב גרעין נתון.
- מתוך סטטיסטיקה> מפורט> נתוני מרחק מוצגים כל נקודות המדידה שנאספו, לבחור את המרחק הקצר ביותר.
- אם תקליק על הסטטיסטיקה על יצוא תצוגת Tab כדי קובץ
מוגש בכפוף פינת מאפייני האובייקט, הנתונים יישמרו על גיליון אלקטרוני. - חזור על אותו התהליך עבור הגרעינים שמסביב האחרים ובמשך מספר נבחר של סיבי שריר לכל גנוטיפ.
- בהתבסס על הנתונים לייצא לקובץ גיליון אלקטרוני, לחשב את המרחק הקצר הממוצע (שד 'D) עבור כל מספר M של שרירים באמצעות המשוואה הבאה:
oad / 53,821 / 53821eq1.jpg "/>
די הוא המרחק הקצר ביותר לגרעין השכנה עבור גרעין נתון אני איפה אני משתנה בין 0 ל N ו- N הוא מספר גרעינים נתחו לכל שריר. הסיכום של ערכים מ j = 0 עד j = m מציין את מספר M של שרירים מנותחים. - לחלופין, להשתמש כתמים אשפי יצירת כתמי כתמי המרחק הקרוב ביותר כדי להעריך את המרחק הממוצע לגרעין הקרוב ביותר אלינו. לשם כך, מודול הרחבה Matlab הוא זקוק.
- לחץ לחיצה כפולה על תמונה ספציפית אחת על זירת תמונת 3D כרכים יוצגה בתצוגת הפינה. הקש על סמל יצירת אובייקט והוספת מקומות חדשים
מסרגל הכלים אובייקטים. - מתוך אשף יצירה באובייקט פינת מאפיינים, לחץ על האפשרות דלג אוטומטי יצירה, עריכה הידנית.
- בחר באחת האפשרויות lamin או ערוץ סמן גרעיני כדי להציג את הגרעינים.
- Shift ולחץ LEFלחצן עכבר לא על כל הגרעינים של שרירים ספציפיים בתמונה. נקודה על כל גרעין תופיע.
- בחר כתמי כתמי המרחק הקרוב ביותר הרשום בכרטיסיית הכלים באובייקט פינת מאפיינים. סטטיסטיקה כתם בחר תחת מצב התוצאה וחלון Matlab מופיעה.
- בכרטיסייה לסטטיסטיקה, בחר ערכים מפורטים ואז ספציפיים. הקש על Distmin וערכי המרחקים המינימאליים עבור כל גרעין יופיעו.
- לייצא את הנתונים לקובץ גיליון אלקטרוני לחשב את הממוצע של המרחקים האלה לכל שריר. חזור על התהליך עבור כל השרירים של גנוטיפ נתון.
- לחץ לחיצה כפולה על תמונה ספציפית אחת על זירת תמונת 3D כרכים יוצגה בתצוגת הפינה. הקש על סמל יצירת אובייקט והוספת מקומות חדשים
. יש לעלות צפה שלושה פאנלים סביבת עבודה עיקריים: Area נוף, Object רשימה עצמים פינת מאפיינים. 
. 
מ ה אובייקטים של הסרגלים בצעו את אשף יצירה שמופיע בשטח מאפייני אובייקט. 
מוגש בכפוף פינת מאפייני האובייקט, הנתונים יישמרו על גיליון אלקטרוני. 
מסרגל הכלים אובייקטים. 7. על דמותה של גרעינים בתוך שרירי הגוף-הקיר של הזחלים תסיסנית
- לניתוח זה, להשתמש בתמונות confocal של שרירי הגוף-קיר מוכתם lamin ועם סמן גרעיני לדמיין את הגרעינים.
- כדי להעריך את הצורה של myonuclei, כדוריות מידה (מוגדר כיחס של סורשטח הפנים של כדור עם נפח זהה כגרעין נתון, אל פני השטח של הגרעין) או סְגַלגַלוּת (מבחין בין ellipsoids oblate / מוּאֲרָך ו spheroids).
- פתח את התמונה כפי שתואר לעיל. הקישו על סמל אובייקטים הכלים הוסף משטחים
. - באשף יצירת המופיע אובייקט פינת מאפיינים, בחר את מכתים סמן גרעיני כמו מקור ערוץ כדי להציג את הגרעינים.
- הגדר את עוצמת האפשרות המוחלטת הוא הסף. ודא כי רוב הגרעינים להראות טיוח חלקה ולא עמוס ידי שינוי הערך על עקומת הסף. במקביל, למנוע את נוכחותו של חורים או מסכה שלמה לכל גרעין באמצעות אותו העיקול.
- להשתמש ב כלי סינון להוציא שום רעש בעיבוד השטח. בכרטיסיית העריכה של שכבת פני שטח החדש שנוצרה, פיצול או מיזוג משטחי הגרעינים כי הם שגוי מחדשndered.
- יצוא לגיליון אלקטרוני להגיש הערכים סְגַלגַלוּת ו עגולים הגרעינים שניתנו המשטח זמינים תחת כרטיסיית הסטטיסטיקה.
- לחלופין, להשתמש בתוכנת ImageJ או פיג'י למדוד את המעגליות של גרעינים שבו המעגלי (C) מוגדר C
. ערך של אחד מייצג עיגול מושלם בעוד שערך מתקרב לאפס מצביע על צורה מאורכת יותר ויותר. - צור תחזיות בעוצמה מקסימלית של ערימות z מתמונות תפריט> סטאקס> פרויקט Z. סוג הקרנת גדר מקס עצמה.
- פיצול הערוצים בחרו בערוץ הסמן הגרעיני.
- מהתפריט הראשי, בחר תמונה> התאם> סף.
- מגזר הגרעינים ידי התאמת הסף האינטנסיבי. אם הגרעינים הסמוכים מפולחים כיחידה אחת, לחץ על תהליך> בינארי> כלי Watershed לנתק את הגרעינים.
- מהתפריט הראשי, בחר ערוך> Sבחירות> צור בחירה.
- מוסיף את כל ROIs נבחר למנהל ROI על ידי לחיצה על תפריט לנתח> כלים> מנהל ROI. בחלון מנהל ROI לחץ על הוספה. בתוך אותו חלון בחר עוד> פיצול.
- בחר מתארי צורה בלנתח> מדידות גדר. בחלון מנהל ROI לחץ על הכרטיסייה לִמְדוֹד. זה יציג רשימה של ערכים המעגליים של כל הגרעינים שנבחרו.
- בנוסף, כדי למדוד את הנפח הגרעיני, בצע אשף יצירת משטח באמצעות ערוץ מכתים סמן הגרעיני כמתואר בסעיפים קטן 7.3-7.7.
. 
. ערך של אחד מייצג עיגול מושלם בעוד שערך מתקרב לאפס מצביע על צורה מאורכת יותר ויותר. 8. הדמיות נפח 3D של גרעינים נבחרים בתוך השרירים תסיסנית הזחל גוף-הקיר כדי להעריך את לוקליזציה intranuclear של חלבון מסוים
- השתמש בתמונות confocal דיווח בשרירי דופן הגוף מוכתם סמן גרעיני עם נוגדנים ספציפיים lamin ו DVAP.
- פתח את התמונות על ידי ייזום התוכנה select להיות מנותח גרעין מסוים. ניתן לעשות זאת על ידי בחירת 3D יבול פריט התפריט הראשי ערוך>.
- עקוב אשף יצירת שטח באמצעות ערוץ lamin כמתואר בסעיף קטן 7.3-7.7.
- לאחר שהמשטח נוצר, לחץ על ערוך באזור מאפייני האובייקטים ולאחר מכן בחר מסכת הכל כדי לבודד את האות בתוך הגרעין. זה יוצר חלון חדש.
- אות DVAP בחר מתוך התפריט הנפתח בחר ערוץ. בחר את האות החיסונית תגובתיות DVAP בתוך הגרעין על ידי לחיצה על אפשרות Set ווקסלים מחוץ Surface לאפס. ערוץ רעול פנים חדש נוצר והוא זמין בחלון התאמת תצוגה לבחירה.
- כדי להמחיש את נוכחותו של אות בתוך גרעין ליצור מטוס קונטור ידי לחיצה על סמל הוסף Clipping Plane
מסרגל הכלים אובייקטים. - אינטראקטיבי להתאים את הזווית של גזירמטוס עמדתה כדי להמחיש את ההפצה של האות בתוך הגרעין.
מסרגל הכלים אובייקטים. Representative Results
ALS היא מחלה ניוונית במיוחד משפיעים הנוירונים מוטורי המוביל שיתוק מתקדם וקטלני של שרירים מפוספסים 7. מוטציות missense ב- B חלבון אנושי-Associated VAMP (hVAPB) לגרום למגוון של מחלות הנוירון המוטורי כולל סוג ALS 8 8-12. מוטציה missense (V234I) בגן hVAPB זוהה לאחרונה במקרה אחד ALS טיפוסי בבני אדם 13. כדי להעריך את הפוטנציאל פתוגניים שלה, שעוררנו זבובים מהונדסים המבטאים את DVAP hVAPB תסיסנית orthologue נושא את מוטצית גורמי מחלות (DVAP-V260I). הביטוי של transgene זו היה ממוקד השרירים באמצעות מערכת כטב"מ / GAL4 והנהג ספציפי שרירים BG57-Gal4 14,15. השפעת ביטוי מהונדס DVAP-V260I הושווה ו בניגוד לזו של שני transgenes אחרים (DVAP-WT1 ו DVAP-WT2), המבטאים רמות שונות של חלבון wild-type DVAP 16. מורדואר ספציפי, העלייה immunoreactivity DVAP הוא 2.2 גבוה פי מאשר בקבוצת הביקורת עבור הקו DVAP-WT2 בעוד DVAP-V260I ו DVAP-WT1 התערוכה להשוות והתחתון רמות של אותו אות 16.
שינויים גרעיניים כבר הקשורות להזדקנות וכמה מחלות ניווניות כולל 17,18 מחלת פרקינסון. כדי להעריך אם דגם הזבוב שלנו עבור ALS8 מפגין שינויים בארכיטקטורה גרעיני, מיקום וגודל, אנו מוכתמים גרעינים בתוך שרירים מפוספסים של גנוטיפים מתאימים בטוש גרעיני הנוגדן אנטי lamin 19-22, אשר ממחיש את מעטפת הגרעין. כדי להדגיש את השרירים, נוגדן DVAP ספציפי גם התווסף דגימות אותו (איור 1). תמונות Confocal נאספו וניתוחי morphometric מפורטים בוצעו באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. בשרירים מלאים, גרעינים נמצאו מופץ באופן שווה לאורך השרירסיבים בעוד DVAP-V260I ו DVAP-WT להביע שרירים, גרעינים מפגינים נטייה להפיץ באשכולות קשר הדוק (איור 1).
ערכנו ניתוח השכן הקרוב ביותר לבצע הערכה כמותית של חלוקת הגרעינים לאורך סיבי השריר של כל גנוטיפ. ניתוח שכן קרוב ראשון מזהה את השכן הקרוב ביותר לכל גרעין על ידי מדידת המרחק בין המרכז של גרעין נתון במרכזה של כל גרעין שמסביב אחר. הליך זה חוזר על עצמו אז עבור כל גרעינים אחרים לאורך הסיב השריר. לבסוף, המרחק הקצר ביותר בין גרעינים בתוך שריר ספציפי, מחושב על ידי ממוצע המרחקים הקצרים ביותר של כל גרעין השכנים הכי הקרובים שלה. (איור 2 א - ג). בהשוואה לקבוצת הביקורת, השרירים להביע גם את הגן DVAP-V260I או כל אחד transgenes overexpressing חלבון wild-type, להציג ירידה דרמטית המרחק הקצר הממוצע בין גרעינים, וכתוצאה מכך, גרעינים נראים קשר הדוק באשכולות. השפעת ALS גרימת אלל DVAP-V260I הוא חמור יותר מזה הקשורים ביטוי יתר של חלבון wild-type, גם אם transgene DVAP-WT2 החזק משמש (איור 1 ואיור 2D).
התבטאות יתר של או DVAP-V260I או DVAP-WT transgenes גם מפגין הידרדרות חמורה של האדריכלות גרעינית וכתוצאה מכך גרעינים מעוות עם מבנה מאורך (איור 1). סטייה מבנית זה הייתה לכמת באמצעות תוכנת ImageJ שבו מעגלי מוגדרת על ידי הנוסחא C 
, אשר מודד את יחס רוחב אורך של כל גרעין עם C = 1 מייצג עיגול מושלם ו- C = 0 מצולע מוארך עד אין קץ. ב contrגרעיני ol מפגינים צורה עגולה ברורה, C שווה ל -1 ואילו מוטציות המהונדסות שינוי הצורה שגרם לאיבוד מעגלי, גורם לחריגה משמעותית מן הערך הזה (איור 1 ואיור 3).
גם מצאנו כי בשרירים להביע אותו transgenes, גרעינים להציג נפח גרעיני מוגדל מסומן בהשוואה לקבוצת הביקורת, אם כי האלל גרימת ALS שנראה יעיל יותר בזירוז פנוטיפ זה לעומת transgenes DVAP-WT (איור 4).
כמעט כל מחל ניווניות מאופיינות ההצטברות התאית של אגרגטים המכילים החלבון פתוגניים. עשינו שחזורי 3D ו הדמיות נפח של גרעינים ומצאנו כי בשרירים המבטאים את transgene המוטציה או overexpressing חלבון wild-type, אשכול החיסוניות תגובתיות DVAP יצרהnd שכמה מהם גם היו נקודות לתוך הגרעינים (איור 5). לעומת זאת, ב NMJs שליטה, תגובתיות חיסונית DVAP מתפזר קלוש לאורך סיב השריר והוא נשלל מהגרעין 16.
. איור 1: תמונות Confocal של myonuclei בתוך השרירים מפוספס להביע גם את DVAP-WT או transgenes DVAP-260I (א) BG57-Gal4 / + שליטה, (B) BG57; DVAP-V260I, (C) BG57; DVAP-WT1 ו (ד) BG57; שרירי DVAP-WT2 המבטאים את transgenes הצביע מגואלות נוגדנים ספציפיים עבור DVAP (אות אדומה), lamin (אות ירוקה) עם סמן ספציפי גרעיני לדמיין את הגרעינים (אות כחולה). בר סולם = 30 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי להציגגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: ניתוח השכן הקרוב ביותר כדי לקבוע את המרחק הממוצע בין גרעין לבין שכנו הקרוב היחיד שלה (B) תוצאות נציג מראות מיצוב גרעיני שינה בשרירים ביתר את גן DVAP-WT2 כאשר בהשוואה לקבוצת ביקורת (A).. מרחק גרעיני ממוצע בשרירים של גנוטיפים הצביע נאמד בעזרת הנוסחא (C) לבין הנתונים מדווחים (D). NMJs זחל מגואלות נוגדנים ספציפיים עבור DVAP (אות אדומה), lamin (ירוק) עם סמן גרעיני (אות כחולה). כוכביות לציין מובהקות סטטיסטיות. *** P <0.001, ** P <0.01. לניתוח סטטיסטי של ניסוי זה ושל כל הניסויים דיווחו להלן מבחן חד סטרי ANOVA שימש וכן multip של Tukeyle מבחן השוואה יושם כמבחן פוסט הוק כאשר הבדלים בין גנוטיפים נמצאו משמעותי על ידי מבחן ANOVA. ברי שגיאה מייצגים SEM. בר סולם = 30 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3:. תמונות מראות צעדי נציג בחישוב הנפח הגרעיני (א) תמונת נציג מראה גרעינים מפולחים באמצעות אשף יצירת משטח. גרעינים בגבול של התמונות זכו להתעלמות. (ב) תמונה מראה את אות DVAP הגרעינית לאחר מכתים DVAP שמסביב כבר רעולה פנים באמצעות פני השטח נוצר בערוץ הסמן הגרעיני. (C) בשכבת קרקע מספקת מידע של פרמטרים נוספיםכולל נפח הכדוריות הגרעיני. (ד) נתונים על נפח הגרעין של גנוטיפים שונים. כוכביות לציין מובהקות סטטיסטיות. NMJs הגזור הוכתם נוגדנים אנטי DVAP (אות אדומה), נוגדנים נגד lamin (אות ירוקה) סמן גרעיני (אות כחולה). *** P <0.001, ** P <0.01. ברי שגיאה מייצגים SEM. בר סולם = 30 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: תמונות מראות צעדי נציג להערכת צורה גרעינית על ידי ImageJ. הקרנה של תמונות עצמה המקסימלית נותחה באמצעות ImageJ להעריך מעגלי של גרעינים בתוך שרירים. (א) דוגמה מייצגת של הקרנת העוצמהשל תמונה תלת ערוץ כמו בשלב 7.9 של הפרוטוקול. תמונה (B) מראה צעד 7.10 של הפרוטוקול שבו ערוצי מפוצלות וערוץ הסמן הגרעיני נבחרת. (C) תמונה מייצגת מראה כי לאחר החלת סף עוצמת לפלח את מנהל הגרעינים ואת ההחזר על ההשקעה תוסף ImageJ, כל הגרעינים של עניין ניתן לבחור וצורתם נמדד באמצעות מתארי צורה (שלבים 7.11-7.15). (ד) כימות של המעגליות של גנוטיפים שונים. על NMJs הזחל, האות האדום מציין מכתים DVAP בעוד ירוק תאר גרעינים ואת תואם את מכתים lamin. הפנים של כל גרעין מסומן הכחול בשל המכתים עם סמן גרעיני. כוכביות לציין מובהקות סטטיסטיות. *** P <0.001, ** P <0.01. ברי שגיאה מייצגים SEM. בר סולם = 30 מיקרומטר אנא לחץ אותהדואר כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: תמונות מראות צעדים ספציפיים ביצירת הדמיות היקף myonuclei. (א) תמונת מראת עוצמת 3D מעורבבת לאור שרירים מוכתמים חלבון DVAP (אדום), lamin (ירוק) ואת סמן ה- DNA (הכחול). (ב) תמונה המייצגת את שכבת פני שטח שנוצרה באמצעות ערוץ lamin לפלח את הגרעינים. (C) תמונה המייצגת את גרעין שבו שכבת פני השטח נעשה שימוש כדי להסוות את האות DVAP שמחוץ לגרעין הנבחר. מודגש בצהוב הוא מטוס גזיר שנוסף על התמונה. זווית הראייה ואת המיקום שלה יכול להיות מותאם באופן אינטראקטיבי כדי להמחיש את לחלוקת אותות בתוך גרעין. (ד) תמונת דיווח נוף חתך של שכבת פני שטח הגרעיני נוצר using ערוץ lamin התמזג עם DVAP מסיכת אותות סמן גרעיניים. (E ו- F) הדמיות נפח מחולקות נוספות מאותו הגרעין. בר סולם = 10 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
בעבר, וריאציות מורפולוגיים בתוך ובין קבוצות ניסוי לעתים רחוקות נלקחו בחשבון. עם זאת, היישום של שיטות כמותיות חברה הופך לנורמה במחקרים השוואתיים של מורפולוגיה תיאור מתמטי של צורות אנטומיות מחושבת. שימוש ניתוחים כמותיים בהערכת ההשפעות של מניפולציות גנטיות על תהליכים תאיים ספציפיים, הבטחה בשיפור יכולתנו לזהות שינויים מורפולוגיים בשיפור הדיוק שבו שינויים אלה מתוארים. יתר על כן, ניתוח סטטיסטי של נתונים כמותיים מאפשר לנו להעריך האם ההבדלים שנצפו בין פנוטיפים הם משמעותיים.
בשרירים מפוספסים, גרעינים מפגינים מבנה מעוגל ברור והם פזורים באופן אחיד לאורך הסיב השריר. למרות המנגנונים המולקולריים לקביעתם ולקיומם גודל, צורה ואדריכלות של גרעינים אינם ידועים, תכונות גרעיניות אלה לא סבירo לשחק תפקיד בסיסי שליטת תפקוד שרירים. ואכן, כמה myopathies נגרמת על ידי מוטציות בגני ויסות מורפולוגיה ומיקום של גרעינים בתוך שרירים. החשיבות התפקודית של צורה והפצה של גרעינים בתוך תא אינה מוגבלת שרירים. צבירת הראיות עולה כי פגמים הגרעין קשורים גם עם מחלות ניווניות כגון של מחלת פרקינסון 18,24. בנוסף, אנו מתחילים להעריך מורפולוגיה כי, גודל והפצה התאית של אברונים אחרים כולל reticulum endoplasmic ואת המיטוכונדריה יכול להיות השלכות תפקודיות. לדוגמא, שינויים במורפולוגיה המיטוכונדריה קשורים להפרעות נוירולוגיות כגון מסוג 1 ניוון ראייה (OPA1) ו שארקו-מארי-שן הסוג 2A נוירופתיה 25.
כדי לסייע בתהליך של הבהרת המנגנונים המולקולריים שבבסיס תהליכים חשובים אלה, אנו מציעים לשלב confocal ברזולוציה גבוההנתונים עם תוכנות morphometric הדמיה מנתחות להעריך כמותית כיצד מניפולציות גנטיות יכולות להשפיע צורה, גודל, ומיקום של גרעינים בתוך סיבי שריר. העצמה ואת צדדיות של גנטיקה תסיסנית יחד עם טבע השבלונות ביותר של המערכת העצבית-שרירית זחלים תסיסנית להפוך את NMJ זחל מודל ניסיוני מתאים במיוחד עבור סוג זה של ניתוחים. בבית NMJs הזחל, ניתוח פנוטיפי יכול להתבצע ברזולוציה סינפסה אחת ומאפשר ניתוח morphometric מדויק שבו מספר NMJs ניתן ללמוד בתוך אותו זבוב ואפילו באותו NMJ לזיהוי ניתן להשוות בין זבובים של גנוטיפים שונים 3,4.
אפיון פנוטיפי של מיקום, צורה וגודל גרעיני בבית NMJ תסיסנית הזחל מתחיל על ידי ביצוע immunostaining של NMJs גזור עם נוגדנים מדגישים שרירי גרעינים בתוך שרירים. בפרוטוקול מפורט תישל העיתון, myonuclei הוכתמו נוגדנים polyclonal נגד lamin, סמן של מעטפת הגרעין, בטוש גרעיני הדגשת נוגדנים פנים עם גרעיני ספציפי DVAP להכתים את השריר כולו. הנוגדנים lamin השתמשו בניסויים אלה נמסרו באדיבות על ידי פול פישר 19-22 אבל מקורות חלופיים של נוגדנים אנטי-lamin ניתן להשתמש. בנוסף, מספר נוגדנים אחרים ספציפיים עבור מעטפת הגרעין זמין מסחרי. לבסוף, סמנים גרעיניים, כגון DAPI ו יודיד propidium, זמינים גם בעוד שרירים יכולים להיות דמיינו ידי מכתים עם נוגדנים נגד תקטין או אנטי-טובולין. אם נוגדנים אחרים מאלה המשמשים בהליך ניסיוני זה מועסקים, פרוטוקול immunostaining ידרוש תוספת-צעדים בם תנאי קיבעון ריכוזיים עובדים עבור הנוגדנים החדשים יצטרכו להיות מותאמים. שלב קריטי אחת בפרוטוקול זה, במיוחד כאשר הדמיות נפח צריכות להיות מנותחות, הוא הדואר הרכבה של דגימות בשקופית. במקרה זה, חשוב לכלול מפרידים בין השקופיות ואת coverslip כך הדגימות לא תימחצנה. שלוש להקות של קלטת תאית עוטפות את השקף על שני הצדדים של coverslip מייצגות דרך קל להרוויח מפרידים.
בעוד ImageJ שמש תמונות 2D, שרוב התמונה מתקבלת רב ערוצית 3D ניתוחי המוצג במאמר זה, נעשה באמצעות Imaris בגלל הזמינות בתוך הבית שלה. עם זאת, חבילת תוכנה מסחרית דומה אחרת יכולה לשמש עבור יישומים אלה.
ישנן מספר קוד פתוח (למשל, ImageJ, CellProfiler, Vaa3D, Icy, KNIME ואחרים) ופלטפורמות תוכנה מסחרית זמין עבור ניתוח של תמונות confocal. ImageJ 26, התוכנה החופשית מ- NIH או בגרסתו המשופרת יותר, המכונה פיג'י 27, יש מספר גדול של מסנני יבוא, פקודות מאקרו ותוספות זמינות עבור ותקשורת ההדמיה ברחבי העולםty. רוב התוספים האלה מתמקדים עיבוד המידע על באופן פרוס פרוס בנפרד. ישנם גם תוספים זמינים עבור להדמיה והניתוח של תמונות 3D רבות. עם זאת, הם לעתים קרובות המיועדים משימה מסוימת ומשתמשים עשויים להידרש להרחיב או להתאים תוספים אלה לצרכימים שלהם. מצד השני, פלטפורמות מסחר למקד למשתמשים מנוסים יחסית, ולעתים קרובות הם התמקדו קלים לשימוש, כיסוי רחב של משימות עיבוד תמונה במהירות מדהימה.
הליך הניסוי יחד עם ניתוח פנוטיפי כמותית המפורטים בפרוטוקול זה, יכול לסייע הבהרת המנגנונים המולקולריים השולטים מורפולוגיה אברון והפיצו בתוך תא. עם זאת, גישה זו יש ההגבלה הברורה של ניתוח תהליכים אלה במבוי-לנקודה מסוימת. תהליך שליטת מורפולוגיה והפצה של אברונים צפוי להיות מאוד דינמי לגוון לא רק בין ty תאים השונהPES אלא גם בתוך התא אותו בהתאם למצב התפתחותי או פיסיולוגי. יישום נוסף של ניתוח זה יהיה מיוצג על ידי הדמית זמן לשגות המאפשרת שינויים במורפולוגיה אברון ותנוחה להיות במעקב לאורך זמן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro-Forceps 0.3 mm x 0.25 mm | Fine Science Tools | 11030-12 | |
| Sylgard dissection plates | SIGMA-ALDRICH | 76103 | Mix the pre-weighed elastomer base with curing agent. Poor the mixture into a 5 cm Petri dish. Let cure it at 60 °C for at least 24 hr |
| Stainless/Steel Minutien Pins 0.1 mm diameter | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Microdissection scissors (ultra-fine) | Fine Science Tools | 15200-00 | |
| 1x PBS (Phosphate Buffered Saline). Composition: 3 mM NaH2PO4, 7 mM Na2HPO4, 130 mM NaCl, pH 7 | NaH2PO4 (SIGMA-S8282), Na2HPO4 (SIGMA-S7907), NaCl (SIGMA-S7653) | ||
| Bouin's Solution. Composition: Picric Acid, Formaldehyde, Acetic Acid (15:10:1) | Picric Acid (SIGMA 197378), Formaldehyde (F8775), Acetic Acid (SIGMA-1005706) | ||
| 1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton). 1x PBS + 0.1% Triton | Triton-X100. SIGMA-T8787 | ||
| Normal Goat Serum | SIGMA | G9023 | |
| Guinea Pig anti-DVAP antibody | Provided by Dr. Giuseppa Pennetta (University of Edinburgh, UK). Use at 1:200 dilution in 5% NGS | ||
| Rabbit anti-HRP (Horseradish peroxidase) | Jackson ImmunoResearch | 123-065-021 | Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS |
| Rabbit anti-Lamin antibody | Provided by Dr. Paul Fisher (State Univeristy of New York at Stony Brook). Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS | ||
| TO-PRO-3 | Molecular Probes | T3605 | |
| Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor488, conjugated | Jackson ImmunoResearch | bs-295G-A555-BSS | Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS |
| Goat anti-guinea pig IgG antibody, Cy3, conjugated | Jackson ImmunoResearch | bs-0358G-Cy3-BSS | Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS |
| Vectashield mounting medium for fluorescence | Vector laboratories | H-1000 |
References
- Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr. Opin. Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).
- Fortini, M. E., Skupski, M. P., Boguski, M. S., Hariharan, I. K. A survey of human disease gene counterparts in the Drosophila genome. J. Cell Biol. 150 (2), 23-30 (2000).
- Ramachandran, P., Budnik, V. Dissection of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. (8), (2010).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D.
- Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D.
- Ramachandran, P., Budnik, V. Immunocytochemical staining of Drosophila larval body-wall muscles. Cold Spring Harb Protoc. (8), (2010).
- Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging mechanisms in ALS and FTD: disrupted RNA and protein homeostasis. Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).
- Nishimura, A. L., et al. A mutation in the vesicle-trafficking protein VAPB causes late-onset spinal muscular atrophy and amyotrophic lateral sclerosis. Am J Hum Genet. 75 (5), 822-831 (2004).
- Chen, H. J., et al. Characterization of the properties of a novel mutation in VAPB in familial amyotrophic lateral sclerosis. J Biol Chem. 285 (51), 40266-40281 (2010).
- Funke, A. D., et al. The P56S mutation in the VAPB gene is not due to a single founder: the first European case. Clin Genet. 77 (3), 302-303 (2010).
- SOD1,ANG,VAPB,TARDBP, and FUS mutations in familial amyotrophic lateral sclerosis: genotype-phenotype correlations. J Med. Genet. Millecamps, S., et al. 47 (8), 554-560 (2010).
- Landers, J. E., et al. New VAPB deletion variant and exclusion of VAPB mutations in familial ALS. Neurology. 70 (14), 1179-1185 (2008).
- Van Blitterswijk, M., et al. VAPB and C9orf72 mutations in 1 familial amyotrophic lateral sclerosis patient. Neurobiol Aging. 33 (12), 2951-2954 (2012).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Budnik, V., et al. Regulation of synapse structure and function by the Drosophila tumor suppressor gene dlg. Neuron. 17 (4), 627-640 (1996).
- Sanhueza, M., Zechini, L., Gillespie, T., Pennetta, G. Gain-of-function mutations in the ALS8 causative gene VAPB have detrimental effects on neurons and muscles. Biol Open. 3 (1), 59-71 (2014).
- Worman, H. J., Ostlund, C., Wang, Y.
- Liu, G. H., et al. Progressive degeneration of human neural stem cells caused by pathogenic LRRK2. Nature. 491 (7425), 603-607 (2012).
- Pennetta, G., Hiesinger, P. R., Fabian-Fine, R., Meinertzhagen, I. A., Bellen, H. J. Drosophila VAP-33A directs bouton formation at neuromuscular junctions in a dosage-dependent manner. Neuron. 35 (2), 291-306 (2002).
- Fisher, P. A., Berrios, M., Blobel, G. Isolation and characterization of a proteinaceous subnuclear fraction composed of nuclear matrix, peripheral lamina, and nuclear pore complexes from embryos of Drosophila melanogaster. J Cell Biol. 92 (3), 674-686 (1982).
- Smith, D. E., Fisher, P. A. Identification, developmental regulation, and response to heat shock of two antigenically related forms of a major nuclear envelope protein in Drosophila embryos: application of an improved method for affinity purification of antibodies using polypeptides immobilized on nitrocellulose blots. J Cell Biol. 99 (1), 20-28 (1984).
- Smith, D. E., Gruenbaum, Y., Berrios, M., Fisher, P. A. Biosynthesis and interconversion of Drosophila nuclear lamin isoforms during normal growth and in response to heat shock. J Cell Biol. 105 (2), 771-790 (1987).
- Puckelwartz, M. J., et al. Disruption of nesprin-1 produces an Emery Dreifuss muscular dystrophy-like phenotype in mice. Hum Mol Genet. 18 (4), 607-620 (2009).
- Tsujikawa, M., Omori, Y., Biyanwila, J., Malicki, J. Mechanism of positioning the cell nucleus in vertebrate photoreceptors. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (37), 14819-14824 (2007).
- Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 872-884 (2010).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
