Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.
Die meisten Studien über Morphogenese verlassen sich auf qualitative Beschreibungen, wie anatomische Merkmale durch die Unterbrechung von spezifischen Genen und genetischen Pfade betroffen sind. Quantitative Beschreibungen werden selten durchgeführt, obwohl genetische Manipulationen eine Reihe von phänotypischen Effekte erzeugen und Variationen sind auch unter den Individuen innerhalb der Kontrollgruppe beobachtet. Beweise Schwellen zeigt, dass die Morphologie, Größe und Lage von Organellen eine bisher unterschätzten, aber fundamentale Rolle in der Zellfunktion und das Überleben spielen. Hier stellen wir Schritt- für -Schritt – Anleitungen zur Durchführung von quantitativen Analysen von Phänotypen an der Drosophila Larven neuromuskulären Synapse (NMJ). Wir verwenden mehrere zuverlässige immunhistochemischen Marker mit Bio-Imaging-Techniken kombiniert und morphologisch analysiert die Auswirkungen von genetischen Mutationen auf spezifische zelluläre Prozesse zu untersuchen. Insbesondere konzentrieren wir uns auf die quantitative Analyse von Phänotypen Morphologie, Größe und Position von n zu beeinflussenuclei innerhalb der quergestreiften Muskeln von Drosophila – Larven. Die Drosophila Larven NMJ ist eine wertvolle experimentellen Modell die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen , die die Struktur und die Funktion des neuromuskulären Systems, sowohl bei Gesundheit und Krankheit zu untersuchen. die Methoden wir hier beschreiben, können jedoch auch auf andere Systeme ausgedehnt werden.
Qualitative analysis restricts the focus of most experimental studies to the examination of genetic manipulations leading to large phenotypic effects or to phenotypes that are not amenable to quantification, e.g., absence/presence. Quantification of phenotypes is not usually performed and variations present within members of a phenotypic group are not taken into consideration. Additionally, without mathematical descriptions of morphologies, it may be difficult to determine whether fine scale phenotypic changes are the result of genetically induced alterations or whether observed changes are simply due to random fluctuations.
We propose that for an accurate and unbiased analysis of phenotypic defects due to gene disruption, quantitative methodologies should accompany more traditional qualitative approaches. Quantitative evaluation of phenotypes is particularly beneficial for structures such as synapses that present a high degree of variability due to their intrinsic morphological and functional plasticity. We have selected examples of quantitative analyses applied to areas of investigation with which we are most familiar, namely the Drosophila larval neuromuscular junctions (NMJs). However, concepts and principles apply equally well to other experimental systems.
The larval NMJ is an excellent model system to study synaptic development and function because of the highly stereotyped nature of its structure. Each hemi-segment of the larval neuromuscular system contains 32 identifiable motor neurons forming synaptic contacts with their postsynaptic target muscle. Every hemi-segment also contains a fixed number of muscles visible as multinucleated fibers attached to the internal surface of the cuticle1. Another advantage of using the larval neuromuscular system is the power and versatility of Drosophila genetics that easily allows the generation of a number of mutant alleles and the possibility to modify gene expression in a time- and tissue-restricted manner. Finally, 75% of the human genes causing a disease have an evolutionarily conserved orthologue in Drosophila2. Indeed, entire genetic pathways are conserved between flies and humans. Because of this, the Drosophila larval neuromuscular system is a very popular experimental model to elucidate the molecular mechanisms underlying a number of human diseases including amyotrophic lateral sclerosis (ALS)1.
Here we show that the availability of several reliable immuno-histochemical markers, combined with bio-imaging techniques and accurate morphometric analyses can describe anatomical traits that are likely to play an important functional role3,4,5. Among the cellular processes that are amenable to quantitative analyses, we focus on changes in shape, size and position of intracellular structures such as the nuclei. All these are processes that we know very little about.
The challenge for molecular geneticists in the coming decades will be to extend our current knowledge by analyzing the effect of genetic mutations that produce very subtle phenotypic defects. Quantitative methodologies that allow researchers to meticulously explore the effects of genetic mutations can provide a more comprehensive understanding of how genotypes relate to phenotypes, especially for poorly understood cellular processes.
In der Vergangenheit morphologischen Variationen innerhalb und zwischen den Versuchsgruppen wurden nur selten berücksichtigt. Jedoch ist die Anwendung quantitativer Verfahren jetzt immer die Norm in vergleichenden Untersuchungen der Morphologie und mathematische Beschreibung der anatomischen Formen berechnet. Die Verwendung von quantitativen Analysen in die Auswirkungen von genetischen Manipulationen auf spezifische zelluläre Prozesse der Beurteilung halten Versprechen bei der Verbesserung unserer Fähigkeit morphologischen Veränderungen zu erfassen und die Genauigkeit zu verbessern, mit der diese Veränderungen beschrieben sind. Darüber hinaus ermöglicht die statistische Analyse von quantitativen Daten uns ob die beobachteten Unterschiede zwischen den Phänotypen signifikant zu bewerten sind.
In quergestreiften Muskulatur weisen Kerne eine deutliche gerundete Struktur und sind entlang der Muskelfasern gleichmäßig verteilt. Obwohl die molekularen Mechanismen, Einführung und Aufrechterhaltung von Größe, Form und Architektur der Kerne nicht bekannt sind, sind diese Kernfunktionen wahrscheinlich to spielen eine fundamentale Rolle Muskelfunktion bei der Kontrolle. Tatsächlich sind mehrere Myopathien durch Mutationen in Genen verursacht Morphologie und Position der Kerne in den Muskeln zu regulieren. Die funktionale Bedeutung der Form und Verteilung von Kernen innerhalb einer Zelle auf Muskeln beschränkt. Akkumulieren Beweise zeigen , dass die Kern Defekte werden auch mit neurodegenerativen Erkrankungen wie Morbus Parkinson 18,24 verbunden. Darüber hinaus beginnen wir, dass die Morphologie, Größe und intrazelluläre Verteilung von anderen Organellen einschließlich endoplasmatischen Retikulum und Mitochondrien zu schätzen funktionelle Auswirkungen haben. Zum Beispiel 25 Veränderungen in der mitochondrialen Morphologie mit neurologischen Erkrankungen wie Optikusatrophie Typ-1 (OPA1) und Charcot-Marie-Tooth – Typ 2A Neuropathie in Verbindung gebracht.
Zur Unterstützung im Prozess der molekularen Mechanismen der Aufklärung diese wichtigen Prozesse zugrunde liegen, schlagen wir eine hohe Auflösung der konfokalen zu kombinierenDaten mit Bildbearbeitungssoftware und morphometrische Analysen quantitativ zu bewerten, wie genetische Manipulationen Form beeinflussen können, Größe und Lage der Kerne innerhalb Muskelfasern. Die Leistungsfähigkeit und Vielseitigkeit der Drosophila Genetik zusammen mit dem sehr klischee Natur des neuromuskulären Systems in Drosophila – Larven machen die Larven NMJ ein experimentelles Modell besonders geeignet für diese Art von Analysen. An den Larven NMJs können phänotypische Analyse bei einer einzelnen Synapse Auflösung durchgeführt werden , um eine genaue morphometrische Analyse ermöglicht , wo eine Anzahl von NMJs kann innerhalb derselben Fliege und sogar die gleiche identifizierbare NMJ zwischen Fliegen verschiedener Genotypen werden 3,4 im Vergleich untersucht werden.
Phänotypischen Charakterisierung von Kern Position, Form und Größe an der Drosophila Larven NMJ beginnt durch Immunfärbung von seziert NMJs mit Antikörpern durchführen , die Muskeln und Kerne in den Muskeln hervorheben. Im Protokoll thi skizziertes Papier, myonuclei wurden mit polyklonalen Antikörpern gegen lamin, einem Marker der Kernhülle gebeizt, mit einem nuklearen Marker Hervorhebung der Kerninnen und mit Antikörpern, die spezifisch an DVAP die gesamte Muskel zu färben. Die lamin Antikörper in diesen Experimenten verwendet wurden von Paul Fisher freundlicherweise 19-22 aber alternative Quellen von anti-lamin Antikörper können verwendet werden. Darüber hinaus sind eine Reihe anderer Antikörper, die spezifisch für die Kernhülle im Handel erhältlich. Schließlich sind Kern Marker, wie DAPI und Propidiumiodid, auch während Muskeln durch Färbung mit anti-Aktin oder anti-Tubulin-Antikörpern sichtbar gemacht werden konnten. Wenn andere Antikörper als die in diesem Versuchsverfahren verwendet, eingesetzt werden, wird die Immunfärbungsprotokoll erfordern Extraschritte, bei denen Fixierungsbedingungen und Arbeitskonzentrationen für die neuen Antikörper müssen optimiert werden. Ein wichtiger Schritt in diesem Protokoll, vor allem, wenn Volumen Renderings analysiert werden müssen, ist the Montage der Proben auf der Folie. In diesem Fall ist es wichtig, Abstandshalter zwischen dem Objektträger und dem Deckglas aufzunehmen, so dass die Proben werden nicht zerquetscht. Drei Bänder aus Celluloseband um die Folie auf beiden Seiten des Deckglases gewickelt stellen eine einfache Möglichkeit, Abstandhalter zu machen.
Während ImageJ für 2D-Bilder verwendet wurde, analysiert die meisten 3D-Multi-Channel-Bild in diesem Papier, wurden unter Verwendung von Imaris getan wegen seiner im Haus vorhanden sind. Jedoch kann jede andere ähnliche kommerzielle Software-Paket kann für diese Anwendungen verwendet werden.
Es gibt mehrere Open-Source (zB ImageJ, CellProfiler, Vaa3D, Icy, KNIME und andere) und kommerzielle Software-Plattformen zur Verfügung für die Analyse von konfokalen Bildern. ImageJ 26, die freie Software von der NIH oder seine erweiterte Version, wie FiJi bekannt 27, hat eine große Anzahl von Import – Filter, Makros und Plugins für die weltweite Kommunika – Bildgebungty. Die meisten dieser Plugins sind auf die Verarbeitung der Informationen auf einer Scheibe-für-Scheibe Weise fokussiert. Es gibt auch Plugins für die Visualisierung und Analyse von mehrkanaligen 3D-Bildern. Allerdings sind sie oft für eine bestimmte Aufgabe entwickelt und Benutzer müssen diese Plugins, um ihre eigenen Bedürfnisse zu erweitern oder anpassen. Auf der anderen Seite, Ziel kommerziellen Plattformen relativ unerfahrene Anwender und werden oft konzentrierte sich auf einfache zu bedienende, breite Abdeckung von Bildverarbeitungsaufgaben mit einer unglaublichen Geschwindigkeit.
Das experimentelle Verfahren zusammen mit der quantitativen in diesem Protokoll beschriebenen phänotypische Analyse kann helfen, die molekularen Mechanismen bei der Aufklärung Organell Morphologie zu steuern und deren Verteilung innerhalb einer Zelle. Jedoch hat dieser Ansatz die offensichtliche Einschränkung dieser Prozesse zu einem bestimmten Endpunkt-Analyse. Das Verfahren Morphologie und Verteilung von Organellen des Steuerns ist wahrscheinlich sehr dynamisch sein und variieren nicht nur zwischen verschiedenen Zell types, sondern auch innerhalb der gleichen Zelle auf der Entwicklungs-oder physiologischen Zustand abhängig. Eine weitere Anwendung dieser Analyse würde durch Zeitrafferabbildungs dargestellt werden, die Änderungen in Organell Morphologie und Position ermöglicht über die Zeit überwacht werden.
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to Dr. Andrea Chai for her insightful comments on the manuscript. This work was supported by the Wellcome Trust (grant number: Pennetta8920) and by the Motor Neuron Disease Association (grant number: Pennetta6231).
Micro-Forceps 0.3×0.25 mm | Fine Science Tools | 11030-12 | |
Sylgard dissection plates | SIGMA-ALDRICH | 76103 | Mix the pre-weighed elastomer base with curing agent. Poor the mixture into a 5 cm Petri dish. Let cure it at 60ºC for at least 24 hours |
Stainless/Steel Minutien Pins 0.1 mm diameter | Fine Science Tools | 26002-10 | |
Microdissection scissors (ultra-fine) | Fine Science Tools | 15200-00 | |
1x PBS (Phosphate Buffered Saline). Composition: 3mM NaH2PO4, 7mM Na2HPO4, 130mM NaCl, pH 7 | NaH2PO4 (SIGMA-S8282), Na2HPO4 (SIGMA-S7907), NaCl (SIGMA-S7653) | ||
Bouin's Solution. Composition: Picric Acid, Formaldehyde, Acetic Acid (15:10:1) | Picric Acid (SIGMA 197378), Formaldehyde (F8775), Acetic Acid (SIGMA-1005706) | ||
1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton). 1xPBS +0.1% Triton | Triton-X100. SIGMA-T8787 | ||
Normal Goat Serum | SIGMA | G9023 | |
Guinea Pig anti-DVAP antibody | Provided by Dr. Giuseppa Pennetta (University of Edinburgh, UK). Use at !:200 dilution in 5% NGS | ||
Rabbit anti-HRP (Horseradish peroxidase) | Jackson ImmunoResearch | 123-065-021 | Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS |
Rabbit anti-Lamin antibody | Provided by Dr. Paul Fisher (State Univeristy of New York at Stony Brook). Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS | ||
TO-PRO-3 | Molecular Probes | T3605 | |
Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor488, conjugated | Jackson ImmunoResearch | bs-295G-A555-BSS | Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS |
Goat anti-guinea pig IgG antibody, Cy3, conjugated | Jackson ImmunoResearch | bs-0358G-Cy3-BSS | Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS |
Vectashield mounting medium for fluorescence | Vector laboratories | H-1000 |