Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Комбинированная Запись Механически Вынужденное Афферентный Output и нервных окончаний в Labelling мыши фолликула волос ланцетные концовок

doi: 10.3791/53854 Published: May 7, 2016

Abstract

Роман рассечение и записи методика описана для мониторинга афферентной стрельбы вызванной механическим перемещением волос в ушной раковины мыши. Этот метод является очень рентабельным и легко осуществляться с материалами, которые обычно можно найти в большинстве лабораторий электрофизиологии, или легко приобрести. Рассечение является простым и быстрым, с механическим перемещением, представленной общей электрокерамических пластины управляемой собственным программным обеспечением. То же самое программное обеспечение также записывает и анализирует выход электронейрография. Запись при вызванном нервной активности через коммерческий дифференциальный усилитель, подключенный к пожарам отполированы стандартных стеклянных микроэлектродов. Полезные советы приведены для улучшения качества препарата, стимуляции и условий записи, чтобы оптимизировать качество записи. Система пригодна для опробования электрофизиологические и оптические свойства ланцетовидными зажимах палисадная окончаний волосяных фолликулов, а такжерезультаты от их фармакологического и / или генетических манипуляций. Пример сочетания электрической записи с механической стимуляции и маркировки с стирильная пиридиния витальным красителем дается.

Introduction

В ланцетные терминалы сенсорных аксонов, иннервирующих фолликулы волос у млекопитающих образуют частоколы вокруг эпителия волос вала. Их цель состоит в том, чтобы обнаружить механическое перемещение волос они окружают. Они представляют собой смесь быстро и медленно приспосабливаясь окончаний, которые в основном производят короткие всплески активности в ответ на движение волос. Активность прекращается очень быстро, когда движение прекращается, даже при наличии непрерывного перемещения. Здесь мы опишем развитие этой мышиной модели ушной раковины для корреляционных исследований структуры и функции в ланцетными терминалах. Пина имеет много выгодных возможностей для изучения этих окончаний. Во-первых, ушной раковины, по существу, два слоя кожи обратно соединенный к спине, с небольшим количеством другой ткани между ними, чтобы препятствовать доступу к фолликулах и терминалов. Кожа очень тонкая и легко рассекают за счет минимальных количеств жесткой соединительной ткани. Иннервации легко доступен и идентифицировать. В то время как follicl волосэс присутствуют, они сравнительно редко распределены, что способствует стимуляции отдельных или небольших групп фолликулов механическим способом. Тонкий базовый слой кожи дает хороший доступ к нервных окончаний с фармакологическими препаратами и красителями. Это делает их особенно идеально подходит для исследований визуализации с использованием флуоресцентной микроскопии. Формирования изображения может быть либо в живых терминалах, или после фиксации и последующей гистологической обработки.

Реакции механосенсорных нейронов , иннервирующих волосяные фолликулы традиционно изучались в грызуна вибриссами 1,2 и, в меньшей степени, в изолированных препаратах кожи 3,4. Они научили нас много о общих принципах механосенсорных физиологии в нервных окончаний, окружающих стержень волоса. Vibrissal подготовка позволяет изысканный контроль над движением одного волосяного фолликула. Тем не менее, это может быть трудно расшифровать выход из-за его сложности, так как vibrissalфолликулы содержат по меньшей мере 8 различных типов анатомически отчетливым механосенсорных окончание 5 и согласование этих морфологических типов к конкретным электрофизиологических ответов по - прежнему является предметом спора. / Подкожная подготовка нерва кожи мыши чаще всего используется в депилированной состоянии исследовать сенсорные и болевые реакции. Иннервация волосяных фолликулов в таком препарате является менее сложным , но плотность волосяных фолликулов, а также наличие трех различных типов фолликула (сторожевых, шило / auchene и зигзагообразные волоски) в такой непосредственной близости 6, означает изучение конкретных ответы один фолликул или один тип окончание снова бросает вызов. Кроме того, этот препарат включает в себя сложное рассечение. И, наконец, в обоих vibrissal и других кожных препаратах, то трудно представить себе окончаний , участвующих в то время как экс виво препараты все еще ​​живы. Таким образом, требуется ткани секционирования даже в GFP-экспрессирующих мышей линий. AlternatiVely, это требует дальнейшего гистологического / иммунологические обработки, такой как фиксации и / или инкубацией антител для иммунофлуоресценции.

Поэтому мы разработали препарат PINNA и использовали его, чтобы сделать электрические записи с ограниченным населения волосяной фолликул афферентов и показать, что езда на велосипеде мембраны происходит в этих ланцетными окончаний, о чем свидетельствует поглощение стирильная пиридиния красителей. Наконец, мы показали, что краситель не мешает механической чувствительности, что указывает на его не блокирует механотрансдукция каналов. Результаты простых стимуляции и анализа протоколов проиллюстрированы.

Protocol

Мышь после смерти урожая ткани должны использовать утвержденные этические методы. В Великобритании, рак шейки дислокации является правительство одобрило метод для взрослых мышей (перечисленной метод Списка 1 в Великобритании животных (научные процедуры) Закон, 1986 и Европейской директиве 2010/63 / ЕС). Это законодательство соблюдается на местном уровне в Университете Абердина по защите животных и Этического совета по рассмотрению действия, которые рассматриваются и утверждаются все процедуры, используемые в следующем протоколе.

Примечание: Эти методы были использованы в исследовании , опубликованном в банках и др 7.

1. Подготовка Уши для электрофизиологии

  1. Перед тем как рассечение, подготовить стандартный физиологический солевой раствор, такой как Liley ( в 1956) и насыщают его с 90% O 2/5% CO 2. Солевой раствор Liley ( в мМ) состоит из: NaHCO 3 (12), KCl (4), КН 2 РО 4 (1), NaCl (138,8), MgCl 2 (1), CaCl 2 (2) и глюкозы(11).
  2. Гуманно эвтаназии взрослой мыши без повреждения черепа возле ушей. Здесь мы используем C57 / Bl6J и MF1 мышей, но любой стандартный штамм лабораторной мыши можно использовать. В идеале, используют мышей, которые <25 г, если электрический записи должно быть объединено с маркировкой стирильная красителем, как маркировка в более крупных мышей является менее надежным, зачастую отмечаются только в ограниченных районах, очерченными.
  3. Снимите головку с большими ножницами или костными ножницами.
  4. Поместите голову спинной стороне в газовых камерах Liley-х в широком дном рассечение блюдо (50 см, как правило, удобно) на сцене стерео микроскопом рассечение. Регулярно (~ 10 мин) шлюзовой или погрузить голову с газированной физиологическим раствором.
  5. Тщательно надрезать и отделить кожу у основания наружного уха (ушной раковины) с springbow ножницами и # 3 щипцами, подвергая хрящ наружного слухового прохода (EAM). Определение ветвей тройничного (нижнечелюстной деление, MDV) и большие аурикулярных нервы, поскольку они возникают пром череп в расселине нижнечелюстного сустава и проекта через хрящ основания к иннервируют вогнутую (передняя) и выпуклую (задних) аспекты ушной раковины кожи, соответственно.
  6. Рядом с черепом, определить, где две ветви нерва выход в паз между челюстью и сосцевидного отростка. Увеличьте свою длину, осторожно потянув за ушную подальше от черепа и перерезать нервы как можно ближе к черепу, насколько это возможно.
  7. Удалите ушную из головы с springbow ножницами, стараясь избежать дистальных пни разделенных нервов и свести к минимуму количество плотного волосяным покровом у основания уха, который удаляется.
  8. Передача ушную к гибкой силиконовой резины (PDMS) -lined блюдо заполнена жидкостью отравлен газом Liley в. Откройте EAM, разделив его на своей узкой (передне-самый) точки. Свести ушную, передняя кожа (вогнутую) стороной вниз и пин-код к PDMS тщательно по краям с ~ 6-8 равномерно расположенных очень тонких (~ диаметр 0,2 мм) штифтами насекомых.
  9. RemОве кожу задней поверхности ушной раковины полностью и частично удалить ушную хрящей с тупым # 3 щипцами, обеспечивая передняя кожа остается нетронутой.
  10. С точки тонкого пальца насекомых захватив с # 3 пинцетом, осторожно расширяют ветви (обычно 2) MDV, которые возникают кзади между кожей и EAM хрящей. Pin это к PDMS с лучшими возможными штифтами насекомых, пронзая соединительной ткани, примыкающую их обрезанными концами, а не сами нервные стволы.
  11. Удалите большую часть окружающей соединительной ткани вокруг них, тщательно избегая повреждения от избытка потянув или резки.

2. Электрофизиологические записи Настройка

  1. Pin кожи Pinna к PDMS подкладке основанию регистрирующей камере с мелкими насекомых булавками по краям (~ 6-8 за ухом), помещая вымытые нервы у основания уха около двух всасывающих электродов - один для записи (в возьмите нерв) и ВЗей индифферентный электрод (чтобы обеспечить нейтральный сигнал дифференциального усилителя, см 7).
  2. Для записи электрода, тщательно соответствовать апертуру и внутреннего диаметра отверстия к суммарной толщины двух нервов, так что они подходят в качестве прилегать, насколько это возможно и в качестве большой длины, насколько это возможно.
  3. Проводим нервы в электрод с помощью деликатного всасывания из 2 мл шприца, прикрепленной к другому концу с силиконовой резиновой трубки. Убедитесь, что нервы прямые, не сложена или удвоенными.
  4. Разработка высокое электрическое сопротивление подгонку / сопротивления с помощью сильного всасывания рисовать соединительной ткани или жировой ткани, образуя пробку, которая плотно герметизирует отверстие вокруг нерва.
  5. Заполните другую (безразличное) электрод с физиологическим раствором с помощью отсоса, если это необходимо (это может заполнять под действием капиллярных сил).
  6. Установите одинаковые провода записи (серебро или платину) во внутреннее отверстие регистрирующих электродов в контакт с раствором соли и нерв(Запись) или сужен, огневой полировкой конец (безразличными) электрода. Каждый электрод спаян индивидуально к различным ядрам двухжильного экранированного кабеля. Поместите ванну (молотый) электрод (Ag / AgCl гранул) в ванну, и молол на экран двух жильного кабеля, подключенного к регистрирующих электродов.
  7. Подача электрической активности от двух электродов в отдельные каналы дифференциального усилителя, фильтра (полоса обойден 0,2-2 кГц), а также вид на экране осциллографа. Проверьте, что канал А (запись) и канал B (безразличные) электрические уровни шума выглядят одинаково. На этом этапе может оказаться невозможным, чтобы увидеть нормальные спонтанные потенциалы действия в канале А до того, как два электрода сбалансированы.
  8. Решать любые различия в фоновый шум между электродами за счет увеличения сопротивления записи (канал А) или индифферентные (канал B) электродов. Делайте это при всасывании рыхлой (жировая) соединительной ткани дополнительно в любой электрод, и /или применяя большую всасывающую силу на 50 мл шприца.
    1. После того, как "сбалансированные" таким образом, вернуться к дифференциальной записи (AB) и искать спонтанных потенциалов действия (AP) в след или при поглаживании волос на краю ушной раковины. Если никакой активности (пики) не видно, повторно проверить плотное прилегание нерва в записи электрода и рыхлой соединительной ткани в индифферентного электрода - обычно плотнее (более высокое сопротивление) уплотнения и более равномерного сопротивления в двух электроды, тем лучше. С практикой, это позволит добиться хорошего качества (> 2: 1) сигнал: шум.
  9. Запись электронейрография через лабораторный интерфейс и электрофизиологии программного обеспечения, работающего на компьютере. Аудиовыход брать на острие является весьма полезным и может быть достигнуто путем подачи neurogram через аудиоусилителю и связанного с ним аудио динамик. Отрегулируйте порог, чтобы быть чуть выше базового уровня шума (который определяется отсутствием белых пУаз 'шипеть').
  10. Для увеличения лекарственного средства или флуоресцентный доступа стирильная красителя к ланцетными окончаний, тщательно удаляйте подкожного жирового слоя вблизи края ушной раковины, открывая окно ~ 5 мм х 5 мм подвергая дерму и основание фолликулов (рис 1A, B ).
  11. Pin назад складку ~ 1 мм жировой ткани уха очищенную кожу на переднем краю (на уровне окна только производится, если это применимо), оставляя за собой четкий физиологический заполненный разрыв между слоями кожи, соединенной. Нежно поглаживать волосы, выступающие вдоль свернутого края с булавкой или заземленными тонким пинцетом, не касаясь кожи, чтобы найти область максимального выхода AP на осциллографе и отличительные "щелчки" и "хлопков" аудиовыхода.

3. Запись Стимул-вызванных Потенциалы действия

  1. Установить механическое раздражение зонд - пожарное полированные 10 см боросиликатного стекла микроэлектродного прикрепленный к Ceramiс пьезоэлектрическим приводом - так движение параллельно кожной складки. Поместите кончик около 0,5-1 мм от кожи раза, так что она затрагивает волосы, но не на кожу. Проверка эффективной стимуляции, медленно перемещая кончик зонда вручную, чтобы отвести волосы и наблюдать / слушать пики.
  2. Используйте программное обеспечение для управления механической стимуляции 1-3 волосков (например , 3 сек при 5 синусоиды Гц, каждые 10 сек. Зонд Рабочий объем 200-500 мкм), а также записывать стимуляции вызвали ответы на нервы.
  3. Дайте несколько идентичных механических поездов стимуляции с интервалом в 10 сек. Оптимизация положения зонда для воспроизводимости, затем уменьшить частоту стимуляции в соответствии с протоколом эксперимента (например , скорость повтора падение от 10 до 30 секунд).
  4. Используйте программное обеспечение для различения AP-подобной активностью , например , с помощью простой порог , установленный для ~ 2x амплитуда высокочастотного шума и ~ 25% крупнейших точек доступа.
  5. Количество точек доступа, переступив порог, как«события», позволяющих количественно определить частоту и характеристики точек доступа производства.

4. Запись Стимул-вызванных Обжиг В сочетании с N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (дибутиламино) стирилового) пиридини дибромиду этикетирование

  1. Для изучения влияния стириловых красителей на стимулами вызванных афферентных стрельбы и терминала маркировки, добавьте соответствующую концентрацию красителя стирилового выбора, к раствору для купания и продолжить с электрической записью.
  2. После необходимого времени экспозиции (как правило, по меньшей мере, 30 мин), подготовить подготовку к просмотру фолликулы. Открываются кожный лоскут, удалив стопорные штифты, и подвергать очищенную зону кожный выявить терминала маркировки.
  3. Смыть внешний краситель с физиологическим раствором красителей, что делает 3 полных изменений физиологического раствора.
  4. Выдержите в окончательном изменении газированной физиологического раствора красителя бесплатно в течение 10-15 мин, чтобы позволить загрязнение наиболее стойких красителей вымываться из экзогенных / внешних мембран.
  5. Удаления не усвоены оставшиеся на мембранах с комплексообразующего агента (sulfobutylated бета-циклодекстрина, 1 мМ, 5 мин) в физиологическом растворе красителя.
  6. Передача записи камеры на стадии вертикального эпифлуоресцентной микроскопа и включите камеру с механизмом перемещения столика / слайдов.
  7. Осветите препарат с возбуждающего света, подходящей для стирилового красителя. С помощью объектива микроскопа 10х или 25X флуоресценции для наблюдения фолликула маркировки (рис 1).

Representative Results

Электрофизиологические регистрирующее устройство, с подкожный жировой ткани удалена , чтобы подвергнуть волосяные фолликулы, как показано на рисунке 1А. Часть этого экспонированной области показан с большим увеличением в светлопольному освещенности на фиг.1В. Складывание край ушной раковины вверх и назад на себя в этой области выставляет эпидермальный поверхность. Это позиционирует волосы на краю сгиба , чтобы выступать в горизонтальном направлении , в идеальной ситуации для механической стимуляции с помощью тупого зонда (не показана). На фиг.1С показывает , что после контакта с красителем и снова возвращая запас в разложенном положении, вынужденное фолликулы в этой позиции были помечены стирильная пиридиний красителя. Electroneurograms из препаратов , как правило , показывают текущую активность AP даже при отсутствии наложенного движения стекловолокнистой зонда, в том числе точек доступа самого большого размера (фиг.2А (Рисунок 2BI-III)). Это довольно повторяемые, хотя фаза сигнала , при котором ответы запертом зависит от их положения, то есть в какой момент движения вибрационные зонда она контактирует с волос. Простое определение порога (горизонтальная линия пересечения neurogram следы в A (I-III)) был использован для этого анализа. Тем не менее, запись функциональность программного обеспечения часто могут быть использованы в более сложным способом, чтобыразличать особенности размера шипа и формы. Это может затем выделить реакции отдельных афферентных волокон этими характеристиками, чтобы позволить анализ псевдо-одноквартирный записи, которая будет осуществляться.

Рисунок 1
Рисунок 1:. Электрофизиологические Устройство записи и N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (дибутиламино) стирильная) пиридини дибромиду Маркировку фолликула волос Афферентный ланцетные окончаний (A) Пина препарат создан для электрофизиологического эксперимента , показывая ушную ориентация, расположение нервов, регистрирующих электродов и поврежденная площадь фолликулостимулирующего иннервации после удаления жировой ткани. (B) Несколько волосяные фолликулы видны при ярком освещении поля в зоне очищенной от вышележащих жировой ткани вплоть до дермы. Темно, как правило, двулопастные, формы являются сальные железы. ( 7, с разрешения автора . Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: (A) Стимул-вызванной активности записи от мышей Пина. (Ai-III) Примеры, взятые из 3 -х различных экспериментов, активности из непрерывных neurograms из ушных раковин в солевом растворе стандартного Liley в. Каждая запись показывает сечение 5 сек примерно через 5 мин после начала записи, в том числе 3 сек период синусоидального смещения, какторговый центр количество стержней волос. Механическая стимуляция повторялась каждые 30 сек на протяжении непрерывной записи, который обычно длился 1-2 часа. Пользовательские файлы сценариев отмечены отдельные события, которые переступили порог, установленный горизонтальный курсор (шипы), а также начало каждого синусоидальной цикла (периода). (Aiv) Команда сигнал синусоидальной смещения. (В) Анализ Стимул-вызванных подсадки активность. (Bi-III) Цикл гистограмм в 3 ° бункеров построены из образцов neurogram (Ai-III) , соответственно, показывая ответов предполагаемых ланцетными окончаний к механическим раздражением от 5 Гц синусоидальной смещения валов волос стеклянным зондом. Обратите внимание на отмеченные фазовой синхронизации, на разных фазах цикла, в зависимости от их положения относительно начального положения механического датчика. (Biv) Нормированный датчик перемещения синусоиды; фактическая амплитуда составляла приблизительно 1001; м . Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

Здесь мы разработали сравнительно простую препарат, который может быть быстро рассекают, имеет низкую плотность волосяного фолликула и позволяет относительно селективным механической стимуляции небольшого количества волосяных фолликулов. Он легко доступен для электрофизиологические записи и флуоресцентных изображений живых клеток, в том числе ответы на окрашивают приложение для визуализации механически стимулированных волосяные фолликулы, то есть фолликулы визуализации с определенными электрофизиологических ответов. В то время как мы еще не сделали этого, эта система также кажется, легко поддается подразделяя сенсорную нерва для одной единицы (одного сенсорной аксонов) записи и использованием целевых GFP-выражения для визуализации сенсорной морфологии терминала завершено.

Мы использовали препарат уха кожи для того чтобы исследовать характеристики интернализации и высвобождения флуоресцентного мембраны стириловых pridinium красителей 7, метод , первоначально разработанный для изучения локализованную ВесичМембрана утилизацию ле в синаптических окончаний 8. В синапсах, визуализация также легко сочетается с одновременной электрофизиологические записи ответов в определенных терминалов 8,9. Именно в этих ранних исследованиях , которые мы впервые отметили красители были усвоены механосенсорных окончаний 10. Для сенсорных нейронов в культуре , так и в волосковых клетках улитки, большая часть маркировки с помощью стирильная пиридиния красителей , кажется, вовлекает красители , проходящие через механосенсорных каналы, которые они затем блокируют 11,12. Красители затем маркировать внутриклеточных мембран, и эта маркировка является необратимым. Тем не менее, в клетках волос, которые механически не стимулируется 13,14 и в полностью дифференцированных первичных сенсорных нервных окончаний на месте, таких как Ia окончаний мышечных веретен 15, а в ланцетными окончаний здесь 7, маркировка стирильная краситель , кажется, отражает мембранный эндоцитоз, так как маркировка является обратимым и не блокирует механосенсорных Резponses 7,15,16. Хотя некоторые интернализации красителя канала просачивания в этих окончаний не может быть исключена полностью, как видно из дальнейшего обжига во время инкубации с красителем и обратимости маркировки , что подавляющее большинство маркировки в дифференцированных терминалов на месте является интернализации с пузырьком рециркуляции мембрана. Таким образом, этот простой метод легко использовать для комбинированного электрического и оптического мониторинга диапазона механосенсорных терминальных функций в естественных условиях бывших тканей.

Как и в большинстве практических методов, воспроизводимости потребует повторения и практики. Некоторые из ключевых моментов стоит особое внимание теперь будет описано. На протяжении рассечение и записи сессии, максимально жизнеспособности тканей и выживания за счет обеспечения подготовки постоянно озарен физиологическим раствором полностью насыщенной 95% O 2/5% CO 2. Убедитесь, что волосяные фолликулы не смещаются во время этого процесса, ВГIch будет стимулировать сенсорную окончание стрельбы. Либо использовать непрерывную систему ламинарного потока перфузионного или тщательно пузырьковой газа через ванночку с тонкой трубкой на расстоянии от препарата, или тщательно обновлять каждые 20-30 Solutions мин, поддерживая препарат ниже соляного поверхности во все времена. записи всасывания электроды изготовлены путем модификации острых электродов боросиликатного пипеток, обычно используемых для внутриклеточной регистрации. Во-первых, тщательно прекращаться острые кончики с # 3 щипцами, чтобы дать соответствующий внутренний диаметр, чтобы соответствовать нервы и огневую полировку очень короткой (<1 сек) воздействия пламени горелки Бунзена (см 2.4 и 2.5). Для того, чтобы получить хорошее отношение сигнал-шум при записи, то важно, чтобы электрическое сопротивление (сопротивление) в этих двух электродов и максимальна и равна. Сделайте это, обращая внимание на следующее в двух электродов. Для записи электрода, обеспечивает внутренний диаметр подогнаны под нерва, а максимальная длина пеRVE втягивается в записи электрода. Попробуйте использовать соединительную ткань, окружающую нерв, чтобы эффективно герметизировать кончик электрода. В качестве альтернативы, или в дополнение, рисовать узкий конец подходящего размера, сужающейся части жировой ткани в вдоль нерва. Затем подключаем кончик электрода с применением сильного всасывания в течение ~ 1 мин с 50 мл шприца, прикрепленной к трубке. Для хорошо уплотненной наконечника, применяя сильное всасывание будет просто повысить эффективность пробки и не втягивать больше жидкости или нерва. Во избежание повреждения нерва, однако, убедитесь, что соединительная ткань смягчаются нерва от сжатия на окружающем материале и EAM хряща. Индифферентный электрод должен имитировать сопротивление / импеданс электрода записи настолько близко, насколько это возможно. Этому способствует тщательно Спиртовая кончик к как малые апертуры, как это возможно без фактического герметизации его. Если дальнейшее сопротивление необходимо, а затем вставьте конец индифферентного электрода с ADIPOС.Е. соединительной ткани, как было описано выше для записи электрода.

Электрокерамических дает изысканный контроль над механическим перемещением, как в пространстве и во времени. Тем не менее, заботиться делая электрические соединения - высокие температуры уничтожают их, так что не используйте горячую припой. Используйте металлическую загруженным эпоксидный клей, или использовать специализированную насаживаемая розетку, рекомендованный поставщиком. Это и надежно удерживают и установить электрическое соединение. Прикрепите стекло стимулирующее зонд к электрокерамических со стандартной эпоксидной смолой. Противопожарные польский конец стандартного 10 см х 1,5 мм боросиликатного диаметр стеклянной капиллярной трубки, используемый для изготовления патч или острые электроды для электрофизиологические записи, чтобы свести к минимуму риск повреждения тканей. Если требуется один волос стимуляции фолликул, пожарно-польский кончик, чтобы соответствовать один волос, и поместите зонд с одним волос внутри открытой диафрагме. Это дает изысканный контроль над одной волос. Для стирилового Dyе маркировки, то, как правило, более однородны в тканях от молодых животных. Не совсем понятно, почему, но это, вероятно, отражает меньшую механическую травму и более эффективное удаление глубоких тканей из молодых тканей. Будьте внимательны при удалении пенистый слой напоминающее пенополистирола, залегающего волосяных фолликулов основания. Тем не менее, во избежание слишком энергично, так как это риск удаления нервных сплетений слоя и связанных с ними ланцетовидные терминалы. Если есть мало или нет электрический ответ на движение волосяного фолликула, а также применение стирильная красителя приводит к преимущественному маркировке сальных желез (желтый / белый), с отчетливым автофлюоресценции основания стержня волоса, а не ланцетными окончаний (оранжевый / желтый), чрезмерно восторженный зазор повредил прилежащие ткани. И, наконец, с помощью агента красителя хелаты до обработки изображений значительно повышает контрастность изображения и качество конечных изображений.

Этот метод может быть полезен в ряде дальнейших исследований. Это сотрудничествоULD включают в себя, например, скрининг на механосенсорных канала (ов), ответственного за натяжных вызвали ответы, путем инкубирования препарат с фармакологическими лигандами селективными для кандидатов каналов или скрининга линий мышей с такими каналами генетически удалены. Последнее может быть в сочетании с оценкой флуоресценции каких - либо изменений в терминальной морфологии из - за генетических манипуляций в линиях мыши, например , с помощью Npy2r-связанного выражения 17 GFP. Последним примером может быть изучение роли синаптических типа везикул (КРН) 7 в этих ланцетными терминалов путем изучения влияния модуляторов оборота SLV (Ca, Mg, latrotoxin, лиганды рецептора глутамата) на натяжных вызвали ответы и поглощения стирильная красителя /выпуск. Таким образом, эта новая технология открывает целый ряд потенциально интересных направлений исследований в mechansensory нейробиологии.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS - Sylgard 184 Dow Corning Flexible, inert, translucent solid silicone polymer.
No. 3 Dumont forceps Fine Science Tools 11231-20
Austerlitz Insect pins Fine Science Tools 26002-10 Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage.
AC Differential Preamplifier Digitimer Neurolog NL104A Amplifying the size of the incoming afferent electroneurogram. Differential recording minimises the extraneous electrical noise and baseline drift. 
High/Low-pass Filter Digitimer Neurolog NL125 Signal conditioning, by reducing extraneous electrical noise to ensure best signal to noise ratio.
Spike Trigger Digitimer Neurolog NL201 Sets the event detector threshold and displays it on the oscilloscope. This shows the action potential detection efficacy. 
Audio Amplifier & speakers Digitimer Neurolog NL120S Useful audio monitoring for the presencec of electrical firing of the sensory endings while adjusting the mechanical stimulation preparation down the microscope 
Oscilloscope Digitimer PM3380A We use this old model but any standard oscilloscope will suffice.
Piezo electroceramic  wafer Morgan Electroceramics, Southampton UK PZT507 Electrophysiology/computer interface
Piezo electroceramic  powersupply Home made 0-200 V DC output to drive the ceramic wafer displacement, with variable electronic control of output via recording/stimulation software and computer interface. We use Spike2 software and 1401micro computer interface.
Electrophysiology Software Cambridge Electronic Design (CED) Spike2 v7 Electrophysiology recording, stimulation and data analysis software
Laboratory interface Cambridge Electronic Design (CED) 1401 micro Electrophysiology interface, between the amplifier/filters and the computer. It inputs the electroneurogram and also drives the electroceramic movement.
FM1-43/Synaptogreen C4 Biotium/Cambridge Bioscience BT70020 Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis.
Advasep 7 Biotium/Cambridge Bioscience BT70029 A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence.
Retiga Exi Fast 1394 Qimaging Monochrome, cooled CCD camera - basic model
Volocity 3D Image Analysis Software Perkin Elmer Volocity 6.3 Image capture and analysis software.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cahusac, P. M. Effects of transient receptor potential (TRP) channel agonists and antagonists on slowly adapting type II mechanoreceptors in the rat sinus hair follicle. J. Peripher. Nerv. Syst. 14, (4), 300-309 (2009).
  2. Fagan, B. M., Cahusac, P. M. Evidence for glutamate receptor mediated transmission at mechanoreceptors in the skin. Neuroreport. 12, 341-347 (2001).
  3. Price, M. P., et al. The mammalian sodium channel BNC1 is required for normal touch sensation. Nature. 407, (6807), 1007-1011 (2000).
  4. Ranade, S. S., et al. Piezo2 is the major transducer of mechanical forces for touch sensation in mice. Nature. 516, (7529), 121-125 (2014).
  5. Ebara, S., Kumamoto, K., Matsuura, T., Mazurkiewicz, J. E., Rice, F. L. Similarities and differences in the innervation of mystacial vibrissal follicle-sinus complexes in the rat and cat: a confocal microscopic study. J. Comp. Neurol. 449, (2), 103-119 (2002).
  6. Li, L., Ginty, D. D. The structure and organization of lanceolate mechanosensory complexes at mouse hair follicles. eLife. 3, 01901 (2014).
  7. Banks, R. W., et al. Glutamatergic modulation of synaptic-like vesicle recycling in mechanosensory lanceolate nerve terminals of mammalian hair follicles. J. Physiol. 591, (10), 2523-2540 (2013).
  8. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, (5041), 200-203 (1992).
  9. Reid, B., Slater, C. R., Bewick, G. S. Synaptic vesicle dynamics in rat fast and slow motor nerve terminals. J. Neurosci. 19, 2511-2521 (1999).
  10. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J. Neurosci. 12, 363-375 (1992).
  11. Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. J. Neurosci. 23, 4054-4065 (2003).
  12. Drew, L. J., Wood, J. N. FM1-43 is a permeant blocker of mechanosensitive ion channels in sensory neurons and inhibits behavioural responses to mechanical stimuli. Molecular Pain. 3, (1), 1 (2007).
  13. Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22, 3939-3952 (2002).
  14. Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. Apical endocytosis in outer hair cells of the mammalian cochlea. Eur. J. Neurosci. 20, (1), 41-50 (2004).
  15. Bewick, G. S., Reid, B., Richardson, C., Banks, R. W. Autogenic modulation of mechanoreceptor excitability by glutamate release from synaptic-like vesicles: evidence from the rat muscle spindle primary sensory ending. J. Physiol. 562, (2), 381-394 (2005).
  16. Watson, S., Aryiku, C., Banks, R. W., Bewick, G. S. Comparison of gadolinium and FM1-43 as blockers of stretch-evoked firing of rat muscle spindle afferents. Proc. Phys. Soc. 21, (PC22), (2010).
  17. Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147, (7), 1615-1627 (2011).
Комбинированная Запись Механически Вынужденное Афферентный Output и нервных окончаний в Labelling мыши фолликула волос ланцетные концовок
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bewick, G. S., Cahusac, P. M. B., Banks, R. W. Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings. J. Vis. Exp. (111), e53854, doi:10.3791/53854 (2016).More

Bewick, G. S., Cahusac, P. M. B., Banks, R. W. Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings. J. Vis. Exp. (111), e53854, doi:10.3791/53854 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter