Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.
De flesta studier om morfogenes lita på kvalitativa beskrivningar av hur anatomiska drag påverkas av störningar i specifika gener och genetiska vägar. Kvantitativa beskrivningar sällan utförs, även om genetiska manipulationer producerar en rad fenotypiska effekter och variationer observeras även mellan individer inom kontrollgrupper. Emerging bevis visar att morfologi, storlek och placering av organ spela en tidigare underskattad, men grundläggande roll i cellernas funktion och överlevnad. Här ger vi steg-för-steg-instruktioner för att utföra kvantitativa analyser av fenotyper på Drosophila larver neuromuskulära förbindelsen (NMJ). Vi använder flera tillförlitliga immun histokemisk markörer i kombination med bio-avbildningstekniker och morfometriska analyser för att undersöka effekterna av genetiska mutationer på specifika cellulära processer. Framför allt fokuserar vi på kvantitativ analys av fenotyper som påverkar morfologi, storlek och position nuclei inom de tvärstrimmiga muskler i Drosophila larver. Drosophila larver NMJ är en värdefull experimentell modell för att undersöka de molekylära mekanismerna bakom struktur och funktion neuromuskulära systemet, både i hälsa och sjukdom. Däremot kan de metoder vi beskriver här utökas till andra system.
Qualitative analysis restricts the focus of most experimental studies to the examination of genetic manipulations leading to large phenotypic effects or to phenotypes that are not amenable to quantification, e.g., absence/presence. Quantification of phenotypes is not usually performed and variations present within members of a phenotypic group are not taken into consideration. Additionally, without mathematical descriptions of morphologies, it may be difficult to determine whether fine scale phenotypic changes are the result of genetically induced alterations or whether observed changes are simply due to random fluctuations.
We propose that for an accurate and unbiased analysis of phenotypic defects due to gene disruption, quantitative methodologies should accompany more traditional qualitative approaches. Quantitative evaluation of phenotypes is particularly beneficial for structures such as synapses that present a high degree of variability due to their intrinsic morphological and functional plasticity. We have selected examples of quantitative analyses applied to areas of investigation with which we are most familiar, namely the Drosophila larval neuromuscular junctions (NMJs). However, concepts and principles apply equally well to other experimental systems.
The larval NMJ is an excellent model system to study synaptic development and function because of the highly stereotyped nature of its structure. Each hemi-segment of the larval neuromuscular system contains 32 identifiable motor neurons forming synaptic contacts with their postsynaptic target muscle. Every hemi-segment also contains a fixed number of muscles visible as multinucleated fibers attached to the internal surface of the cuticle1. Another advantage of using the larval neuromuscular system is the power and versatility of Drosophila genetics that easily allows the generation of a number of mutant alleles and the possibility to modify gene expression in a time- and tissue-restricted manner. Finally, 75% of the human genes causing a disease have an evolutionarily conserved orthologue in Drosophila2. Indeed, entire genetic pathways are conserved between flies and humans. Because of this, the Drosophila larval neuromuscular system is a very popular experimental model to elucidate the molecular mechanisms underlying a number of human diseases including amyotrophic lateral sclerosis (ALS)1.
Here we show that the availability of several reliable immuno-histochemical markers, combined with bio-imaging techniques and accurate morphometric analyses can describe anatomical traits that are likely to play an important functional role3,4,5. Among the cellular processes that are amenable to quantitative analyses, we focus on changes in shape, size and position of intracellular structures such as the nuclei. All these are processes that we know very little about.
The challenge for molecular geneticists in the coming decades will be to extend our current knowledge by analyzing the effect of genetic mutations that produce very subtle phenotypic defects. Quantitative methodologies that allow researchers to meticulously explore the effects of genetic mutations can provide a more comprehensive understanding of how genotypes relate to phenotypes, especially for poorly understood cellular processes.
Förr i tiden var morfologiska variationer inom och mellan experimentella grupper sällan beaktas. Dock är tillämpningen av kvantitativa metoder nu bli norm i jämförande studier av morfologi och matematisk beskrivning av anatomiska former beräknas. Användningen av kvantitativa analyser för att bedöma effekterna av genetiska manipulationer på specifika cellulära processer, hålla löftet att stärka vår förmåga att upptäcka morfologiska förändringar och för att förbättra noggrannheten med vilken dessa förändringar beskrivs. Vidare tillåter statistisk analys av kvantitativa data oss att utvärdera om observerade skillnaderna mellan fenotyper är betydande.
I tvärstrimmiga musklerna, kärnor uppvisar en tydlig rundad struktur och är jämnt fördelade längs muskelfiber. Även de molekylära mekanismerna etablera och upprätthålla storlek, form och arkitektur av kärnor inte är kända, dessa kärnfunktioner sannolikt to spela en viktig roll i att kontrollera muskelfunktion. I själva verket är flera myopatier orsakas av mutationer i gener som reglerar morfologi och position kärnor inom musklerna. Den funktionella betydelsen av form och fördelning av kärnor inom en cell är inte begränsad till muskler. Ackumulerande bevis visar att kärn defekter är också förknippade med neurodegenerativa sjukdomar, såsom Parkinsons sjukdom 18,24. Dessutom börjar vi inse att morfologi, storlek och intracellulär distribution av andra organeller, inklusive endoplasmatiska retiklet och mitokondrier kan ha funktionella konsekvenser. Till exempel är förändringar i mitokondriell morfologi i samband med neurologiska störningar, såsom optisk atrofi typ-1 (OPA1) och Charcot-Marie-Tooth typ 2A neuropati 25.
För att underlätta arbetet med att klarlägga de molekylära mekanismerna bakom dessa viktiga processer, föreslår vi att kombinera hög upplösning konfokaladata med bildbehandlingsprogram och morfometriska analyser för att kvantitativt utvärdera hur genetiska manipulationer kan påverka form, storlek och placering av kärnor inom muskelfibrer. Kraften och mångsidigheten hos Drosophila genetik tillsammans med den högt stereotypa naturen hos det neuromuskulära systemet i Drosophila larver gör larver NMJ en experimentell modell särskilt lämplig för denna typ av analyser. Vid larv NMJs kan fenotypisk analys utföras vid en enda synaps upplösning möjliggör en noggrann morfometrisk analys där kan studeras ett antal NMJs inom samma fluga och även samma identifierbara NMJ kan jämföras mellan flugor av olika genotyper 3,4.
Fenotypisk karakterisering av kärn läge, form och storlek på Drosophila larver NMJ startar genom att utföra immunfärgning av dissekerade NMJs med antikroppar som framhäver muskler och kärnor inom musklerna. I det protokoll som beskrivs i this papper, var myonuclei färgades med polyklonala antikroppar mot lamin, en markör av kärnhöljet, med en nukleär markör som markerar de nukleära interiör och med antikroppar som är specifika för DVAP att färga hela muskeln. De Lamin antikroppar som används i dessa experiment tillhandahölls vänligen av Paul Fisher 19-22 men alternativa källor för anti-Lamin antikroppar kan användas. Dessutom kan ett antal andra antikroppar specifika för kärnhöljet är kommersiellt tillgängliga. Slutligen, kärn markörer, såsom DAPI och propidiumjodid, finns även tillgängliga muskler kan visualiseras genom färgning med anti-aktin eller anti-tubulin-antikroppar. Om andra än de som används i denna experimentella förfarande antikroppar används, kommer immunfärgning protokoll kräver extra steg där fixeringsförhållanden och arbets koncentrationer för de nya antikropparna kommer att behöva optimeras. Ett viktigt steg i detta protokoll, särskilt när volym renderingar måste analyseras, är the montering av proverna på bilden. I det här fallet är det viktigt att inkludera distanser mellan sliden och täck så att exemplaren inte får klämd. Tre band av cellulosa tejp virad runt bilden på båda sidor av täck utgör ett enkelt sätt att göra distanser.
Medan ImageJ användes för 2D-bilder, de flesta av 3D flerkanalsbild analyser presenteras i detta dokument gjordes med hjälp av Imaris på grund av dess egen tillgänglighet. Emellertid kan vilken som helst annan liknande kommersiella programvarupaket användas för dessa tillämpningar.
Det finns flera öppen källkod (t.ex. ImageJ, CellProfiler, Vaa3D, Icy, KNIME och andra) och kommersiella mjukvaruplattformar tillgängliga för analys av konfokala bilder. ImageJ 26, fri programvara från NIH eller dess mer förbättrad version, känd som Fiji 27, har ett stort antal importfilter, makron och plugins för den globala avbildning kommty. De flesta av dessa plugins är inriktade på att bearbeta informationen på en skiva-by-skiva sätt. Det finns också plugins tillgängliga för visualisering och analys av flerkanaliga 3D-bilder. Men de är ofta utformade för en specifik uppgift och användare kan behöva förlänga eller anpassa dessa plugins till sina egna behov. Å andra sidan, kommersiella plattformar rikta relativt oerfarna användare och är ofta fokuserade på enkel att använda, bred täckning av bildbehandlingsuppgifter med otrolig hastighet.
Det experimentella förfarandet tillsammans med den kvantitativa fenotypisk analys som beskrivs i detta protokoll, kan hjälpa till att belysa molekylära mekanismer som styr organell morfologi och deras fördelning i en cell. Emellertid har detta tillvägagångssätt den uppenbara begränsningen att analysera dessa processer vid en specifik ändpunkt. Processen för styrning av morfologin och distribution av organeller kommer sannolikt att vara mycket dynamisk och för att variera inte bara mellan olika cell types men även inom samma cell beroende på utvecklings eller fysiologisk status. En ytterligare tillämpning av denna analys skulle representeras av tidsförlopp avbildning som tillåter förändringar i organell morfologi och position för att följas över tid.
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to Dr. Andrea Chai for her insightful comments on the manuscript. This work was supported by the Wellcome Trust (grant number: Pennetta8920) and by the Motor Neuron Disease Association (grant number: Pennetta6231).
Micro-Forceps 0.3×0.25 mm | Fine Science Tools | 11030-12 | |
Sylgard dissection plates | SIGMA-ALDRICH | 76103 | Mix the pre-weighed elastomer base with curing agent. Poor the mixture into a 5 cm Petri dish. Let cure it at 60ºC for at least 24 hours |
Stainless/Steel Minutien Pins 0.1 mm diameter | Fine Science Tools | 26002-10 | |
Microdissection scissors (ultra-fine) | Fine Science Tools | 15200-00 | |
1x PBS (Phosphate Buffered Saline). Composition: 3mM NaH2PO4, 7mM Na2HPO4, 130mM NaCl, pH 7 | NaH2PO4 (SIGMA-S8282), Na2HPO4 (SIGMA-S7907), NaCl (SIGMA-S7653) | ||
Bouin's Solution. Composition: Picric Acid, Formaldehyde, Acetic Acid (15:10:1) | Picric Acid (SIGMA 197378), Formaldehyde (F8775), Acetic Acid (SIGMA-1005706) | ||
1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton). 1xPBS +0.1% Triton | Triton-X100. SIGMA-T8787 | ||
Normal Goat Serum | SIGMA | G9023 | |
Guinea Pig anti-DVAP antibody | Provided by Dr. Giuseppa Pennetta (University of Edinburgh, UK). Use at !:200 dilution in 5% NGS | ||
Rabbit anti-HRP (Horseradish peroxidase) | Jackson ImmunoResearch | 123-065-021 | Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS |
Rabbit anti-Lamin antibody | Provided by Dr. Paul Fisher (State Univeristy of New York at Stony Brook). Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS | ||
TO-PRO-3 | Molecular Probes | T3605 | |
Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor488, conjugated | Jackson ImmunoResearch | bs-295G-A555-BSS | Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS |
Goat anti-guinea pig IgG antibody, Cy3, conjugated | Jackson ImmunoResearch | bs-0358G-Cy3-BSS | Use at 1:500 dilution in PBT containing 5% NGS |
Vectashield mounting medium for fluorescence | Vector laboratories | H-1000 |