क्यों मात्रा मामला: phenotypes की विशेषता पर<em> ड्रोसोफिला</em> लारवल neuromuscular जंक्शन

Summary

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

Abstract

morphogenesis पर सबसे अध्ययन कैसे शारीरिक लक्षण विशिष्ट जीन और आनुवंशिक रास्ते के विघटन से प्रभावित हैं गुणात्मक विवरण पर भरोसा करते हैं। मात्रात्मक वर्णन शायद ही कभी प्रदर्शन कर रहे हैं, हालांकि आनुवंशिक जोड़तोड़ प्ररूपी प्रभाव की एक श्रृंखला का उत्पादन और बदलाव भी नियंत्रण समूहों के भीतर व्यक्तियों के बीच मनाया जाता है। सबूत से पता चलता उभरते आकृति विज्ञान, आकार और अंगों का स्थान एक पहले से underappreciated, सेल समारोह और अस्तित्व में अभी तक मौलिक भूमिका निभाते है। यहाँ हम ड्रोसोफिला लार्वा neuromuscular जंक्शन (NMJ) पर phenotypes के मात्रात्मक विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए कदम दर कदम निर्देश प्रदान करते हैं। हम कई विश्वसनीय इम्युनो-histochemical जैव इमेजिंग तकनीक और morphometric विशिष्ट सेलुलर प्रक्रियाओं पर आनुवंशिक परिवर्तन के प्रभाव की जांच करने के लिए विश्लेषण के साथ संयुक्त मार्कर का उपयोग करें। विशेष रूप से, हम आकृति विज्ञान, आकार और एन की स्थिति को प्रभावित phenotypes के मात्रात्मक विश्लेषण पर ध्यान केंद्रितuclei ड्रोसोफिला लार्वा की धारीदार मांसपेशियों के भीतर। ड्रोसोफिला लार्वा NMJ संरचना और neuromuscular प्रणाली के समारोह, दोनों स्वास्थ्य और रोग में अंतर्निहित आणविक तंत्र की जांच के लिए एक मूल्यवान प्रयोगात्मक मॉडल है। हालांकि, के तरीके में हम यहाँ वर्णन अन्य प्रणालियों के रूप में अच्छी तरह से बढ़ाया जा सकता है।

Introduction

Qualitative analysis restricts the focus of most experimental studies to the examination of genetic manipulations leading to large phenotypic effects or to phenotypes that are not amenable to quantification, e.g., absence/presence. Quantification of phenotypes is not usually performed and variations present within members of a phenotypic group are not taken into consideration. Additionally, without mathematical descriptions of morphologies, it may be difficult to determine whether fine scale phenotypic changes are the result of genetically induced alterations or whether observed changes are simply due to random fluctuations.

We propose that for an accurate and unbiased analysis of phenotypic defects due to gene disruption, quantitative methodologies should accompany more traditional qualitative approaches. Quantitative evaluation of phenotypes is particularly beneficial for structures such as synapses that present a high degree of variability due to their intrinsic morphological and functional plasticity. We have selected examples of quantitative analyses applied to areas of investigation with which we are most familiar, namely the Drosophila larval neuromuscular junctions (NMJs). However, concepts and principles apply equally well to other experimental systems.

The larval NMJ is an excellent model system to study synaptic development and function because of the highly stereotyped nature of its structure. Each hemi-segment of the larval neuromuscular system contains 32 identifiable motor neurons forming synaptic contacts with their postsynaptic target muscle. Every hemi-segment also contains a fixed number of muscles visible as multinucleated fibers attached to the internal surface of the cuticle¹. Another advantage of using the larval neuromuscular system is the power and versatility of Drosophila genetics that easily allows the generation of a number of mutant alleles and the possibility to modify gene expression in a time- and tissue-restricted manner. Finally, 75% of the human genes causing a disease have an evolutionarily conserved orthologue in Drosophila². Indeed, entire genetic pathways are conserved between flies and humans. Because of this, the Drosophila larval neuromuscular system is a very popular experimental model to elucidate the molecular mechanisms underlying a number of human diseases including amyotrophic lateral sclerosis (ALS)¹.

Here we show that the availability of several reliable immuno-histochemical markers, combined with bio-imaging techniques and accurate morphometric analyses can describe anatomical traits that are likely to play an important functional role^3,4,5. Among the cellular processes that are amenable to quantitative analyses, we focus on changes in shape, size and position of intracellular structures such as the nuclei. All these are processes that we know very little about.

The challenge for molecular geneticists in the coming decades will be to extend our current knowledge by analyzing the effect of genetic mutations that produce very subtle phenotypic defects. Quantitative methodologies that allow researchers to meticulously explore the effects of genetic mutations can provide a more comprehensive understanding of how genotypes relate to phenotypes, especially for poorly understood cellular processes.

Protocol

1. प्रायोगिक तैयारी नोट: Dissections और वर्गों 2 में इम्युनो-ऊतकरसायनविज्ञान प्रक्रियाओं और 3 संदर्भ 3-6 के अनुसार प्रदर्शन कर रहे हैं, लेकिन संशोधनों के साथ। 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) और पीबीएस युक्त 0.1% ट्राइटन एक्स 100 (पीबीटी) तैयार करें। उन्हें बर्फ पर रखें। Bouin लगानेवाला तैयार (1 हिमनदों एसिटिक एसिड 15 रंगाई एसिड: 10: संक्रामक)। इस अभिकर्मक ताजा बनाओ। साफ स्टेनलेस स्टील minutien पिन और ठीक संदंश का चयन करें। एक 5 सेमी पेट्री डिश में एक Sylgard डिस्क युक्त विच्छेदन प्लेटों की तैयारी। 2. तीसरे instar लार्वा NMJs के विच्छेदन एक शीशी या एक ठीक ब्रश के साथ एक बोतल से तीसरे instar लार्वा भटक उठाओ और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पीबीएस युक्त भोजन अवशिष्ट दूर धोने के लिए एक 2 सेमी पेट्री डिश में रखें। विच्छेदन प्लेट की Sylgard सतह के ऊपर एक लार्वा की जगह है और यकीन है कि यह स्थिति हैइतनी है कि दो अनुदैर्ध्य सांस की नली ट्यूब के शीर्ष पर दिखाई दे रहे हैं अपने पृष्ठीय पक्ष के साथ वन। संदंश का प्रयोग पिन धारण करने के लिए, लार्वा सही मुँह हुक के तहत, अपने पूर्वकाल अंत में नीचे पिन। जितना संभव हो लार्वा बढ़ाकर और इसके पीछे नीचे अंत में पिन। प्लेट की दीवारों तक पहुंचने के लिए पर्याप्त पीबीएस खारा जोड़ें और पूरी तरह से लार्वा को विसर्जित कर दिया। एक ही जीनोटाइप के अन्य लार्वा के लिए 2.3 करने के लिए कदम 2.1 से प्रक्रिया को दोहराएँ। एक भी 5 सेमी पेट्री डिश विच्छेदन प्लेट को आसानी से 8 लार्वा को समायोजित कर सकते हैं। माइक्रो-विच्छेदन कैंची का प्रयोग, थोड़ा पृष्ठीय छल्ली उठा और पिन के पास पीछे अंत में एक छोटा सा क्षैतिज चीरा बनाते हैं। चीरा में कैंची डालें, श्वासनली के दो अनुदैर्ध्य इलाकों के बीच midline के साथ पूर्वकाल अंत करने के लिए सभी तरह काट लार्वा। सुनिश्चित करें कि midline कटौती पर्याप्त सतही सिर्फ छल्ली के माध्यम से पारित करने के लिए और मांसपेशियों के माध्यम से काटने से बचने के लिए कर रहे हैं बनाओउदर की ओर। प्रत्येक के अंत में, दोनों बाएँ और दाएँ पक्ष पर दो डिग्री काटा। पूर्वकाल चीरा के दोनों किनारों पर दो पिनों रखकर पट्टिका खोलें। पीछे के अंत के साथ एक ही दोहराएँ। जब पिंस रखने, शरीर की दीवार के अलावा प्रसार करने के लिए सुनिश्चित करें। संदंश और पीबीएस खारा का उपयोग आंतरिक अंगों को साफ करें। केंद्रीय तंत्रिका तंत्र बरकरार छोड़ दें। धीरे कोने पिन के साथ लार्वा खिंचाव जब तक यह पूरी तरह से फैला है, लेकिन यकीन है कि मांसपेशियों को इस प्रक्रिया के दौरान फटे नहीं कर रहे हैं। एक ही विच्छेदन प्लेट पर अन्य लार्वा के लिए एक ही विच्छेदन प्रक्रिया को दोहराएँ। पीबीएस नमक के साथ तीन बार धो सभी आंतरिक अंगों को हटाने के लिए। Bouin लगानेवाला साथ पीबीएस बदलें और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दें। पीबीटी के साथ कई बार धोएं। पिन ध्यान से निकालें और इम्युनो-धुंधला के लिए एक 1.5 मिलीलीटर सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब में सभी तैयारी है, जो अब काफी कठोर होते हैं, हस्तांतरण। स्नायु और Myonuclei के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ ड्रोसोफिला NMJs 3. इम्यूनो-histochemical धुंधला जल्दी पीबीटी में लार्वा fillets कुल्ला। लगातार आंदोलन के तहत 2 घंटे के लिए पीबीटी में 10% सामान्य बकरी सीरम (NGS) के साथ incubating द्वारा तैयारियों को ब्लॉक करें। पीबीटी NGS के 5% और (1 की एकाग्रता में: 500) एक खरगोश विरोधी Lamin एंटीबॉडी युक्त विच्छेदित NMJs का एक सेट सेते हैं: 2 घंटे के लिए और (500 1 की एकाग्रता में) एक गिनी पिग विरोधी DVAP एंटीबॉडी के साथ कमरे के तापमान पर या रात 4 डिग्री सेल्सियस पर। विरोधी DVAP एंटीबॉडी धारीदार मांसपेशियों दाग जबकि विरोधी Lamin धुंधला myonuclei के समोच्च का पता लगाता है। पीबीटी में एक बार जल्दी से धो अधिक में एंटीबॉडी को दूर करने के लिए। बदलते पीबीटी हर 15 मिनट बफर द्वारा 2 घंटे के लिए पीबीटी में धो लें। पीबीटी 1 पर 5% NGS और फ्लोरोसेंट लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी युक्त नमूने सेते हैं: कमरे के तापमान पर 500 2 के लिए कमजोर पड़ने घंटा। एक ही नमूने गएक ही समय में कई एंटीबॉडी के साथ धुंधला हो जाना करने के लिए विभिन्न chromophores के साथ संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी का इस्तेमाल कर रहे हैं, तो अधीन हो। माध्यमिक एंटीबॉडी निकालें और बदलते पीबीटी हर 15 मिनट बफर द्वारा 2 घंटे के लिए पीबीटी में धो लें। आंतरिक दाग की myonuclei पीबीएस के साथ नमूने तीन बार धोने और इस प्रकार के रूप में आगे बढ़ना: पीबीएस में 1000 और लगातार आंदोलन के तहत 20 मिनट के लिए सेते हैं: 1 के कमजोर पड़ने पर परमाणु मार्कर के लिए प्रो 3 जोड़े। यह मार्कर इस अध्ययन में इस्तेमाल किया जाता है, लेकिन किसी भी अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध परमाणु मार्कर के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है। बढ़ते से पहले पीबीएस में जल्दी से तीन बार धोएं। 4. स्लाइड पर बढ़ते नमूने 1.5 मिलीलीटर सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूब से संदंश के साथ नमूने लेने और उन्हें एक प्रसंस्करण स्लाइड पर लेट गया। माइक्रो-विच्छेदन कैंची का उपयोग करके, सिर और जोड़ने की छड़ें की पूंछ में कटौती और उनके आंतरिक सतह तक रहते हैं। वें तैयारई एक दूसरे से लगभग 1 सेमी की दूरी पर एक साफ स्लाइड के प्रत्येक पक्ष पर सेल्यूलोज टेप के तीन स्ट्रिप्स चारों ओर लपेटकर द्वारा स्लाइड बढ़ते। एक बार जब coverslip दो स्ट्रिप्स के शीर्ष पर तैनात है, एक अंतर उत्पन्न हो जाएगा कि नमूनों की सपाट से बचना होगा। यह महत्वपूर्ण है कि अगर संरचनाओं के तीन आयामी मात्रा renderings किए जाने के लिए कर रहे हैं। तीन सेल्यूलोज टेप स्ट्रिप्स के बीच बढ़ते स्लाइड के बीच में बढ़ते मध्यम के बारे में 20 μl की एक छोटी सी बूंद रखो। साफ संदंश के साथ बढ़ते मध्यम प्रसार के बाद, बढ़ते मध्यम में बढ़ते स्लाइड को विच्छेदित लार्वा खींचें, आंतरिक सतह के ऊपर रखे हुए हैं। उन्हें चार या पांच की पंक्तियों में माउंट करने के लिए प्रयास करें। धीरे बढ़ते स्लाइड के शीर्ष पर एक कवर पर्ची छोड़ देता है और यकीन है कि कोई हवाई बुलबुले उत्पन्न कर रहे हैं। पारदर्शी नेल वार्निश के साथ स्लाइड सील। नमूने इमेजिंग से पहले कम से कम 10 मिनट के लिए सूखी। 5. इमेजिंग के लिए confocal सेटिंग नोट: ई उलटा माइक्रोस्कोप: इस अध्ययन में प्रस्तुत छवियों एक Nikon A1R confocal तिवारी पर एकीकृत इकाई का उपयोग कर लिया जाता है। हालांकि, 488 एनएम, 561 एनएम और 642 एनएम और एक 3 चैनल का पता लगाने प्रणाली की तरंग दैर्ध्य क्षेत्रों में उपलब्ध 3 लेजर इकाइयों की एक न्यूनतम के साथ किसी भी confocal खुर्दबीन इस उद्देश्य के लिए उपयुक्त है। लेजर, डिटेक्टर इकाई, पारा बल्ब, मंच नियंत्रक, माइक्रोस्कोप और पीसी पर बारी। नियंत्रण सॉफ्टवेयर शुरू और मंच धारक पर स्लाइड सुरक्षित। इमेजिंग तेजी, का चयन करने के लिए और एक 20x उद्देश्य का उपयोग करके नमूना पर ब्याज (आरओआई) के सभी क्षेत्रों को चिह्नित करने के लिए। ध्यान से 60X उच्च बढ़ाई उद्देश्य लेंस (60X योजना ए पी ओ कुलपति / NA 1.4 ओआईएल) के लिए nosepiece झूले। विसर्जन के तेल की एक बूंद के उद्देश्य लेंस पर रखें और कंप्यूटर पर XYZ अवलोकन खिड़की से चिह्नित रॉय से एक का चयन करें। निम्नलिखित ऑप्टिकल सेटिंग्स का उपयोग करके प्रारंभ इमेजिंग: का चयन पहले Dichroic दर्पण: 405/488/561/640। उत्सर्जन फिल्टर चैनल 1, 3 चैनल में लंबे पास फिल्टर 650 एनएम के साथ चैनल 2 और 642 एनएम लेजर में 595/50 उत्सर्जन फिल्टर के साथ 561 एनएम लेजर में एनएम 525/50 के साथ 488 एनएम लेजर का चयन करें। छवि अधिग्रहण शुरू करने से पहले निम्न सेटिंग्स स्कैन का उपयोग करें: GALVANO स्कैनर का चयन करें; स्कैन दिशा: एक ही रास्ता है; स्कैन गति: प्रति सेकंड 0.5 फ्रेम। चैनल खून के माध्यम से बचने के लिए चैनल श्रृंखला का चयन करें। 1 हवादार इकाई के लिए पिन-होल आकार को समायोजित करें। स्कैन और लेजर बिजली, पता लगाने के लाभ को समायोजित करने और प्रत्येक चैनल के लिए उचित रूप से ऑफसेट पिक्सेल संतृप्ति और पृष्ठभूमि के स्तर से बचने के लिए। सभी ROIs और स्लाइड की तैयारी के लिए voxel आकार 0.2 x 0.2 x 0.5 माइक्रोन 3 का उपयोग करके Z ढेर मोल। छवियों deconvolution के अधीन हो जाएगा तो 0.06 x 0.06 x 0.15 माइक्रोन से 3 voxel आकार निर्धारित किया है। .nd2 फ़ाइल स्वरूप या .ics प्रारूप में छवियों को बचाओ। 6. के नाभिक के बीच दूरी धारीदार भीतर गणना60; निकटतम पड़ोसी विश्लेषण की विधि द्वारा स्नायु इस विश्लेषण के लिए, लार्वा शरीर दीवार DVAP एंटीबॉडी की मांसपेशियों कल्पना करने के साथ और Lamin एंटीबॉडी और एक परमाणु के नाभिक मार्कर को उजागर करने के साथ दाग की मांसपेशियों को प्रदर्शित confocal छवियों का उपयोग करें। नाभिक के बीच निकटतम दूरी का अनुमान लगाने के लिए, छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (जैसे, Imaris) की MeasurementPro मॉड्यूल के भीतर माप अंक का उपयोग करें। छवि विश्लेषण के लिए अन्य इसी तरह के सॉफ्टवेयर अनुप्रयोगों के समान उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। confocal छवियों खोलें। आरंभ करने के लिए, सॉफ्टवेयर आइकन पर डबल क्लिक करें। खींचें और मैदान में confocal जेड ढेर छवियों ड्रॉप। छवियों पर डबल क्लिक करें स्वचालित रूप से पार दृश्य में उन्हें खोलने के लिए, मेनू उपकरण पट्टी चिह्न के नीचे । क्षेत्र, सूची वस्तु और वस्तु गुण क्षेत्र पार दृश्य तीन मुख्य कार्यक्षेत्र पैनल है। एक मात्रा प्रदान की गई टी बनाएंमेनू आइकन 3D दृश्य पर क्लिक करके hree चैनल छवि । जोड़े न्यू माप अंक आइकन पर क्लिक करें वहाँ से वस्तुओं टूलबार और निर्माण विज़ार्ड कि वस्तु गुण क्षेत्र में प्रकट होता है का पालन करें। निर्माण के जादूगर से पहले संपादित करें टैब का चयन करें और फिर विशिष्ट चैनल। या तो परमाणु मार्कर या Lamin चैनल नाभिक को उजागर करने के लिए चयन करें। कीबोर्ड पर ईएससी टैब दबाकर मोड का चयन करने सूचक सेट करें। छवि में एक दिया नाभिक को शामिल करने के लिए माउस व्हील के साथ 3 डी कर्सर बॉक्स के आकार को समायोजित करें। Shift कुंजी और एक ही नाभिक पर बाईं माउस क्लिक धारण करके एक माप बिंदु जोड़ें। पिछले चरणों दोहरा द्वारा एक ही पेशी पर पास के एक नाभिक पर दूसरी बात जोड़ें। एक लाइन स्वचालित रूप से दो अंक है और बीच मापा दूरी के बीच तैयार की है दो नाभिक प्रदर्शित किया जाता है। दो नाभिक के बीच की दूरी अब टैब सांख्यिकी> विस्तृत> दूरी डेटा के तहत वस्तु गुण क्षेत्र में एक सांख्यिकीय चर के रूप में दर्ज की गई है। एक दिया नाभिक आसपास के सभी नाभिक के लिए 6.10 के लिए कदम 6.6 से प्रक्रिया को दोहराएँ। आंकड़ों> सभी एकत्र माप अंक प्रदर्शित विस्तृत> दूरी डेटा, कम से कम दूरी का चयन करें। फाइल करने के लिए टैब प्रदर्शित पर निर्यात सांख्यिकी क्लिक करके वस्तु गुण क्षेत्र के तहत उपलब्ध है, डेटा एक स्प्रेडशीट पर सहेजा जाएगा। अन्य आसपास के नाभिक के लिए और जीनोटाइप प्रति मांसपेशी फाइबर की एक चयनित संख्या के लिए एक ही प्रक्रिया दोहराएँ। डेटा एक स्प्रेडशीट फ़ाइल को निर्यात का उपयोग करना, निम्न समीकरण का उपयोग मांसपेशियों के सभी एम संख्या के लिए औसत कम से कम दूरी (डी एवेन्यू) की गणना: oad / 53821 / 53821eq1.jpg "/> Di एक दिया नाभिक मैं जहाँ मैं 0 से एन से भिन्न होता है और एन पेशी प्रति विश्लेषण किया नाभिक की संख्या है के लिए पड़ोसी नाभिक के लिए कम से कम दूरी है। जम्मू से मूल्यों का योग = 0 जे के लिए = मी विश्लेषण किया मांसपेशियों के एम नंबर इंगित करता है। वैकल्पिक रूप से, का उपयोग स्पॉट निर्माण विज़ार्ड और स्थानों के लिए स्पॉट निकटतम दूरी निकटतम पड़ोसी नाभिक के लिए औसत दूरी का अनुमान है। इस के लिए, एक मैटलैब विस्तार मॉड्यूल की जरूरत है। अखाड़ा और एक 3 डी मात्रा छवि पर एक विशिष्ट छवि पर डबल क्लिक करें देखें क्षेत्र में प्रदर्शित किया जाएगा। वस्तु निर्माण आइकन पर क्लिक करें और न्यू स्पॉट जोड़ने वस्तुओं उपकरण पट्टी से। वस्तु गुण क्षेत्र में निर्माण विज़ार्ड से, विकल्प को छोड़ स्वत: सृजन, संपादन मैन्युअल पर क्लिक करें। या तो Lamin या नाभिक प्रदर्शित करने के लिए परमाणु मार्कर चैनल का चयन करें। शिफ्ट और क्लिक LEFछवि में एक विशिष्ट पेशी के सभी नाभिक पर टी माउस बटन। हर नाभिक पर एक जगह दिखाई देगा। स्पॉट स्पॉट निकटतम वस्तु गुण क्षेत्र में टूल टैब के तहत सूचीबद्ध दूरी का चयन करें। परिणाम मोड और एक मैटलैब खिड़की के नीचे चयन स्पॉट सांख्यिकी प्रकट होता है। सांख्यिकी टैब के अंतर्गत, विस्तृत और फिर विशिष्ट मानों का चयन करें। Distmin पर क्लिक करें और हर नाभिक के लिए न्यूनतम दूरी के मूल्यों में दिखाई देगा। एक स्प्रेडशीट फ़ाइल में डेटा निर्यात और मांसपेशियों के प्रति इन दूरियों के औसत की गणना। एक दिया जीनोटाइप के सभी मांसपेशियों के लिए प्रक्रिया को दोहराएँ। 7. ड्रोसोफिला लार्वा की शारीरिक-दीवार की मांसपेशियों के भीतर नाभिक के आकार का निर्धारण इस विश्लेषण के लिए, Lamin और एक परमाणु के नाभिक मार्कर कल्पना करने के साथ दाग शरीर दीवार की मांसपेशियों के confocal छवियों का उपयोग करें। myonuclei उपाय गोलाई के आकार का मूल्यांकन करने के लिए (सुर के अनुपात के रूप में परिभाषित किया गयादिए गए नाभिक के रूप में एक ही मात्रा के साथ एक क्षेत्र,) नाभिक की सतह क्षेत्र या अण्डाकार (के चेहरे क्षेत्र चपटा / लंबोतरा ellipsoids और spheroids) के बीच अलग। छवि को खोलने के रूप में पहले से वर्णन किया। वस्तुओं उपकरण पट्टी आइकन पर क्लिक करें नए सतहों । निर्माण विज़ार्ड कि वस्तु गुण क्षेत्र में प्रकट होता है, नाभिक को प्रदर्शित करने के स्रोत के रूप में परमाणु चैनल मार्कर धुंधला का चयन करें। सीमा के रूप में विकल्प निरपेक्ष तीव्रता सेट। सुनिश्चित करें कि नाभिक के सबसे सीमा वक्र पर मूल्य बदलकर एक चिकनी और नहीं अतिभारित प्रतिपादन दिखा। इसी समय, एक ही वक्र का उपयोग कर किसी भी नाभिक के छेद या अधूरा मुखौटा की उपस्थिति से बचें। उपयोग फ़िल्टर उपकरण सतह प्रतिपादन में किसी भी शोर बाहर करने के लिए। नव निर्मित सतह परत, विभाजन के टैब संपादन के तहत या मर्ज नाभिक सतहों कि गलत तरीके से कर रहे हैं फिरndered। एक स्प्रेडशीट के लिए निर्यात फ़ाइल सतह प्रदान की गई नाभिक कि सांख्यिकी टैब के अंतर्गत उपलब्ध हैं की अण्डाकार और गोलाई मूल्यों। वैकल्पिक रूप से, नाभिक का घेरा मापने के लिए ImageJ या फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग जहां घेरा (सी) सी के रूप में परिभाषित किया गया है । जबकि शून्य के करीब पहुंच एक मूल्य के एक तेजी से लम्बी आकार इंगित करता है एक का मान एक पूर्ण चक्र का प्रतिनिधित्व करता है। मेनू छवियाँ> ढेर> जेड परियोजना से जेड के ढेर की अधिकतम तीव्रता के अनुमानों बनाएँ। मैक्स तीव्रता के प्रक्षेपण प्रकार सेट करें। चैनलों को विभाजित और परमाणु मार्कर चैनल का चयन करें। मुख्य मेनू से, का चयन छवि> सीमा समायोजित>। खंड तीव्रता सीमा का समायोजन करके नाभिक। पास के नाभिक एक इकाई के रूप खंडों रहे हैं, तो प्रक्रिया पर नाभिक डिस्कनेक्ट करने के लिए बाइनरी> वाटरशेड उपकरण क्लिक करें>। मुख्य मेनू से, संपादित करें> एसचुनाव> चयन बनाएँ। विश्लेषण> उपकरण> रॉय प्रबंधक मेनू पर क्लिक करके रॉय प्रबंधक को सभी चयनित ROIs जोड़ें। रॉय प्रबंधक विंडो में जोड़ने पर क्लिक करें। एक ही खिड़की के भीतर और अधिक> विभाजित चयन करें। विश्लेषण> सेट माप में आकार वर्णनकर्ताओं का चयन करें। रॉय प्रबंधक विंडो में टैब पर क्लिक करें उपाय। यह सभी चयनित नाभिक का घेरा मानों की सूची प्रदर्शित करेगा। इसके अलावा, परमाणु मात्रा को मापने, उपखंड 7.3-7.7 में वर्णित के रूप में परमाणु मार्कर धुंधला चैनल का उपयोग सतह निर्माण विज़ार्ड का पालन करें। ड्रोसोफिला लार्वा शरीर-दीवार की मांसपेशियों के भीतर चयनित नाभिक की 8. 3 डी की मात्रा Renderings एक विशिष्ट प्रोटीन की Intranuclear स्थानीयकरण का मूल्यांकन करने के लिए रिपोर्टिंग एक परमाणु मार्कर के साथ और Lamin और DVAP के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ दाग शरीर दीवार की मांसपेशियों confocal छवियों का प्रयोग करें। सॉफ्टवेयर और एसईएल की शुरुआत से छवियों को खोलेंect विशिष्ट नाभिक का विश्लेषण किया जाए। यह मुख्य मेनू आइटम संपादित करें> फसल 3 डी का चयन करके किया जा सकता है। उपधारा 7.3-7.7 में वर्णित के रूप Lamin चैनल का उपयोग सतह निर्माण विज़ार्ड का पालन करें। एक बार सतह बनाई गई है, वस्तुओं गुण क्षेत्र में संपादित करें पर क्लिक करें और फिर सभी मुखौटा नाभिक के अंदर संकेत को अलग-थलग करने के लिए चयन करें। यह एक नई विंडो बनाता है। चुनें चैनल ड्रॉप-डाउन मेनू से DVAP संकेत का चयन करें। शून्य करने के लिए सतह पर बाहर विकल्प सेट Voxels क्लिक करके नाभिक के अंदर DVAP इम्युनो-जेट संकेत का चयन करें। एक नया नकाबपोश चैनल बनाया और चयन के लिए प्रदर्शन समायोजन विंडो में उपलब्ध है। नाभिक के अंदर संकेत की उपस्थिति की कल्पना करने के लिए नई कतरन विमान जोड़े आइकन पर क्लिक करके एक समोच्च विमान बनाने वस्तुओं उपकरण पट्टी से। Interactively क्लिपिंग के कोण समायोजितविमान और नाभिक के अंदर संकेत के वितरण कल्पना करने के लिए अपनी स्थिति।

Representative Results

ए एल एस एक अपक्षयी रोग विशेष रूप से मोटर न्यूरॉन्स धारीदार मांसपेशियों 7 के एक प्रगतिशील और घातक पक्षाघात के लिए अग्रणी प्रभावित हो रहा है। मानव खलनायिका जुड़े प्रोटीन बी (hVAPB) में missense म्यूटेशन ए एल एस प्रकार 8 8-12 सहित मोटर न्यूरॉन रोगों की एक सीमा के कारण। एक missense उत्परिवर्तन (V234I) hVAPB जीन में हाल ही में मनुष्यों 13 में ठेठ ए एल एस के एक मामले में पहचान की गई है। इसकी रोगजनक क्षमता का आकलन करने के लिए, हम रोग के कारण उत्परिवर्तन (DVAP-V260I) ले जाने hVAPB ड्रोसोफिला orthologue DVAP व्यक्त ट्रांसजेनिक मक्खियों उत्पन्न। इस transgene की अभिव्यक्ति यूएएस / GAL4 प्रणाली और मांसपेशियों-विशिष्ट चालक BG57-Gal4 14,15 का उपयोग कर मांसपेशियों को निशाना बनाया गया था। DVAP-V260I ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति के प्रभाव की तुलना में और दो ​​अन्य ट्रांसजीन (DVAP-WT1 और DVAP-WT2) है, जो जंगली प्रकार DVAP प्रोटीन 16 के विभिन्न स्तर व्यक्त की है कि विपरीत था। मोरई विशेष रूप से, DVAP immunoreactivity में वृद्धि DVAP-WT2 लाइन के लिए नियंत्रण की तुलना में अधिक 2.2 गुना है, जबकि एक ही संकेत 16 की DVAP-V260I और DVAP-WT1 प्रदर्शनी तुलनीय और निचले स्तरों। परमाणु परिवर्तन उम्र बढ़ने और पार्किंसंस रोग 17,18 सहित कई neurodegenerative रोगों के साथ संबद्ध किया गया है। कि क्या ALS8 के लिए हमारे मक्खी मॉडल परमाणु वास्तुकला, स्थिति और आकार में परिवर्तन दर्शाती का आकलन करने के लिए, हम एक परमाणु मार्कर और विरोधी Lamin एंटीबॉडी 19-22, जो परमाणु लिफाफा visualizes के साथ उचित जीनोटाइप का धारीदार मांसपेशियों के भीतर नाभिक दाग। मांसपेशियों को उजागर करने के लिए, एक DVAP विशिष्ट एंटीबॉडी भी एक ही नमूने (चित्रा 1) को जोड़ा गया है। Confocal छवियों एकत्र किए गए थे और विस्तृत morphometric विश्लेषण एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया। नियंत्रण मांसपेशियों में, नाभिक में समान रूप से मांसपेशियों के साथ वितरित किया जा पाए गएफाइबर जबकि DVAP-V260I और DVAP-गुम्मट में मांसपेशियों को व्यक्त करने, नाभिक बारीकी से जुड़े समूहों (चित्रा 1) में फिर से विभाजित करने की प्रवृत्ति दिखा रहे हैं। हम हर जीनोटाइप की मांसपेशी फाइबर के साथ नाभिक के वितरण की एक मात्रात्मक मूल्यांकन करने के लिए एक निकटतम पड़ोसी विश्लेषण का आयोजन किया। एक निकटतम पड़ोसी विश्लेषण पहले एक दिया नाभिक के केंद्र और हर दूसरे आसपास के नाभिक के केंद्र के बीच की दूरी को मापने के द्वारा हर नाभिक के लिए निकटतम पड़ोसी को पहचानती है। यह प्रक्रिया तब मांसपेशी फाइबर के साथ हर दूसरे नाभिक के लिए दोहराया है। अंत में, एक विशिष्ट मांसपेशियों के भीतर नाभिक के बीच कम से कम दूरी, हर नाभिक और अपने निकटतम पड़ोसियों के कम से कम दूरी के औसत से गणना की है। (चित्रा 2A – सी)। नियंत्रण करने के लिए की तुलना में, मांसपेशियों या तो DVAP-V260I ट्रांस्जीन या ट्रांसजीन जंगली प्रकार के प्रोटीन overexpressing के किसी भी व्यक्त, नाभिक के बीच औसत दूरी कम से कम में एक नाटकीय कमी मौजूद है और, एक परिणाम के रूप में, नाभिक बारीकी से समूहों में जुड़े होने के लिए दिखाई देते हैं। एलील DVAP-V260I के कारण ए एल एस के प्रभाव जंगली प्रकार के प्रोटीन की overexpression के साथ जुड़े है कि अधिक से अधिक गंभीर है, भले ही सबसे मजबूत DVAP-WT2 ट्रांस्जीन प्रयोग किया जाता है (चित्रा 1 और चित्रा 2 डी) है। या तो DVAP-V260I या DVAP-WT transgenes की overexpression भी एक लम्बी संरचना (चित्रा 1) के साथ विकृत नाभिक में जिसके परिणामस्वरूप परमाणु वास्तुकला का एक गंभीर गिरावट दर्शाती है। यह संरचनात्मक विपथन ImageJ सॉफ्टवेयर, जिसमें घेरा सूत्र सी द्वारा परिभाषित किया गया है का उपयोग करके मात्रा निर्धारित की गई थी है, जो सी = 1 एक पूर्ण चक्र का प्रतिनिधित्व करने और सी = 0 एक असीम लम्बी बहुभुज के साथ हर नाभिक की लंबाई के अनुपात करने के लिए चौड़ाई को मापने। contr मेंजबकि ट्रांसजेनिक म्यूटेंट में घेरा के फलस्वरूप नुकसान के साथ आकार में परिवर्तन, इस मूल्य (चित्रा 1 और चित्रा 3) से एक महत्वपूर्ण विचलन का कारण बनता है एक अलग गोल आकार का प्रदर्शन करते राजभाषा नाभिक, सी 1 के बराबर है। हम यह भी पाया है कि एक ही transgenes व्यक्त की मांसपेशियों में, नाभिक, एक चिह्नित बढ़े परमाणु मात्रा प्रदर्शित नियंत्रण की तुलना में हालांकि ए एल एस के कारण एलील इस phenotype DVAP-WT ट्रांसजीन (चित्रा 4) की तुलना में अधिक कुशल उत्प्रेरण प्रतीत होता है। लगभग सभी neurodegenerative रोगों रोगजनक प्रोटीन युक्त समुच्चय के intracellular संचय की विशेषता है। हम 3 डी पुनर्निर्माण और नाभिक की मात्रा renderings बना दिया है और हमने पाया कि मांसपेशियों उत्परिवर्ती transgene व्यक्त या जंगली प्रकार के प्रोटीन overexpressing में, DVAP इम्युनो-जेट का गठन समूहों एकएन डी कि उनमें से कुछ भी नाभिक (चित्रा 5) में अनुवादित किया गया। इसके विपरीत, नियंत्रण NMJs में, DVAP इम्युनो-जेट थोड़े बल मांसपेशी फाइबर भर में छितरी हुई है और नाभिक 16 से बाहर रखा गया है। । चित्रा 1: धारीदार मांसपेशियों या तो DVAP-गुम्मट या DVAP-260I transgenes व्यक्त भीतर myonuclei के confocal छवियों (ए) BG57-Gal4 / + नियंत्रण, (बी) BG57; DVAP-V260I, (सी) BG57; DVAP-WT1 और (डी) BG57; DVAP-WT2 संकेत दिया transgenes व्यक्त की मांसपेशियों DVAP (लाल संकेत), Lamin (हरी झंडी) के लिए विशिष्ट और नाभिक (नीला संकेत) कल्पना करने के लिए एक परमाणु विशिष्ट मार्कर के साथ एंटीबॉडी के साथ दाग रहे हैं। स्केल बार = 30 माइक्रोन एक देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा का बड़ा संस्करण। चित्रा 2: निकटतम पड़ोसी विश्लेषण एक नाभिक और उसके एक करीबी पड़ोसी के बीच औसत दूरी तय करने के लिए (बी) DVAP-WT2 ट्रांस्जीन overexpressing मांसपेशियों में बदल परमाणु स्थिति दिखा प्रतिनिधि परिणाम जब (ए) में नियंत्रण की तुलना में।। संकेत दिया जीनोटाइप की मांसपेशियों में औसत परमाणु दूरी में (सी) सूत्र का उपयोग कर अनुमान लगाया गया था और डेटा में (डी) रिपोर्ट कर रहे हैं। लार्वा NMJs DVAP (लाल संकेत), Lamin (हरा) के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ और एक परमाणु मार्कर (नीला संकेत) के साथ दाग रहे हैं। तारों के सांख्यिकीय महत्व को निरूपित। *** पी <0.001, ** पी <0.01। इस प्रयोग के सांख्यिकीय विश्लेषण और सभी प्रयोगों के लिए एक तरह से एनोवा परीक्षण नीचे की सूचना दी इस्तेमाल किया गया था और एक Tukey के लिए multipजब जीनोटाइप के बीच मतभेद एनोवा परीक्षण से महत्वपूर्ण हो पाए गए le तुलना परीक्षण एक के बाद अस्थायी परीक्षण के रूप में लागू किया गया था। त्रुटि सलाखों SEM प्रतिनिधित्व करते हैं। स्केल बार = 30 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 3:। परमाणु मात्रा की गणना में प्रतिनिधि कदम दिखा छवियों (ए) सतह निर्माण विज़ार्ड का उपयोग कर खंडों नाभिक दिखा एक प्रतिनिधि छवि। छवियों की सीमा पर नाभिक नजरअंदाज कर दिया गया। (बी) के आसपास के DVAP धुंधला के बाद परमाणु DVAP संकेत दिखा छवि सतह परमाणु मार्कर चैनल में बनाया का उपयोग करके नकाबपोश किया गया है। (सी) सतह परत अतिरिक्त मापदंडों की जानकारी प्रदान करता हैपरमाणु मात्रा और गोलाई भी शामिल है। (घ) विभिन्न जीनोटाइप के परमाणु मात्रा पर डेटा। तारों के सांख्यिकीय महत्व को निरूपित। विच्छेदित NMJs विरोधी DVAP एंटीबॉडी (लाल सिग्नल), विरोधी Lamin एंटीबॉडी (हरी झंडी) और एक परमाणु मार्कर (नीला संकेत) के साथ दाग रहे थे। *** पी <0.001, ** पी <0.01। त्रुटि सलाखों SEM प्रतिनिधित्व करते हैं। स्केल बार = 30 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 4: छवियाँ ImageJ द्वारा परमाणु के आकार के आकलन में प्रतिनिधि कदम दिखा।    छवियों की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण मांसपेशियों के भीतर नाभिक का घेरा अनुमान लगाने के लिए ImageJ का उपयोग कर विश्लेषण किया गया। (ए) तीव्रता प्रक्षेपण का एक प्रतिनिधि उदाहरणप्रोटोकॉल के कदम 7.9 में के रूप में तीन चैनल छवि की। (बी) प्रोटोकॉल जिसमें चैनलों विभाजित कर रहे हैं और परमाणु मार्कर चैनल के कदम 7.10 दिखा छवि चयन किया जाता है। (सी) एक प्रतिनिधि दिखा रहा है कि ImageJ में नाभिक और रॉय प्रबंधक प्लगइन खंड के लिए तीव्रता सीमा को लागू करने के बाद, सभी के हित के नाभिक का चयन किया जा सकता है और उनके आकार आकार वर्णनकर्ता के माध्यम से मापा छवि (7.11-7.15 कदम)। (घ) विभिन्न जीनोटाइप का घेरा की मात्रा। लार्वा NMJs पर, रेड सिग्नल जबकि हरी नाभिक की रूपरेखा और Lamin धुंधला से मेल खाती है DVAP धुंधला इंगित करता है। हर नाभिक के इंटीरियर एक परमाणु मार्कर के साथ धुंधला के कारण नीले रंग में लेबल है। तारों के सांख्यिकीय महत्व को निरूपित। *** पी <0.001, ** पी <0.01। त्रुटि सलाखों SEM प्रतिनिधित्व करते हैं। स्केल बार = 30 माइक्रोन उसकी क्लिक करेंई यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए। चित्रा 5: myonuclei की मात्रा renderings के निर्माण में विशेष कदम दिखा छवियों। (ए) 3 डी तीव्रता दिखा छवि DVAP प्रोटीन (लाल), Lamin (हरा) और डीएनए मार्कर (नीला) के साथ दाग मांसपेशियों के मद्देनजर मिश्रित। (बी) छवि एक सतह परत नाभिक खंड के लिए Lamin चैनल का उपयोग करके उत्पन्न प्रतिनिधित्व। (सी) छवि एक नाभिक में जो सतह परत का चयन किया नाभिक के बाहर DVAP संकेत मुखौटा करने के लिए इस्तेमाल किया गया है प्रतिनिधित्व। पीले रंग में प्रकाश डाला एक कतरन विमान उस छवि में जोड़ दिया गया है। देखें और स्थिति की अपनी कोण interactively नाभिक के अंदर संकेत के वितरण कल्पना करने के लिए समायोजित किया जा सकता है। (डी) एक छवि परमाणु सतह परत बनाया यूएसआई के एक पार के अनुभागीय दृश्य रिपोर्टिंगएनजी Lamin चैनल बेपर्दा DVAP और परमाणु मार्कर संकेतों के साथ विलय कर दिया। (ई और एफ) एक ही नाभिक की अतिरिक्त मात्रा sectioned renderings। स्केल बार = 10 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

अतीत में, के भीतर और प्रयोगात्मक समूहों के बीच रूपात्मक बदलाव के शायद ही कभी ध्यान में रखा गया। हालांकि, मात्रात्मक तरीकों के आवेदन अब बनता जा रहा है आकृति विज्ञान और संरचनात्मक रूपों की गणितीय विवरण के तुलनात्मक अध्ययन में आदर्श गणना कर रहे हैं। मात्रात्मक का उपयोग विशिष्ट सेलुलर प्रक्रियाओं पर आनुवंशिक जोड़तोड़ के प्रभाव का आकलन करने में विश्लेषण करती है, रूपात्मक परिवर्तन का पता लगाने के लिए हमारी क्षमता को बढ़ाने में और सटीकता के साथ जो इन परिवर्तनों वर्णित हैं सुधार लाने में वादा पकड़। इसके अलावा, मात्रात्मक डेटा का सांख्यिकीय विश्लेषण हमें मूल्यांकन करने के लिए phenotypes के बीच मनाया मतभेद महत्वपूर्ण हैं या नहीं।

धारीदार मांसपेशियों में, नाभिक एक अलग गोल संरचना दिखा रहे हैं और समान रूप से मांसपेशी फाइबर के साथ वितरित कर रहे हैं। हालांकि आणविक स्थापित करने और बनाए रखने के आकार, आकृति और नाभिक की वास्तुकला तंत्र नहीं जाना जाता है, इन परमाणु सुविधाओं की संभावना टी रहे हैंओ मांसपेशी समारोह को नियंत्रित करने में एक मौलिक भूमिका निभाते हैं। दरअसल, कई myopathies मांसपेशियों के भीतर नाभिक की आकृति विज्ञान और स्थिति को विनियमित करने के जीन में उत्परिवर्तन के कारण होता है। आकार और एक कोशिका के भीतर नाभिक के वितरण के कार्यात्मक महत्व की मांसपेशियों के लिए सीमित नहीं है। सबूत जमते से पता चलता है कि परमाणु दोष भी ऐसे पार्किंसंस रोग ^18,24 के रूप में neurodegenerative रोगों के साथ जुड़े रहे हैं। इसके अतिरिक्त, हम उस आकृति विज्ञान, आकार और जालिका और माइटोकॉन्ड्रिया कार्यात्मक परिणाम हो सकते हैं सहित अन्य अंगों के intracellular वितरण की सराहना करने लगे हैं। उदाहरण के लिए, mitochondrial आकृति विज्ञान में परिवर्तन ऐसे ऑप्टिक शोष टाइप -1 (OPA1) और Charcot-Marie-टूथ प्रकार 2A न्यूरोपैथी ^{25 के} रूप ^में मस्तिष्क संबंधी बीमारियों के साथ जुड़े रहे हैं।

इन महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं अंतर्निहित आणविक तंत्र elucidating की प्रक्रिया में सहायता करने के लिए, हम उच्च संकल्प confocal गठबंधन करने का प्रस्तावइमेजिंग सॉफ्टवेयर और morphometric के साथ डेटा मात्रात्मक मूल्यांकन करने के लिए कैसे आनुवंशिक जोड़तोड़ मांसपेशी फाइबर के भीतर आकार, आकार, और नाभिक के स्थान को प्रभावित कर सकते विश्लेषण करती है। बिजली और एक साथ ड्रोसोफिला आनुवंशिकी की चंचलता ड्रोसोफिला लार्वा में neuromuscular प्रणाली के अत्यधिक टकसाली प्रकृति के साथ लार्वा NMJ विश्लेषण के इस प्रकार के लिए विशेष रूप से उपयुक्त एक प्रयोगात्मक मॉडल बनाते हैं। लार्वा NMJs में प्ररूपी विश्लेषण के लिए एक एकल अन्तर्ग्रथन संकल्प एक सटीक विश्लेषण morphometric जहां NMJs की संख्या में एक ही मक्खी के भीतर का अध्ययन किया जा सकता है और यहां तक कि एक ही पहचान योग्य NMJ अलग जीनोटाइप ^3,4 की मक्खियों के बीच तुलना की जा सकती इजाजत देने पर किया जा सकता है।

ड्रोसोफिला लार्वा NMJ में परमाणु स्थिति, आकार और आकार की प्ररूपी लक्षण वर्णन एंटीबॉडी कि मांसपेशियों के भीतर मांसपेशियों और नाभिक पर प्रकाश डाला साथ विच्छेदित NMJs के immunostaining प्रदर्शन से शुरू होता है। प्रोटोकॉल में थी में उल्लिखितकागज, myonuclei, Lamin, परमाणु लिफाफा के एक मार्कर के खिलाफ पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी के साथ दाग थे एक परमाणु मार्कर पूरे मांसपेशियों दाग DVAP के लिए विशिष्ट परमाणु आंतरिक और साथ एंटीबॉडी पर प्रकाश डाला साथ। Lamin इन प्रयोगों में इस्तेमाल किया एंटीबॉडी कृपया पॉल फिशर ^19-22 द्वारा प्रदान किया गया लेकिन विरोधी Lamin एंटीबॉडी के वैकल्पिक स्रोतों का इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, परमाणु लिफाफा के लिए विशिष्ट अन्य एंटीबॉडी के एक नंबर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। अंत में, इस तरह के DAPI और propidium आयोडाइड के रूप में परमाणु मार्कर, भी उपलब्ध हैं, जबकि मांसपेशियों विरोधी actin या विरोधी ट्यूबिलिन एंटीबॉडी के साथ धुंधला द्वारा देखे जा सकते हैं। इस प्रयोगात्मक प्रक्रिया में इस्तेमाल उन लोगों की तुलना में अन्य एंटीबॉडी कार्यरत रहे हैं, तो immunostaining प्रोटोकॉल अतिरिक्त कदम जिसमें निर्धारण की स्थिति और नई एंटीबॉडी के लिए काम कर रहे सांद्रता अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी की आवश्यकता होगी। इस प्रोटोकॉल है, खासकर जब मात्रा renderings विश्लेषण करने की आवश्यकता में एक महत्वपूर्ण कदम है, ध हैई स्लाइड पर नमूने के बढ़ते। इस मामले में, यह स्लाइड और coverslip इतना है कि नमूनों कुचल नहीं मिलता बीच spacers शामिल करने के लिए महत्वपूर्ण है। सेल्यूलोज टेप के तीन बैंड coverslip के दोनों किनारों पर स्लाइड के चारों ओर लिपटा spacers बनाने का एक आसान तरीका प्रतिनिधित्व करते हैं।

ImageJ 2 डी छवियों के लिए इस्तेमाल किया गया था, वहीं 3 डी मल्टी चैनल छवि का सबसे इस अखबार में प्रस्तुत विश्लेषण, क्योंकि अपने घर में उपलब्धता की Imaris का उपयोग करके किया गया था। हालांकि, किसी भी अन्य इसी तरह के वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर पैकेज इन अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

वहाँ कई खुला स्रोत (उदाहरण के लिए, ImageJ, CellProfiler, Vaa3D, बर्फीले, KNIME और दूसरों के लिए) और वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर प्लेटफार्मों confocal छवियों के विश्लेषण के लिए उपलब्ध हैं। ImageJ ^26, एनआईएच या उसके अधिक बढ़ाया संस्करण, फिजी ²⁷ के रूप में जाना से मुक्त सॉफ्टवेयर, दुनिया भर में इमेजिंग संचार के लिए उपलब्ध आयात फिल्टर, मैक्रोज़ और plugins की एक बड़ी संख्या हैTy। इन plugins के अधिकांश एक टुकड़ा-टुकड़ा द्वारा एक तरीके के बारे में जानकारी के प्रसंस्करण पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं। वहाँ भी दृश्य और मल्टीचैनल 3 डी छवियों के विश्लेषण के लिए उपलब्ध plugins रहे हैं। हालांकि, वे अक्सर एक विशेष कार्य के लिए तैयार कर रहे हैं और उपयोगकर्ताओं को अपने स्वयं की जरूरत को बढ़ाने या इन plugins अनुकूल करने की आवश्यकता हो सकती है। दूसरी ओर, वाणिज्यिक प्लेटफार्मों अपेक्षाकृत अनुभवहीन उपयोगकर्ताओं को निशाना बनाने और अक्सर आसानी से उपयोग, अविश्वसनीय गति के साथ छवि प्रसंस्करण कार्यों के व्यापक कवरेज पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं।

इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित मात्रात्मक प्ररूपी विश्लेषण के साथ प्रयोगात्मक प्रक्रिया एक साथ, organelle आकृति विज्ञान और एक कोशिका के भीतर उनके वितरण को नियंत्रित करने के आणविक तंत्र elucidating में सहायता कर सकते हैं। हालांकि, इस दृष्टिकोण एक विशिष्ट अंत बिंदु पर इन प्रक्रियाओं का विश्लेषण करने के स्पष्ट सीमा है। आकृति विज्ञान और अंगों के वितरण को नियंत्रित करने की प्रक्रिया बहुत गतिशील हो और न केवल अलग सेल Ty के बीच भिन्नता होने की संभावना हैपी इ एस लेकिन यह भी विकास या शारीरिक स्थिति पर निर्भर करता है एक ही कोशिका के भीतर। इस विश्लेषण का एक और कार्यान्वयन के समय चूक इमेजिंग परमिट कि organelle आकृति विज्ञान और स्थिति में परिवर्तन के समय के साथ निरीक्षण किया जा रहा द्वारा प्रतिनिधित्व किया जाएगा।

Materials

Micro-Forceps 0.3×0.25 mm	Fine Science Tools	11030-12
Sylgard dissection plates	SIGMA-ALDRICH	76103	Mix the pre-weighed elastomer base with curing agent. Poor the mixture into a 5 cm Petri dish. Let cure it at 60ºC for at least 24 hours
Stainless/Steel Minutien Pins 0.1 mm diameter	Fine Science Tools	26002-10
Microdissection scissors (ultra-fine)	Fine Science Tools	15200-00
1x PBS (Phosphate Buffered Saline). Composition: 3mM NaH2PO4, 7mM Na2HPO4, 130mM NaCl, pH 7			NaH2PO4 (SIGMA-S8282), Na2HPO4 (SIGMA-S7907), NaCl (SIGMA-S7653)
Bouin's Solution. Composition: Picric Acid, Formaldehyde, Acetic Acid (15:10:1)			Picric Acid (SIGMA 197378), Formaldehyde (F8775), Acetic Acid (SIGMA-1005706)
1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton). 1xPBS +0.1% Triton			Triton-X100. SIGMA-T8787
Normal Goat Serum	SIGMA	G9023
Guinea Pig anti-DVAP antibody			Provided by Dr. Giuseppa Pennetta (University of Edinburgh, UK). Use at !:200 dilution in 5% NGS
Rabbit anti-HRP (Horseradish peroxidase)	Jackson ImmunoResearch	123-065-021	Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS
Rabbit anti-Lamin antibody			Provided by Dr. Paul Fisher (State Univeristy of New York at Stony Brook). Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS
TO-PRO-3	Molecular Probes	T3605
Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor488, conjugated	Jackson ImmunoResearch	bs-295G-A555-BSS	Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS
Goat anti-guinea pig IgG antibody, Cy3, conjugated	Jackson ImmunoResearch	bs-0358G-Cy3-BSS	Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS
Vectashield mounting medium for fluorescence	Vector laboratories	H-1000