Kombinerad Registrering av mekaniskt stimulerad Afferent utgång och nervändsluten Märkning mus hårsäcken lanceolate Endings

Abstract

En ny dissektion och inspelningsteknik beskrivs för övervakning afferenta bränning framkallas genom mekanisk förflyttning av hår i musen pinna. Tekniken är mycket kostnadseffektivt och enkelt genomföras med material som vanligen finns i de flesta elektrofysiologiska laboratorier, eller lätt köpas. Dissektion är enkel och snabb, med den mekaniska förskjutningen från en generisk electroceramic skiva styrs av proprietär programvara. Samma programvara även in på och analyserar electroneurogram utgång. Inspelningen av den framkallade nervaktiviteten är genom en kommersiell differentialförstärkare ansluten till brand polerade standardglas mikroelektroder. Användbara tips ges för att förbättra kvaliteten av preparatet, stimulans och inspelningsförhållandena att optimera inspelningskvalitet. Systemet är lämpligt för analys av de elektrofysiologiska och optiska egenskaper hos lansettlika terminalerna hos Palisade ändelser av hårsäckar, såväl som denresultat från deras farmakologiska och / eller genetisk manipulation. Ett exempel på att kombinera elektrisk inspelning med mekanisk stimulering och märkning med en styryl pyridinium vitala färgämnet ges.

Introduction

De lansettlika terminaler av sensoriska axoner innerverar hårsäckarna hos däggdjur bildar palissader runt håret axeln epitel. Deras syfte är att detektera mekanisk förflyttning av de hårstrån som de omger. De är en blandning av snabbt och långsamt anpassa ändelser som huvudsakligen producerar korta skurar av aktivitet som svar på håret rörelse. Aktivitet upphör mycket snabbt när rörelsen stannar, även i närvaro av en fortsatt förskjutning. Här beskriver vi utvecklingen av denna mus pinna modell för korrelat studier av struktur och funktion i lansettlika terminaler. Ytterörat har många fördelaktiga särdrag för att studera dessa avslutningar. För det första är ytterörat väsentligen två lager av hud apposed back-to-back, med lite annan vävnad mellan att hindra tillträde till folliklar och terminaler. Huden är mycket tunn och lätt dissekeras på grund av minimala mängder av tuffa bindväv. Innervation är lättillgängligt och identifierbar. Medan håret follicles är närvarande, de är relativt glest fördelade, vilket underlättar stimulering av enskilda eller små grupper av folliklar mekaniskt. Det tunna underliggande dermala skiktet ger god tillgänglighet till nervändarna med farmakologiska läkemedel och färgämnen. Detta gör dem särskilt idealisk för avbildning studier med fluorescensmikroskopi. Avbildning kan antingen vara i levande terminaler, eller efter fixering och ytterligare histologisk bearbetning.

Svaren från mechanosensory nervceller innerverar hårsäckar har traditionellt studerats i gnagare vibrissae ^1,2 och, i mindre utsträckning, i isolerade hudpreparat ^3,4. Dessa har lärt oss mycket om de allmänna principerna för mechanosensory fysiologi i nervterminalerna kring hårstrået. Den vibrissal beredning medger utsökt kontroll över rörelsen hos en enda hårsäcken. Dock kan det vara svårt att dechiffrera utsignalen på grund av dess komplexitet, som vibrissalfolliklar innehåller åtminstone 8 olika typer av anatomiskt distinkt mechanosensory slut ⁵ och matchningen av dessa morfologiska typer till specifika elektrofysiologisk undersökning är fortfarande en tvistefråga. Musen hud / vena nerv preparat används oftast i sin avhårade tillstånd att undersöka beröring och smärta svar. Innervation av hårsäckar i ett sådant preparat är mindre komplicerad men densiteten av hårsäckar, plus närvaron av tre olika follikelstimulerande typer (vakt, Awl / auchene och sicksack hårstrån) i en sådan närhet ^6, innebär att studera specifika svar en enda follikelstimulerande eller enda typ av slut återigen utmana. Dessutom har denna beredning innebär en komplicerad dissektion. Slutligen, i både vibrissal och andra hudpreparat, är det svårt att visualisera ändelser inblandade medan ex vivo preparat är fortfarande lever. Således vävnad sektionering krävs även i GFP-uttryckande mus linjer. Alternatidevis krävs det ytterligare histologiska / immunologisk behandling såsom fixering och / eller antikropps inkubation för immunofluorescens.

Vi har därför utvecklat ytterörat preparatet och använde det för att göra elektriska inspelningar från en begränsad population av hårsäcken afferenter och visar att membran cykling sker i dessa lansettlika ändelser, framgår av upptag av styryl pyridinium färgämnen. Slutligen visade det sig att färgämnet inte interfererar med mekanisk känslighet, vilket indikerar att det inte blockera mechanotransduction kanalerna. Resultaten av enkla stimulerings och analysprotokoll illustreras.

Protocol

Mus post mortem vävnad skörd måste använda godkända etiska metoder. I Storbritannien, är halsdislokation en regering godkänd metod för vuxna möss (ett börsnoterat schema en metod i den brittiska djur (Scientific Procedures) Act, 1986 och EU-direktivet 2010/63 / EU). Denna lagstiftning verkställs lokalt vid University of Aberdeen genom djurskydds och etikprövningsnämnden som granskat och godkänt alla metoder som används vid följande protokoll.

Obs: Dessa metoder användes i forskningen redovisas i Banks et al ^7.

1. Förbereda öron för elektrofysiologi

1. Före dissektion, bereds en standard fysiologisk saltlösning, såsom Liley s (1956) och mätta den med 90% _O2 / 5% _CO2. Liley s saltlösning (mM) består av: NaHCOs ₃ (12), KCl (4), KH ₂ PO ₄ (1), NaCl (138,8), _MgCl2 (1), _CaCl2 (2) och glukos(11).
2. Humant euthanize en vuxen mus utan att skada skallen nära öronen. Här använder vi C57 / BL6J och MF1 möss men någon standard laboratorie musstam kan användas. Helst använder möss som är <25 g om elektrisk inspelning ska kombineras med styryl färg märkning, som märkning i större möss är mindre tillförlitliga, ofta upptäcks bara i begränsade avgränsade områden.
3. Ta bort huvudet med stora sax eller ben saxar.
4. Placera huvudet ryggsidan upp i gasade Liley s i ett brett bottnad dissektion skålen (50 cm är vanligen lämpligt) på scenen av en stereo dissektion mikroskop. Regelbundet (~ 10 min) sluss eller doppa huvudet med gasade saltlösning.
5. Noggrant incisionsfilm och separera huden vid basen av ytterörat (pinna) med springbow sax och # 3 pincett, utsätta Brosk i yttre hörselgången (EAM). Identifiera grenarna av trigeminala (mandibular division, MDV) och stora auricular nerver som de dyker upp from skallen i klyftan av mandibular och projekt genom brosk bas för att innerverar konkava (främre) och konvexa (bakre) aspekterna av pinna hud, respektive.
6. Nära skallen, identifiera var de två nervgrenar utgång i spåret mellan käken och mastoidutskottet. Maximera sin längd genom att försiktigt dra ytterörat bort från skallen och skär nerverna så nära skallen som möjligt.
7. Avlägsna ytterörat från huvudet med springbow sax, var noga med att undvika de distala stubbar av de delade nerverna och minimerar mängden tät pelage vid basen av örat som tas bort.
8. Överför ytterörat till en flexibel silikongummi (PDMS) -lined skål fylld med gasade Liley vätske. Öppna EAM genom att dividera den smalast (anterior-mest) punkt. Platta ytterörat, främre hud (konkava) nedåt och stiftet till PDMS försiktigt på kanterna med ~ 6-8 regelbundet åtskilda mycket fina (~ 0,2 mm diameter) insekt stift.
9. remove huden av den bakre aspekten av pinna fullständigt och delvis avlägsna ytterörat brosk genom trubbig dissektion med # 3 pincett, vilket säkerställer den främre huden lämnas intakt.
10. Med spetsen på en fin insekt stift förstått med # 3 pincett, försiktigt sträcka grenarna (vanligen 2) av MDV som uppstår baktill mellan huden och EAM brosk. Nåla dessa till PDMS med de finaste möjliga insekt stift, spetsa bindväv angränsande sina avskurna ändar och inte nerv stammar själva.
11. Ta bort det mesta av den omgivande bindväv runt dem försiktigt för att undvika skador från överskott dra eller skärning.

2. elektrofysiologiska inspelning Konfigurera

1. Nåla fast ytterörat huden till PDMS-fodrade botten av en inspelning kammare med fina insekter stift runt kanterna (~ 6-8 per öra), placera de rengjorda nerver vid basen av örat nära två sug elektroder - en för inspelning (till ta nerven) och othenne en neutral elektrod (för att ge den neutrala signal till en differentialförstärkare, se ^7).
2. För inspelningen elektroden, noggrant matcha öppningen och den inre diametern på öppningen till den kombinerade tjockleken av de två nerver, så att de passar så tätt som möjligt och för en så stor längd som möjligt.
3. Dra nerverna in i elektrod genom försiktig sugning från en 2 ml spruta fäst vid den andra änden med silikongummislang. Se till att nerverna är raka, inte vikta eller dubblerad.
4. Utveckla en hög elektrisk resistans / impedans passning genom starkare sug att dra bindväv eller fettvävnad för att bilda en plugg som tätt tätar öppningen runt nerven.
5. Fyll den andra (likgiltig) elektrod med saltlösning genom sugning vid behov (det kan fylla genom kapillärverkan).
6. Placera identiska inspelningstrådar (silver eller platina) i den inre borrningen av inspelningselektrod att kontakta saltlösning och nerven(Inspelning) eller minskat, brand polerad ände (likgiltig) av elektroden. Varje elektrod löds individuellt till olika kärnor av två kärnor skärmad kabel. Placera bad (jord) elektrod (Ag / AgCl pellet) i badet, och malde det på skärmen av de två ledarkabeln är ansluten till inspelningselektroderna.
7. Mata den elektriska aktiviteten från de två elektroderna i de separata kanaler av en differentialförstärkare, filter (bandpasseras 0,2-2 kHz), och visa på ett oscilloskop skärm. Kontrollera att kanal A (inspelning) och kanal B (likgiltiga) elektriska bullernivåer liknar. I detta skede kan det inte vara möjligt att se de normala spontana aktionspotentialer i kanal A innan de två elektroderna är balanserade.
8. Avhjälpa eventuella skillnader i bakgrundsbruset mellan elektroderna genom att öka impedansen hos inspelningen (kanal A) eller likgiltiga (kanal B) elektroder. Gör detta genom att suga areolar (adipose) bindväv vidare till antingen elektroden och /eller applicera större sug kraft den 50 ml sprutan.
   1. När "balanserad" på detta sätt, växla tillbaka till differentiell (AB) inspelning och leta efter spontana aktionspotentialer (APS) i spår eller när strök hårstrån på kanten av ytterörat. Om ingen aktivitet (spiking) ses, åter kontrollera tät passning av nerven i inspelningen elektroden och areolar bindväv i indifferenta elektroden - oftast tätare (högre motstånd) tätningen och mer lika impedansen i de två elektroder, desto bättre. Med praktiken kommer detta att uppnå en god kvalitet (> 2: 1) signal: brusförhållande.
9. Anteckna electroneurogram via ett labb gränssnitt och elektro programvara som körs på en dator. En ljudutgången på tillsatta är mycket användbar och kan åstadkommas genom att mata neurogram genom en förstärkare och tillhörande högtalare. Justera tröskeln för att vara precis ovanför baslinjen buller (identifieras genom frånvaron av vita-noise 'väsa').
10. Att öka läkemedel eller fluorescerande styryl dye tillgång till de lansettlika ändelser, noggrant skala bort sub-dermal adipose skiktet nära ytterörat marginal, att öppna ett fönster på ~ 5 mm x 5 mm exponera dermis och basen av folliklar (Figur 1A, B ).
11. Stift tillbaka ett veck på ~ 1 mm adipose klar örat huden vid den ledande marginalen (vid nivån i fönstret bara produceras, i förekommande fall), vilket ger en klar saltlösning fylld klyftan mellan de apposed hudlagren. Försiktigt stroke hår utskjutande längs den vikta kanten med ett stift eller jordade fin pincett, utan att vidröra huden, för att lokalisera området av maximal AP utgång på oscilloskopet och distinkt "klick" och "poppar" i ljudutgången.

3. Inspelnings Stimulus framkallade aktionspotentialer

1. Placera mekanisk stimulering sonden - en brand-polerat 10 cm borosilikat mikro glas ansluten till en Ceramic piezoelektriska driv - så rörelse är parallell med hudveck. Placera spetsen ca 0,5-1 mm från hudveck, så det rör hår men inte huden. Kontrollera effektiv stimulering genom att långsamt flytta sondspetsen manuellt för att avleda håren och observera / lyssna på spiking.
2. Använda programvaran för att köra mekanisk stimulering av 1-3 hårstrån (t.ex. tre sekunder vid 5 Hz sinusvågor, var 10 sek. Sökarförflyttning 200-500 um), och spela stimulerings-framkallade svar i nerverna.
3. Ge flera identiska mekanisk stimulering tåg vid 10 sek intervall. Optimera sond läge för repeterbarhet, då minska frekvensen av stimulering enligt försöksprotokoll (t.ex. drop repetitionen från 10 sek till 30 sek).
4. Använda programvaran för att diskriminera AP-liknande aktivitet, t.ex. med användning av en enkel tröskelvärdet satt till ~ 2 x den högfrekventa brus amplitud och ~ 25% av de största AP.
5. Räkna AP korsar tröskeln som"händelser", kvantifiera frekvensen och egenskaper AP producerade.

4. Inspelnings Stimulus-framkallade Firing Kombinerat med N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) Pyridinium Dibromid Labeling

1. För att undersöka effekterna av styrylfärgämnen på stimulus-framkallade afferenta bränning och terminal märkning, tillsätt lämplig koncentration av en styryl färg val, till badlösningen och fortsätt med den elektriska inspelningen.
2. Efter den tid som krävs exponering (vanligtvis minst 30 min), förbereder beredningen för visning folliklarna. Fäll ut hudfliken genom att ta bort fäststiften, och exponera rensas huden området att avslöja terminal märkning.
3. Tvätta bort yttre färg med dye-fri saltlösning, vilket gör 3 fullständiga byten av saltlösning.
4. Inkubera i den slutliga förändringen av gasade färgfria saltlösning i 10-15 minuter för att tillåta den mest långlivade föroreningar färgämne att läcka från utsatta / externa membran.
5. Avlägsna icke-internaliserade färgämnet kvar på membran med ett sekvestreringsmedel (sulfobutylated beta-cyklodextrin, 1 mM, 5 min) i saltlösning.
6. Överför inspelningen kammaren till scenen av en upprätt epifluorescensmikroskop och engagera kammaren med rörelsemekanismen steg / bild.
7. Belysa beredningen med excitationsljus lämplig för styryl färgämnet. Använd en 10X eller 25X fluorescensmikroskop mål att observera follikelstimulerande märkning (Figur 1).

Representative Results

Den elektrofysiologiska inspelning arrangemang, med sub-kutan fettvävnad avlägsnas för att exponera hårsäckarna, visas i figur 1A. En del av denna exponerade området visas på en högre förstoring i ljusfält belysning i figur 1B. Vika ytterörat marginalen upp och tillbaka på sig själv på detta område avslöjar epidermisytan. Detta positionerar håren på kanten av vecket att skjuta ut horisontellt i en idealisk situation för mekanisk stimulering med en trubbig sond (ej visad). Figur 1C visar att efter färgämne exponering och återvänder marginalen till utfällt läge igen, den stimulerade folliklar i detta läge har märkts med en styryl pyridinium färgämne. Electroneurograms från preparat visar typiska pågående AP-aktivitet även i frånvaro av införde förflyttning av glasfiber sond, inklusive AP av den största storleken (Figur 2A (Figur 2Bi-iii)). Detta är helt repeterbara, men fasen för vågformen där svaren är låsta beror på deras position, det vill säga vid vilken punkt i rörelsen vibrationssond det kommer i kontakt med hår. En enkel tröskeldetektering (horisontell linje passerar neurogram spår i A (i-iii)) har använts för denna analys. Däremot kan inspelningsprogram funktionalitet ofta användas på ett mer sofistikerat sätt attdiskriminera funktioner i spik storlek och form. Detta kan sedan isolera svaren från vissa afferenta fibrer av dessa egenskaper för att möjliggöra pseudo-single-enhet inspelning analys som skall genomföras.

Figur 1:. Elektrofysiologiska inspelning arrangemang och N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutylamino) styryl) pyridinium Dibromid Märkning av hårsäcken Afferent lanceolate ändelser (A) En ytterörat preparat som för en elektrofysiologisk experiment visar pinna orientering, placeringen av nerverna, de registreringselektroderna och det exponerade området av follikelstimulerande innervation efter avlägsnande fettvävnad. (B) Flera hårsäckar är synliga i ljusa fält belysning i området rensas från överliggande fettvävnad ner till dermis. Den mörka, vanligen bilobed, former är talgkörtlar. ( 7, med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: (A) Stimulus-framkallade som registrerats från mus Pinna. (Ai-III) Exempel, tagna från 3 olika experiment, av aktivitet från kontinuerliga neurograms från pinnae i standard Liley s saltlösning. Varje post visar en 5 sek sektion ungefär fem minuter efter starten av inspelningen, inklusive en 3 sek period av sinusformad förflyttning av somköpcentret antal hårstråna. Den mekaniska stimulering upprepades var 30 sekund under kontinuerlig inspelning, som vanligtvis varade i 1-2 timmar. Anpassade skriptfiler markerade enskilda händelser som korsade en tröskel som fastställs av de horisontella markören (spikar), samt uppkomsten av varje sinuscykel (period). (AIV) Den styrsignal för sinusformad förskjutning. (B) Analys av stimulans-framkallade spetsning aktivitet. (Bi-III) Cykel histogram i 3 ° fack konstruerat från neurogram prover (Ai-iii) respektive visar svaren från förmodade lansettlika ändelser till mekanisk stimulering med 5 Hz sinus förskjutning av hårstråna med en glassond. Notera den markerade fas-låsning, i olika faser av cykeln, beroende på deras läge i förhållande till utgångsläget för den mekaniska sonden. (Biv) Normaliserad sökarförflyttning sinus; den faktiska amplitud var cirka 1001, m. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Här har vi utvecklat en relativt enkel beredning som snabbt kan dissekeras, har låg hårsäcken densitet och tillåter relativt selektiv mekanisk stimulering av ett litet antal hårsäckar. Det är lätt åtkomlig för elektrofysiologiska inspelning och live-cell fluorescerande imaging, inklusive svaren att färga ansökan för att visualisera mekaniskt stimulerade hårsäckarna, dvs avbildnings folliklar med definierade elektrofysiologiska svar. Även om vi inte har gjort det, verkar detta system också lätt mottagliga för under dividera sensoriska nerver för enhet (enda sensoriska axon) inspelning och användning av riktade GFP-uttryck för att visualisera sensorisk terminal slutar morfologi.

Vi har använt framställningen öronhuden för att undersöka egenskaperna hos den internalisering och frisättning av de fluorescerande membran styrylfärgämnen pridinium färgämnen ^7, en teknik som ursprungligen utvecklades för att studera lokaliserad Vesicle membran återvinning i synaptiska terminaler ^8. I synapser är avbildning också lätt kombineras med samtidig elektrofysiologiska inspelning av svaren i identifierade terminaler ^8,9. Det var i dessa tidiga studier som vi först noterade färgämnena också internaliseras av mechanosensory ändelser ^10. För sensoriska neuroner i kultur och i cochlea hårceller, en stor del av märkningen av styryl pyridinium färgämnen tycks involvera färgämnen som passerar genom mechanosensory kanaler, som de sedan blockerar ^11,12. Färgämnena märka då intracellulära membran, och märkningen är oåterkallelig. Men i hårceller som inte mekaniskt stimuleras ^13,14 och i fullt differentierade primära sensoriska nervändar in situ, såsom Ia ändar i muskelspolar ^15, och i lansettlika ändelser här ^7, styryl färg märkning tycks återspegla membran endocytos, eftersom märkningen är reversibel och inte blockera mechanosensory responses ^7,15,16. Medan vissa färginterna genom kanalträngning i dessa ändelser inte kan uteslutas helt, framgår det av den fortsatta bränning under färgämne inkubation och reversibilitet av märkningen att den stora majoriteten av märkning differentierade terminaler in situ är att internalisering med återvinning vesikler membran. Således är denna enkla teknik lätt användas för kombinerad el- och optik övervakning av en rad mechanosensory terminalfunktioner i ex vivo vävnader.

Som med de flesta praktiska tekniker kommer reproducerbarhet kräver upprepning och praktik. Några av de viktigaste punkterna värda särskild uppmärksamhet kommer nu att beskrivas. Under hela dissekering och inspelningssession maximera vävnadens viabilitet och överlevnad genom att säkerställa framställningen ständigt perfusion med saltlösning fullständigt mättad med 95% _O2 / 5% _CO2. Se till att håret folliklar är inte förskjuts under denna process, WHich kommer att stimulera sensoriska slut bränning. Antingen använda ett kontinuerligt, laminärt flöde perfusion system eller försiktigt bubbla gas genom organbadet med fina rör på avstånd från beredningen, eller noggrant uppdatera lösningar varje 20-30 min, varvid preparatet under saltytan vid alla tillfällen. Sug inspelning elektroder görs genom att modifiera skarpa elektrod borosilikat pipetter som normalt används för intracellulära inspelning. Först försiktigt bryta vassa spetsar med # 3 pincett för att ge en lämplig inre diameter för att passa de nerver och brand polera av mycket kort (<1 sek) exponering för bunsenbrännare låga (se 2.4 och 2.5). För att få en bra signal-brusförhållande vid inspelning, är det viktigt att den elektriska impedansen (motstånd) i dessa två elektroder är både maximerad och lika. Gör detta genom att uppmärksamma följande i de två elektroderna. För inspelningen elektroden, säkerställa den inre diametern är en perfekt passform för nerven, och den maximala längden av nerve dras in i inspelningen elektroden. Försök att använda bindväv som omger nerven för att effektivt täta elektrodspetsen. Alternativt, eller dessutom, dra den smala änden av en lämplig storlek, avsmalnande stycke av fettvävnad i vid sidan av nerven. Anslut sedan elektrodspetsen genom att applicera starkt sug efter ~ 1 min med en 50 ml spruta fäst till slangen. För en väl tillsluten spets kommer att tillämpa starkt sug helt enkelt stärka effektiviteten i kontakten och kommer inte att dra in mer vätska eller nerv. För att undvika nervskador, dock se till att bindväven är dämpa nerven från kompression på det omgivande materialet och EAM brosk. Den indifferenta elektroden bör efterlikna den resistans / impedansen hos den registrerande elektroden så nära som möjligt. Detta underlättas genom att noggrant brand polering spetsen till så liten öppning som möjligt utan att täta den. Om det behövs ytterligare motstånd, anslut sedan slutet av neutral elektrod med adipoSE bindväv, såsom beskrivits ovan för den registrerande elektroden.

Den electroceramic ger utsökt kontroll över mekanisk förflyttning, både rumsligt och tidsmässigt. Men ta hand gör elektriska anslutningar - höga temperaturer förstöra dem, så att inte använda varmt lod. Använd metallbelastade epoxilim, eller använda en specialist skjutpassning uttag som rekommenderas av leverantören. Detta kommer både att hålla den stadigt och etablera elektrisk anslutning. Fäst glas stimulerande sonden till electroceramic med standard epoxiharts. Brand polska slutet av en standard 10 cm x 1,5 mm borosilikat diameter glas kapillärrör som används för att göra plåster eller vassa elektroder för elektrofysiologiska inspelning för att minimera risken för vävnadsskador. Om enstaka hårsäcken stimulering krävs för att brand polera spetsen passa en enda hår och placera sonden med ett enda hårstrå inuti öppen bländare. Detta ger utsökt kontroll över ett enda hårstrå. För styryl dye märkning, är det i allmänhet mer enhetlig i vävnader från yngre djur. Det är inte helt klart varför, men detta återspeglar sannolikt mindre mekanisk trauma och effektivare djup vävnad avlägsnande från de yngre vävnader. Var noggrann i att ta bort skummigt skikt som liknar expanderad polystyren som ligger över hårsäcken baser. Men undvika att vara alltför kraftig, eftersom det riskerar att ta bort nervplexus skiktet och tillhörande lansettlika terminaler. Om det finns lite eller ingen elektrisk svar på hårsäcken rörelse, och styryl färgämnet ansökan leder till övervägande märkning av talgkörtlar (gul / vit), med tydlig autofluorescens av basen av hårstrået snarare än lansettlika ändelser (orange / gul), överentusiastiska clearance har skadat underliggande vävnader. Slutligen, med användning av ett färgämnes kelatmedel innan avbildning förbättrar avsevärt bildkontrasten och kvaliteten hos de slutliga bilderna.

Denna teknik skulle kunna vara användbar i ett område av ytterligare studier. dessa could innefattar exempelvis, screening med avseende på mechanosensory kanal (er) som ansvarar för stretch-evoked potential, genom att inkubera preparatet med farmakologiska ligander selektiva för kandidatkanaler eller screening mus linjer med sådana kanaler genetiskt borttagna. Den senare kan kombineras med fluorescens bedömning av eventuella förändringar i terminal morfologi på grund av genetisk manipulation i mus linjer, t.ex. med Npy2r bunden GFP uttryck ^17. Ett sista exempel kan vara att undersöka rollen av synaptiska liknande vesiklar (SLVS) ⁷ i dessa lansettlika terminaler genom att undersöka effekten av modulatorer för SLV omsättning (Ca, Mg, latrotoxin, glutamat-receptorligander) på stretch-framkallade svar och styryl färgupptagning /släpp. Således, öppnar denna nya teknik upp en rad potentiellt intressanta möjligheter till forskning inom mechansensory neurovetenskap.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS - Sylgard 184	Dow Corning		Flexible, inert, translucent solid silicone polymer.
No. 3 Dumont forceps	Fine Science Tools	11231-20
Austerlitz Insect pins	Fine Science Tools	26002-10	Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage.
AC Differential Preamplifier	Digitimer	Neurolog NL104A	Amplifying the size of the incoming afferent electroneurogram. Differential recording minimises the extraneous electrical noise and baseline drift.
High/Low-pass Filter	Digitimer	Neurolog NL125	Signal conditioning, by reducing extraneous electrical noise to ensure best signal to noise ratio.
Spike Trigger	Digitimer	Neurolog NL201	Sets the event detector threshold and displays it on the oscilloscope. This shows the action potential detection efficacy.
Audio Amplifier & speakers	Digitimer	Neurolog NL120S	Useful audio monitoring for the presencec of electrical firing of the sensory endings while adjusting the mechanical stimulation preparation down the microscope
Oscilloscope	Digitimer	PM3380A	We use this old model but any standard oscilloscope will suffice.
Piezo electroceramic  wafer	Morgan Electroceramics, Southampton UK	PZT507	Electrophysiology/computer interface
Piezo electroceramic  powersupply	Home made		0-200 V DC output to drive the ceramic wafer displacement, with variable electronic control of output via recording/stimulation software and computer interface. We use Spike2 software and 1401micro computer interface.
Electrophysiology Software	Cambridge Electronic Design (CED)	Spike2 v7	Electrophysiology recording, stimulation and data analysis software
Laboratory interface	Cambridge Electronic Design (CED)	1401 micro	Electrophysiology interface, between the amplifier/filters and the computer. It inputs the electroneurogram and also drives the electroceramic movement.
FM1-43/Synaptogreen C4	Biotium/Cambridge Bioscience	BT70020	Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis.
Advasep 7	Biotium/Cambridge Bioscience	BT70029	A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence.
Retiga Exi Fast 1394	Qimaging		Monochrome, cooled CCD camera - basic model
Volocity 3D Image Analysis Software	Perkin Elmer	Volocity 6.3	Image capture and analysis software.