Kombinierte Aufnahme von Mechanisch Stimulated Afferent Output und Nervenendigung Kennzeichnung Maus Haarfollikel Lanceolate Endings

Abstract

Eine neuartige Dissektion und Aufzeichnungstechnik wird zur Überwachung afferenten Brennens durch mechanische Verschiebung der Haare in der Maus Ohrmuschel evozierten beschrieben. Die Technik ist sehr kostengünstig und einfach mit Materialien, die üblicherweise in den meisten Elektro Laboratorien oder leicht gekauft fand geführt. Die Präparation ist einfach und schnell, mit der mechanischen durch eine generische elektrokeramischer Wafer durch proprietäre Software gesteuert bereitgestellt Verschiebung. Die gleiche Software auch Aufzeichnungen und analysiert die electroneurogram ausgegeben. Die Aufzeichnung der Aktivität hervorgerufenen Nerven ist über einen kommerziellen Differenzverstärker zu feuerpolierten Standardglas-Mikroelektroden verbunden. Hilfreiche Tipps für die Verbesserung der Qualität der Zubereitung, die Stimulation und die Aufnahmebedingungen gegeben Aufnahmequalität zu optimieren. Das System eignet sich zur Bestimmung der elektrophysiologischen und optischen Eigenschaften von lanceolate Anschlüsse der Palisadendigungen der Haarfollikel sowie dieErgebnisse aus ihrer pharmakologischen und / oder genetische Manipulation. Ein Beispiel für die Kombination von elektrischen Aufzeichnung mit mechanischer Stimulation und Markierung mit einem Styrylpyridinium- Vitalfarbstoff gegeben.

Introduction

Die lanceolate Terminals sensorischer Axone Innervation Haarfollikeln bei Säugetieren Palisaden bilden um das Haar-Welle Epithel. Ihr Zweck ist, mechanische Verschiebung der Haare zu erkennen, sie umgeben. Sie sind eine Mischung aus schnell und langsam Endungen Anpassung, die überwiegend kurze Ausbrüche von Aktivität in Reaktion auf Haar Bewegung erzeugen. Aktivität aufhört sehr schnell, wenn die Bewegung stoppt, sogar in Gegenwart von fort Verschiebung. Hier beschreiben wir die Entwicklung dieses murine Ohrmuschel Modell für Korrelat Studien von Struktur und Funktion in lanceolate Terminals. Die Ohrmuschel hat viele vorteilhafte Eigenschaften für diese Endungen zu studieren. Erstens ist die Ohrmuschel im wesentlichen zwei Schichten der Haut angelagert back-to-back, mit wenig anderes Gewebe zwischen den Zugang zu den Follikeln und die Anschlüsse zu stören. Die Haut ist sehr dünn und leicht durch minimale Mengen an harten Bindegewebe seziert. Die Innervation ist leicht zugänglich und erkennbar. Während Haar follicles vorhanden sind, sind sie relativ dünn verteilt, mechanisch die Stimulation der einzelne oder kleine Gruppen von Follikeln zu erleichtern. Die dünne darunter liegende Hautschicht ergibt eine gute Zugänglichkeit zu den Nervenendigungen mit pharmakologischen Medikamenten und Farbstoffen. Das macht sie besonders geeignet für die Bildgebung Studien unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie. Die Bildgebung kann entweder in lebenden Terminals sein, oder nach der Fixierung und weitere histologische Verarbeitung.

Die Antworten von mechanosensorischen Neuronen Innervation Haarfollikeln traditionell vibrissae ^1,2 und in geringerem Ausmaß, in isolierten Hautpräparate ^3,4 in Nagetieren untersucht worden. Diese haben uns gelehrt, viel über die allgemeinen Grundsätze der mechanosensorischen Physiologie in den Nervenendigungen in den Haarschaft umgibt. Die vibrissal Vorbereitung ermöglicht exquisite Kontrolle über die Bewegung eines einzelnen Haarfollikel. Jedoch kann es schwierig sein, die Ausgabe aufgrund seiner Komplexität zu entschlüsseln, wie vibrissalFollikel enthalten mindestens 8 verschiedene Arten von anatomisch verschiedene mechanosensorischen Ende ⁵ und die Abstimmung dieser morphologischen Typen auf bestimmte elektrophysiologischen Reaktionen ist nach wie vor umstritten. Die Mäusehaut / saphenus Vorbereitung wird am häufigsten in seiner enthaarte Zustand verwendet Antworten Berührung und Schmerz zu untersuchen. Die Innervation der Haarfollikel in einem solchen Präparat ist weniger komplex , aber die Dichte der Haarfollikel, sowie das Vorhandensein von drei verschiedenen Follikel - Typen (Wache, Ahle / auchene und Zick - Zack - Haare) in solcher Nähe ^6, bedeutet , dass die spezifischen Antworten des Studiums ein einzelner Follikel oder einzelne Art von Ende herausfordernd wieder. Darüber hinaus beinhaltet diese Vorbereitung eine komplexe Präparation. Schließlich Zubereitungen in sowohl vibrissal und andere Haut, ist es schwierig , die Enden , während der ex vivo Präparationen noch am Leben sind beteiligt zu visualisieren. Somit wird Gewebe Schnitte auch in GFP-exprimierenden Mauslinien erforderlich. Alternavely erfordert es weitere histologische / immunologischen Verarbeitung, wie die Fixierung und / oder Antikörper-Inkubation für Immunofluoreszenz.

Wir haben daher die Ohrmuschel Vorbereitung und dem verwendeten elektrischen Aufnahmen von einer eingeschränkten Population von Haarfollikel Afferenzen zu machen und zeigen, dass Membran Radfahren in diesen lanceolate Endungen auftritt, belegt durch die Aufnahme von Styrylpyridinium- Farbstoffe. Schließlich haben wir gezeigt, dass der Farbstoff nicht mit mechanischen Empfindlichkeit nicht beeinträchtigt, was anzeigt, es nicht die Mechanotransduktion Kanäle nicht blockiert. Die Ergebnisse der einfachen Stimulation und Analyseprotokolle dargestellt.

Protocol

Maus post mortem Gewebe Ernte müssen ethische Methoden für diese Anwendung freigegeben. Im Vereinigten Königreich ist Zervikaldislokation eine staatlich anerkannte Methode für erwachsene Mäuse (börsennotiertes Zeitplan 1 Verfahren in Großbritannien Tiere (Scientific Procedures) Act 1986 und der europäischen Richtlinie 2010/63 / EU). Diese Gesetzgebung wird vor Ort an der University of Aberdeen durch den Tierschutz und ethische Review Board durchgesetzt, die alle Verfahren in dem folgenden Protokoll verwendet, überprüft und genehmigt.

Hinweis: Es wurden in der Forschung in Banken meldeten Diese Methoden et al ^7.

1. Vorbereiten Ohren für Elektrophysiologie

1. Vor Dissektion, bereiten Sie einen Standard physiologischer Kochsalzlösung, wie Liley der (1956) und sättigen sie mit 90% O _2/5% CO _2. Liley der Kochsalzlösung (mM) besteht aus: NaHCO ₃ (12), KCl (4), KH ₂ PO ₄ (1), NaCl (138,8), MgCl ₂ (1), CaCl ₂ (2) und Glucose(11).
2. Menschlich eine erwachsene Maus einschläfern, ohne den Schädel in der Nähe der Ohren zu beschädigen. Hier verwenden wir C57 / Bl6J und MF1-Mäuse aber jede Standard-Labormausstamm verwendet werden kann. Idealerweise Mäuse verwenden, die <25 g sind, wenn elektrische Aufnahme mit Styrylfarbstoffs Kennzeichnung kombiniert werden soll, wie die Kennzeichnung in größeren Mäuse weniger zuverlässig ist, oft nur in eingeschränkten umschriebenen Bereichen gefunden werden.
3. Entfernen Sie den Kopf mit großen Schere oder Knochenschere.
4. Setzen Sie den Kopf dorsalen Seite nach oben in vergast Liley die in einem breiten Boden Sezieren Schale (50 cm ist in der Regel bequem) auf der Bühne eines Stereo-Präpariermikroskop. Regelmäßig (~ 10 min) Schleuse oder den Kopf mit vergast Salz versenken.
5. Sorgfältig einzuschneiden und die Haut an der Basis des äußeren Ohres (Ohrmuschel) mit Springbow Schere und # 3 Zange trennen, den Knorpel des äußeren Gehörgangs (EAM) ausgesetzt wird. Identifizieren Sie die Zweige des Trigeminus (mandibularis, MDV) und große Ohrmuschel Nerven, wie sie f entstehenrom der Schädel in der Spalte des Kiefergelenks und Projekt durch den Knorpel Basis der konkaven zu innervate (anterior) und konvexen (posterior) Aspekte der Ohrmuschel Haut sind.
6. In der Nähe des Schädels, zu identifizieren, wo die beiden Nervenäste Ausfahrt in die Nut zwischen der Backe und dem Mastoid Prozess. Maximieren ihrer Länge durch sanft die Ohrmuschel vom Schädel ziehen und die Nerven so nah an den Schädel wie möglich schneiden.
7. Entfernen Sie die Ohrmuschel aus dem Kopf mit Springbow Schere so, daß die distalen Stümpfe der geteilten Nerven und Minimierung der Menge an dicht pelage an der Basis des Ohres zu vermeiden, die entfernt wird.
8. Übertragen Sie die Ohrmuschel mit einem flexiblen Silikonkautschuk (PDMS) -lined Schüssel gefüllt mit begasten Liley der Flüssigkeit. Öffnen Sie die EAM, indem sie es an seiner schmalsten Stelle (anterior-die meisten) Punkt geteilt wird. Flatten die Ohrmuschel, vordere Haut (konkave) Seite nach unten und Pin an die PDMS sorgfältig an den Rändern mit ~ 6-8 in regelmäßigen Abständen sehr fein (~ 0,2 mm Durchmesser) Insektenstifte.
9. Remove die Haut des hinteren Teils der Ohrmuschel vollständig und teilweise die Ohrmuschel Knorpel durch stumpfe Dissektion mit # 3 Pinzette zu entfernen, um die vordere Haut gewährleisten intakt gelassen wird.
10. Mit der Spitze eines feinen Insektenstift gegriffen mit einem # 3 Pinzette vorsichtig die Zweige erstrecken (in der Regel 2) des MDV, die posterior zwischen der Haut und EAM Knorpeln entstehen. Pin diese an die PDMS mit den besten möglichen Insektenstifte, spießte das Bindegewebe angrenzenden ihren Schnittenden und nicht die Nervenstämme selbst.
11. Entfernen Sie die meisten der umgebenden Bindegewebe um sie herum, sorgfältig Schaden von überschüssigem vermeiden Ziehen oder Schneiden.

2. Die elektrophysiologischen Aufzeichnung einrichten

1. Pin der Ohrmuschel Haut an die PDMS-lined Basis eines Aufnahmekammer mit feinen Insektenstifte an den Rändern (~ 6-8 pro Ohr), legen Sie die gereinigten Nerven an der Basis des Ohres in der Nähe von zwei Saugelektroden - eine für die Aufnahme (zu nehmen Sie den Nerv) und die otihr eine indifferente Elektrode (dem Neutralsignal an einen Differenzverstärker zu schaffen, siehe ^7).
2. Für die Aufzeichnungselektrode, passen sorgfältig die Blende und die Innendurchmesser der Öffnung auf die kombinierte Dicke der beiden Nerven, so passen sie so eng wie möglich und für so große Länge wie möglich.
3. Zeichne die Nerven in die Elektrode durch vorsichtiges Absaugen aus einer 2 ml-Spritze mit dem anderen Ende befestigt ist mit Silikongummischlauch. Achten Sie darauf, die Nerven sind gerade, nicht gefaltet oder verdoppelt.
4. Entwickeln Sie einen hohen elektrischen Widerstand / Impedanz fit durch stärkere Absaugung mit Bindegewebe oder ein Fettgewebe zu ziehen einen Stecker zu bilden, die dicht verschließt die Öffnung um den Nerv.
5. Füllen Sie das andere (indifferent) Elektrode mit Kochsalzlösung durch Absaugen, falls erforderlich (es durch Kapillarwirkung füllen kann).
6. Platzieren Sie identische Aufnahme Drähte (Silber oder Platin) in die Innenbohrung der Aufzeichnungselektroden, die Kochsalzlösung in Kontakt zu treten und den Nerv(Aufnahme) oder verengt, feuerpolierte Ende (indifferent) der Elektrode. Jede Elektrode ist gelötet individuell an verschiedene Kerne von zwei-adriges geschirmtes Kabel. Stellen Sie das Bad (Masse) Elektrode (Ag / AgCl-Pellet) in das Bad und zermalmte es auf den Bildschirm der beiden Core-Kabel an die Aufzeichnungselektroden verbunden.
7. Führen Sie die elektrische Aktivität von den beiden Elektroden in die einzelnen Kanäle eines Differenzverstärkers, Filter (Bandgeben 0,2-2 kHz) und Blick auf dem Bildschirm eines Oszilloskops. Überprüfen Sie, dass der Kanal A (Aufnahme) und Kanal B (indifferent) die elektrischen Rauschpegel ähnlich aussehen. In diesem Stadium kann es nicht möglich sein, die normalen spontanen Aktionspotentiale in Kanal A zu sehen, bevor die beiden Elektroden ausgeglichen sind.
8. REDRESS keine Unterschiede in Hintergrundrauschen zwischen den Elektroden durch die Impedanz der Aufnahme (Kanal A) zu erhöhen oder indifferent (Kanal B) Elektroden. Tun Sie dies durch das Saugen areolar (adipöse) Bindegewebe weiter in jeder Elektrode und /oder die Anwendung von mehr Saugkraft auf die 50-ml-Spritze.
   1. Sobald "ausgewogen" auf diese Weise, wechseln Sie wieder auf Differential (AB) Aufnahme und suchen spontane Aktionspotentiale (APs) in der Spur oder wenn Haare am Rand der Ohrmuschel zu streicheln. Wenn keine Aktivität (spiking) gesehen wird, überprüfen Sie nochmals auf festen Sitz der Nerv in der Aufzeichnungselektrode und die areolar Bindegewebe in der indifferenten Elektrode - in der Regel die engere (höherer Widerstand) der Dichtung und der mehr gleich der Impedanz in den beiden Elektroden, desto besser. Mit der Praxis wird dies eine gute Qualität zu erreichen (> 2: 1) Signal: Rausch-Verhältnis.
9. Notieren Sie sich die electroneurogram über eine Labor-Schnittstelle und Elektrophysiologie-Software auf einem Computer ausgeführt wird. Ein Audioausgang spiking ist sehr nützlich und kann durch Einspeisen des Neurogramms über einen Audio-Verstärker und zugehörigen Audio-Lautsprecher erreicht werden. Stellen Sie die Schwelle gerade über dem Grundrauschen ist (identifiziert durch die Abwesenheit von white-noise 'Zischen').
10. Zur Erhöhung der Droge oder fluoreszierende Styrylfarbstoffs Zugang zu den lanceolate Endungen sorgfältig schälen die Unterhautfettschicht in der Nähe der Ohrmuschel Rand entfernt, ein Fenster von ~ 5 mm x 5 mm Aussetzen der Dermis und der Basis der Follikel (1A Öffnung, B ).
11. Pin zurück eine Falte von ~ 1 mm von Fettgewebe geräumten Ohrhaut an den vorderen Rand (auf der Ebene des Fensters nur produziert, wo zutreffend), eine klare Kochsalzlösung gefüllte Lücke zwischen den apposed Hautschichten zu verlassen. Sanft Hub entlang der gefalteten Kante die Haare mit einem Stift oder geerdeten feinen Pinzette vorsteht, ohne die Haut zu berühren, den Bereich der maximalen AP Ausgang auf dem Oszilloskop und dem unverwechselbaren "klickt" und "Pops" in den Audio-Ausgang zu finden.

3. Aufnahme Stimulus-evozierte Aktionspotentiale

1. Positionieren Sie die mechanische Stimulationssonde - eine feuerpolierte 10 cm Borosilikat-Glas-Mikroelektrode zu einem cerami befestigtc piezoelektrische Betätigungseinrichtung - so ist die Bewegung parallel zu der Hautfalte. Setzen Sie die Spitze etwa 0,5-1 mm von Hautfalte, so dass es die Haare berührt aber nicht die Haut. Stellen Sie sicher, wirksam Stimulation durch langsam die Sondenspitze bewegen manuell die Haare abzulenken und zu beobachten / hören zum Spicken.
2. Verwenden Sie die Software mechanische Stimulation von 1-3 Haare zu fahren (zB 3 Sekunden bei 5 Hz Sinusoide, alle 10 sec. Sonde Verschiebung 200-500 & mgr; m), und notieren Sie die Stimulation hervorgerufenen Reaktionen in den Nerven.
3. Geben Sie mehrere identische mechanische Stimulation Züge in 10 Sekunden-Intervallen. Optimieren Sie die Sondenposition für die Wiederholbarkeit, dann Frequenz der Stimulation reduzieren gemäß Versuchsprotokoll (zB Tropfenwiederholungsrate von 10 s bis 30 s).
4. Verwenden Sie die Software AP-ähnliche Aktivität zB unter Verwendung einer einfachen Schwelle auf ~ 2x Hochfrequenzrauschamplitude und ~ 25% der größten APs zu unterscheiden.
5. Zählen Sie die APs Überschreiten der Schwelle als"Ereignisse", Quantifizieren der Frequenz und die Eigenschaften der hergestellten APs.

4. Aufnahme Stimulus-evozierte Firing Kombination mit N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (Dibutylamino) styryl) Pyridinium -dibromid Labeling

1. Um die Auswirkungen der Styrylfarbstoffe auf Stimulus-evozierte zuführenden Brennen und Klemmenbeschriftung, fügen Sie die entsprechende Konzentration eines Styrylfarbstoffs der Wahl, auf die Badelösung prüfen und mit der elektrischen Aufzeichnung fortzusetzen.
2. Nach der Belichtungszeit erforderlich (in der Regel mindestens 30 min), bereiten Sie die Vorbereitung auf die Follikel sehen. Klappen Sie die Hautlappen durch die Haltestifte zu entfernen, und setzen die gelöscht dermalen Bereich der Klemmenbeschriftung zu offenbaren.
3. Wegspülen externen Farbstoff mit farbstofffreie Kochsalzlösung, so dass 3 vollständige Änderungen der Salzlösung.
4. Inkubieren in der letzten Änderung des vergast farbstofffreie Kochsalzlösung für 10 bis 15 min die hartnäckigsten Farbstoff Kontamination zu ermöglichen, von exponierten / externen Membranen auszulaugen.
5. Entfernen Sie nicht internalisierte Farbstoff noch auf Membranen mit einem Maskierungsmittel (sulfobutylated Beta-Cyclodextrin, 1 mM, 5 min) in Kochsalzlösung.
6. Übertragen Sie die Aufnahmekammer auf die Bühne eines aufrechten Epifluoreszenzmikroskope und greifen in die Kammer mit der Bühne / Dia-Bewegungsmechanismus.
7. Illuminate die Vorbereitung mit Anregungslicht geeignet für den Styrylfarbstoffs. Verwenden Sie ein 10X oder 25X Fluoreszenzmikroskopobjektiv , um die Follikel Kennzeichnung (Abbildung 1) zu beobachten.

Representative Results

Die elektroAufnahmeAnordnung, mit dem subkutanem Fettgewebe die Haarfollikel freizulegen, ist in 1A gezeigt. Ein Teil dieses freiliegenden Bereich mit einer höheren Vergrößerung in Hellfeldbeleuchtung in 1B gezeigt. die Ohrmuschel Folding-Marge in diesem Bereich auf sich selbst nach oben und zurück macht die Epidermis. Dies positioniert die Haare am Rand des Falzes horizontal, in einer idealen Situation für mechanische Stimulation mit einem stumpfen Sonde (nicht gezeigt) vorstehen. 1C zeigt , dass nach der Farbstoff Belichtung und der Rand in die aufgeklappte Position zurückkehrt wiederum die Follikel stimuliert in dieser Position sind mit einem Styryl pyridinium-Farbstoff markiert. Elektron von Präparaten zeigen in der Regel laufenden AP - Aktivität auch in Abwesenheit von auferlegte Bewegung der Glasfasersonde, einschließlich APs der größten Größe (2A (Abbildung 2Bi-iii)). Das ist ziemlich wiederholbar, obwohl die Phase der Wellenform , bei der die Antworten gesperrt sind nach ihrer Position abhängt, das heißt , an welcher Stelle in der Bewegung der schwingenden Sonde kontaktiert er das Haar. Eine einfache Schwellendetektion (horizontale Linie , die die Neurogramms Spuren in einer Kreuzung (i-iii)) wurde für diese Analyse verwendet. Allerdings kann die Aufnahme-Software-Funktionalität oft in eine anspruchsvollere Art und Weise verwendet werden, umdiskriminieren Merkmale von Spike Größe und Form. Dies kann dann Antworten von bestimmten Afferenzen isolieren, indem diese Eigenschaften Pseudo-Single-Unit-Aufzeichnung Analyse durchgeführt werden zu können.

Abb . 1: Elektrophysiologische Aufnahmeanordnung und N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (Dibutylamino) styryl) Pyridinium Dibromid Labeling des Haarfollikels Afferent Lanceolate Endungen (A) Eine Ohrmuschel Vorbereitung für eine elektrophysiologische Versuchsaufbau zeigt die Ohrmuschel Orientierung, die Lage der Nerven, die Aufzeichnungselektroden und der belichtete Bereich des Follikel Innervation nach Entfernen Fettgewebe. (B) Mehrere Haarfollikel sind in Hellfeld - Beleuchtung im Bereich der darüberliegenden Fettgewebe bis in die Dermis gelöscht. Die dunkle, in der Regel zweilappig, Formen sind Talgdrüsen. ( 7, mit freundlicher Genehmigung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2: (A) Stimulus-evozierte Aktivität von der Maus Pinna aufgezeichnet. (Ai-iii) Beispiele, entnommen aus drei verschiedenen Experimenten, der Tätigkeit von kontinuierlichen Neurogramme von Ohrmuschel in Standard Liley der Salzlösung. Jeder Datensatz zeigt einen 5 sec Schnitt etwa 5 Minuten nach dem Start der Aufzeichnung, einschließlich einer 3 Sekunden Dauer von Sinus Verschiebung alsMall Anzahl von Haarwellen. Die mechanische Stimulation wurde alle 30 Sekunden während des gesamten kontinuierlichen Aufzeichnung wiederholt, die in der Regel für 1-2 Stunden dauerte. Benutzerdefinierte Skriptdateien markiert einzelne Ereignisse, die eine Schwelle durch die horizontalen Cursor (Spikes), sowie den Beginn eines jeden sinusförmigen Zyklus (Periode) eingestellt gekreuzt. (AIV) Das Befehlssignal für Sinus Verschiebung. (B) Analyse von Stimulus-evozierte Schmettern Aktivität. (Bi-iii) Zyklus Histogramme in 3 ° Bins aus den Neurogramms Proben (Ai-iii) jeweils konstruiert, die Antworten von mutmaßlichen lanceolate Endungen auf mechanische Stimulation von 5 Hz Sinus Verschiebung von Haarwellen durch eine Glassonde zeigt. Beachten Sie die markierte Phasenverriegelung, in verschiedenen Phasen des Zyklus, in Abhängigkeit von ihrer Position relativ zu der Ausgangsposition der mechanischen Sonde. (Biv) Normalized Sonde Verschiebung Sinuskurve; die tatsächliche Amplitude betrug ungefähr 100. 1, m Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Hier haben wir eine relativ einfache Herstellung entwickelt, die schnell zerlegt werden kann, hat eine geringe Dichte und Haarfollikel ermöglicht relativ selektive mechanische Stimulation einer kleinen Anzahl von Haarfollikeln. Es ist leicht zugänglich für elektrophysiologische Aufzeichnung und Live-Zell - Fluoreszenz - Bildgebung, einschließlich der Antworten Anwendung zu färben die mechanisch stimuliert Haarfollikel, dh Bildgebung Follikel mit definierten elektrophysiologischen Reaktionen sichtbar zu machen. Während wir noch nicht getan haben, scheint dieses System auch leicht zugänglich, um die sensorischen Nerven für einzelne Einheit (Einzel sensorischen Axon) Aufnahme Unterteilung und gezielte GFP-Expression unter Verwendung von für die Visualisierung sensorischer Terminal endet Morphologie.

Wir haben die Ohrhautpräparat ⁷ verwendet die Eigenschaften der Internalisierung und Freisetzung der fluoreszierenden Membran styryl pridinium Farbstoffe zu untersuchen, eine Technik , die ursprünglich zu studieren lokalisierten Vesic entwickeltle Membran - Recycling in der synaptischen Terminals ^8. In Synapsen wird Bildgebung auch bei gleichzeitiger Aufnahme von elektrophysiologischen Reaktionen in identifizierten Terminals ^8,9 leicht kombiniert. Es war in diesen frühen Studien , die wir zum ersten Mal die Farbstoffe auch durch mechanosensorischen Endungen ¹⁰ internalisiert festgestellt wurden. Für sensorische Neuronen in Kultur und in Cochlea Haarzellen, viel von der Markierung durch Styryl pyridinium Farbstoffe scheint Farbstoffe , die durch die mechanosensorischen Kanäle beinhalten, die sie dann ^11,12 blockieren. Die Farbstoffe beschriften dann intrazellulären Membranen, und diese Kennzeichnung ist irreversibel. In Haarzellen jedoch , die nicht mechanisch ^13,14 stimuliert werden und in ausdifferenzierten primären sensorischen Nervenendigungen in situ, beispielsweise Ia Digungen in Muskelspindeln ¹⁵ und in den lanceolate Digungen hier ⁷ scheint Styrylfarbstoff Kennzeichnungs Membran Endozytose zu reflektieren, da die Kennzeichnung ist reversibel und blockiert nicht die mechanosensorischen responses ^7,15,16. Während einige Farbstoff Internalisierung durch Kanal Permeation in diesen Endungen nicht vollständig ausgeschlossen werden kann, ist es von der weiterhin Brennen während der Farbstoff Inkubation und die Reversibilität der Kennzeichnung deutlich , dass die große Mehrheit der Etikettierung in differenzierten Terminals in situ durch Internalisierung mit Recycling - Vesikel Membran. Somit ist diese einfache Technik für den kombinierten elektrischen und optischen Überwachung einer Reihe von mechanosensorischen Terminalfunktionen in ex vivo Gewebe ohne weiteres eingesetzt.

Wie bei den meisten praktischen Techniken, Reproduzierbarkeit Wiederholung und Übung erfordern. Einige der wichtigsten Punkte wert besondere Aufmerksamkeit wird nun beschrieben. Während der Präparation und Aufnahme - Session, maximieren die Lebensfähigkeit des Gewebes und das Überleben durch die Vorbereitung zu gewährleisten ständig mit Kochsalzlösung durchströmt wird , vollständig mit 95% O _2/5% CO ₂ gesättigt. Sicherstellen, dass die Haarfollikel nicht während dieses Prozesses verschoben, which will sensorischen Ende Brennen stimulieren. Verwenden Sie entweder eine kontinuierliche, Laminar-Flow-Perfusions-System oder sorgfältig Blase Gas durch das Organbad mit feinen Schlauch in einem Abstand von der Vorbereitung, oder sorgfältig aktualisieren Lösungen für jeden 20-30 Minuten, zu jeder Zeit die Vorbereitung unter der Salzoberfläche zu halten. Absaug- Aufzeichnungselektroden werden durch Modifizieren scharfe Elektrode Borosilikat-Pipetten normalerweise für die intrazelluläre Aufnahme verwendet gemacht. Zuerst sorgfältig die scharfen Spitzen mit # 3 Zange abbrechen die entsprechende Innendurchmesser zu geben, die Nerven und Feuerpolitur durch sehr kurze (<1 sec) Exposition gegenüber Bunsenbrennerflamme zu passen (siehe 2.4 und 2.5). Um ein gutes Signal-zu-Rausch-Verhältnis erhalten, wenn die Aufzeichnung, ist es wesentlich, dass die elektrische Impedanz (Widerstand) in diesen beiden Elektroden sowohl maximiert und gleich. Tun Sie dies, indem die Aufmerksamkeit auf die folgenden in den beiden Elektroden. Für die Aufzeichnungselektrode, sicherzustellen, der Innendurchmesser eine eng anliegende Passform für die Nerven ist, und die maximale Länge neRVE wird in die Aufzeichnungselektrode gezogen. Versuchen Sie, das Bindegewebe rund um die Nerven zu verwenden, um effektiv die Elektrodenspitze abzudichten. Alternativ oder zusätzlich zeichnen das schmale Ende eines geeigneter Größe, verjüngte Stück Fettgewebe in neben dem Nerv. Dann stecken Sie die Elektrodenspitze durch Anlegen starken Sog für ~ 1 min mit einer 50-ml-Spritze mit dem Rohr befestigt. Für eine gut abgedichtete Spitze wird stark abgesaugt wird einfach die Wirksamkeit des Steckers zu stärken und wird nicht mehr flüssig oder Nerv ziehen in. Um Nervenschäden zu vermeiden, sollten Sie jedoch, dass das Bindegewebe den Nerv von Kompression auf das umgebende Material und EAM Knorpel abzufedern. Die indifferente Elektrode sollte der Widerstand / Impedanz der Aufzeichnungselektrode so dicht wie möglich nachahmen. Dies geschieht durch vorsichtiges Feuerpolieren der Spitze so klein eine Öffnung wie möglich geholfen, ohne es wirklich abdichten. Wenn weitere Widerstand erforderlich ist, dann stecken Sie das Ende der indifferenten Elektrode mit adipose Bindegewebe, wie oben für die Aufzeichnungselektrode beschrieben.

Die elektrokeramischer gibt exquisite Kontrolle über mechanische Verschiebung, sowohl räumlich als auch zeitlich. Achten Sie jedoch darauf elektrische Verbindungen herstellen - hohe Temperaturen zerstören sie, also nicht Lötzinn verwenden. Verwenden Sie mit Metall beladene Epoxy-Kleber, oder verwenden Sie einen Fachsteckmuffe vom Lieferanten empfohlen. Dadurch wird es sowohl fest halten und die elektrische Verbindung herzustellen. Bringen Sie das Glas anregende Sonde an die elektrokeramischer mit Standard-Epoxidharz. Feuer-Politur das Ende eines Standard-10 cm x 1,5 mm Durchmesser Borosilikat Glaskapillarröhren zur Herstellung von Patch oder scharfe Elektroden für elektrophysiologische Aufzeichnung verwendet, um das Risiko von Gewebeschäden zu minimieren. Wenn einzelne Haarfollikel Stimulation erforderlich ist, Feuerpolitur der Spitze ein einzelnes Haar zu passen, und die Sonde mit einem einzigen Haar in die offene Öffnung positionieren. Dies gibt exquisite Kontrolle über ein einzelnes Haar. Für Styryl dye Etikettierung ist es im Allgemeinen gleichmäßigere in Geweben von jungen Tieren. Es ist nicht ganz klar, warum, aber dies spiegelt wahrscheinlich weniger mechanische Trauma und effektiver tiefe Gewebeentnahme aus den jüngeren Geweben. Seien Sie gründlich in die schaumige Schicht ähnelnden expandiertem Polystyrol Entfernen der Haarfollikel Basen liegt. Vermeiden Sie jedoch zu stark sein, da dies die Nervengeflechte Schicht und die damit verbundenen lanceolate Terminals Risiken zu entfernen. Wenn es wenig oder keine elektrische Antwort auf Haarfollikel Bewegung ist, und Styrylfarbstoff Anwendung führt zur überwiegenden Kennzeichnung Talgdrüsen (gelb / weiß), mit ausgeprägtem Eigenfluoreszenz der Basis des Haarschaftes anstatt lanceolate Digungen (orange / gelb), überenthusiastische Clearance hat die darunter liegende Gewebe beschädigt. Schließlich stark ein Farbstoff-Chelatbildner vor Bildgebung verbessert den Bildkontrast und die Qualität der endgültigen Bilder.

Diese Technik könnte in einer Reihe von weiteren Studien nützlich sein. Diese Could umfassen zum Beispiel für den mechanosensorischen Kanal-Screening (n) verantwortlich für die Strecke hervorgerufenen Reaktionen, durch die Zubereitung mit pharmakologischen Liganden selektiv für Kandidatenkanälen Inkubation oder Screening-Mauslinien mit solchen Kanälen genetisch gelöscht. Letzteres könnte mit Fluoreszenz Beurteilung von Änderungen in Terminal Morphologie kombiniert werden durch genetische Manipulation in Mauslinien, zB mit Npy2r gebundenen GFP - Expression ^17. Ein letztes Beispiel kann die Rolle der synaptic-like Vesikel (SLVs) ⁷ in diesen lanceolate Terminals Untersuchung durch die Wirkung von Modulatoren der SLV Umsatz untersucht (Ca, Mg, Latrotoxin, Glutamat - Rezeptor - Liganden) auf Dehnung hervorgerufenen Reaktionen und styryl Farbstoffaufnahme /Freisetzung. Somit eröffnet diese neue Technik eine Reihe von potentiell interessante Wege in der Forschung in den Neurowissenschaften mechansensory auf.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS - Sylgard 184	Dow Corning		Flexible, inert, translucent solid silicone polymer.
No. 3 Dumont forceps	Fine Science Tools	11231-20
Austerlitz Insect pins	Fine Science Tools	26002-10	Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage.
AC Differential Preamplifier	Digitimer	Neurolog NL104A	Amplifying the size of the incoming afferent electroneurogram. Differential recording minimises the extraneous electrical noise and baseline drift.
High/Low-pass Filter	Digitimer	Neurolog NL125	Signal conditioning, by reducing extraneous electrical noise to ensure best signal to noise ratio.
Spike Trigger	Digitimer	Neurolog NL201	Sets the event detector threshold and displays it on the oscilloscope. This shows the action potential detection efficacy.
Audio Amplifier & speakers	Digitimer	Neurolog NL120S	Useful audio monitoring for the presencec of electrical firing of the sensory endings while adjusting the mechanical stimulation preparation down the microscope
Oscilloscope	Digitimer	PM3380A	We use this old model but any standard oscilloscope will suffice.
Piezo electroceramic  wafer	Morgan Electroceramics, Southampton UK	PZT507	Electrophysiology/computer interface
Piezo electroceramic  powersupply	Home made		0-200 V DC output to drive the ceramic wafer displacement, with variable electronic control of output via recording/stimulation software and computer interface. We use Spike2 software and 1401micro computer interface.
Electrophysiology Software	Cambridge Electronic Design (CED)	Spike2 v7	Electrophysiology recording, stimulation and data analysis software
Laboratory interface	Cambridge Electronic Design (CED)	1401 micro	Electrophysiology interface, between the amplifier/filters and the computer. It inputs the electroneurogram and also drives the electroceramic movement.
FM1-43/Synaptogreen C4	Biotium/Cambridge Bioscience	BT70020	Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis.
Advasep 7	Biotium/Cambridge Bioscience	BT70029	A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence.
Retiga Exi Fast 1394	Qimaging		Monochrome, cooled CCD camera - basic model
Volocity 3D Image Analysis Software	Perkin Elmer	Volocity 6.3	Image capture and analysis software.