Summary

İzolasyon ve Serebral Parankimal arteriollerin kanülasyonu

Published: May 23, 2016
doi:

Summary

This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

Abstract

parankimal Arteriolleri, delici arteriol ve pre-kapiller Arteriolleri içeren Intraserebral parankimal arteriol (genelge), beyin parankimi içine pial arterler ve arteriol ve dalış dallanma yüksek direnç kan damarları vardır. Bireysel PA parankim ayrı bir silindirik bölge ve içinde bulunan nöronlar serpmek. Bu arteriyollerde yerel serebral kan akımı, hem küresel (serebrovasküler otoregülasyon) ve (fonksiyonel hiperemi) düzenlenmesinde merkezi bir oyuncu vardır. PA nörovasküler biriminde, beyin içinde metabolik aktivite bölgesel kan akımı ile eşleşen bir yapının parçası olan ve aynı zamanda nöronlar, internöronlardan ve astrositler içerir. Pleomorfik adenomun ile perfüzyon doğrudan yem PA genişlemesinden kaynaklanır yerel perfüzyon bir artışlarına söz konusu bölgede nöronlar ve nöronal metabolizma kurşun artışların aktivitesi ile bağlantılıdır. Pleomorfik düzenlenmesi daha iyi karakterize farklıdırpial arterler. Basınç kaynaklı vazokonstriksiyon PA olgularında daha büyüktür ve vazodilatör mekanizmaları değişir. Buna ek olarak, PA perivasküler sinirler dışsal innervasyon almıyorsunuz – innervasyon astrositik endfeet ile temas yoluyla içsel ve doğada dolaylı olduğunu. Böylece, pial arterleri kullanarak çalışmalarla biriken kontraktil düzenlenmesi ile ilgili verileri doğrudan PA işlevini anlamak için anlamına gelmez. Hipertansiyon ve diyabet gibi patolojik durumlar, PA yapısı ve reaktivite nasıl etkilediğini Ayrıca, belirsiz kalır. Bu bilgi boşluğu kısmen PA izolasyon ve kanülasyona ilişkin teknik zorluklar bir sonucudur. Bu yazıda izolasyon ve kemirgen PA olgularının kanülasyon için bir protokol mevcut. Dahası, agonist kaynaklı daralma içi ve kas reaktivitesi de dahil olmak üzere, bu arteriyoller ile yapılabilir deneylerin örnekleri göstermektedir. Bu yazının odak noktası PA kanülasyon ve basınç myography üzerinde olmasına rağmen, PA izoles da biyokimyasal biyofiziksel moleküler ve görüntüleme çalışmaları için kullanılabilir.

Introduction

serebral dolaşım benzersiz merkezi nöronları, enerji depolar sınırlı ve oksijen basıncı ve gerekli besinlerin temini değişimlere dolayısıyla son derece duyarlıdır hücrelerin metabolik taleplerini desteklemek üzere düzenlenmiştir. Özel görevler yapılırken özellikle nöronal alt popülasyonlar aktif hale geldikçe, damarsal yerel hipoksi ve besin 1 tükenmesi önlemek için perfüzyon oldukça lokalize bir artış teşvik etmektedir. Bu aktif nöronlar, astrositler ve serebral arterlerin 2 oluşan nörovasküler kaplin olarak bilinen fonksiyonel hiperemi şeklidir ve nörovasküler ünitenin düzgün çalışması bağlıdır. İntraserebral parankimal Arterioller, kan damarları, parankimal kapsayan delici ve pre-kapiller arteriol bir grup, bu yanıt için merkezi önem taşımaktadır ve nörovasküler kaplin 3 araştırmak amacıyla bunları tek tek incelemek için kritik öneme sahiptir.

<beyin içinde farklı nöron popülasyonları serpmek – (70 mikron iç çapı 20) yüksek dirençli kan damarları p class = "jove_content"> parankim arteriol küçüktür. Yüzeyde pial arterlerden dallanma, parankimal arteriol yeraltı mikro dolaşımı (Şekil 1) beslemek için yaklaşık 90 açıyla beyin parankimi içine nüfuz eder. Bu arteriyollerde onlar kılcal koruyan en uzak düz kas içeren kaplar gibi uygun perfüzyon basıncını muhafaza kritik bir rol oynamaktadır. Yüzey pial dolaşıma aksine, parankimal arteriol teminat şubesi ve anastomoz eksikliği ve dolayısıyla serebral dolaşımın 4 "darboğazlar" dir. Sonuç olarak, parankimal arteriollerin disfonksiyonu gibi vasküler kognitif bozukluk ve küçük iskemik inme (aynı zamanda sessiz veya laküner vuruş olarak da bilinir) gibi serebrovasküler hastalıkların gelişimine katkıda bulunur. çalışmalar Indicate bu parankimal arteriyollerinde disfonksiyonu esansiyel hipertansiyon 5, kronik stres 6 tarafından uyarılan ve küçük damar hastalığı, genetik fare modelinde 7 erken bir olaydır olabilir. Sıçanlarda bir nüfuz arteriyollerin Bundan başka, deneysel olarak indüklenmiş oklüzyon yaşlı insanlarda 8 gözlenenler silindirik, benzer küçük bir iskemik inme neden olmak için yeterli olduğunu.

Bu anatomik farklılıklara ek olarak, kontraktil fonksiyon düzenleyici mekanizmalar Pial arter ve parenkimal arteriyollerin arasında farklılık gösterir. Miyojenik vazokonstriksiyon nedeniyle muhtemelen damar düz kas hücrelerinde 12,13 sinyalizasyon hücre içi Ca dışsal inervasyon 10, mechanotransduction 11 farklı modları ve farklılıkların olmaması 2+ arasında parankimal arteriyollerde 9 daha fazladır. Kanıt endotele bağımlı vazodilatör mekanizmaları da bu vascu arasında farklılık göstermektedirCa 2+ içeren mekanizmalar üzerinde daha fazla güven sergileyen parankimal arterler ile lar bölümleri, nitrik oksit ve prostasiklinler 14 olarak yayılabilir faktörlerle karşılaştırıldığında damar duvarındaki K + kanalları ve elektrotonik iletişim -etkinleştirilmiş. Bu nedenle, veri serebral perfüzyon yerel kontrolü bilgimizin bir boşluk bırakarak, mutlaka Arteriolleri parenkimal için geçerli olmayabilir pial arterleri kullanarak deneylerde toplandı.

Onların önemine rağmen, parankimal arteriol öncelikle izolasyon ve ex vivo çalışma için montaj teknik zorluklar altında incelenmiş, büyük ölçüde vardır. Bu yazıda izole ve basınç myography için kullanılabilir ya da immunolabeling, elektrofizyoloji, moleküler biyoloji, ve biyokimyasal analiz için doku izole etmek için olan serebral parenkimal arteriyollerin kanülasyonu için bir yöntem tarif eder.

Protocol

1. Kanül ve Odası Hazırlık (Dış çap: 1.2 mm; iç çapı: 0.69 mm, uzunluğu 10 mm), temiz borosilikat cam kılcal takın bir platin filaman (100 um çapında), bir pipet çektirmenin oluklara. Uygun ayarları kullanarak, bir mikropipet çektirmenin kullanarak, uzun ve ince ucu (Şekil 2) ile bir kanül oluşturmak için kılcal çekin. kullanılan ayarlar şunlardır: Isı – 700, Pull – 100, Hız – 50, Zaman – 10. Basınç myograph odasının tutucu içine kanül ye…

Representative Results

Şekil 5A hazırlık bütünlüğünü değerlendirmek için 60 mM KCI aCSF fare PA olgularının temsili daralmasını gösterir. 60 mM KCI mevcudiyetinde% 30 – PA 15 arasında büzülür gerekir. daralma% 15 altında ise, PA atmak ve arteriole izolasyon ve kanülasyon sırasında zarar gördüğünü anlaşılacağı gibi, başka bir cannulate. Şekil 5B, superfusing banyosuna tromboksan A <…

Discussion

Serebral parankimal arteriyollerde farklı nöron popülasyonları serpmek birkaç anastomoz ve şubeleri ile yüksek direnç arteriyollerinde vardır. Bu özel kan damarları astrosit aracılı vazodilatasyon 1 ile serebrovasküler otoregülasyonun ve nörovasküler kaplin merkezi oyuncular. Serebral vasküler hastalık bu özel kan damarlarının önemi Doktor Miller Fisher öncü çalışması hipertansif hastalarda ölüm sonrası 16 beyinlerinde laküner infarkt topraklarında paranki…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Funded by NHLBI R01HL091905 (SE), the United Leukodystrophy Foundation CADASIL research grant (FD) and AHA 15POST247200 (PWP). The authors would like to thank Samantha P. Ahchay for providing the image on Figure 1, and Dr. Gerry Herrera, Ph.D., for providing critical comments on the manuscript.

Materials

artificial Cerebrospinal Fluid
NaCl Fisher Scientific S-640
KCl Fisher Scientific P217
MgCl Anhydrous Sigma-Aldrich M-8266
NaHCO3 Fisher Scientific S233
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S9638
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G2870
CaCl2 Sigma-Aldrich C4901
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9647
Name Company Catalog Number Comments
Isolation/ Cannulation
Stereo Microscope Olympus SZX7
Super Fine Forceps Fine Science Tools 11252-00
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-00
Wiretrol 50 μL VWR Scientific 5-000-1050
0.2 μm Sterile Syringe Filter VWR Scientific 28145-477
Micropipette Puller Sutter Instruments P-97
Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm Sutter Instruments B120-69-10
Dark Green Nylon Thread Living Systems Instrumentation THR-G
Linear Alignment Single Vessel Chamber Living Systems Instrumentation CH-1-LIN
Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump Living Systems Instrumentation PS-200
Video Dimension Analyzer Living Systems Instrumentation VDA-10
Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software Living Systems Instrumentation DAQ-IWORX-404
Heating Unit Warner Instruments 64-0102
Automatic Temperature Controller Warner Instruments TC-324B

References

  1. Dunn, K. M., Nelson, M. T. Neurovascular signaling in the brain and the pathological consequences of hypertension. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 306, H1-H14 (2014).
  2. Iadecola, C. Neurovascular regulation in the normal brain and in Alzheimer’s disease. Nat Rev Neurosci. 5, 347-360 (2004).
  3. Dabertrand, F., et al. Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 479-482 (2013).
  4. Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 365-370 (2007).
  5. Pires, P. W., Jackson, W. F., Dorrance, A. M. Regulation of myogenic tone and structure of parenchymal arterioles by hypertension and the mineralocorticoid receptor. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 309, H127-H136 (2015).
  6. Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 7462-7467 (2014).
  7. Dabertrand, F., et al. Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, E796-E805 (2015).
  8. Shih, A. Y., et al. The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit. Nature neuroscience. 16, 55-63 (2013).
  9. Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of applied physiology. 117, 53-59 (2014).
  10. Hamel, E. Perivascular nerves and the regulation of cerebrovascular tone. Journal of applied physiology. 100, 1059-1064 (2006).
  11. Brayden, J. E., Li, Y., Tavares, M. J. Purinergic receptors regulate myogenic tone in cerebral parenchymal arterioles. J Cereb Blood Flow Metab. 33, 293-299 (2013).
  12. Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation. Microcirculation. 20, 307-316 (2013).
  13. Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels. Circ Res. 110, 285-294 (2012).
  14. You, J., Johnson, T. D., Marrelli, S. P., Bryan, R. M. Functional heterogeneity of endothelial P2 purinoceptors in the cerebrovascular tree of the rat. Am J Physiol. 277, H893-H900 (1999).
  15. Nagase, K., Iida, H., Dohi, S. Effects of ketamine on isoflurane- and sevoflurane-induced cerebral vasodilation in rabbits. J Neurosurg Anesthesiol. 15, 98-103 (2003).
  16. Fisher, C. M. The arterial lesions underlying lacunes. Acta Neuropathol. 12, 1-15 (1968).
  17. Brown, W. R., Moody, D. M., Thore, C. R., Anstrom, J. A., Challa, V. R. Microvascular changes in the white mater in dementia. J Neurol Sci. 283, 28-31 (2009).
  18. Pires, P. W., Dams Ramos, C. M., Matin, N., Dorrance, A. M. The effects of hypertension on the cerebral circulation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304, H1598-H1614 (2013).
  19. Filosa, J. A., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Calcium dynamics in cortical astrocytes and arterioles during neurovascular coupling. Circ Res. 95, e73-e81 (2004).
  20. Dacey, R. G., Duling, B. R. A study of rat intracerebral arterioles: methods, morphology, and reactivity. Am J Physiol. 243, H598-H606 (1982).
  21. Coyne, E. F., Ngai, A. C., Meno, J. R., Winn, H. R. Methods for isolation and characterization of intracerebral arterioles in the C57/BL6 wild-type mouse. J Neurosci Methods. 120, 145-153 (2002).
  22. Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, myogenic tone, and vasodilator responses in middle cerebral arteries and parenchymal arterioles: effect of ischemia and reperfusion. Stroke. 40, 1451-1457 (2009).

Play Video

Cite This Article
Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles. J. Vis. Exp. (111), e53835, doi:10.3791/53835 (2016).

View Video