Summary

El aislamiento y la canulación del parénquima cerebral arteriolas

Published: May 23, 2016
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Summary

This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

Abstract

arteriolas del parénquima intracerebrales (AP), que incluyen las arteriolas, arteriolas penetrantes del parénquima y arteriolas pre-capilares, vasos sanguíneos son de alta resistencia que ramifican hacia fuera de las arterias y arteriolas pial y el buceo en el parénquima cerebral. PA individual perfundir un territorio cilíndrica discreta del parénquima y las neuronas que contiene. Estas arteriolas son un actor central en la regulación del flujo sanguíneo cerebral tanto a nivel mundial (autorregulación cerebrovascular) y local (hiperemia funcional). AP son parte de la unidad neurovascular, una estructura que coincide con el flujo de sangre regional a la actividad metabólica en el cerebro y también incluye neuronas, interneuronas, y astrocitos. La perfusión a través de las AP está directamente relacionada con la actividad de las neuronas en ese territorio particular, y el aumento de plomo metabolismo neuronal a un aumento en la perfusión de la zona por la dilatación de la alimentación de PA. Reglamento de las AP difiere de la de mejor caracterizadopial arterias. vasoconstricción inducida por presión es mayor en las áreas protegidas y los mecanismos vasodilatadores varían. Además, las áreas protegidas no reciben inervación extrínseca de los nervios perivasculares – inervación es intrínseca e indirecta en la naturaleza a través del contacto con los pies terminales astrocíticos. Por lo tanto, los datos relativos a la regulación contráctil acumulados por los estudios que utilizan arterias pial no se traduce directamente a la comprensión de la función PA. Además, sigue sin determinarse cómo los estados patológicos, como la hipertensión y la diabetes, afectan a la estructura y reactividad PA. Esta brecha de conocimiento es en parte consecuencia de las dificultades técnicas relacionadas con el aislamiento de PA y la canalización. En este manuscrito se presenta un protocolo para el aislamiento y la canalización de las AP de roedores. Además, se muestran ejemplos de experimentos que se pueden realizar con estas arteriolas, incluyendo constricción inducida por el agonista y reactividad miogénica. Aunque el objetivo de este manuscrito es el PA canulación y myography presión, aislado PAs también se puede utilizar para estudios bioquímicos, biofísicos, moleculares y de imagen.

Introduction

La circulación cerebral se organiza única para apoyar las demandas metabólicas de las neuronas centrales, las células que han limitado las reservas de energía y en consecuencia son muy sensibles a los cambios en la presión de oxígeno y el suministro de nutrientes necesarios. Como determinadas subpoblaciones neuronales se vuelve activo cuando se realizan tareas específicas, la vasculatura promueve un aumento muy localizada en la perfusión para evitar la hipoxia local y el agotamiento de los nutrientes 1. Esta es una forma de hiperemia funcional conocido como acoplamiento neurovascular, y depende de la operación correcta de la unidad neurovascular, compuesto de neuronas activas, astrocitos y las arterias cerebrales 2. Arteriolas parenquimatosas intracerebral, un grupo de los vasos sanguíneos que abarcan del parénquima, penetrantes y arteriolas pre-capilares, son centralmente importante para esta respuesta y entonces es fundamental para estudiar de forma individual con el fin de investigar el acoplamiento neurovascular 3.

<p class = "jove_content"> arteriolas parenquimatosas son pequeñas (20 a 70 micras de diámetro interno) los vasos sanguíneos de alta resistencia que perfunden distintas poblaciones neuronales en el cerebro. Diversificación de las arterias pial en la superficie, arteriolas parenquimatosas penetran en el parénquima cerebral en un ángulo de casi 90 para alimentar la microcirculación subsuelo (Figura 1). Estas arteriolas juegan un papel crítico en el mantenimiento de la presión de perfusión adecuada, ya que son los vasos que contiene músculo liso más distales que protegen a los capilares. En contraste con la circulación pial superficie, arteriolas parenquimatosas carecen de ramas colaterales y anastomosis, y por lo tanto son "cuellos de botella" de la circulación cerebral 4. Como resultado de ello, la disfunción de las arteriolas del parénquima contribuye al desarrollo de las enfermedades cerebrovasculares tales como deterioro cognitivo vascular y pequeños accidentes cerebrovasculares isquémicos (también conocido como accidentes cerebrovasculares silenciosos o lacunares). estudios iNDICATe que la disfunción del parénquima arteriolas puede ser inducida por la hipertensión esencial 5, el estrés crónico 6, y es un evento temprano en la enfermedad de vasos pequeños modelo de ratón genético 7. Oclusión Además, inducida experimentalmente de las arteriolas penetrantes individuales en ratas es suficiente para provocar pequeños accidentes cerebrovasculares isquémicos que son de forma cilíndrica, similar a los observados en los seres humanos de edad avanzada 8.

Además de estas distinciones anatómicas, mecanismos que regulan la función contráctil difieren entre arterias y arteriolas pial parenquimatosas. Vasoconstricción miogénica es mayor en las arteriolas del parénquima 9, posiblemente debido a la falta de inervación extrínseca 10, modos distintos de mechanotransduction 11, y las diferencias en la señalización intracelular de Ca2 + 12,13 en las células del músculo liso vascular. La evidencia sugiere que los mecanismos vasodilatadores dependientes del endotelio también difieren entre estos Vascusegmentos lar, con arterias del parénquima que exhiben una mayor dependencia de los mecanismos que implican Ca2 + activados por los canales de K + y la comunicación electrotónico dentro de la pared vascular en comparación con los factores difusibles como el óxido nítrico y prostaciclinas 14. Por lo tanto, los datos reunidos en experimentos utilizando arterias pial no necesariamente puede aplicarse a las arteriolas del parénquima, dejando un vacío en nuestro conocimiento del control local de la perfusión cerebral.

A pesar de su importancia, las arteriolas del parénquima son muy insuficientemente estudiada, principalmente debido a las dificultades técnicas con el aislamiento y el montaje para el estudio ex vivo. En este manuscrito se describe una metodología para aislar y canular arteriolas del parénquima cerebral, que puede ser utilizado para myography presión, o para aislar el tejido para immunolabeling, la electrofisiología, la biología molecular y el análisis bioquímico.

Protocol

1. cánula y cámara de preparación de Inserte capilares de vidrio de borosilicato limpia (diámetro exterior: 1,2 mm; diámetro interior: 0,69 mm; 10 mm de longitud) en las ranuras de un extractor de pipeta con un filamento de platino (diámetro: 100 micras). Utilización de las configuraciones adecuadas, tire del capilar para generar una cánula con una punta larga y delgada (Figura 2) utilizando un extractor de micropipeta. Los ajustes que se utilizan son: Heat – 700, Pull – 100…

Representative Results

La Figura 5A muestra una constricción representante de las AP de ratón a 60 mM KCl LCRa para evaluar la integridad de la preparación. AP debe constreñir entre 15 – 30% en presencia de KCl 60 mM. Si el estrechamiento es inferior al 15%, desechar la AP y cannulate otro, ya que sugiere que la arteriola fue dañado durante el proceso de aislamiento y la canalización. La Figura 5B ilustra PA c…

Discussion

arteriolas del parénquima cerebral son las arteriolas de alta resistencia con pocas anastomosis y ramas que irrigan distintas poblaciones neuronales. Estos vasos sanguíneos especializados son actores centrales en la autorregulación cerebrovascular y acoplamiento neurovascular a través de la vasodilatación mediada por astrocito-1. La importancia de estos vasos sanguíneos especializados en la enfermedad vascular cerebral se conoce desde hace aproximadamente 50 años, cuando el trabajo pionero del Dr. Mill…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Funded by NHLBI R01HL091905 (SE), the United Leukodystrophy Foundation CADASIL research grant (FD) and AHA 15POST247200 (PWP). The authors would like to thank Samantha P. Ahchay for providing the image on Figure 1, and Dr. Gerry Herrera, Ph.D., for providing critical comments on the manuscript.

Materials

artificial Cerebrospinal Fluid
NaCl Fisher Scientific S-640
KCl Fisher Scientific P217
MgCl Anhydrous Sigma-Aldrich M-8266
NaHCO3 Fisher Scientific S233
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S9638
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G2870
CaCl2 Sigma-Aldrich C4901
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9647
Name Company Catalog Number Comments
Isolation/ Cannulation
Stereo Microscope Olympus SZX7
Super Fine Forceps Fine Science Tools 11252-00
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-00
Wiretrol 50 μL VWR Scientific 5-000-1050
0.2 μm Sterile Syringe Filter VWR Scientific 28145-477
Micropipette Puller Sutter Instruments P-97
Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm Sutter Instruments B120-69-10
Dark Green Nylon Thread Living Systems Instrumentation THR-G
Linear Alignment Single Vessel Chamber Living Systems Instrumentation CH-1-LIN
Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump Living Systems Instrumentation PS-200
Video Dimension Analyzer Living Systems Instrumentation VDA-10
Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software Living Systems Instrumentation DAQ-IWORX-404
Heating Unit Warner Instruments 64-0102
Automatic Temperature Controller Warner Instruments TC-324B

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Cite This Article
Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles. J. Vis. Exp. (111), e53835, doi:10.3791/53835 (2016).

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